Et gentagne Concussive hoved Injury Model i mus

Introduction

Hjernerystelse, også kaldet mild traumatisk hjerneskade (MTBI), er den hyppigste forekomst af traumatisk hjerneskade (TBI) og påvirker millioner af mennesker i USA. Hjernerystelse kan være vanskelig at diagnosticere, og der er ingen specifik kur mod hjernerystelse. Der er en stigende erkendelse og nogle beviser for, at mild mekanisk traume som følge af sportsskader, militær kamp og andre fysisk engagerende sysler kan have kumulative og kroniske neurologiske konsekvenser ^1,2. Men er der stadig mangel på viden om hjernerystelse og deres virkninger. Aktuel metode begrænser studier af patologi og behandling hos mennesker, da det kun neurologisk vurdering og billedbehandling evaluering er tilgængelige for klinisk diagnose. Dyremodeller tilvejebringer et middel til at studere hjernerystelse på en effektiv, streng, og kontrolleret måde med håb om yderligere diagnose og behandling af MTBI.

Undersøgelser har tilpasset traditionelle TBImodeller som kontrolleret kortikal påvirkning (CCI), at væske-percussion effekt (FPI), vægt drop skade, og blast skader udføre MTBI og stimulere lave skade sværhedsgrader ved at ændre parametrene skade. Disse modeller er fordelagtigt at anvende på grund af deres evne til at replikere hjernetraume morfologisk ligner den kliniske tilstand; men de har også deres egne begrænsninger. Alvorligheden af ​​kvæstelser induceret af en acceleration skade (vægt dråbe) er ofte meget varierende. De to resultater af den milde CCI - subaraknoidalblødning og fokal kontusion - kan ikke sammenlignes med typiske menneskelige hjernerystelse. CCI og FPI kræver en kraniotomi, som ikke er klinisk relevant, mens blast skade er en mere kontroversiel model i forhold til de forskellige eksponering position og peak trykmåling samt variable sekundær skade under eksponeringen ^_3-6. En opdateret concussive dyremodel der kan oversætte præklinisk forskning i den kliniske Setting er nødvendig forskning.

Det centrale spørgsmål i modellering mild TBI er at definere den eksperimentelle skade sværhedsgrad, som bedst replikerer skaden i et klinisk miljø. For nylig, forskellige forskergrupper udviklet lukket hovedlæsion eller concussive hoved skade (CHI) model ^7-10. CHI er en modifikation af CCI uden kraniotomi, men det stadig bruger en traditionel elektronisk magnetisk effekt system til at generere et hoved effekt. En CHI kan fremkalde en hjernerystelse der spænder fra mild til moderat ved at justere parametrene konsekvensanalyser. Bevidsthedstab (LOC) kan observeres umiddelbart efter en påvirkning ved at detektere et fald i vejrtrækning eller forbigående afbrydelse af vejrtrækning. Perioden for LOC bruges til at bestemme sværhedsgraden af ​​skaden. Dette papir indeholder en lidt forbedret og opdateret version af en repetitiv CHI (rCHI) model i mus, sammen med en detaljeret trin-for-trin-protokol og repræsentative resultater. Den rCHI strategier model forskning enre fordelagtig ved bestemmelse MTBI virkninger og potentielle behandlinger, især da der ikke er nogen individuel dyremodel som kan efterligne alle de hjernerystelse-inducerede patologiske forandringer.

Protocol

Alle procedurer blev udført under protokoller # 201207692 godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg University of Florida og i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr.

1. Animal Care

1. Brug 3-4 måneder gamle mandlige C57BL / 6J mus. Giv strøelse, redemateriale, mad og vand ad libitum. Hold musene i omgivelsestemperaturer kontrolleret ved 20 - 22 ° C med konstant 12-timers lys / 12-timers mørke cyklusser.

2. Pre-impaction Forberedelse

1. Vedhæft en specialfremstillet silikone gummibelagt metalspids til en elektromagnetisk stereotaktisk effekt enhed. Kontroller den flade bund af spidsen er parallel med overfladen af probespidsen (figur 1A).
2. Bedøver musen med 4% isofluran efterfulgt af vedligeholdelse anæstesi på 2,5% isofluran. Kontroller anæstesi via flowmeteret. Monitor anæstesi niveau indtil dyret når et kirurgisk niveau for bedøvelse ved at vise tab af pedal tilbagetrækning refleks.
3. Sætte musen i en liggende stilling på en varmepude. Brug en tragtformet næsekegle at holde musen under anæstesi. Helt barbere hovedet ved hjælp af en trimmer. Brug vaseline oftalmologiske salve på musens øjne til at forebygge tørhed, mens under anæstesi.

3. Impact Parametre Indstilling

BEMÆRK: Systemet påvirkning omfatter en styreboks til at indstille parametre effekt, en aktuator til at udføre sammenpresning, og en digital stereotaktisk ramme med 3-bevægelse akser.

1. Forudindstillet hastighed af anordningen virkning til 4 m / sek og opholdstiden til 240 msek på kontrolboksen.

4. Placering af Impact center

1. Sætte en blød varmepude under dyrets krop for at holde kropstemperaturen nær 39 ° C. Monter musen i en stereotaktisk ramme i et prone position med stump ende øre barer.
2. Sænk spidsen indvirkning tæt på musens hoved ved at flytte Z-driver. Juster flade indvirkning spids (9 mm i diameter) ved at bevæge X- og Y-drivere midtvejs til målkoordinaterne over det sagittale sutur.
3. Sørg ene kant af virkningen spids er lodret parallel med en imaginær vandret linie trukket mellem de to ører (figur 1C). Centrum af virkningen svarer til den centrale sagittale sutur midtvejs mellem interfrontal og lambdoid suturer (interaurale 9 mm til interaurale 0 mm, lateral 4,5 mm).

5. Virkningerne Dybde Setting

1. For at indstille dybden indvirkning korrekt, bruge ekstra sonde tip til at erstatte den isolerede silicone gummibelagt effekt tip.
2. For at sikre, at der ikke er nogen forskydning af virkningen centrum efter skifte tips, indstille X og Y-kanal på det digitale stereotaktisk kontrolpanel til nul, før du skifter tips.
3. Flyt probe tip til midten af ​​slagområdet ved manuelt at bevæge X-og Y-drevene.
4. Clip kontakt sensor til musens hale.
5. Flyt slaglegemet (Z-drev), indtil sondespidsen rører overfladen af ​​webstedet effekt.
6. Indstil Z kanal på stereotaktisk kontrolpanel til nul.
7. Flyt tip effekten tilbage til virkningen område ved manuel justering X- og Y-drivere (ikke knapper nul på den digitale stereotaktisk kontrolpanel), indtil X- og Y-drivere er nul (hvor spidsen indvirkning tidligere var placeret).
8. Træk aktuatoren ved at flytte tilbagetrækningsdrevet kontakten på kontrolboksen. Manuelt flytte slaglegemet ned (Z driver) med 4 mm.

6. Virkning

1. Trigger konsekvenserne ved at klikke på konsekvenserne kontakten på kontrolboksen og opnå en deformation dybde på 4 mm.

7. Post-impaction

1. Måle tiden fra virkningen indtil musens første åndedrag ved hjælp af en timer.
2. Tillad til nyttiggørelse før han vendte tilbage dyret tilbage i en ren bur. Må ikke returnere et dyr til selskab med andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt.
3. Observere og vejes musene dagligt. Hvis musene viser tegn på smerte, intraperitonealt injicere dem med Meloxicam 1 - 2 mg / kg hver 12 - 24 timer.

8. Gentagne Impaction

1. Giv musene yderligere skader på dag 4, 7 og 10 efter den initiale skade (72 hr interval mellem virkninger).

9. Immunhistokemi (IHC)

1. Transcardial perfusion
   1. Bedøver mus via intraperitoneal injektion med 200 m / kg pentobarbital.
   2. Vurdere og sikre kirurgisk-plane anæstesi ved en tå knivspids. secure musen i liggende stilling ved forsigtigt at tape forpoterne og bagpoter til en Styrofoam arbejde overflade inde stinkskab.
   3. Lav et snit gennem huden langs thorax midterlinjen fra lige under formet som et sværd proces til kravebenet. Gøre yderligere to hudincisioner på xiphoid proces og fortsætte langs bunden af ​​den ventrale brystkassen lateralt.
   4. Åbn brysthulen og udsætte hjertet ved at skære gennem thorax muskulatur og brystkassen.
   5. Fastgør det bankende hjerte med stumpe pincet og gøre en 1 - 2 mm snit i den venstre ventrikel.
   6. Læg straks en sommerfugl nål ind i højre atrium. Begynd infusion af 20 ml saltvand ved at skubbe sprøjten langsomt.
   7. Skift fra saltvand til 4% paraformaldehyd. Fortsæt perfusion med 20 ml paraformaldehyd.
   8. Halshugge musen og fjerne huden med en saks. Isoler hjernen fra kraniet ved en knogle cutter.
2. Cryostat sektionering
   1. Integrer hjernevæv i optimal skæring temperatur (OLT) formulering og fryse ved -80 ° C. Placer hjernen i kryostat i et sagittalt orientering. Cut hjernesnit 5 um tykt.
3. Farvning
   1. Tør frosne snit ved stuetemperatur i 1 time.
   2. Glassene inkuberes tildækket med 100 pi 2% gedeserum og 0,1% Triton X-100 i phosphatpufret saltvand (PBS) i 1 time ved stuetemperatur.
   3. Vask præparatglassene 3 gange med 300 pi PBS. Derefter inkuberes objektglassene med anti-GFAP (1: 200) eller anti-ferritin antistof (1: 200) separat natten over ved 4 ° C.
   4. Vask præparatglassene 3 gange med 300 pi PBS. Derefter inkuberes objektglassene i 2 timer ved stuetemperatur med biotin-konjugeret sekundært antistof.
   5. Vask præparatglassene 3 gange med 300 pi PBS. Derefter inkuberes objektglassene med avidin-biotin-kompleks (ABC) opløsning (1:50) ved stuetemperatur i 30 min.
   6. Vask præparatglassene 3 gange med 300 pi PBS. Derefter inkuberes i 3,3'-diaminobenzidin (DAB) substrat-opløsning (50 ml PBS, 10 pi H ₂ O _2, 10 mg DAB pille, filter før brug) 5 - 8 min. Overhold dias under mikroskop, indtil de positive celler vises.
   7. Skyl dias i langsom vand kører hanen i 5 min. Rene dias med en lab-tørre. Derefter montere sektioner med montering medium og dækglas.

Representative Results

I denne model (Figur 1 AC), der var korte perioder med gispende og lavvandede respirations. Et tab af bevidsthed (ubevidst) er defineret som et fald i vejrtrækning eller forbigående ophør af vejrtrækning, inden de genoptager en normal respiration. En indvirkning på midten af hovedet, forårsaget kortvarig bevidstløshed (7,5 ± 4,7, 7,8 ± 5,5, 10,2 ± 8,8, 9,5 ± 8,0 sekunder ved hvert stød separat, fig 1D). Mus hjerner viste normal morfologi af H & E histologisk farvning, hvilket indikerede ingen indlysende strukturelle læsioner eller vævsskader som følge af virkningen (figur 2A). Som svar på TBI, er astrocytter kendt for at undergå visse ændringer, herunder aktivering, proliferation eller reaktiv gliose ^11,12. Øgede glial fibrillært surt protein (GFAP) -positive celler med store cellelegemer og tykke synapser er de aktiverede astrocytter. Den corpus callosum fra rCHI musehjerner viste tydelige tegn på astrocytter aktivering ved 7 dage efter den sidste virkning (figur 2B).

Microbleeds i vævet er almindelige i MTBI og kan føre til frigivelse af jern fra hæmoglobin ^13. Jernophobning i serummet kan detekteres ved ferritin test i klinisk ^13. De ferritin immunpositive celler i mus cortex blev der fundet en dag efter den sidste effekt og varede mindst syv dage, tyder på, at flere impactions kan resultere i kortikale microbleeds (Figur 2C).

Figur 1. En mus Model of Gentagne Concussive hoved skade. (A) Skræddersyede 1 mm tyk silicone gummibelagt spids måler 9 mm i diameter med en sonde spids. (B) En mus er mounted i en stereotaktisk ramme i bugleje med en blød varmepude under kroppen. (C) Virkningen center positionering. Kanten af ​​virkningen tip er lodret parallel med en imaginær vandret linje mellem de to ører. Centret effekt svarer midtpunktet mellem interfrontal og lambdoid suturer (interaurale 9 mm til interaurale 0 mm, lateral 4,5 mm). (D) Apnø defineres som korte perioder med forbigående ophør af vejrtrækning. Middel og SD er vist i det nederste panel. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Histologi for Gentagne Concussive hoved skade. (A, venstre) En musehjerne blev fjernet efter perfusion med 4% paraformaldehyd. Ingen skader væv blev fundet. (B) Forhøjelse af den biokemiske markør for gliose (GFAP) i corpus callosum 7 dage efter den sidste skade. Scale bar = 200 um. (C) ved immunhistokemi, ferritin-H-kæde viste sig at blive udtrykt i hjernen cortex efter skade. De indsætte billeder repræsenterer forstørret positive celler. Scale bar = 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

At efterligne hjerneskader morfologisk ligner den kliniske tilstand, forventes post-hjernerystelse symptomer. Post-hjernerystelse symptomer omfatter generelt hovedpine, svimmelhed, vertigo, træthed, hukommelses- og søvnproblemer, problemer med at koncentrere samt angst og nedtrykthed. Da somatiske symptomer måske endnu ikke måles i dyremodeller, er ændringerne i motor og kognitiv funktion og følelsesmæssig adfærd bruges som kriterier for rationelt vurdere hjernerystelse i dyremodeller. I et tidligere rapporteret undersøgelse blev det vist, at rCHI musemodel inducerer underskud i den fysiske indlæring, hukommelse og angst ^8. Vigtigere er det, rCHI model, der anvendes i denne protokol repræsenterer den kliniske indstilling uden invasiv hjerneskade eller hjernens struktur fraktur, som begge kan resultere i blødning, blødning, ødem eller akut celledød / vævstab.

Følgende er vigtige tips til en vellykket modellering konsekvent concussion / MTBI bruger en elektronisk magnet effekt systemet:

Undgå en anden hjerneskade direkte efter den første hjerneskade, der kan være forårsaget af bevægelse under anslaget. Musen hoved kan bevæge sig lidt ned under anslaget. For at undgå en hjerne kontusion forårsaget af en hurtig bevægelse mod hårdt underlag eller hoved strækning, skal en blød varmepude sættes under musen kroppen. Hoved og krop skal også holdes vandret. Desuden bruger stump-end øre barer at fastsætte musen hovedet i stereotaktisk ramme, og ikke indsætte dem inde i øregangen. Dette beskytter mus mod skader forårsaget af skarpe ender under bevægelsen.

Korrekt placere centret virkning og etablere nul. I modsætning til åben skade i hovedet, virkningen tip positionering er relativt vanskeligt. Størrelsen af ​​spidsen virkninger og virkningerne center påvirker skaden sværhedsgrad og læsioner. Baseret på musehjerne anatomi er centret virkning designet til at svare til midtvejsmellem interfrontal og lambdoid suturer (interaurale 9 mm til interaurale 0 mm, lateral 4,5 mm). Således er en optimeret 9 mm spids påkrævet. Spidsen effekt skal justeres til målet koordinater over den sagittale sutur midtvejs, og en kant af virkningen spids skal være lodret parallelt med en imaginær vandret linje mellem de to ører (figur 1C). Den isolerede effekt spids med en silikonegummi belægning blokerer kontakten sensoren og forhindrer indstillingen virkningen dybde. En probespids er nødvendig, og bør være parallel med overfladen af ​​knappen om virkningen spids. I midten af ​​virkningen justeres til sondespidsen rørende sted ved at betjene stereotaktisk instrument. Skrubbe hovedet med saltvand øger elektro-følsomhed. Desuden proben er aftagelig eller designet til ikke at skade hjernen under anslaget. En alternativ måde er at bygge to spidser med samme længde; én tip belagt med silikonegummi, og den anden spids vil være metal, som vil væreanvendes som en probe tip. De to tips skal skiftes mellem positionering og dønninger.

Overvåg musens korte ubevidste symptomer umiddelbart efter en effekt. Som diskuteret ovenfor er de fleste post-hjernerystelse symptomer er vanskelige at iagttage straks i et laboratorium mus dyremodel. MTBI patienter kan opleve en kort tab af bevidsthed efter skaden. At etablere de synlige parametre skade, en kort tab af bevidsthed var et symptom anvendes til at vurdere gyldigheden af ​​denne concussive TBI model. Tab af bevidsthed (LOC) anvendes normalt som kriterier til at klassificere skaden sværhedsgraden i TBI patienter. I de fleste sports-relaterede hjernerystelse, varigheden af LOC er mindre end et minut ^14. Ved at optimere de eksperimentelle betingelser, såsom hastighed, og opholdstiden, LOC er mindre end 10 sek efter et sammenstød. Den optimale tilstand effekt er et 4 mm indvirkning dybde, 240 ms dvæle tid, og 4 m / s indvirkning hastighed. Øget hastighed, og dvæletid kan forårsage akut øget intrakranielt tryk over en stor mængde tid, hvilket kan resultere i alvorlig hjerneskade eller død straks fra respirationsdepression. Mus vil tabe kropsvægt efter hvert stød, men vil genvinde vægt efter 72 timer for inddrivelse. 72 timers gentagne intervaller er valgt for at efterligne en tilbagebetalingsperioden for tilskadekomne atleter før han vendte tilbage til deres sport.

Udover tab af bevidsthed og respiratoriske problemer, kan klinikken symptomer på en hjernerystelse omfatter kramper, hovedpine, svimmelhed, kvalme og opkastning. I model, kan hjerne smerte være de fleste ubehagelig symptom til dyrene. Huld og smerte kategori beskrivelse bør anvendes som humane endepunkter. Desuden bør andre specifikke neurologiske endepunkter såsom ukontrolleret beslaglæggelse, spontan kredser adfærd, tab af balance og ude af stand til at gå eller stå betragtes som rCHI-specifikke humane endepunkter. Da dette er en mild skade model, der normalt ingen signisentlige tegn på smerte overholdes indlæg hvert stød. Analgetika er typisk unødvendigt på dette niveau af hjerneskade. Denne protokol indeholder detaljerede vigtige trin til modellering en gentagen concussive mild TBI. Hastigheden og dybden af ​​de enkelte virkninger kan justeres afhængigt af den ønskede sværhedsgraden af ​​skade. Denne model bruger et elektronisk magnet effekt systemet til at levere påvirkninger. Det er stabilt med en præcist styret hastighed, opholdstid, og deformation dybde. Men fordi det er en lukket hovedlæsion uden en kraniotomi, er det umuligt at præcist at placere musen hjernen indvirkning hjælp stereotaksiske koordinater. Også omskiftning af indvirkningen / probespidser kan resultere i en indvirkning websted skift, som er den største årsag til inkonsekvente skader. I betragtning af den diffuse skade og hjernerystelse viste sig som forventet, denne model er stadig præcis og let at kontrollere.

Denne model er en fordel at bruge for dets nøjagtighed og enkelhed i bestemmelse af virkningerne af virkningen-relaterede mild hjerneskade, især sports-relaterede hjernerystelse. Det tjener som en platform for prækliniske studier som udforske diagnostiske og prognostiske biomarkører samt test af medicinsk udstyr, lægemidler og genterapi løsning. Denne model kan også bruges til studier af kronisk traumatisk encephalopati (CTE), som i øjeblikket kun diagnosticeres via post-mortem neuropatologiske eksamen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
anesthesia machine	Eagle Eye Anesthesia, Inc	Model 150	anesthesia
Electromagnetic Impactor	LeicaBiosystems	Impact One Stereotaxic Impactor	perform impaction
Digital Stereotaxic instrument	LeicaBiosystems	39462501	mount mouse and positioning tips
Sicilone rubber-coated metal tip	Precision Tool & Engineering, Gainesvill FL	custom-made	impact tip
Lithium Ion All-in-One Trimmer	WAHL Home Products	9854-600	shave mouse hair
paper clips	custom-made		probe tip
Cotton tipped applicators	MEDLINE	MDS202055	scrub head with saline
Tissue Tek O.C.T.	ASKURA FINETEK USA INC	4583	tissue embedding
anti-GFAP	Dako	CA93013	antibody for IHC
anti Ferritin	Sigma	F6136	antibody for IHC
VECTASTAIN Elite ABC  kit	Vector laboratories	PK-6100	IHC detection system
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-100
Aperio XT ScanScope scanner	Leica Microsystems Inc,		slides scanning
Leica AutoStainer XL	Leica the pathology Company	ST2010	H&E staining
DAB	sigma	D3939	IHC detection system