Introduction
뇌진탕은라고도 가벼운 외상성 뇌 손상 (mTBI), 외상성 뇌 손상 (TBI)의 가장 흔한 발생하고 미국에서 수백만의 사람에 영향을 미친다. 뇌진탕 진단하는 까다로운 일이 될 수 있으며, 충격에 대한 특별한 치료법은 없습니다. 성장 인식 및 스포츠 부상, 군사 전투 및 기타 물리적으로 결합 추구로 인한 경미한 기계적 외상 누적 만성 신경 학적 결과 1, 2를 가질 수 있다는 몇 가지 증거가있다. 그러나, 여전히 뇌진탕과 그 효과에 대한 지식의 부족입니다. 만 신경 학적 평가 및 이미징 평가는 임상 진단에 사용할 수 있기 때문에 현재 방법론은 인간의 병리와 치료의 연구를 제한합니다. 동물 모델은 추가 진단 및 mTBI의 치료의 희망 효율적이고 엄격하고 통제 된 방식으로 뇌진탕을 연구 할 수있는 수단을 제공한다.
연구는 기존의 TBI 적응이러한 제어 대뇌 피질의 영향 (CCI)와 같은 모델은 유체 타악기에 미치는 영향 (FPI), 체중 감소 부상 및 폭발 부상 mTBI을 수행하고 부상 매개 변수를 변경하여 낮은 부상의 심각도를 자극합니다. 이 모델 인해 임상 상태에 형태 학적으로 유사한 뇌 외상을 복제 할 수있는 능력을 사용하는 것이 유리하다; 그러나, 그들은 또한 그들 자신의 한계를 가지고있다. 가속 부상 (체중 감소)에 의해 유도 부상의 심각도는 종종 매우 가변적이다. 온화한 CCI의 두 가지 결과 - 지주막 하 출혈 및 초점 타박상은 - 전형적인 인간의 뇌진탕과 비교할 수 없습니다. 폭발 부상이 노출 3-6 동안 서로 다른 노출 위치 및 피크 압력 측정에 관해서 논쟁 모델뿐만 아니라 변수 보조 부상 상태에서 CCI와 FPI는 임상 적으로 관련없는 개두술을 필요로합니다. 업데이트 진탕 동물 모델을 즉, 임상 setti에 전임상 연구를 번역 할 수 있습니다NG 연구에 필요하다.
가벼운 TBI 모델링의 핵심 문제는 가장 밀접하게 임상 설정에서 부상을 복제 실험 부상의 심각도를 정의하는 것입니다. 최근 다른 연구 그룹은 폐쇄 머리 부상 또는 진탕 머리 부상 (CHI) 모델 7-10을 개발했다. CHI는 개두술없이 CCI의 변형이지만, 여전히 두부 충돌을 생성하는 기존의 전자파 영향 시스템을 사용한다. 카이는 효과 매개 변수를 조정하여 중간에 온화한에 이르기까지 뇌진탕을 유도 할 수 있습니다. 의식 (LOC)의 손실은 호흡 속도 또는 호흡 과도 종단의 감소를 검출함으로써 충격 후 즉시 관찰 될 수있다. LOC의 기간은 상처의 정도를 결정하는 데 사용된다. 본 논문은 자세한 단계별 프로토콜과 대표적인 결과와 함께 마우스의 반복적 인 CHI (rCHI) 모델의 약간 개선 및 업데이트 된 버전이 포함되어 있습니다. rCHI 모델 연구 전략 a를뇌진탕에 의한 병리학 적 변화를 모두 모방 할 수없는 각각의 동물 모델이 없습니다 특히 때문에, mTBI 효과와 잠재적 인 치료를 결정하는데 도움이 다시.
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Protocol
모든 절차는 플로리다 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라 승인 된 프로토콜 번호 201207692에서 수행 하였다.
1. 동물 관리
- 3-4 개월 된 수컷 C57BL / 6J 마우스를 사용합니다. 침구, 중첩 재료, 음식과 임의 량의 물을 제공한다. 일정 12 시간 빛 / 12 시간 다크 사이클 22 ° C - 20 제어 주위 온도에 마우스를 유지합니다.
2. 사전 매복 준비
- 전자 정위 충격 장치에 맞춤형 실리콘 고무 코팅 금속 끝을 연결합니다. 팁의 평평한 바닥이 프로브 팁 (그림 1A)의 표면에 평행해야합니다.
- 2.5 %의 이소 플루 란의 유지 보수 마취 다음에 4 % 이소 플루 란과 마우스를 마취. 유량계를 통해 마취를 확인합니다. 과정 제어R 동물까지 마취 수준은 페달 철수 반사의 손실을 보여줌으로써 마취의 수술 수준에 도달.
- 가열 패드에 발생하기 쉬운 위치에 마우스를 놓습니다. 마취 마우스를 유지하기 위해 깔때기 모양의 코 콘을 사용합니다. 완전히 트리머를 사용하여 머리를 면도. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 바셀린 안과 연고를 사용합니다.
3. 충격 매개 변수 설정
주 : 충격 시스템은 충격 파라미터를 설정하는 제어 박스의 박힘을 수행하기위한 액츄에이터, 및 3 운동 축을 디지털 정위 프레임을 포함한다.
- 4m / 초 충격 장치의 속도를 미리 설정하고 제어 박스에 240 msec의 시간 드웰.
4. 위치 충격 센터
- 39 ° C 부근의 체온을 유지하기 위해 동물의 신체에 따라 소프트 가열 패드를 넣는다. 포르노에 정위 프레임에 마우스를 장착무딘 엔드 귀 막대 전자 위치입니다.
- Z 축 드라이버를 이동하여 마우스의 머리에 가까운 충격 팁을 낮 춥니 다. 대상 시상 봉합 위 좌표의 중간 X- 및 Y 드라이버를 이동시켜 평면 영향 팁 (9 mm 직경)을 조정한다.
- 상하 두 귀 (도 1C) 사이에 그려진 가상 수평선에 평행 한 충돌 팁 확실히 한쪽 가장자리를 만든다. 충격의 중심 (0 mm, 측면 4.5 mm를 간가에 간가 9mm) interfrontal과 lambdoid 봉합 사이의 중앙 시상 봉합의 중간에 해당한다.
5. 충격 깊이 설정
- 정확하게 타격 깊이를 설정하기 위해, 절연 된 실리콘 고무 코팅 충격 팁을 교체 추가 탐침을 사용한다.
- 팁을 전환하기 전에 제로로 디지털 정위 제어판의 X와 Y의 채널을 설정 전환 팁 후 충격의 중심에는 변화가 없다 확인하십시오.
- PROB 이동수동 X 및 Y 축 모터를 이동하여 충격 영역의 중심에 예를 팁.
- 마우스의 꼬리에 클립 접촉 센서.
- 프로브 팁의 충격 부위의 표면에 닿을 때까지 임팩터 (Z 드라이브)를 이동.
- 제로로 정위 제어판의 Z 채널을 설정합니다.
- 수동 X- 및 Y 드라이버까지 X 및 Y 드라이버 (NOT 디지털 정위 조작부 제로 버튼)을 조정하여 다시 충돌 면적에 영향 팁을 이동 (충격 팁 나란히 배치 된)는 0이다.
- 제어 박스에 인입 스위치를 이동시킴으로써, 액추에이터 후퇴. 수동 4mm에 의해 아래로 임팩터 (Z 드라이버)를 이동합니다.
6. 영향
- 컨트롤 박스에 대한 영향 스위치를 눌러 영향을 트리거 4mm의 변형 깊이를 달성한다.
7. 후 매복
- 마우스의 첫 호흡 타이머를 사용하여 충격까지의 시간을 측정한다.
- 깨끗한 케이지로 다시 동물을 반환하기 전에 복구 할 수 있습니다. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 동물을 반환하지 않습니다.
- 관찰하고 매일 쥐를 무게. 쥐가 고통의 흔적이 보일 경우, 복강 1 멜 록시 캄로 주입 - 24 시간 - 2 밀리그램 / 각 12 kg이다.
8. 반복 매복
- 일 4, 7 쥐에게 추가 부상을주고, 초기 손상 (충격 사이에 72 시간 간격) 이후 10.
9. 면역 조직 화학 (IHC)
- Transcardial 관류
- 200m / kg 펜토 바르 비탈로 복강 내 주사를 통해 마우스를 마취.
- 평가 및 발가락 핀치에 의해 수술 평면 마취를 확신합니다. 비서URE 부드럽게 화학 물질 흄 후드 내부에 스티로폼 작업 표면에 앞발과 뒷발을 테이핑으로 누운 자세에서 마우스.
- 다만 쇄골에 칼 모양의 과정을 아래에서 흉부 중간 선을 따라 피부를 통해 절개를합니다. 칼 모양의 과정에서 두 개의 추가 피부 절개를 확인하고 옆으로 복부 흉곽의 기본을 따라 진행합니다.
- 흉강을 열고 흉부 근육과 흉곽을 절단하여 심장을 노출.
- 무딘 집게로 뛰는 심장을 보호하고는 1 - 좌심실에서 2mm 절개를.
- 즉시 우심방에 나비 바늘을 삽입합니다. 천천히 주사기를 밀어 20ml의 식염수의 주입을 시작합니다.
- 식염수에서 4 % 파라 포름 알데히드로 전환합니다. 파라 포름 알데히드의 20 ㎖와 재관류를 계속합니다.
- 마우스를 목을 벨과 가위로 피부를 제거합니다. 뼈 커터를 이용하여 두개골로부터 뇌를 분리.
- 기음절편 ryostat
- -80 ° C에서 최적의 절삭 온도 OCT () 수립 및 동결에 포함 된 뇌 조직. 시상 방향으로 그라 이오 스탯의 뇌를 놓습니다. 잘라 뇌 섹션 5 μm의 두께.
- 더럽히는 것
- 실온에서 1 시간 동안 고정 된 부분을 건조.
- RT에서 1 시간 동안 인산염 완충 식염수 100 2 % 염소 혈청 μL, 0.1 % 트리톤 X-100 (PBS)로 슬라이드를 부화.
- PBS 300 μL와 슬라이드 3 회 반복한다. 4 ℃에서 별도로 하룻밤 : (200 일) 또는 항 페리틴 항체 : 다음 안티 GFAP (200 일)와 슬라이드를 품어.
- PBS 300 μL와 슬라이드 3 회 반복한다. 이어서 바이오틴 - 컨쥬 게이트 화 2 차 항체와 함께 실온에서 2 시간 동안 슬라이드를 배양한다.
- PBS 300 μL와 슬라이드 3 회 반복한다. 이어서 실온에서 30 분 동안 아비딘 - 바이오틴 복합체 (ABC) 용액 (1시 50분)로 슬라이드를 배양한다.
- PBS 300 μL와 슬라이드 3 회 반복한다. 8 분 - 그럼 3,3'- 디아 미노 벤지딘 5 (DAB) 기질 용액 (50 ㎖ PBS, 10 μL의 H 2 O 2, 10 mg을 DAB 알약, 사용하기 전에 필터)에 품어. 긍정적 인 세포가 나타날 때까지 현미경 슬라이드를 관찰한다.
- 5 분 동안 천천히 실행 수돗물에 슬라이드를 씻어. 실험실 닦아 청소 슬라이드. 그런 다음 설치 매체와 coverslip에와 섹션을 탑재합니다.
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Representative Results
이 모델 (그림 1 AC)에서, 모든게 완벽 할꺼야 얕은 호흡의 짧은 기간이 있었다. (의식) 의식의 손실은 호흡 속도 또는 정상적인 호흡을 다시 시작하기 전에 호흡의 일시적인 중단의 감소로 정의된다. 머리의 중심에 미치는 영향은 단기 무의식의 원인 (7.5 ± 4.7, ± 5.5, 7.8, ± 8.8 10.2, 개별적으로 각각의 영향에서 9.5 ± 8.0 초, 그림 1D). 마우스의 뇌에 미치는 영향 (그림 2A)로 인한 명백한 구조적 병변 또는 조직 손상이 표시되지 H & E 조직 학적 염색에 의해 정상적인 형태를 보여 주었다. TBI에 대한 응답으로, 성상 세포는 활성화, 증식, 또는 반응성 신경교 증 (11, 12)를 포함하여 어떤 변화를 겪을 것으로 알려져있다. 대 세포 기관 및 두께 시냅스와 증가 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP) 양성 세포는 활성화 된 성상 세포이다. corpurCHI 마우스 뇌에서의의의 callosum은 지난 미치는 영향 (그림 2B) 후 7 일에서 성상 세포 활성화의 명백한 징후를 보였다.
조직에서 Microbleeds는 mTBI에서 흔히 헤모글로빈 (13)에서 철의 릴리스로 이어질 수 있습니다. 혈청 철 과부하 임상 13 페리틴 시험에 의해 검출 될 수있다. 마우스 피질의 페리틴 면역 양성 세포는 마지막에 미치는 영향 후 일일 발견하고 여러 impactions는 대뇌 피질의 microbleeds (그림 2C)이 발생할 수 있음을 시사 적어도 칠일 지속되었다.
그림 1. 반복적 인 충격 포 머리 부상의 마우스 모델입니다. (A)는 프로브 팁과 직경 9mm 측정 주문품 1mm 두께의 실리콘 고무 코팅 된 팁. (B)는 마우스이다 m몸에서 부드러운 가열 패드와 함께 발생하기 쉬운 위치에 정위 프레임에 ounted. (C) 충격 센터 위치. 충격 선단의 에지가 두 귀 사이에 그려진 가상 수평선에 수직으로 평행하다. 충격 센터 (0 mm, 측면 4.5 mm를 간가에 간가 9mm) interfrontal 및 lambdoid 봉합 사이의 중간에 해당한다. (D) 무호흡은 호흡의 일시적인 중단의 짧은 기간으로 정의된다. 평균과 SD 하부 패널에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 조직학 반복적 인 충격 포 머리 부상합니다. (A, 왼쪽)가 마우스의 뇌는 4 % 파라 포름 알데히드와 관류 후 제거 하였다. 어떤 조직 손상은 발견되지 않았다.
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Discussion
임상 상태에 형태 학적으로 유사한 뇌 손상을 모방하기 위해 사후 뇌진탕 증상이 예상된다. 포스트 뇌진탕의 증상은 일반적으로 두통, 현기증, 현기증, 피로, 기억과 수면 문제, 문제가 집중뿐만 아니라 불안하고 우울한 기분을 포함한다. 신체 증상이 아직 동물 모델에서 측정되지 않을 수 있기 때문에, 모터 및인지 기능, 정서적 행동의 변화는 합리적으로 동물 모델에서 뇌진탕을 평가하기위한 기준으로 사용된다. 이전에보고 된 연구에서, 그것은 rCHI 마우스 모델은 공간 학습, 기억, 불안 8 결핍을 유도 것으로 나타났다. 더 중요한 것은,이 프로토콜에 사용되는 rCHI 모델은 침습적 인 뇌 손상이나 출혈, 출혈, 부종, 또는 급성 세포 죽음 / 조직 손실이 발생할 수 있습니다 둘 다 뇌 구조의 파괴없이 임상 적 설정을 나타냅니다.
다음 성공적으로 일관 concussio 모델링을위한 핵심 팁입니다N 전자 자석 영향 시스템을 사용 / mTBI :
직접 영향 동안 움직임으로 인해 발생할 수 있습니다 첫 번째 뇌 손상 다음 두 번째 뇌 손상을 피하십시오. 마우스 머리는 약간 아래로 영향 동안 이동할 수 있습니다. 하드 지상 또는 스트레칭 머리에 대한 빠른 움직임에 의한 뇌 타박상을 방지하기 위해 부드러운 가열 패드는 마우스 본체 아래에 넣어해야합니다. 머리와 몸은 수평 유지해야합니다. 또한, 정위 프레임에 마우스 머리를 해결하기 위해 무딘 엔드 귀 막대를 사용하고, 외이도 안쪽을 삽입하지 않습니다. 이 운동 중에 날카로운 단부로 인한 손상으로부터 마우스를 보호한다.
올바르게 충격 센터를 놓고 영점을 설정합니다. 오픈 두부 손상과 달리 충격 선단 위치가 상대적으로 어렵다. 충격 팁과 타격 중심의 크기가 손상 정도와 병변에 영향을 미친다. 마우스 뇌의 해부학 적 구조에 기초하여, 타격 중심의 중간에 대응하도록 설계interfrontal 및 lambdoid 봉합 사이 (간가 9mm 0 mm, 측면 4.5 mm를 간가합니다). 따라서, 최적화 된 9mm 팁이 필요합니다. 목표 조정해야 충격 팁 시상 봉합 중간 위 좌표 및 충격 팁의 하나의 에지는 수직으로 두 귀 (도 1C) 사이에 그려진 가상 수평선에 평행해야한다. 절연 충격 실리콘 고무 코팅 블록 끝의 접촉 센서가 충격 깊이 설정을 방지한다. 탐침이 필요하고, 충격 팁 버튼의 표면과 평행해야한다. 충격의 중심은 정위 기기를 조작함으로써 프로브 팁 접촉 사이트로 조정된다. 식염수로 머리를 세정하는 전기 감도를 증가시킨다. 또한, 프로브를 탈착 또는 충격시 뇌 해치지 않도록 설계된다. 대안적인 방법은 동일한 길이를 갖는 두 개의 팁을 구축하는 것; 실리콘 고무 및 다른 팁으로 코팅 된 하나의 팁은 될 것이다, 금속 것탐침으로 사용 하였다. 두 팁은 위치 및 충격을 가하는 사이에서 전환해야합니다.
충격 후 즉시 마우스의 간단한 의식이 증상을 모니터링합니다. 상술 한 바와 같이, 대부분의 뇌진탕 후 증상 실험실 마우스 동물 모델에서 즉시 관찰하기 어렵다. mTBI 환자들은 손상 후 의식에 대한 간단한 손실이 발생할 수 있습니다. 가시 부상 파라미터를 설정하기 위해 의식의 짧은 손실이 진탕 TBI 모델의 타당성을 평가하는 데 이용되는 현상이다. 의식 (LOC)의 손실은 일반적으로 TBI 환자의 손상 정도를 분류하는 기준으로 사용된다. 대부분의 스포츠 관련 진탕에서 LOC의 지속 시간은 1 분 미만 14이다. 이러한 충돌 속도 및 체류 시간 등의 실험 조건을 최적화함으로써, LOC은 충격 후 10 초 미만이다. 최적의 충격 조건은 240 밀리 초는 드웰 시간, 4 밀리미터 영향을 깊이, 그리고 4m / s의 충돌 속도. 충돌 속도 증가와 거시간은 호흡 우울증 즉시 심각한 뇌 손상이나 사망을 초래할 수 많은 시간, 이상 급성 증가 두개 내압의 원인이 될 수 있습니다. 마우스는 각각의 영향 후 체중을 잃게되지만, 회복의 72 시간 후 체중을 되 찾을 것입니다. 72 시간 반복 간격은 스포츠로 돌아 가기 전에 부상 선수에 대한 복구 기간을 모방하기 위해 선택된다.
의식과 호흡 문제의 손실 옆에, 뇌진탕의 임상 증상은 경련, 두통, 현기증, 구역질과 구토를 포함 할 수 있습니다. 모델에서 뇌의 통증은 동물에 대부분의 불편한 증상이있을 수 있습니다. 신체 조건 점수와 통증 카테고리 설명 인도 엔드 포인트로 사용되어야한다. 또, 제어되지 않는 발작, 자연 선회 동작, 균형의 손실 걷거나 서 할 수없는 등의 특정 신경 엔드 포인트는 rCHI 특정 인간 엔드 포인트로 고려되어야한다. 이것은 약한 손상 모델은 일반적으로 더 유의 없으므로고통의 ficant 징후 후 각 미치는 영향을 관찰된다. 진통제는 뇌 손상이 수준에서 일반적으로 필요하지 않습니다. 이 프로토콜은 반복적 인 진탕 가벼운 TBI를 모델링에 대한 자세한 주요 단계를 제공합니다. 각 효과의 속도 및 깊이는 손상의 원하는 정도에 따라 조정될 수있다. 이 모델은 영향을 제공하는 전자식 충격 자석 시스템을 사용한다. 그것은 정밀하게 제어 속도, 드웰 시간, 변형 깊이 안정적입니다. 이 폐쇄 두부 손상은 개두술없이 때문에, 정확하게 정위 좌표를 이용하여 마우스의 뇌에 영향을 배치하는 것은 불가능하다. 또한 충격 / 프로브 팁을 전환하는 것은 일관성이 부상의 주요 원인이 영향 사이트 이동,이 발생할 수 있습니다. 확산 부상과 뇌진탕을 감안하면 예상대로,이 모델은 정밀하고 제어가 용이 남아 밝혀졌다.
이 모델은 충격의 효과를 결정하는 정확성과 편의상 사용 유용- 관련 가벼운 뇌 손상, 특히 스포츠 관련 뇌진탕. 그러한 진단 및 예후 바이오 마커를 탐색뿐만 아니라, 의료 장비, 약물 및 유전자 치료 용액을 테스트와 같은 임상 시험을위한 플랫폼으로 기능한다. 이 모델은 현재 사후 신경 병리학 적 검사를 통해서만 진단 가능한 만성 외상성 뇌병증 (CTE)의 연구에 사용할 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anesthesia machine | Eagle Eye Anesthesia, Inc | Model 150 | anesthesia |
| Electromagnetic Impactor | LeicaBiosystems | Impact One Stereotaxic Impactor | perform impaction |
| Digital Stereotaxic instrument | LeicaBiosystems | 39462501 | mount mouse and positioning tips |
| Sicilone rubber-coated metal tip | Precision Tool & Engineering, Gainesvill FL | custom-made | impact tip |
| Lithium Ion All-in-One Trimmer | WAHL Home Products | 9854-600 | shave mouse hair |
| paper clips | custom-made | probe tip | |
| Cotton tipped applicators | MEDLINE | MDS202055 | scrub head with saline |
| Tissue Tek O.C.T. | ASKURA FINETEK USA INC | 4583 | tissue embedding |
| anti-GFAP | Dako | CA93013 | antibody for IHC |
| anti Ferritin | Sigma | F6136 | antibody for IHC |
| VECTASTAIN Elite ABC kit | Vector laboratories | PK-6100 | IHC detection system |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Aperio XT ScanScope scanner | Leica Microsystems Inc, | slides scanning | |
| Leica AutoStainer XL | Leica the pathology Company | ST2010 | H&E staining |
| DAB | sigma | D3939 | IHC detection system |
References
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