Introduction
Biyoaktif küçük moleküller temelde hücre içinde, ile etkileşim ve bir ya da daha fazla "hedef" moleküller, en çok protein fonksiyonunu değiştirerek çalışır. ilaç keşfi, ne, bir aktif bileşik fenotipik tarama yoluyla tespit edilir, bu bileşiğin moleküler hedef (ler) in tespiti, sadece hareket ve bileşik potansiyel yan etkilerinin mekanizmasının anlaşılması, değil, aynı zamanda potansiyel olarak keşfetmek olmayan, son derece önemlidir yeni biyoloji hastalık modelin altında yatan ve terapötik 1 yeni mekanistik sınıfların gelişmesi için önünü açtı. hedef tanımlama terapötik kullanılacak bir ilaç için gerekli olmasa da, son yıllarda yeni ilaç adayları geçerli bir hedef bilinen ise, daha iyi yatırım getiri nedenle klinik çalışmalarda başarılı ve daha muhtemel olduğunu artan bir tanıma olmuştur 2. Böylece, küçük belirlemek için yöntemler artan bir ilgi olmuşturmolekül hedef proteinler.
Klasik bir hedef belirleme deneyi tipik haliyle ilgi küçük molekül, bir reçine üzerine immobilize ve bağlanmamış protein yıkanarak ve geri kalan proteinler elüt edilmekte ve 3 tespit edilir, sonra bütün hücre lizatları ile kuluçkalanır afinite saflaştırma dayanır. Bu teknik, çok sayıda küçük moleküller 4 hedeflerini tanımlamak için kullanılmış olsa da, bazı nedenlerle, evrensel bir hedef kimliği yöntem için uygun değildir. İlk olarak, hedef proteinin küçük moleküllü bağlanma yeteneğini muhafaza etmek için, hücre lizizi sonrasında doğal yapısını muhafaza etmelidir. Bu genellikle, doğal ortamından ayrılmış sonra yapı değişimlerine uğrama, ya da sadece agrega ve solüsyonun dışında çökelmesi membran proteinleri için, özellikle sorun yaratabilir. korurken İkinci olarak, küçük molekül kimyasal olarak reçine üzerine immobilize edilebilir bir şekilde değiştirilmesi gerekirHedef protein bağlanma yeteneğidir. Bu reçineye giderildikten sonra derin bağlanma cepleri nedenle küçük moleküle erişilemez olabilir. Üçüncü olarak, bağlanma afinitesi etkileşimi zor düşük afinite etkileşimler kimlik verme, yıkama adımları sırasında korunur şekilde yeterince yüksek olması gerekmektedir. pH, iyon konsantrasyonu veya diğer endojen moleküllerin varlığı gibi Dördüncü, çevre koşulları hücre içinde mekansal değişir ve bazen ilaç hedef etkileşimleri için de önkoşul olabilir. Böylece, izin ve deneme yanılma önemli miktarda gerektirebilir hücrenin dışında bağlayıcı korumak için doğru koşulların bulunması.
Fotoafinite işaretleme küçük bir molekülün bir hücrenin doğal kapsamında hedefinin kovalent izin vererek bu sorunları circumvents. Aksine büyük bir hantal reçine küçük molekül immobilize daha molekül yerine kimyasal iki küçük fonksiyonel g yüklemek için modifiye edilirroups: belirli bir ışık dalga boyuna sahip ışınlanmış olduğunda hedef proteine kovalent çapraz bağlanmasını sağlayan bir foto-aktifleştirilebilen kısım, ve hedef proteinin algılanabilir ve daha sonra izole sağlayan bir raportör grubu yer alır. Canlı hücreler, prob bağlanmakta ve kovalent hedef proteine çapraz bağlayan ve prob-protein kompleksi daha sonra izole bozulmamış, fotoafinite probu ile tedavi edilir. hedefe bağlanabilen prob özgünlüğü ana bileşiğin fazla bir hedef proteine probun bağlanması uzaklıkta rekabet için kullanılan paralel bir rekabet deneyi gerçekleştirmek gösterilmiştir.
fotoafinite prob tasarımı ve sentezi küçük bir molekülün diğerine büyük ölçüde değişir ve bu protokolde kapsamında değildir; Ancak, konuyla ilgili çeşitli mükemmel tartışmalar 5-9 yayınlandı. ana dikkate presumab nedenle prob ana bileşiğin biyolojik etkinliğini muhafaza etmesidirly Aynı hedef (ler) e bağlandığı görülmüştür. Yapı-aktivite ilişkisi (SAR) çalışmaları molekülün parçaları biyo kaybı olmadan değiştirilebilir belirlemek için gerçekleştirilmelidir. Farklı kimyasal grupların çeşitli avantajları ve dezavantajları 10 sahip diazirine, benzofenon ve aril azit içeren ışıkla çapraz bağlayıcı, olarak kullanıldı. Benzer şekilde, prob bağlayıcı proteinler izole etmek için kullanılmıştır birçok muhabir etiketleri bulunmaktadır. Raportör grupları gibi yaygın olarak kullanılan biyotin veya flüoresan etiketler olarak, kendi işlevsel olabilir, ya da daha küçük ve biyolojik aktivite 11 tehlikeye böylece daha az muhtemel olması avantajına sahiptir foto-çapraz adım sonraki daha işlevselleştirilmesini gerektiren ön olabilir.
Bu protokol, bir foto-çapraz diazirine grubu içeren bir fotoafinite sonda ve bir Cu (I) ile bir raportör grubunun eklenmesi için bir terminal alkin -catalyz kullandıked Azid-Alkin Kansız-Hüsgen Siklokatılma (veya tıklayın) reaksiyon 12-15. SAR çalışmaları, tasarım ve sentez soruşturma ve bu çalışmaların sonuçları yerde 16-18 yayınlandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokol, canlı hücrelerde kullanım için Mackinnon'dan ve Taunton 10 uyarlanmıştır.
Kültür Hücrelerinin hazırlanması 1.
- (Aşağıya bakınız) istenen numune sayısı steril 6 cm hücre kültür kaplarına hazırlayın.
Not: hücrelerin bir çanak işleme durumuna göre kullanılır, ancak daha fazla protein, 2 veya 3 yemekler durum başına hazırlanmış ve UV ışınımı sonrasında birleştirilebilir gerekli ise.- hücrelerin en az 3 yemekleri hazırlamak; DMSO yalnızca (D) Prob tedavisi (P) ve prob + rakip (C) Negatif kontrol.
- İsteğe bağlı olarak, bir UV kontrol olarak 4. çanak, sonda ile tedavi, ancak UV ışığına maruz kalmaması için hazırlar.
Not: birden çok rakip molekülleri, ilgi küçük molekülün farklı analogları, test edilecek ise, gerektiğinde ilave bir rakip plakaları hazırlamak.
- 4 mL kültür ortamı içinde kültür tabaklarına HEK293T hücreleri ekleyin. 3,5 milyon c kullanınplaka başına arşın.
Not: hücre deneyin başlangıcında hemen hemen% 100 konfluent böylece hücrelerin sayısı en protein verimi elde etmek için, her hücre türü için belirlenmelidir. HUVEC için plaka başına 0,3 milyon hücre kullanın. İyi bir yaklaşım konfluent 15 cm çanak hücrelerin 1/10 olduğunu. HEK293T hücreleri kültüre gereken Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiştir. - Kültür inkübatör hücreleri Dönüş (37 ° C,% 5 CO2) gece boyunca karıştırılmıştır.
Hücreler ve foto-çapraz 2. Tedavi
- Bir sonraki gün, ön kısım, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine aşağıdaki ilaçlar:
- İlk tedavi olarak, 2 tüpleri ve 1 borunun 10 mM yarışmacının (örneğin, tadil edilmemiş ana bileşik) 4 ul DMSO 4 ul ekle.
- İkinci tedavi için, 1 tüp DMSO 16 ul ve 50 arasında 16 ul# 181; 2 tüplere M fotoafinite probu.
NOT: En iyi konsantrasyon farklı prob (tartışma) için farklı olabilir, ancak 200-500 arasında nM iyi bir başlangıç noktası (burada 200 nM kullanın) 'dir. yarışmacının konsantrasyonu probu en az 20 kat (burada 10 mcM kullanıyorum) bu aşması gerekir. DMSO'nun nihai konsantrasyonu, her levha olarak eşit olması gerekmektedir ve% 0.5 (20 ul hacim) fazla olmamalıdır.
- hücre kültürü kaputu içine hücre plakaları getirin ve aşağıdaki gibi adım 2.1.1 öncesi aliquoted ilaçlar ekleyin: kültür ortamı aspire 1 ml, medyada ön aliquoted ilaç resuspending ve yavaşça plaka damla geri ekleyerek bilge. DMSO (D) plaka ve sonda (P) plakaya DMSO ekleyin ve rekabet (C) plakaya rakip ekleyin. 30 dakika boyunca kültür inkübatör plakaları dönün.
- silik kültürü kaputu ışıkları ile, prob adım 2.1.2 öncesi aliquoted probu ekleyin (P) ve yarışma (C) plakaları ve eklemeYukarıdaki DMSO (D) plakaya DMSO. 1 saat boyunca kültür inkübatör plakaları dönün.
- İnkübasyon sırasında, aşağıdaki öğeleri hazırlamak; plakaların tüm sığabilecek bir buz tepsisi; buz soğukluğunda lisis tampon maddesi (PBS [pH 8.5] + 1 x proteaz inhibitör kokteyli [komple EDTA-içermeyen su içinde yapılan 50x stok çözeltisinden seyreltilmiş]; 200 ul / plaka); mikrosantrifüj tüpleri, buz üzerinde, farklı tedavi koşulların her biri için D, P, veya C etiketli.
- 1 saat inkübasyon sonunda 15 dk önce, soğuk bir odada UV lambası (365 nm) kurmak ve ampul ısınmak için yeniden açın.
- prob ile 1 saat süreyle inkübe edildikten sonra buz üzerinde yemekler yerleştirin. aşırı prob çıkarmak için yavaşça 5 ml buz gibi soğuk PBS (pH 7.4) ile hücrelerin yıkayın. 4 ml buz gibi soğuk PBS ile hücrelerin yeniden kapsamaktadır.
- Lambanın Isıtma aza indirmek için bir buz paketi üzerinde UV lamba altında 3 cm merkezli hücrelerin çanak yerleştirin. 3 dakika boyunca ışın tedavisi. buz tepsiye çanak çıkarın ve tüm numuneler için tekrarlayın.
- birfter ışınlama, hücreler PBS aspire ve her plakaya proteaz inhibitörleri ile buz soğukluğunda PBS (pH 8.5) 200 ul ilave edin. buz üzerinde önceden etiketlenmiş mikrosantrifüj tüplerine kauçuk kazıyıcı ve transfer kullanarak hücreleri plakadan ayırın.
- (Örnek 250 ul bir% 10 SDS ve 10 ul)% 0.4 bir son konsantrasyona SDS ekleyin.
DİKKAT: SDS toz tehlikelidir. burnunun ve ağzının üzerinde bir maske takarak SDS tozu solumaktan kaçının. - Lyse 10 darbe (çıkışı 1, görev döngüsü% 30) süspansiyonu sonicating 10 pals ikinci tur önce 1 dakika boyunca buz üzerinde inkübe, hücrelerin.
- Gerekirse, süspansiyon 2 ul kaldırmak ve tam hücre parçalama sağlamak için ışık mikroskobu altında kontrol edin.
- Hücre lizizi tamamlamak ve tüm proteinleri denatüre etmek için 5 dakika boyunca 95 ° C olarak ayarlanmış sıcak bir plaka üzerinde örnekleri kaynatılır.
- Bu inci gibi, bir spektrofotometrik deterjan uyumlu protein deneyi kullanılarak her bir numune içindeki protein konsantrasyonu ölçümü750 nm'de absorbans ölçümü için ayarlanmış bir spektrofotometre ile, üretici talimatlarına göre e DC Protein Deney 19,.
- Gerektiğinde PBS pH 8.5 +% 0.4 SDS ilave edilerek 2.5 mg / ml protein konsantrasyonu normalize (ya da konsantrasyonlar ise daha düşük 2.5 mg / ml, en düşük protein konsantrasyonu ile örnek normalize) (örneğin, numuneler, 5 ise 250 ul mg / ml) 2.5 mg / ml'lik bir son konsantrasyon elde etmek üzere, PBS, pH 8.5 +% 0.4 SDS, 250 ul ekle.
Etiketli Proteinlerin Görselleştirme için tıklayın Kimya tarafından Floresan Tag 3. Eklenti
- Yeni bir mikrosantrifüj tüpüne hücre lizatının transfer 40 ul çıkarın. biyotin-azid (aşama 4) ile reaksiyona sokulması için kalan lizatları tutun.
- sırasıyla aşağıdaki reaktifler ekleyin: 0.2 ul flor-azid (DMSO içinde 1 mM stok çözelti), 0.58 ul TCEP (100 mM'lik bir stok su içinde NaOH 4 eşdeğer, taze olarak hazırlanmıştır) ve 3.38 ul TBTA (1.4 7 mM stok: DMSO t-butanol 1 oran). Vortex karıştırın.
- Reaksiyonu başlatmak üzere 1.14 ul -5H 2 O (su içinde 50 mM) CuSO 4 ekleyin. Vortex kısa ve karanlıkta 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- reaksiyonun sönmesi için 2x SDS örnek tampon maddesi 50 ul ekle. Bu noktada, gerektiğinde gece boyunca -20 ° C 'de en iyi sonuçları veya deposu için bir SDS-PAGE jeli 20 doğrudan örneklerini yürüt.
- örnekleri dondurma ise, jel üzerine yüklenmeden önce 95 ° C'de 5 dakika boyunca ısıtın.
Not: hedef proteinin moleküler ağırlığı, tipik olarak, bu aşamada bilinmediği için, farklı akrilamid konsantrasyonları ile 2 jeller çalıştırmak için tavsiye edilir (yani,% 8 ve% 15) ya da geniş bir moleküler ağırlık aralığı, gradyan jeli (örneğin, 4-15%), tam molekül ağırlığı kapsama sağlamak. - Boyanın önü jelin sonuna ulaştığı zaman, fazla unreacte tüm sağlamak için ilave bir 5 dakika daha jel çalışmaya devamd flor-azid tamamen jel çıkıldı.
- GKD 2 O olan bir kaba jel çıkartın ve tüm fazla flor-azit yıkamak için, yumuşak çalkalama ile 10 dakika süreyle inkübe edilir.
- bir cam plaka üzerine jel yerleştirin ve üreticinin talimatlarına göre bir Typhoon flüoresan jel tarayıcı kullanılarak jel tarama.
Etiketli proteinlerinin eğilim saflaştırılmasına Click kimyası ile de biotin etiketini 4. Ek
- Aşama 3.1 kalan lizatları, sonra normalizasyon 2.5 mg / ml elde örnek hacmi 500, 550 ve 600 ul ise tüm örnekler (örneğin, aynı hacimde olan örneğin, protein normale döndükten sonra en fazla miktarda kullanmak, 500 kullanımı her ul).
- PBS (pH 7.4) 50 ul yüksek kapasiteli streptavidin agaroz boncuklar, önceden yıkanmış 2x ekleyerek lizatları ön temizleyin. rotasyon ile 4 ° C 'de 1 saat inkübe edin.
- 3 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj ile boncuk Pelet. t kaldırO buz üzerinde yeni bir mikrosantrifüj tüpüne süpernatan ve boncuk atın.
- "Girdi" etiketli yeni bir tüp DMSO örnek% 1-2 çıkarın. -20 ° C'de 2 x SDS örnek tamponu ve mağaza eşdeğer hacim.
- lizat 500 ul, aşağıdaki reaktifler ekleyin: 1.38 ul biyotin-azid (DMSO içinde 10 mM stok), 5.5 ul TCEP, 32,5 ul TBTA. Vortex karıştırın.
- 11 ul kısaca lizat ve vorteks 500 ul başına -5H 2 O CuSO 4 ekleyin. 30 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir.
- -20 ° C'ye soğutulmuş asetonla 4 Örnek hacimleri ekleyin. örnekler ve -80 ° C'de bir gece inkübe Vortex tamamen proteinleri çöktürmek ve reaksiyona girmemiş biyotin-azit kaldırmak için.
- Santrifüj, 4 ° C'de 15 dakika boyunca 17,000 x g'de örnekler çökelmiş proteinleri pelet.
- Tamamen süpernatanı havalandırın, ve 150 ul PBS (pH 7.4) +% 1 SDS içinde sonikasyon ile proteinler resolubilize.
- 30 ul önceden yıkanmış yüksek kapasiteli streptavidin agaroz tanelerine örnekleri ekleyin ve rotasyon ile 4 ° C 'de 1 saat inkübe edilir.
- 3 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj ile boncuk Pelet. ilişkisiz proteinler ve imha edilmesini içeren süpernatant aspire.
- tanelerine yıkama tamponu (400 mM NaCI, 50 mM Tris,% 0.2 SDS, pH 7.4) 1 ml ilave edilir ve rotasyon ile oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir.
- Tekrarlayın 4.12 ve 4.13 3 kez yineleyin.
- boncuklar tamamen yıkama tamponu aspire, ve 2 x SDS numune tamponu 30 ul ekle.
- boncuklardan proteinleri serbest bırakmak için 95 ° C sıcaklıkta bir blok üzerinde 5 dakika boyunca inkübe edin.
- Oda sıcaklığında 13.000 xg'de 1 dakika için boncuk santrifüjleyin.
NOT: Bu noktada, numuneler, SDS-PAGE çalıştırmak için hazır olana kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir. örnekleri dondurma durumunda, kullanımdan önce 95 ° C 'de 5 dakika ısıtın. - dikkatliceboncuk kapalı proteinleri içeren örnek tamponu pipet ve SDS-PAGE 20 üzerine yük (aşağıdaki önemli açıklamalara bakın). boncuklar gerekirse daha sonra reboiling için kaydedilebilir.
Not: gümüş boya ile protein tespiti için, iyi sonuçlar 1 mm kalınlığında jel kullanılarak elde edilir. bir grup kütle spektrometrisi (MS) analizi için, gümüş boyalı jel üzerinden kesilecek olursa, steril çözeltiler taze tüm reaktifleri hazırlayıp jeli üzerinde örnekler arasında iyi bir boş bırakın. Bu arka plan proteinleri çıkartılır böylece prob kulvar kesilmiş, her grup için, bir paralel kesit DMSO şerit alınmalıdır. Western blot ile protein kimliğinin doğrulanması için, SDS-PAGE jeli çalışan, aynı zamanda adım 4.4 giriş örnek yüklemek için çok önemlidir. - Hedef protein (ler) tespit etmek için gümüş boyama 21 veya Western blot 22 biri için standart bir protokol takip edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada gösterilen sonuçlar, daha önce 16 yayımlanmıştır kullanımı olan antifungal ilaç itrakonazol, fotoğraf afinite probu ile elde edilmiştir. Bu özellik sayesinde 35 kDa zar proteini Voltaj bağımlı Anyon Kanal 1 (VDAC1) gibi önemli bir itrakonazol bağlayıcı proteini tespit etmek canlı hücre fotoafinite işaretleme tekniği kullanımını göstermektedir.
Yukarıdaki protokol rakip molekül olarak photolabeling ve modifiye edilmemiş itrakonazol için itrakonazol prob kullanılarak HEK293T hücreleri uygulandı. tarif edildiği gibi numuneler hazırlandı sonra, molekül ağırlığı proteinleri ayırmak için SDS-PAGE tabi tutulmuştur. Soldaki moleküler ağırlık markörü birimleri kilodalton (kDa) cinsinden verilmiştir. İlk şerit DMSO kontrol numunesi (D) ikinci şerit prob örneği (P) ve üçüncü şerit rekabet örneği (C). bantları pDMSO tek şeritte resent arka plan olarak kabul edilir. Bu veriler analiz olarak, söz konusu bağlayıcı proteinler probun numunede mevcut olan DMSO, kontrol numunesinde mevcut olması gerektiğine dikkat ve rekabet örnek olarak azalmıştır. Bu durumda, ana protein bandı prob örneği, yaklaşık 35 kDa'lık bir bant olduğu (Şekiller 1 ve 3), VDAC1 olarak kütle spektrometresi ile tespit edildi, sadece tespit edildi. Bu proteinin kimliğini belirli VDAC1 antikoru kullanılarak Western blot ile Şekil 5'te doğrulanmıştır. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar, bu VDAC1 bu hücrelerde itrakonazolün önemli bir bağlayıcı protein olduğu sonucuna varılmıştır.
Şekil 1, bir floresan etiket ile işaretlendikten sonra proteinlerin görselleştirme gösterir (protokolünde adım 3), Şekil 3 biyotin etiketi ve PE ile işaretlendikten sonra gümüş boya ile proteinlerin görselleştirme göstermektedir (Protokol aşama 4'den) afinite saflaştırma rforming; ve Şekil 5. VDAC1 için özel bir antikor kullanarak protein kimliği doğrulama gösteren 2 ve 4 protokolde bazı adımlar (şekil efsaneleri not) doğru yapılmadığı takdirde ne olur örnek Rakamlar.
Şekil 1. (protokolünde adım 3) bir Örnek floresan taranmış SDS-PAGE jeli D = DMSO yalnızca.; P = probu sadece (200 nM); C = Rekabet (10 uM). Soldaki moleküler ağırlık markörü birimleri kilodalton (kDa) cinsinden verilmiştir. Prob şeritte spesifik olarak mevcut olup, belirli bir bağlayıcı protein olduğunu gösteren, fazla kalan ana bileşik ile yarıştırılır ana photolabeled protein bandı yaklaşık olarak 35 kDa okla.529 / 54529fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. floresan taranan jel. Fazla flor-azid tamamen jel kaldırılmış değil, jel alt kısmında görünmesini büyük siyah smear neden (3.6 ve 3.7 adımlar). Büyük halini görmek için tıklayınız bu rakamın.
Şekil 3 (protokol adım 4'den), biyotin pull sonra temsili bir gümüş-lekeli SDS-PAGE jeli. Şekil 1 'de görüntülenmiştir, aynı bant Ok, daha sonra eksize edildijelden ve protein belirlenmesi için MS analizine tabi tutuldu. Soldaki Marker birimleri kilodalton (kDa) cinsinden verilmiştir. Boşluk-arasında her kulvarın, jel yükleme ve bant eksizyonu sırasında örneklerin çapraz bulaşmayı önlemek için dikkat ediniz. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. gümüş boyama. Çok yüksek bir arka plan boyaması ile gümüş lekeli jel, bağlı boncuklar (aşama 4.13) yetersiz lizatlarının ön temizleme (aşama 4.2) ve / veya yıkama. Ayrıca şerit arasındaki boşluk olmaması dikkat. Soldaki işaretleyici birimleri kilodalton (kDa) bulunmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için tıklayınız.
(Protokol aşama 4'den) biyotin pull sonra VDAC1 olarak MS tarafından tanımlanan photolabeled 35-kDa 'lık proteini, Şekil 5. Western Blot. Sinyali, Şekil 1' deki gibi, prob kulvar bulunur ve rekabet şeritte azalma 3, VDAC1 proteinin kimliğini teyit etmektedir. (Adım 4,4) giriş kısmı antikor çalışmaları ve ilgi protein lizatı tespit edilebilir olmasını sağlamak için, açılan örneklerinin yanında çalıştırılan önemlidir. Molekül ağırlığında hafif bir artış nedeniyle kovalent bağlanmış prob eklenen boyutuna açılan örneklerinde görülebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İlacın hücresel fenotip onların bilinen fonksiyonları dayalı potansiyel hedefleri daraltmak için kullanılan yukarıdan aşağıya, ya da aşağıdan yukarıya, hedef: küçük moleküllerin hedefleri belirlenmesi için farklı yaklaşımlar genel olarak iki kategoride toplanabilir kimyasal veya genetik yollarla 3 doğrudan tanımlanır. Yukarıdan-aşağıya veya fenotipik çalışmalar ilacın etkilenen bazı hücresel süreçleri tanımlamak (örneğin, transkripsiyon / çeviri / DNA sentezi, hücre döngüsü bloğu, yolun aktivasyonu / inhibisyon, vb sinyal), küçük molekülün nihai fenotip altında yatan olabilir, hangi bu süreçlerde yer alan proteinlere potansiyel hedeflerin listesini daraltmak yardımcı olur. Bununla birlikte, yukarıdan aşağıya yaklaşımın önemli bir dezavantajı ise, daha önce bu işlemler hakkında bilinen dayanır ve bu nedenle opsiyonel bileşenleri karakterize edilmemiştir veya daha önce dahil olmak üzere tarif edilmemiştir hedeflerine karşı bastırılmaktadır olmasıdırbelirli bir işlemde.
aşağıdan yukarıya yaklaşım tarafsız bir şekilde doğrudan hedef belirleyerek bu sorunu circumvents. Bu genetik yollarla gerçekleştirilebilir; Örneğin, veya ilaca karşı dirençli hücre çizgileri izole edilmesi ve genlerin mutasyon 1 içeren belirlemek için, genomik sıralama kullanılarak ilaca karşı direnç veya aşırı duyarlılık kazandıran yok etme hücre çizgileri için bir shRNA kütüphanenin taranması ile. deneylerin Bu tür ilacın etkinliği ile ilgili önemli proteinleri ya da yolları tespit edebilir, ama mutlaka tespit proteine bağlanma doğrudan ispat yoktur. Kimyasal yaklaşımlar ise, tipik olarak, doğrudan hedef proteine bağlanan ve onun izolasyon ve belirlenmesine olanak sağlamak için, kimyasal bir probun kullanılmasını içerir. hedef proteine bağlanma kabiliyetini muhafaza eden bir sonda ile tasarlanması sayesinde aktivitesinde belirgin bir kayıp olmaksızın değiştirilebilir molekül üzerinde bir konumunu belirlemek SAR çalışmalar kullanılmasını gerektirir. Bu alsO probu ya kovalent ya da başka bir hücresel protein (yani, ilgi yoluyla arıtılmış) izole edilebilir, yeterince yüksek bir afinite ile hedefine bağlanabilen gerektirir ve bu proteinlerin doğal dışındaki küçük bir molekülü bağlanma kabiliyetini muhafaza eden hücresel ortamı. Bu gereklilik, belirli hedefler için sorunlu olabilir; Örneğin, yekpare zar proteinleri, genellikle aktif yapıyı muhafaza belirli lipit ortam gerektirir, ve toplanmış ya da yanlış hücreler lize kez ligand için yönlendirilmiş olabilir. Daha sonra manipülasyonlar, ecza-hedef etkileşimi 10 kesme, böylece bu metin içinde tarif edilen yöntem, doğal selüler ortamlarının içindeki hedef proteinin kovalent modifikasyonu sağlayarak afinite saflaştırma bu potansiyel tuzaklar önler.
açıklanan protokol başarılı bir şekilde uygulanması birçok faktöre bağlıdır. Bu ta önemlidirküçük molekülün rYer proteini photolabeling için seçilen hücre tipinde yeterince zengindirler olabilir. en kuvvetli küçük molekül tarafından etkilenen hücre tipi iyi bir başlangıç yeri olabilir, ancak yüksek hedef protein verimleri ile bulmak için birden fazla farklı hücre tiplerini test etmek için gerekli olabilir. Arka plan etiketleme azaltırken Alternatif olarak, hücre içi fraksiyon tarafından farklı protein nüfusun zenginleştirme hedefi verimini artırabilir. Algılama floresan gümüş leke protein tespiti daha genel çok daha hassas olan etiketli proteinlerin; Bu nedenle, floresan tespit bantları biyotin pull sonra gümüş boyama ile algılanabilir olmayabilir. Tedavi durumun başına hücre birden yemekleri kullanarak deneyi büyütülmesi, bu algılama sorunu aşmak için yardımcı olabilir. prob konsantrasyonunun artırılması da açılan verim artırmak için yardımcı olabilir. Belirli bantları da yüksek bir arka plan tarafından gizlenmiş olabilir ki bu durumda daha sıkı yıkama, birden çok önceden bölgesindekiadımları veya (yerine agaroz manyetik boncuk gibi) farklı bir bileşime sahip tanelerin kullanılmasını temizleme yardımcı olabilir. hedef protein bolluğu çok düşükse Ancak, gümüş boya ile tespit etmek mümkün olmayabilir. Hedef proteini (örneğin derecede glikozile proteinler gibi), SDS-PAGE üzerinde keskin bant olarak göç etmez Ek olarak, aynı zamanda görselleştirmek daha zor olacaktır. protokole başka modifikasyonlar dışarı bir grup kesmek için ihtiyacını ortadan kaldırarak, pull sonra etiketli proteinleri tespit etmek gibi (Hücre kültüründe Amino asitler Kararlı İzotop Etiketleme) tam örnek proteomik veya SILAC performans olarak bu sorunların üstesinden gelmek için yapılabilir gümüş-lekeli jel.
Diğer bir önemli husus denemede kullanılmak üzere prob konsantrasyonudur. İdeal olarak, bir tespit edilebilir sinyal üretir prob düşük miktarda kullanılmalıdır. Yüksek konsantrasyonlarda o zamanlar tüm yüksek sinyal değil, aynı zamanda yüksek bir arka plan etiketleme ve verecekhaline yüksek afinite hedef bağlanma yerleri, doymuş ön tespit başlar ek bir alt afinite hedefler olabilir. uygun konsantrasyonu, deneysel olarak, nispeten yüksek bir konsantrasyonda (1-2 uM) ile başlayan ve arka titre sadece bir veya iki proteinin etiketli ve rekabet açıktır kadar tarafından belirlenmelidir.
prob kuvveti başlangıç konsantrasyonu seçiminde dikkate alınabilir; Bununla birlikte, hedef bolluğu ve inhibisyon moduna bağlı olarak, prob aktivitesi, hedef tespiti arasında iyi bir korelasyon olmayabilir (örneğin, düşük nanomolar inhibisyonu bir sonda mutlaka tespit için düşük nanomolar konsantrasyonlarda yeterli protein aşağı çekme olmaz ). Bu nedenle, deneysel bir okuma olarak etiketlenmiş proteinlerin tespiti ile, en uygun konsantrasyonu belirlemek için tercih edilir. kullanılan yarışmacının konsantrasyonu en tarafından prob o aşması gerekiren az 20 kat, ama bakımı da yarışmacının çözünürlük sınırını aşmayacak şekilde alınmalıdır.
Birden fazla proteinler prob ile aşağı doğru çekilir durumda, fonksiyonel olarak bağlantılı proteinin tanımlanması daha karmaşık hale gelir. Ancak, potansiyel hedef proteinleri daraltmak yardımcı olmak için çeşitli yollar vardır. Yukarıda belirtildiği gibi, prob konsantrasyonu geri titre etiketleme özgüllüğünü iyileştirmeye yardımcı olabilir. prob konsantrasyonu düşer gibi alt afinite proteinleri ortadan gerekirken, yüksek afinite bağlayıcı proteinler kendi sinyal yoğunluğu tutmalıdır. Birden çok potansiyel hedefler Dekonvolüsyon da faaliyet derecelerinde ana bileşiğin kimyasal analogların kullanımı ile yardım edilebilir. Teorik olarak, fonksiyonel olarak ilgili hedef için, analog hedef ve aktivitesi bağlanabilen arasında bir bağlantı olmalıdır. Örneğin, ana bileşiğin inaktif analogları ile rekabet bağlama s ekarte etmek için de kullanılabilirbileşik fenotipik etkilere dahil olmayan roteinler. Aynı şekilde, ana bileşik ile aynı fenotipe neden aktif analoglan ya da diğer küçük moleküller, uygun bağlayıcı proteinlerin kuralı yardımcı kullanılabilir. Aynı doğrultuda, inaktif veya yapısal ilgisiz fotoafinite prob kullanımı alakasız proteinler ekarte yardımcı olabilir.
hedef proteinin Doğrulama ilk MS tarafından belirlenen protein doğrulama gerektirir. Bu kolayca hedef protein mevcuttur için yüksek kalitede bir antikor varsayarak, biyotin pull aşağıdaki western blot ile gerçekleştirilebilir. alışılmadık bir protein ile çalışırken Ancak, kötü antikorlar üzerinde önemli zaman ve para harcamak kolaydır. Sebepten, antikorun geçerli olması kritiktir ve hücre lizatı içinde özel bir bant algıladığı etiketleme (yani, giriş örneği) için kullanılır. Buna ek olarak, pull sonra protein verimi düşük olabilir, çünkü karıncaiBody çok hassas olması gerekir ve antikora bağlı olarak yüksek konsantrasyonlar gerekebilir (en fazla 1: Bazı durumlarda 100 seyreltme). Bu sorunları önlemek için, proteinin etiketli versiyonu photolabeling önce hücrelerde eksprese edilebilir, ve etiket ve sonra açılan sonra protein tespit etmek için kullanılabilir.
Protein numarası onaylandıktan sonra, hedef fonksiyonel doğrulama hedefin aktivitesi küçük molekül bağlama etkilenir olduğunu göstermek için, genetik ve / veya farmakolojik müdahaleler veya ilgili hedef ile ilgili işlevsel deneyler gerçekleştirilebilir. bağlama sahası probu ile modifiye edilmiş amino asit belirlenmesi, ya da X-ışını kristalografisi veya NMR spektroskopisi ile bağlanan küçük molekülün 3-boyutlu yapısının belirlenmesi ile eşlenebilir. mutant küçük bir molekülü bağlanma yeteneğini kaybeder bulunabilir ise, vahşi tip Pro yerine ifade İdeal olarak, küçük bir molekülün aktivitesini ortadan kaldırmak mümkün olmalıdırtein. Aynı zamanda, diğer yapısal olarak ilişkili veya "hedef dışı" proteinlerden hedefe bağlanma spesifikliğini gösteren arzu edilebilir.
Bu genel bir protokol, bir prob, ana bileşiğin biyo-aktivitesini korur yapılabilir sürece, küçük moleküllü bağlayıcı bir protein hedefine doğrudan ölçülmesini gerektiren herhangi bir uygulama kullanılabilir. Potansiyel uygulamalar, yeni bileşiklerin moleküler hedeflerin belirlenmesi dışı hedefler mevcut ilaçların potansiyel ölçme, ilgi konusu özel bir protein için küçük bir molekülün, doğrudan bağlanma teyit diğer küçük moleküller ile bağlanma rekabeti belirlenmesi arasında, ancak bunlarla sınırlı değildir: doğal olarak türetilmiş ya da endojen ligandların yeni reseptörler keşfetmek aynı bağlayıcı bir protein ile ilgili site ve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Life Technologies | 20490 | Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA) | AnaSpec | 63360-50 | Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20 °C. |
| Copper Sulfate (CuSO4•5H2O) | LabChem, Inc. | LC13440-1 | Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature. |
| Biotin-azide | Click Chemistry Tools | AZ104-100 | Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C. |
| Alexa Fluor 647-azide | Life Technologies | A10277 | Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20 °C. |
| 365 nm UV lamp | Spectroline | FC100 | UV-blocking glasses should be worn while operating. |
| Protease inhibitor tablets, EDTA-free | Roche Life Science | 11873580001 | Prepare 50x solution in water and store at -20 °C. |
| Sonicator | Branson | Sonifier 250 | Set to output 1, duty 30%. |
| Fluorescent gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | FLA 9500 | Use red laser to detect Alexa-fluor 647. |
| Detergent-compatible Dc protein assay kit | Bio-Rad | 5000112 | |
| High Capacity Streptavidin Agarose beads | Life Technologies | 20359 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose | ThermoFisher Scientific | 11885092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| SDS Sample Buffer (2x) | ThermoFisher Scientific | LC2676 |
References
- Schenone, M., Dančìk, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
- Cook, D., Brown, D., et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: a five-dimensional framework. Nat Rev Drug Discov. 13 (6), 419-431 (2014).
- Titov, D. V., Liu, J. O. Identification and validation of protein targets of bioactive small molecules. Bioorg Med Chem. 20 (6), 1902-1909 (2012).
- Jung, H. J., Kwon, H. J. Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery. Arch Pharm Res. 38 (9), 1627-1641 (2015).
- Sumranjit, J., Chung, S. J. Recent Advances in Target Characterization and Identification by Photoaffinity Probes. Molecules. 18 (9), 10425-10451 (2013).
- Robles, O., Romo, D. Chemo- and site-selective derivatizations of natural products enabling biological studies. Nat Prod Rep. 31 (3), 318-334 (2014).
- Zhou, Q., Gui, J., et al. Bioconjugation by Native Chemical Tagging of C-H Bonds. J Am Chem Soc. 135 (35), (2013).
- Li, Z., Hao, P., et al. Design and Synthesis of Minimalist Terminal Alkyne-Containing Diazirine Photo-Crosslinkers and Their Incorporation into Kinase Inhibitors for Cell- and Tissue-Based Proteome Profiling. Angew Chem Int Edit. 52 (33), 8551-8556 (2013).
- Chamni, S., He, Q. L., Dang, Y., Bhat, S., Liu, J. O., Romo, D. Diazo reagents with small steric footprints for simultaneous arming/SAR studies of alcohol-containing natural products via O-H insertion. ACS chem biol. 6 (11), 1175-1181 (2011).
- Mackinnon, A. L., Taunton, J. Target Identification by Diazirine Photo-Cross-linking and Click Chemistry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 55-73 (2009).
- Smith, E., Collins, I. Photoaffinity labeling in target- and binding-site identification. Future med chem. 7 (2), 159-183 (2015).
- Huisgen, R., Szeimies, G., Möbius, L. 1.3-Dipolare Cycloadditionen, XXXII. Kinetik der Additionen organischer Azide an CC-Mehrfachbindungen. Chem Ber. 100 (8), 2494-2507 (1967).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chem Int Ed Engl. 40 (11), 2004-2021 (2001).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41 (14), 2596-2599 (2002).
- Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on Solid Phase: [1,2,3]-Triazoles by Regiospecific Copper(I)-Catalyzed 1,3-Dipolar Cycloadditions of Terminal Alkynes to Azides. J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).
- Head, S. A., Shi, W., et al. Antifungal drug itraconazole targets VDAC1 to modulate the AMPK/mTOR signaling axis in endothelial cells. P Natl Acad Sci USA. 112 (52), E7276-E7285 (2015).
- Shi, W., Nacev, B. A., Aftab, B. T., Head, S., Rudin, C. M., Liu, J. O. Itraconazole Side Chain Analogues: Structure-Activity Relationship Studies for Inhibition of Endothelial Cell Proliferation, Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 (VEGFR2) Glycosylation, and Hedgehog Signaling. J Med Chem. 54 (20), 7363-7374 (2011).
- Shi, W., Nacev, B. A., Bhat, S., Liu, J. O. Impact of Absolute Stereochemistry on the Antiangiogenic and Antifungal Activities of Itraconazole. ACS Med Chem Lett. 1 (4), 155-159 (2010).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Bioph Res Co. 28 (5), 815-820 (1967).
- Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal Biochem. 98 (1), 231-237 (1979).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. P Natl Acad Sci USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
