Identifiering av liten molekyl-bindande proteiner i en Native Cellular miljö med Live-cell fotoaffinitetsmärkning

Introduction

Bioaktiva små molekyler fungerar i grunden genom att interagera med och förändra funktionen av en eller flera "mål" molekyler, oftast proteiner i cellen. Inom läkemedelsforskning, när en aktiv förening upptäcks genom fenotypisk screening, är avgörande identifiering av molekylära mål (s) av denna förening, inte bara för att förstå verkningsmekanismen och potentiella biverkningar av föreningen, men även för potentiellt upptäcka nya biologin bakom sjukdomen modell och banar väg för utvecklingen av nya mekanistiska klasser av läkemedel ^1. Även mål identifiering inte krävs för ett läkemedel som ska användas terapeutiskt, under de senaste åren har det skett en ökande insikt om att nya läkemedelskandidater är mer benägna att lyckas i kliniska prövningar, och därför ge bättre avkastning på investeringen, om en validerad mål är känd ^2. Således har det funnits ett växande intresse för metoder för att identifiera småmolekyl målproteiner.

Ett klassiskt mål identifiering experiment bygger vanligtvis på affinitetsrening, där den lilla molekylen av intresse immobiliseras på ett harts och inkuberades med hela cellysat, varefter obundna proteiner tvättas bort och de återstående proteinerna elueras och identifierade ^tre. Även om denna teknik har använts för att identifiera målen för många små molekyler ^4, är det olämpligt som en universell mål-ID metod av flera skäl. För det första måste målproteinet bibehålla sin nativa konformation vid cellys för att behålla sin förmåga att binda till den lilla molekylen. Detta kan vara särskilt problematiskt för membranproteiner, som ofta undergår konformationsförändringar efter att ha avlägsnats från sin ursprungliga miljö, eller helt enkelt aggregat och fällas ut ur lösningen. För det andra måste den lilla molekylen modifieras kemiskt på ett sådant sätt att det kan immobiliseras på hartset under bibehållande avdess förmåga att binda målproteinet. Djupa bindningsfickor kan därför bli otillgängliga för en liten molekyl när den är fäst till hartset. För det tredje måste bindningsaffiniteten vara tillräckligt hög att interaktionen bibehålls under tvättningsstegen, vilket gör identifiering av lägre affinitet interaktioner utmanande. Fjärde, miljöförhållanden såsom pH, jonkoncentration, eller närvaron av andra endogena molekyler kan variera spatialt i cellen och är ibland en förutsättning för läkemedels mål interaktioner. Således, att hitta de rätta förutsättningarna för att möjliggöra och bibehålla bindande utanför cellen kan kräva en betydande mängd trial and error.

Fotoaffinitetsmärkning kringgår dessa problem genom att tillåta kovalent bindning av en liten molekyl och dess målet inom den nativa ramen för en cell. Snarare än att immobilisera den lilla molekylen till en stor skrymmande harts, är molekylen i stället modifieras kemiskt för att installera två liten funktionell groups: ett fotoaktiverbart molekyldel som medger kovalent tvärbindning till målproteinet vid bestrålning med en speciell våglängd av ljus, och en reportergrupp som gör målproteinet som skall detekteras och därefter isoleras. Levande celler behandlas med fotoaffinitetssonden, sonden binder och kovalent tvärbinder till målproteinet, och sonden-protein-komplexet isoleras sedan intakt. Specificiteten hos proben bindning till målet demonstreras genom att utföra en konkurrensexperiment parallellt, där ett överskott av moderföreningen används för att konkurrera bort bindning av proben till målproteinet.

Utformning och syntes av fotoaffinitetssonder varierar kraftigt från en liten molekyl till en annan, och kommer inte att behandlas i detta protokoll; dock har flera utmärkta diskussioner i ämnet publicerats ^5-9. Det viktigaste skälet är att sonden kvar bioaktiviteten hos moderföreningen, därför presumably-bindning till samma mål (s). Struktur-aktivitetssamband (SAR) studier måste utföras för att avgöra vilka delar av molekylen kan ändras utan förlust av bioaktivitet. Ett flertal olika kemiska grupper har använts som fotoaktiverbara tvärbindningsmedel, inklusive diazirine, bensofenon, och aryl azid, vilka var och en har fördelar och nackdelar ^10. Likaså finns det multipla reporter taggar som har använts för att isolera probbindande proteiner. Reportergrupper kan vara funktionella på egen hand, såsom den vanligen använda biotin eller fluorescerande markörer, eller kan vara prekursorer som kräver ytterligare funktionalisering efter det att fototvärsteg, vilket har fördelen av att vara mindre och därmed mindre benägna att kompromissa bioaktivitet ^11.

I detta protokoll, har vi använt en fotoaffinitets prob innehållande en diazirine fototvärgrupp, och en terminal alkyn för att fästa en reportergrupp genom ett Cu (I) -catalyzEd Azid-alkyn Sharpless-Hüisgen cykloaddition (eller klicka) reaktion ^12-15. SAR studier sond design och syntes, och resultaten av dessa studier har publicerats någon annanstans ^16-18.

Protocol

OBS: Detta protokoll anpassades från MacKinnon och Taunton ¹⁰ för användning i levande celler.

1. Framställning av odlade celler

1. Framställa sterila 6-cm cellodlingsskålar för antalet prover önskade (se nedan).
   OBS: En maträtt av celler används per behandling tillstånd, men om mer protein krävs 2 eller 3 rätter kan framställas per tillstånd och kombineras efter UV-strålning.
   1. Bered minst 3 rätter av celler; Negativ kontroll med DMSO enbart (D), endast Probe behandling (P), och sond + konkurrent (C).
   2. Eventuellt förbereda en ^{4: e} maträtt som ingen UV kontroll, som skall behandlas med sond men inte utsätts för UV-ljus.
      OBS: Om flera konkurrerande molekyler är som skall testas, såsom olika analoger av den lilla molekylen av intresse, förbereda ytterligare konkurrentplattor vid behov.
2. Lägg HEK293T celler till odlingsskålar i 4 ml odlingsmedia. Använd 3,5 miljoner calnar per platta.
   OBS: Antalet celler bör bestämmas för varje celltyp så att celler är nästan 100% konfluenta vid början av experimentet, i syfte att uppnå maximal proteinutbytet. För HUVEC använder 0,3 miljoner celler per platta. En god approximation är 1/10 av cellerna i ett sammanflytande 15 cm skål. HEK293T celler bör odlas i Dulbeccos modifierade Eagles medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin.
3. Återgå cellerna till odlingsinkubator (37 ° C, 5% _CO2) över natten.

2. Behandling av celler och fototvär

1. Nästa dag, för-alikvot följande läkemedel i 1,5 ml mikrocentrifugrör:
   1. För den första behandlingen, tillsätt 4 ^ il DMSO till 2 rör och 4 | j, l av 10 mM konkurrent (dvs. den omodifierade moderföreningen) till ett rör.
   2. För den andra behandlingen, tillsätt 16 pl DMSO till en slang och 16 pl 50 &# 181; M fotoaffinitetssonden till 2 rör.
      OBS: Den optimala koncentrationen kan vara olika för olika sönder (se diskussion), men mellan 200-500 nM är en bra startpunkt (här använder vi 200 nM). Koncentrationen av konkurrenten bör överskrida den hos proben åtminstone 20-faldigt (här använder vi 10 | iM). Den slutliga koncentrationen av DMSO bör vara lika i alla plattor och bör inte överstiga 0,5% (20 ^ il volym).
2. Föra cellplattoma in i cellodlings huva och lägga de i förväg alikvoteras läkemedel från steg 2.1.1 enligt följande: Aspirera 1 ml av odlingsmedia, återsuspendering av pre-alikvoteras läkemedlet i media, och försiktigt tillsätta det tillbaka till plattan droppe klok. Tillsätt DMSO till DMSO (D) platta och sonden (P) plattan och tillsätt konkurrent till tävlingen (C) platta. Återgå plattorna till odlingsinkubator under 30 minuter.
3. Med ljus i kulturen huva nedtonade, tillsätt pre-alikvoteras sond från steg 2.1.2 till sond (P) och konkurrens (C) plattor och tillsättDMSO till DMSO (D) platta, som ovan. Återgå plattorna till odlingsinkubator under 1 timme.
4. Under inkubation, förbereda följande; En bricka med is som kan passa alla plattorna; iskall lysbuffert (PBS [pH 8,5] + 1x proteashämmare cocktail [fullständig EDTA-fri, utspädd från 50x stamlösning görs i vatten], 200 ul / platta); mikrocentrifugrör märkta D, P eller C för var och en av de olika behandlingsbetingelser, på is.
5. 15 min före slutet av en timme inkubation, ställa in UV-lampa (365 nm) i kylrummet och slå på den för att värma upp lampan.
6. Efter en timme inkubation med sonden, placera rätter på is. Tvätta cellerna försiktigt med 5 ml iskall PBS (pH 7,4) för att avlägsna överskott av prob. Åter täcka cellerna med 4 ml iskall PBS.
7. Placera skålen med celler centrerade 3 cm under UV-lampan ovanpå en kylpåse att minimera värme från lampan. Bestråla under 3 min. Ta bort skålen facket av is och upprepa för alla prover.
8. enfter bestrålning, aspirera PBS från cellerna och tillsätt 200 | il av iskall PBS (pH 8,5) med proteasinhibitorer till varje platta. Lossa cellerna från plattan med hjälp av en gummiskrapa och överföring till de i förväg märkta mikrocentrifugrör på is.
9. Lägg SDS till en slutkoncentration av 0,4% (10 ^ il av 10% SDS i 250 | il prov).
   VARNING: SDS pulver är farligt. Undvik att inandas SDS pulver genom att bära en mask över näsan och munnen.
10. Lyserar cellerna genom sonikering av suspensionen för 10 pulser (output 1, duty cycle 30%) och inkubera på is under 1 min före en andra omgång av 10 pulser.
11. Om det behövs, ta bort 2 | il av suspensionen och kontrollera under ett ljusmikroskop för att säkerställa fullständig cell-lys.
12. Koka proverna på en varm platta inställd på 95 ° C under 5 min för att fullborda cellys och denaturera alla proteinerna.
13. Mäta proteinkoncentrationen i varje prov med användning av en spektrofotometrisk detergent-kompatibla proteinanalys, såsom the Dc-proteinanalys ^19, enligt tillverkarens anvisningar, med en spektrofotometer inställd för att mäta absorbansen vid 750 nm.
14. Normalisera proteinkoncentrationen till 2,5 mg / ml (eller om koncentrationer är lägre än 2,5 mg / ml, normalisera till provet med den lägsta proteinkoncentrationen) genom tillsats av PBS pH 8,5 + 0,4% SDS vid behov (till exempel, om proverna är 5 mg / ml i 250 | il, tillsätt 250 | il av PBS pH 8,5 + 0,4% SDS för att erhålla en slutlig koncentration av 2,5 mg / ml).

3. Montering av fluorescerande Tag av Klicka kemi för visualisering av märkta proteiner

1. Avlägsna 40 pl av cell-lysatet och förflyttas till en ny mikrocentrifugrör. Hålla de återstående lysat för reaktion med biotin-azid (steg 4).
2. Tillsätt följande reagenser för: 0,2 l fluor-azid (1 mM stamlösning i DMSO), 0,58 pl TCEP (100 mM lager i vatten med 4 ekvivalenter NaOH, beredda färska), och 3,38 l TBTA (1.7 mM stamlösning i ett 4: 1 förhållande av t-butanol till DMSO). Vortex för att blanda.
3. Lägga 1,14 pl _CUSO4 -5H ₂ O (50 mM i vatten) för att starta reaktionen. Vortex en kort stund och inkubera vid rumstemperatur under 30 minuter i mörker.
4. Tillsätt 50 pl av 2x SDS-provbuffert för att släcka reaktionen. Vid denna punkt, köra proverna direkt på en SDS-PAGE-gel ²⁰ för bäst resultat, eller förvara vid -20 ° C över natt om så behövs.
5. Om frysa prover, värma under 5 minuter vid 95 ° C innan du lägger på gelén.
   OBS: Eftersom molekylvikten av målproteinet är typiskt inte känt i detta skede, är det lämpligt att köra 2 geler med olika koncentrationer akrylamid (dvs 8% och 15%), eller ett brett molekylviktsintervall gradient gel (dvs., 4-15%), för att säkerställa fullständig molekylvikt täckning.
6. När färgfronten har nått slutet av gelén, fortsätta att köra gelén under ytterligare 5 min för att säkerställa att allt av överskottet unreacted fluor-azid har helt lämnat gelén.
7. Avlägsna gelén till en behållare med DDH ₂ O och inkubera under 10 min med försiktig omröring, för att tvätta bort allt överskott av fluor-azid.
8. Placera gelén på en glasplatta och skanna gelén med användning av en Typhoon fluorescerande gel Scanner enligt tillverkarens instruktioner.

4. Montering av Biotin Tag av Klicka kemi för affinitetsrening av märkta proteiner

1. Av de återstående lysat från steg 3,1, använd det maximala beloppet efter protein normalisering så att alla prover är samma volym (till exempel om efter normalisering till 2,5 mg / ml de resulterande provvolymer är 500, 550, och 600 pl, använda 500 il av vardera).
2. Pre-rensa lysaten genom att lägga till 50 l med hög kapacitet streptavidin agarospärlor, förtvättad 2x med PBS (pH 7,4). Inkubera 1 h vid 4 ° C med rotation.
3. Pelletera pärlorna genom centrifugering vid 1000 xg under 3 min. ta bort than supernatanten till ett nytt mikrocentrifugrör på is och kassera pärlorna.
4. Ta 1-2% av DMSO provet till ett nytt rör märkt "input". Lägg en ekvivalent volym 2x SDS-provbuffert och förvara vid -20 ° C.
5. Per 500 pl lysat, lägga till följande reagenser: 1,38 l biotin-azid (10 mM lager i DMSO), 5,5 pl TCEP, och 32,5 l TBTA. Vortex för att blanda.
6. Lägg till 11 l _CUSO4 -5H ₂ O per 500 pl lysat och skaka kortfattat. Inkubera vid rumstemperatur i 30 min.
7. Tillsätt 4 provvolymer aceton kyld till -20 ° C. Vortex proven och inkubera över natten vid -80 ° C för att fullständigt fälla ut proteinerna och avlägsna oreagerad biotin-azid.
8. Centrifugera proverna vid 17.000 xg under 15 min vid 4 ° C för att pelletera de utfällda proteinerna.
9. Aspirera supernatanten fullständigt och återlösas proteinerna genom sonikering i 150 | il PBS (pH 7,4) + 1% SDS.
10. Lägga proverna till 30 ^ förtvättade hög kapacitet streptavidin-agarospärlor och inkubera 1 timme vid 4 ° C med rotation.
11. Pelletera pärlorna genom centrifugering vid 1000 xg under 3 min. Aspirera supernatanten innehållande obundna proteiner och kassering.
12. Tillsätt 1 ml tvättbuffert (400 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,2% SDS, pH 7,4) till pärlorna och inkubera 5 min vid rumstemperatur med rotering.
13. Upprepa steg 4.12 och 4.13 tre gånger.
14. Aspirera tvättbufferten helt från kulorna, och tillsätt 30 pl 2x SDS-provbuffert.
15. Inkubera under 5 min på en 95 ° C värmeblock för att frigöra proteinerna från kulorna.
16. Centrifugera pärlorna för en min vid 13000 xg vid rumstemperatur.
    OBS: Vid denna punkt, kan proverna förvaras vid -20 ° C tills redo att köra SDS-PAGE. Om frysa prover, värma under 5 minuter vid 95 ° C före användning.
17. Försiktigtpipett provbuffert innehållande proteiner bort av pärlorna, och laddar in SDS-PAGE ²⁰ (se viktiga överväganden nedan). Pärlorna kan sparas för återkokning senare om det behövs.
    NOTERA: För proteindetektering genom silverfärgning, erhålles bättre resultat med användning av en 1 mm tjock gel. Om ett band är att skäras ut ur silverfärgade gel för masspektrometri (MS) analys, förbereda alla reagenser färska sterila lösningar och lämna en tom väl mellan proverna på gelén. För varje band klippt från sonden körfält, bör en parallell skiva tas från DMSO körfält så att bakgrundsproteiner kan dras. För validering av protein ID genom western blot, är det viktigt att också ladda provet input från steg 4,4 när du kör SDS-PAGE-gel.
18. Följer ett standardprotokoll för antingen silverfärgning ²¹ eller Western blöt ²² för att detektera mål-protein (er).

Representative Results

De resultat som visas här erhölls med ett foto-affinitetssonden av den antifungala drogen itrakonazol, vars användning har tidigare publicerats ^16. Dessa resultat visar användningen av den levande-cellfotoaffinitetsmärkningsteknik för att framgångsrikt identifiera en stor itrakonazol-bindande protein som den 35 kDa membranproteinet Spänningsberoende Anion Kanal 1 (VDAC1).

Det ovanstående protokollet utfördes i HEK293T celler använder itrakonazol sond för photolabeling och omodifierad itrakonazol som konkurrent molekylen. Efter proven framställdes såsom beskrivits, utsattes de för SDS-PAGE för att separera proteiner genom molekylvikten. Molekylviktsmarkör heter till vänster är i kilodalton (kDa). Den första banan är DMSO kontrollprovet (D), är den andra banan provsonden (P), och den tredje körfält är prov konkurrensen (C). band pogillar i den enda DMSO körfält betraktas bakgrund. Vid analysen av dessa uppgifter, notera att specifika bindande proteiner bör vara frånvarande i provet DMSO kontroll, närvarande i sondprovet och minskade i provet tävlingen. I detta fall, den huvudsakliga proteinbandet detekterades endast i sondprovet var ett band på cirka 35 kDa (fig 1 och 3), som identifierades genom masspektrometri som VDAC1. Identiteten för detta protein bekräftades i figur 5 genom Western blöt med användning av en specifik VDAC1 antikropp. Sammantaget visar dessa resultat tillåter oss att dra slutsatsen att VDAC1 är en stor bindningsprotein av itrakonazol i dessa celler.

Figur 1 visar visualisering av proteiner efter märkning med en fluorescerande tagg (från steg 3 i protokollet), fig 3 visar visualisering av proteiner genom silverfärgning efter märkning med biotin-tagg och pe rforming affinitetsrening (från steg 4 i protokollet); och Figur 5 visar validering av proteinet ID med en specifik antikropp för VDAC1. Figurerna 2 och 4 exemplifiera vad som händer om vissa steg i protokollet inte utförs korrekt (noteras i figurtexterna).

Figur 1. Ett representativt fluorescens-skannade SDS-PAGE-gel (från steg 3 i protokollet) D = DMSO enbart. P = sond bara (200 nM); C = konkurrens (10 M). Molekylviktsmarkör heter till vänster är i kilodalton (kDa). Pilen pekar på den stora photolabeled proteinband vid ungefär 35 kDa som är specifikt är närvarande i sonden körfält och är konkurreras bort genom överskott moderföreningen, vilket indikerar att det är ett specifikt bindande protein.529 / 54529fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. En fluorescens-skannad gel. Överskottet fluor-azid har inte tagits bort helt från gelén (steg 3,6 och 3,7), vilket stora svarta fläckar visas längst ned i gelén. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Ett representativt silverfärgad SDS-PAGE-gel efter biotin pull-down (från steg 4 i protokollet). Pilen pekar på samma band som visualiseras i figur 1, som därefter skarsfrån gelén och utsattes för MS-analys för proteinidentifiering. Marker enheter till vänster är i kilodalton (kDa). Notera det tomma utrymmet mellan varje bana, för att undvika korskontaminering av prover under gel lastning och band excision. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Silver-färgning. En silverfärgad gel med mycket hög bakgrundsfärgning, på grund av otillräcklig pre-clearing av lysaten (steg 4,2) och / eller tvättning av pärlorna (steg 4,13). noterar också bristen på utrymme mellan banorna. Marker enheter till vänster är i kilodalton (kDa). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5. Western blöt av photolabeled proteinet 35 kDa, som identifierats av MS som VDAC1 efter biotin pull-down (från steg 4 i protokollet). The signal närvarande i sonden körfält och minskade i tävlingen körfält, som i figurerna 1 och 3, vilket bekräftar identiteten av proteinet som VDAC1. Det är viktigt att den ingående fraktionen (från steg 4,4) körs vid sidan av de pull-down prover för att säkerställa att de arbeten antikroppen och proteinet av intresse kan detekteras i lysatet. En liten ökning i molekylvikt kan observeras i rullgardins prover på grund av den extra storleken på kovalent bunden sond. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Olika metoder för att identifiera målen för små molekyler kan grovt delas in i två kategorier: top-down, där den cellulära fenotypen av läkemedlet används för att begränsa dess potentiella mål baserat på deras kända funktioner eller bottom-up, där målet identifieras direkt genom kemisk eller genetisk medel ^3. Top-down eller fenotypiska studier kan identifiera vissa cellulära processer som påverkas av läkemedlet (t.ex. transkription / translation / DNA-syntes, cellcykelblock, signaleringsvägen aktivering / inhibering, etc.) som kan ligga bakom den slutliga fenotypen av den lilla molekylen, vilket hjälper begränsa listan över potentiella mål för proteiner involverade i dessa processer. Emellertid är en stor nackdel med top-down-strategi som det bygger på vad som redan är känt om dessa processer, och därför förspänd mot mål vars funktioner har inte präglats eller har inte tidigare beskrivits vara inblandadei en given process.

Bottom-up-metod kringgår detta problem genom att identifiera målet direkt på ett opartiskt sätt. Detta kan åstadkommas genom genetiska medel; till exempel, genom att screena ett shRNA bibliotek för knockdown cellinjer som ger resistens eller överkänslighet mot läkemedlet, eller genom att isolera läkemedelsresistenta cellinjer och använda genomisk sekvensering för att bestämma vilka gener innehåller mutationer ^1. Dessa typer av experiment kan identifiera viktiga proteiner eller vägar i samband med läkemedlets aktivitet, men inte nödvändigtvis innebära direkt bindning till den identifierade proteinet. Kemiska metoder, å andra sidan, typiskt innebära användning av en kemisk sond för att binda till målproteinet direkt och tillåta dess isolering och identifiering. Att utforma en sond som bibehåller sin förmåga att binda till målproteinet kräver användning av SAR-studier för att identifiera en position på molekylen som kan modifieras utan signifikant förlust av aktivitet. det also kräver att proben ha förmåga att binda sitt mål antingen kovalent eller med tillräckligt hög affinitet att det kan isoleras från andra cellulära proteiner (dvs., affinitetsrenad), och att dessa proteiner bibehåller sin förmåga att binda den lilla molekylen utanför deras nativa cellulära miljön. Detta krav kan vara problematiskt för vissa mål; till exempel, integralmembranproteiner kräver ofta en särskild lipid miljö för att behålla sin aktiva konformation, och kan bli aggregerade eller felaktigt orienterad för ligandbindning när celler lyseras. Den metod som beskrivs i detta manuskript undviker dessa potentiella fallgropar av affinitetsrening genom att tillåta kovalent modifiering av målproteinet inom den nativa cellulära miljön, så att efterföljande manipulationer inte kan avbryta den läkemedelsmålet interaktion ^10.

Ett framgångsrikt genomförande av den beskrivna protokollet beror på flera faktorer. Det är viktigt att tarFå proteinet i den lilla molekylen vara tillräckligt rikligt förekommande i celltypen som valts för photolabeling. Celltyp mest potent påverkas av den lilla molekylen kan vara en bra startpunkt, men det kan vara nödvändigt att testa flera olika celltyper för att hitta en med hög målprotein avkastning. Alternativt kan anrikning av olika protein populationer av subcellulär fraktione öka målet avkastning samtidigt som man minskar bakgrundsmärkning. Detektion av fluorescerande taggade proteiner är i allmänhet mycket känsligare än proteindetektering genom silverfärgning; Därför kan band detekteras genom fluorescens inte vara detekterbar genom silverfärgning efter biotin rullgardins. Uppskalning experimentet genom att använda flera rätter av celler per behandlingsbetingelse kan hjälpa till att övervinna detta problem upptäckt. Ökning av koncentrationen av sonden kan också bidra till att förbättra pull-down utbyten. Specifika band kan också skymmas av hög bakgrund, i vilket fall mer stringent tvätt, flertal pre-clearing steg, eller användning av pärlor av en annan sammansättning (såsom magnetiska pärlor i stället för agaros) kan vara till hjälp. Men om målproteinet är för lågt i överflöd det kanske inte är möjligt att detektera genom silverfärgning. Dessutom, om målproteinet inte migrerar som ett skarpt band på SDS-PAGE (såsom tungt glykosylerade proteiner) blir det också svårare att visualisera. Ytterligare modifieringar i protokollet kan göras för att lösa dessa problem, såsom att utföra hela-prov proteomik eller SILAC (stabil isotop märkning av Aminosyror i cellkultur) för att identifiera märkta proteiner efter rullgardins, vilket eliminerar behovet av att minska ett band ut av en silverfärgad gel.

Ett annat viktigt övervägande är koncentrationen av sonden som skall användas i experimentet. Helst bör man använda lägsta mängden sond som producerar en detekterbar signal. Högre koncentrationer ger högre signal men också högre bakgrund märkning, och när alla of bindningsställena på den högsta affiniteten mål mättas det kan finnas ytterligare lägre affinitet mål som börjar detekteras. Den optimala koncentrationen bör därför bestämmas empiriskt genom att starta med en relativt hög koncentration (1-2 M) och titrera tillbaka tills endast en eller två proteiner märks och konkurrensen är uppenbar.

Potensen av sonden kan tas i beaktande vid val av utgångskoncentrationen; dock, beroende på målet överflöd och sättet för inhibition, kan det inte vara en god korrelation mellan sonden aktivitet och mål detektering (t ex en sond med låg nanomolar inhibition kommer inte nödvändigtvis att dra ner tillräckligt med protein vid låga nanomolära koncentrationer har påvisats ). Således är det föredraget att bestämma den mest lämpliga koncentrationen empiriskt med användning av detektering av märkta proteiner som en utläsning. Koncentrationen av konkurrenten som används bör överstiga den av sonden med åtminminst 20 gånger, men man bör också tas inte överstiga löslighetsgränsen för den tävlande.

I fallet att multipla proteiner dras ned av sonden, blir identifieringen av den funktionellt relevanta proteinet mer komplicerat. Det finns dock flera sätt att hjälpa begränsa antalet potentiella målproteiner. Såsom nämnts ovan, kan titrera tillbaka sondkoncentrationen bidra till att förbättra specificiteten hos märkningen. När koncentrationen av sonden droppar, bör högre affinitet bindande proteiner bibehåller sin signalintensitet medan lägre affinitetsproteiner bör försvinna. Avfaltning av flera potentiella mål kan också underlättas genom användning av kemiska analoger av moderföreningen med varierande grad av aktivitet. I teorin för en funktionellt relevant mål, bör det finnas en korrelation mellan bindning till målet och aktivitet av analogen. Till exempel, kan konkurrensen genom inaktiva analoger av moderföreningen kan användas för att utesluta bindning proteins som inte är involverade i de fenotypiska effekterna av föreningen. Likaså aktiva analoger eller andra små molekyler som inducerar samma fenotyp som moderföreningen, kan användas för att hjälpa till regel i relevanta bindande proteiner. På samma sätt kan användningen av en inaktiv eller strukturellt obesläktade fotoaffinitetssonden hjälpa utesluta irrelevanta proteiner.

Validering av målprotein först kräver kontroll av proteinet som identifierats av MS. Detta kan enkelt åstadkommas genom western blöt efter biotin pull-down, under antagande av en hög kvalitet antikropp för målproteinet finns tillgänglig. Men det är lätt att slösa mycket tid och pengar på dåliga antikroppar när man arbetar med en obekant protein. Det är därför kritiskt att antikroppen skall valideras, och att den detekterar ett specifikt band i lysatet av cellerna som används för märkning (dvs provet ingång). Dessutom, eftersom proteinet utbyte efter neddragnings kan vara låg, den antibody måste vara mycket känsliga, och beroende på antikroppen höga koncentrationer kan vara nödvändigt (upp till 1: 100 spädning i vissa fall). För att undvika dessa problem, kan en märkt version av proteinet uttryckas i cellerna innan photolabeling, och taggen kan sedan användas för att detektera proteinet efter neddragnings.

När proteinet ID bekräftas, kan funktionell validering av målet åstadkommas genom genetiska och / eller farmakologiska manipulationer, eller funktionella analyser av målet av intresse, för att visa att aktiviteten av målet påverkas av små som binder till molekyler. Bindningsstället kan kartläggas genom att identifiera aminosyran modifieras av sonden, eller bestämma 3-dimensionella strukturen hos den bundna liten molekyl genom röntgenkristallografi eller NMR-spektroskopi. Helst om en mutant kan hittas som förlorar sin förmåga att binda den lilla molekylen, bör den kunna avskaffa aktiviteten av den lilla molekylen när den uttrycks i stället för vildtyp protein. Det kan också vara önskvärt att visa specificiteten för bindning till målet framför andra strukturellt besläktade eller "off-mål" proteiner.

Detta allmänna protokoll kan användas i alla applikationer som kräver direkt mätning av liten molekyl-bindning till ett proteinmål, så länge som en prob kan göras som bibehåller bioaktiviteten hos moderföreningen. Potentiella tillämpningar innefattar, men är inte begränsade till, identifiering av molekylära mål för nya föreningar, lantmäteri potential off-mål av befintliga läkemedel, vilket bekräftar den direkt bindning av en liten molekyl till ett särskilt protein av intresse, bestämning konkurrens av bindning av andra små molekyler vid samma bindningsställe på ett protein, och upptäcka nya receptorer av naturligt härledda eller endogena ligander.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Life Technologies	20490	Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA)	AnaSpec	63360-50	Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20 °C.
Copper Sulfate (CuSO4•5H2O)	LabChem, Inc.	LC13440-1	Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature.
Biotin-azide	Click Chemistry Tools	AZ104-100	Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C.
Alexa Fluor 647-azide	Life Technologies	A10277	Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20 °C.
365 nm UV lamp	Spectroline	FC100	UV-blocking glasses should be worn while operating.
Protease inhibitor tablets, EDTA-free	Roche Life Science	11873580001	Prepare 50x solution in water and store at -20 °C.
Sonicator	Branson	Sonifier 250	Set to output 1, duty 30%.
Fluorescent gel scanner	GE Healthcare Life Sciences	FLA 9500	Use red laser to detect Alexa-fluor 647.
Detergent-compatible Dc protein assay kit	Bio-Rad	5000112
High Capacity Streptavidin Agarose beads	Life Technologies	20359
Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose	ThermoFisher Scientific	11885092
Fetal Bovine Serum, qualified	ThermoFisher Scientific	26140079
Penicillin/Streptomycin solution	ThermoFisher Scientific	15140122
SDS Sample Buffer (2x)	ThermoFisher Scientific	LC2676