マウスにおける反復震とう頭部損傷モデル

Introduction

脳震盪は、とも呼ばれる軽度の外傷性脳損傷（MTBI）、外傷性脳損傷（TBI）の中で最も頻繁に発生であり、米国で何百万人もの人々に影響を与えます。脳震盪は、診断するのが難しいことができ、脳震盪のための具体的な治療法はありません。成長している認識とスポーツ傷害、戦闘、および他の物理的に魅力的な追求に起因する軽度の機械的外傷が累積し、慢性神経結果^1,2を有していてもよいことを、いくつかの証拠があります。しかし、脳震盪とその効果に関する知識の欠如が依然として存在します。唯一の神経学的評価とイメージング評価は臨床診断のために利用可能であるため、現在の方法論は、ヒトの病態と治療の研究を制限します。動物モデルは、MTBIのさらなる診断と治療の希望を持って、効率的で厳格な、かつ制御された方法で脳震盪を研究するための手段を提供します。

研究は、伝統的なTBIを適応していますこのような制御皮質衝撃（CCI）、流体パーカッションのインパクト（FPI）のようなモデルは、重量MTBIを実行し、けがのパラメータを変更することにより、低損傷の重大度を刺激するために、損傷、およびブラスト傷害をドロップします。これらのモデルは、原因の臨床症状と形態学的に類似した脳外傷を複製する能力を使用することは有益です。しかしながら、それらはまた、独自の制限を有します。加速損傷（重量の低下）によって誘発される損傷の重症度は、多くの場合、非常に可変です。軽度のCCIの二つの結果 - くも膜下出血と焦点挫傷は - 典型的な人間の脳震盪と比較することはできません。爆風損傷が異なる露光位置とピーク圧力測定だけでなく、露出^3-6中の変数二次的損傷に関して、より論争のモデルでありながら、CCIとFPIは、臨床的に関連していない開頭術を必要として_います。更新震とう動物モデルをそれは、臨床セッティに前臨床研究を翻訳することができますngが研究に必要です。

軽度のTBIのモデル化における重要な問題は、最も密接に臨床設定で怪我を複製する実験的な傷害の重症度を、定義することです。最近、別の研究グループは、閉鎖性頭部外傷または震盪頭部外傷（CHI）モデル^7-10を開発^しました。 CHIは開頭せずにCCIの変形であるが、それはまだ頭部衝撃を生成するために、従来の電子、磁気インパクト方式を使用しています。 CHIはインパクトパラメータを調整することによって、軽度から中等度の範囲で脳震盪を誘導することができます。意識消失（LOC）は、すぐに呼吸速度または呼吸の一時的停止の減少を検出することにより、衝撃後に観察することができます。 LOCの期間は、損傷の重症度を決定するために使用されます。本稿では、詳細なステップバイステップのプロトコルおよび代表的な結果と一緒に、マウスにおける反復CHI（rCHI）モデルのわずかに改善および更新されたバージョンが含まれています。 rCHIモデルの研究戦略のA脳震盪誘発性の病理学的変化の全てを模倣することのできるいかなる個々の動物モデルが存在しない、特に以来、MTBIの効果と潜在的な治療法を決定する上で有益な再。

Protocol

すべての手順は、フロリダ大学の施設内動物管理使用委員会によって、および実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所に従って承認されたプロトコル番号201207692下で行いました。

1.動物ケア

1. 3-4ヶ月齢の雄のC57BL / 6Jマウスを使用してください。寝具、ネスティング材料、食品、および水を自由に提供します。一定の12時間明/ 12時間暗サイクルで22°C - 20で制御された周囲温度にマウスを保管してください。

2.事前衝突準備

1. 電磁定位インパクトデバイスにカスタムメイドのシリコーンゴムでコーティングされた金属チップを取り付けます。先端の平坦な底部は、プローブ先端（ 図1A）の表面に平行であることを確認してください。
2. 2.5％イソフルランの維持麻酔に続いて4％イソフルランでマウスを麻酔。流量計を介して麻酔を確認してください。 Monito動物がペダル撤退反射の消失を示すことによって、麻酔の外科的なレベルに達するまで、麻酔レベルrを。
3. 加熱パッド上の腹臥位でマウスを置きます。麻酔下でマウスを維持するために漏斗状のノーズコーンを使用してください。完全にトリマーを使用して頭を剃ります。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、マウスの目にワセリン眼軟膏を使用してください。

3.インパクトパラメータ設定

注：影響システムは、衝撃パラメータを設定するための制御ボックス、衝突を実行するためのアクチュエータ、及び3の移動軸を有するデジタル定位フレームを含みます。

1. 4メートル/秒の衝撃装置の速度を事前に設定し、コントロールボックスに240ミリ秒に滞留時間。

4.ポジショニングインパクトセンター

1. 39℃付近で体温を維持するために、動物の体の下に柔らかい加熱パッドを置きます。 PRONに定位フレームにマウスをマウント平滑末端耳バー付きの電子の位置。
2. Z-ドライバを移動することで、マウスの頭部に近い衝撃先端を下げます。ターゲットは矢状縫合の上座標に途中でX軸とYドライバを移動させることにより、フラットなインパクトチップ（直径9mm）を調整します。
3. 衝撃先端の1辺が上下に2耳（ 図 1C）の間に引かれた仮想の水平線に平行であることを確認してください。インパクトの中心はinterfrontalとラムダ状縫合（0ミリメートル、横4.5ミリメートルを耳にする耳9ミリメートル）の間の中央矢状縫合の中間に相当します。

5.インパクトの深さの設定

1. 正しくインパクトの深さを設定するには、絶縁されたシリコーンゴムでコーティングされたインパクトチップを交換するために、追加のプローブ・チップを使用しています。
2. ヒントを切り替えた後の衝撃中心のないシフトがないことを確認するために、ヒントを切り替える前にゼロにデジタル定位コントロールパネルにXとYのチャンネルを設定します。
3. PROBを移動手動でX-とY-ドライブを移動することにより、インパクトエリアの中心に電子チップ。
4. マウスの尾のクリップ接触センサ。
5. プローブ先端が衝突部位の表面に触れるまでインパクタ（Zドライブ）を下に移動します。
6. ゼロに定位コントロールパネルのZチャンネルを設定します。
7. 手動でX軸とYドライバまで、X軸とYドライバ（NOTデジタル定位コントロールパネル上のゼロボタン）を調整することにより、バックインパクトエリアへの衝撃先端を移動（衝撃先端が以前に配置された）はゼロです。
8. コントロールボックスに後退スイッチを動かすことによって、アクチュエータを撤回。手動で4ミリメートルによって（Zドライバ）インパクターを下に移動。

6.影響

1. コントロールボックスへの影響スイッチをクリックすることで、衝撃をトリガし、4ミリメートルの変形の深さを実現。

7.ポストインパク

1. タイマーを使用して、マウスの最初の呼吸までの衝撃からの時間を測定します。
2. きれいなケージに戻って動物を返す前に、リカバリを可能にします。完全に回復するまで、他の動物の会社に動物を返しません。
3. 毎日マウスを観察し、重量を量ります。マウスは、痛みの兆候を示した場合は、腹腔内に1でメロキシカムでそれらを注入 - 24時間 - 2ミリグラム/毎12 kgです。

8.繰り返しインパク

1. 日4、7日にマウスを追加傷害を与え、最初の損傷（インパクトの間に72時間間隔）後の10。

9.免疫組織化学（IHC）

1. Transcardial灌流
   1. 200メートル/ kgのペントバルビタールで腹腔内注射によりマウスを麻酔。
   2. 評価し、つま先のピンチによって外科的平面麻酔を確保します。秒URE優しく化学ヒュームフードの内側に発泡スチロールの作業面に前足と後足をテーピングすることにより、仰臥位でマウス。
   3. ちょうど鎖骨の剣状突起下から胸部正中線に沿って皮膚を通して切開を行います。剣状突起の2つの追加の皮膚切開を行い、横方向に腹側胸郭のベースに沿って進みます。
   4. 胸腔を開き、胸部の筋肉や肋骨を切断することにより、心臓を露出。
   5. 鈍鉗子で鼓動している心臓を固定し、1作る - 左心室中2ミリメートルの切開を。
   6. すぐに右心房に翼状針を挿入します。ゆっくりとシリンジを押して20ミリリットルの生理食塩水の注入を開始します。
   7. 生理食塩水から4％パラホルムアルデヒドに切り替えます。パラホルムアルデヒドの20ミリリットルで灌流を続けます。
   8. マウスを刎ねるとハサミで皮膚を取り除きます。骨カッターを使用して、頭蓋骨から脳を分離します。
2. C言語切片ryostat
   1. -80℃における最適切断温度（OCT）製剤、凍結中の埋め込み脳組織。矢状方向にクライオスタットに脳を置きます。カット脳切片厚さ5μm。
3. 染色
   1. 室温で1時間凍結切片を乾燥させます。
   2. 室温で1時間、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の2％ヤギ血清および0.1％トリトンX-100100μlでスライドをインキュベートします。
   3. 300μlのPBSでスライドを3回洗浄。 4℃で別々に一晩：（200 1）または抗フェリチン抗体：その後、抗GFAP（200 1）でスライドをインキュベートします。
   4. 300μlのPBSでスライドを3回洗浄。その後、ビオチン結合二次抗体とともに室温で2時間、スライドをインキュベートします。
   5. 300μlのPBSでスライドを3回洗浄。その後、室温で30分間アビジン - ビオチン複合体（ABC）溶液（午前1時50分）でスライドをインキュベートします。
   6. 300μlのPBSでスライドを3回洗浄。 8分-そして5用の3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）基質溶液（50ミリリットルPBS、10μlのH ₂ O _2、10ミリグラムのDABピル、使用する前に、フィルタ）でインキュベートします。陽性細胞が現れるまで顕微鏡下でスライドを観察します。
   7. 5分間の実行速度の遅いスライドを水道水ですすぎます。ラボ・ワイプできれいにスライドします。その後、封入剤とカバーガラスとのセクションをマウントします。

Representative Results

このモデル（ 図1 AC）では、あえぎ呼吸や浅い呼吸の短い期間ではありました。意識（無意識）の損失は、呼吸速度または正常な呼吸を再開する前に、呼吸の一時的停止の減少として定義されます。頭の中心への影響は短期的無意識（個別インパクト時の7.5±4.7、7.8±5.5、10.2±8.8、9.5±8.0秒、 図1D）が発生しました。マウスの脳には明らかな構造的病変または衝撃（ 図2A）に起因する組織損傷を示さなかっれ、H＆E組織学的染色によって正常な形態を示しました。 TBIに応答して、星状細胞、活性化、増殖、または反応性グリオーシス^11,12を含む特定の変化を受けることが知られています。大きな細胞体と厚いシナプスと増加グリア線維酸性タンパク質（GFAP）陽性細胞は活性化星状細胞です。 corpurCHIマウスの脳からの脳梁は、最後の影響（ 図2B）後7日目にアストロサイト活性化の明らかな兆候を示しました。

組織内MicrobleedsはMTBIに一般的であり、ヘモグロビン¹³からの鉄の放出につながる可能性があります。血清中の鉄過剰は、臨床設定¹³でフェリチン試験によって検出することができます。マウスの大脳皮質におけるフェリチン免疫陽性細胞は、1日の最後のインパクト後に発見された、複数のimpactionsは皮質microbleeds（ 図2C）につながる可能性があることを示唆し、少なくとも7日間続きました。

図1.繰り返し震とう頭部外傷のAマウスモデル 。 （A）プローブ先端と、直径9ミリメートルを測定するカスタムメイドの厚さ1mmのシリコーンゴムでコーティングされたチップ。（B）マウスをm本体の下に柔らかい加熱パッドで発生しやすい位置に定位フレームにounted。（C）インパクト中心の位置。衝撃先端のエッジは、両耳の間に引かれた想像上の水平線と垂直方向に平行です。インパクトの中心は（0ミリメートル、横4.5ミリメートルを耳する耳9ミリメートル）interfrontalとラムダ状縫合糸の中間に相当する。（D）無呼吸は、呼吸の一時的停止の短い期間として定義されています。平均およびSDが下のパネルに示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2.組織学繰り返し震とう頭部外傷のために。 （A、左）は 、マウスの脳を4％パラホルムアルデヒドで灌流した後に除去しました。いいえ組織の損傷は見られませんでした。 （B）の増加。スケールバー=200μmである。免疫組織化学により、（C）、フェリチンH鎖は、損傷後の脳皮質において発現されることが見出されました。挿入写真は拡大陽性細胞を表します。スケールバー=200μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

臨床症状と形態学的に類似した脳損傷を模倣するために、ポスト脳震盪の症状が期待されています。ポスト脳震盪の症状は、一般的に頭痛、めまい、めまい、疲労感、メモリや睡眠の問題、トラブル集中だけでなく、不安、および抑うつ気分が含まれます。身体症状はまだ動物モデルにおいて測定可能ではないかもしれないので、運動および認知機能および感情行動の変化は、合理的に、動物モデルにおいて脳震盪を評価するための基準として使用されます。以前報告された研究では、rCHIマウスモデルは、空間学習、記憶、不安⁸の欠損を誘導することが示されました。より重要なことに、このプロトコルで使用されるrCHIモデルは、浸潤性脳損傷または脳構造破壊することなく臨床的設定を表し、出血、出血、浮腫、または急性細胞死/組織の損失をもたらす可能性が両方とも。

以下に成功一貫したconcussioをモデル化するための重要なヒントを紹介します電子マグネット影響システムを用いてN / MTBI。

直接衝突時の動きによって引き起こされる可能性が最初に脳損傷に続く第2の脳損傷を避けます。マウスヘッドがインパクト時にわずかに下に移動することができます。ハード地面やストレッチヘッドに対する迅速な移動による脳挫傷を回避するために、柔らかい加熱パッドは、マウス本体の下に置かなければなりません。頭と体も水平に保たれなければなりません。また、定位フレームでマウスの頭部を固定するために平滑末端の耳バーを使用し、外耳道の内側にそれらを挿入しないでください。これは、移動中の鋭い端部によって引き起こされる損傷からマウスを保護します。

正しくインパクトセンターを配置し、ゼロを確立します。オープン頭部外傷とは異なり、衝撃先端の位置は比較的困難です。インパクトチップの大きさと衝撃センターは、傷害の重症度および病変に影響を与えます。マウスの脳の解剖学に基づいて、衝撃の中心は途中に対応するように設計されていますinterfrontalとラムダ状縫合（0ミリメートル、横4.5ミリメートルを耳にする耳9ミリメートル）の間。従って、最適化の9mmチップが必要とされます。目標に調整されなければならない衝撃先端は矢状縫合の中間の上方調整し、インパクトチップの1辺は、上下に2耳（ 図1C）の間に引かれた仮想の水平線に平行にする必要があります。シリコーンゴムコーティングブロックと絶縁衝撃先端接触センサや衝撃の深さの設定を防止します。プローブ先端が必要とされ、衝撃先端のボ​​タンの表面に平行でなければなりません。衝撃の中心は定位器具を操作することにより、プローブ先端の接触部位に調整されます。生理食塩水でヘッドをスクラブすると、電気感受性を増加させます。また、プローブは、リムーバブルや衝撃時の脳を傷つけないように設計されています。別の方法は、同じ長さを持つ2つのヒントを構築することです。シリコーンゴムと他の先端でコーティングされた1チップがされる、金属だろうプローブ・チップとして使用します。 2つの先端は、位置決めと衝撃の間で切り替えなければなりません。

インパクト直後に、マウスの簡単な無意識の症状を監視します。上述したように、ほとんどのポスト脳震盪の症状は、実験用マウスの動物モデルにおいて即座に観察することが困難です。 MTBI患者は、損傷後の短時間の意識消失が発生することがあります。目に見える損傷パラメータを確立するために、短時間の意識消失は、この震とうTBIモデルの妥当性を評価するために使用する症状でした。意識（LOC）の損失は、通常、TBI患者における傷害の重症度を分類するための基準として使用されます。ほとんどのスポーツ関連脳震盪では、LOCの持続時間は、1分未満である^14。このような衝突速度および滞留時間などの実験条件を、最適化することにより、LOCは、インパクト後10秒未満です。最適な衝突条件を4mm衝撃深度、240ミリ秒の滞留時間、および4メートル/秒の衝撃速度です。衝突速度を増加し、住みます時間は、呼吸抑制からすぐに深刻な脳損傷または死に至ることが多くの時間にわたって急性頭蓋内圧上昇を引き起こす可能性があります。マウスは、各衝突の後に体重を失うことになるが、回復の72時間後の重量を取り戻すだろう。 72時間の繰り返し間隔は、彼らのスポーツに戻る前に、負傷した選手の回復期間を模倣するように選択されます。

意識と呼吸の問題の損失のほかに、脳震盪の臨床症状は、痙攣、頭痛、めまい、吐き気、嘔吐を含めることができます。モデルでは、脳の痛みは、動物への大半不快な症状であってもよいです。ボディコンディションスコアと痛みカテゴリの説明は、人道的エンドポイントとして使用されるべきです。また、このような制御不能な発作、自発的な旋回挙動、バランスの喪失と歩いたり、立つことができないなど、他の特定の神経学的エンドポイントはrCHI固有の人道的エンドポイントとして考慮されるべきです。これは、軽度の損傷モデルは、通常、何signiないので痛みのficant兆候はポストにそれぞれ影響を観察しています。鎮痛剤は、典型的には、脳損傷のこのレベルでは不要です。このプロトコルは、反復的な震とう軽度のTBIをモデル化するための詳細な重要なステップを提供します。各衝撃の速度および深さは、損傷の所望の重症度に応じて調整することができます。このモデルは、影響を配信するために電子磁石衝撃システムを使用しています。それは正確に制御された速度、滞留時間、および変形の深さで安定しています。それは開頭せずに閉鎖性頭部外傷であるためしかし、正確に定位座標を使用してマウス脳への影響を配置することは不可能です。また、衝撃/プローブ先端を切り替えると、一貫性のない傷害の主な原因である衝突場所のシフトをもたらすことがあります。びまん性傷害と脳震盪を考慮すると予想されるように、このモデルは正確で制御しやすいままで判明しました。

このモデルは、衝撃の影響を決定する際に、その正確さと単純化のために使用することが有益です関連の軽度の脳損傷、特にスポーツ関連脳震盪。このような診断および予後バイオマーカーを探索するだけでなく、医療機器、医薬品及び遺伝子治療ソリューションのテストとして前臨床試験のためのプラットフォームとして機能します。このモデルは、現在、死後の神経病理学的検査によってのみ診断可能であり、慢性外傷性脳症（CTE）の研究のために使用することができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
anesthesia machine	Eagle Eye Anesthesia, Inc	Model 150	anesthesia
Electromagnetic Impactor	LeicaBiosystems	Impact One Stereotaxic Impactor	perform impaction
Digital Stereotaxic instrument	LeicaBiosystems	39462501	mount mouse and positioning tips
Sicilone rubber-coated metal tip	Precision Tool & Engineering, Gainesvill FL	custom-made	impact tip
Lithium Ion All-in-One Trimmer	WAHL Home Products	9854-600	shave mouse hair
paper clips	custom-made		probe tip
Cotton tipped applicators	MEDLINE	MDS202055	scrub head with saline
Tissue Tek O.C.T.	ASKURA FINETEK USA INC	4583	tissue embedding
anti-GFAP	Dako	CA93013	antibody for IHC
anti Ferritin	Sigma	F6136	antibody for IHC
VECTASTAIN Elite ABC  kit	Vector laboratories	PK-6100	IHC detection system
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-100
Aperio XT ScanScope scanner	Leica Microsystems Inc,		slides scanning
Leica AutoStainer XL	Leica the pathology Company	ST2010	H&E staining
DAB	sigma	D3939	IHC detection system