Introduction
尤文肉瘤（ES）是影响儿童和青少年积极恶性肿瘤。 1肿瘤的软组织和骨骼发育，常见于四肢。虽然转移的存在是ES患者最强大的不良预后因素，其发展背后的机制仍不清楚。 2肿瘤缺氧是在ES进展牵连的几个因素之一。在ES患者，非灌注区域的肿瘤组织中存在与预后不良相关联。 3 在体外 ，缺氧增加ES细胞的侵袭，并触发亲转移性基因的表达。 4-6然而，尽管这些证据，对缺氧诱导的ES进展和蔓延没有直接的证据存在。此外，由缺氧产生如此效果，目前的机制尚不清楚。因此，我们已经创建了一个体内模型，以填补现有体外数据和临床安装前后之间的间隙vations。此模型系统使得在它们的天然环境中存在的肿瘤的缺氧的影响直接检测，利用磁共振成像（MRI），以按照与体外病理学和分子分析（ 图1）组合的体内肿瘤进展和转移。
自的ES没有建立转基因模型是目前可用的，这些肿瘤的转移特性的体内研究依赖于人的细胞注射到免疫缺陷的小鼠。而采用免疫受损的动物可能会低估对疾病进展的免疫系统的影响，用人类细胞的能力提高了这些研究的译。在不同的异种移植模型，全身注射到尾静脉是最容易执行，但他们忽略肿瘤细胞血管内的最初步骤，并从经济增长的主站点逃脱。 7-12另一方面，orthoto PIC异种移植，其中涉及肿瘤细胞注射到骨头（股骨，肋骨）或肌肉，更多的是技术上具有挑战性，也更生物学相关的人类癌症。 13-16转移发展之前然而，在过去，与原发肿瘤的快速生长相关的高发病率常常必要动物安乐死。在这项研究中，我们采用的细胞注射的先前建立模型到腓肠肌接着将得到的原发肿瘤与通过MRI纵向监测转移进展的组合的切除。 17,18这种注射成靠近胫骨腓肠肌允许在两个天然ES环境肿瘤生长-肌肉和骨骼-并导致远处转移到通常受在人类中的位置。 18因此，这种模式概括准确疾病进展过程中ES患者发生转移的进程。
帐篷“>原发性肿瘤中的下后肢的定位也有助于血液供应肿瘤组织的精确控制。股动脉结扎（FAL）是血管生成的研究用来阻止血液流向的远侧区域中的良好建立的技术腿和调查组织血管响应于缺血19,20重要的是，在血流量的初始下降之后是侧枝血管开口和组织灌注FAL后约3天观察到20因此，在荷瘤肢执行时，该模型再现自然出现缺氧/再灌注事件在迅速生长的肿瘤，使由于灌注到经由新打开的侧支血管的下后肢的恢复转移性肿瘤细胞的逃逸。21重要的是，当肿瘤大小是必须执行此程序足够小，以防止在对照肿瘤过度缺氧（通常在荷瘤小牛体积150 UME - 250 立方毫米），确保控制和FAL治疗组之间的肿瘤缺氧的水平显著的差异。除了缺氧对ES延迟的影响和转移的频率纵向监测，这种模式也允许组织的收集和从原发肿瘤和转移两个新的细胞系的开发。重要的是，以前的工作确定，转移来源的细胞系后，再引入显示出增强转移潜力动物，这表明肿瘤传播与在肿瘤细胞中的表型永久改变，并由此确认使用这些细胞系的破译转移性进程相关联。 18总的来说，这些模型现在可以用于识别缺氧诱导转移性途径所需的遗传和分子分析。
由于缺氧是一个亲转移因子增强各种T的恶性肿瘤umors，我们的模型可以作为一个平台来调查缺氧在其他类型的肿瘤，在四肢自然发展，如骨肉瘤和横纹肌肉瘤的作用。 21-23此外，类似的方法可以适用于恶性肿瘤在其它解剖学位置具有定义良好的血液供应的路线发展。最终，模型可以被修改，并且它的效用进一步延长，这取决于个体的研究需要。
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Protocol
所有的程序是由乔治敦大学机构动物护理和使用委员会的批准。
1.细胞制备注射原位
- 培养人类胚胎干细胞在标准条件下。使用大约15厘米细胞培养板不超过5只小鼠注射汇合的70％。
注意：对于该研究中，SK-ES1细胞的McCoy的5A培养基中培养，用15％胎牛血清（FBS）的胶原包被的板和TC71细胞培养在RPMI有10％FBS和1％的4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）。两种培养基均补充有抗生素 - 青霉素（100单位/ ml），链霉素（100微克/毫升）和两性霉素B（1微克/毫升）。 - 用0.25％胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）洗涤ES细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS）和trypsinize在70％汇合5分钟。
- 从细胞培养中介板中取出胚胎干细胞一个，然后在室温下以200 xg离心离心5分钟。重悬的ES细胞在10ml冷PBS中，然后计数细胞数。
- 离心机ES细胞在室温下200 xg离心5分钟，然后重新悬浮于2×10 7（SK-ES1）或每ml 10 7（TC71）细胞在冷PBS中。保持最终的细胞悬浮液在冰在执行注射。
2.胚胎干细胞原位注入腓肠肌
- 使用4-6周龄雌性SCID /米色小鼠。
- 注入的ES细胞，轻轻握住鼠标和稳定在第四和第五手指之间的左腿，露出下部后肢的内侧。
- 使用28 G½针，注入0.1包含任一2×10 6（SK-ES1）或10 6（TC71）ES细胞入腓肠肌（ 图2A）预先制备的细胞悬浮液中的溶液。
注意：虽然最大音量为肌内注射ections通常0.05毫升，对于此特定步骤的体积增加至0.1 m1为必要的，因为注入的高细胞数。此程序已获得乔治敦大学机构动物护理和使用委员会。- 针插入腓肠肌前方约30 - 45度角在胫骨嵴/结节的方向。
- 一旦倒是胫骨嵴/结节稍拔出针头。缓缓注入细胞悬液溶液，逐渐抽出针以释放压力。
- 在监控遇险的迹象，未来24小时的小鼠注射。
注：在动物的处理经验较少侦查人员应该考虑麻醉对肿瘤细胞注射小鼠。有些机构可能需要为安全起见麻醉。
3.监测原发性肿瘤生长
- 监测原发性肿瘤D的生长aily直到肿瘤大小达到所需的体积。
注意：在本研究中，为250mm 3小牛体积用作实验（ 图2B）的一个起点。通常情况下，需要约1 - 2周的肿瘤达到这个尺寸。- 通过其内侧 - 外侧和前侧 - 后侧长度的数字卡尺每天测量小腿尺寸。
- 确定由式（D XD 2/6）小牛体积×3.14，其中D是长直径，d是荷瘤低级后肢的短径。
注：在正常成年小鼠小牛的大小是约40 - 50 立方毫米。其体积会增加在稍后阶段小腿将主要由肿瘤组织由于肿瘤生长和。
4.股动脉进行结扎（FAL）在荷瘤后肢缺氧诱导
- 准备所需此操作的手术工具：CURVED或尖细镊子，镊子尖，手术剪刀和一个持针器。之前使用高压釜或热珠灭菌手术消毒这些工具。此外，已准备好该手术精细棉签。
注：建议工具可以在手术期间根据需要的提示重新灭菌。 - 注入镇痛剂（卡洛芬5毫克/千克）经皮下（SQ）。检测和确认缺氧，注入hypoxyprobe-1（pimonidazole，60毫克/千克）。
注意：此剂量相当于每只小鼠1.5毫克和通过注入0.1的PBS腹膜内（IP）的15毫克/毫升hypoxyprobe溶液毫升实现。该hypoxyprobe然后通过免疫动物组织中检测到死后。 - 鼠标放置在含有3麻醉诱导腔 - 在100％的氧气5％异氟烷以1升/分钟的流速。
- 留在感应腔室中的小鼠，直到它是响应于外部刺激。然后从我删除动物nduction室。放置动物在上放置的操作表面上的变暖垫顶上的无菌披盖仰卧位。使用鼻锥将其连接到1的连续流动 - 以0.8升/ min的流速3％异氟烷在100％的氧。
- 应用无菌非药物眼药膏每只眼睛预防角膜干燥。彻底脱毛手术区，应用脱毛膏，留在皮肤上的时间不超过10秒。然后擦去用乙醇消毒片脱毛膏。
- 延伸，并与来自小鼠的中线大约45度的一块胶带固定后肢。一旦后肢是安全的，擦拭用10％聚维酮/碘拭子/溶液，接着乙醇裸露的皮肤，重复各两次。对于手术过程的剩余部分，使用立体显微镜来获得后肢区域的放大图。
- 用尖头镊子和手术剪，使SK的切口在大约长1厘米，从向腹股沟区，大腿中部。用盐水浸湿细棉签，轻轻刷掉围绕大腿肌肉皮下脂肪组织。
- 小心露出通过皮下脂肪组织通过钝性分离底层的股动脉。稳住伤口，手术野暴露中上收肌的血管。
- 用细镊子，轻轻捅破通过膜质鞘股暴露神经血管束。使用干净组细钳子，解剖并在腹股沟，远端的腹股沟韧带靠近近侧的位置分开从股静脉和神经股动脉。请小心，以免刺入股静脉壁。
- 继夹层，通过6-0丝线缝合的股的股动脉和远端的旋股外侧动脉（LCFA）的分支下面。闭塞使用双结（ 图3）的股动脉。 关闭使用6-0聚丙烯缝合切口。关闭切口后，注入流体平衡疗法温生理盐水SQ0.5毫升。广场上的恢复笼中披保暖垫的顶部动物和连续监测，直到清醒。
- 监视第一6小时期间将动物手术后和注入的镇痛剂（卡洛芬5毫克/公斤，SQ）每天3天。删除缝线采用无菌剪刀10天手术后。
由截肢5.原发肿瘤切除术
注：截肢荷瘤低级后肢时小腿尺寸达到250毫米3为对照组或FAL后3天的低氧组。
- 从荷瘤肢体从胫骨远端剃光头发骨盆区域的头发剪的同时轻轻地捧着动物。注入过程之前的镇痛剂（卡洛芬5毫克/公斤，SQ）。
- 鼠标放置到麻醉诱导通道含有3琥珀色 - 在100％的氧气5％异氟烷以1升/分钟的流速。留在感应腔室中的小鼠，直到它是响应于外部刺激。然后取出从感应室的动物。
- 放置在右侧卧位的动物上放置在操作表面上的暖垫的无菌披盖。使用鼻锥将其连接到异氟烷1的连续流 - 以0.8升/分钟的流速的3％在100％的氧。应用无菌非药物眼药膏每只眼睛预防角膜干燥
- 制备，用10％聚维酮/碘拭子/溶液中的手术部位，接着乙醇，重复3次。应用消毒纱布（ 如手术单）通过鼠标来获得无菌手术领域。
- 制作股骨中段环形切开皮肤，其次是钝性分离和近端皮肤回缩。暴露在腿部的中间侧股骨内侧神经血管蒂，然后结扎使用附近的涂4-0（聚乳糖910）可吸收缝合线材料腹股沟韧带。
- 执行肌肉群用剪刀，接着软组织的钝器解剖到coxofemoral接头的中间股骨横断。用骨刀，进行中期股骨截骨术。使用无菌细棉签或吸收性明胶海绵，轻轻按下截骨部位，以减少和防止出血。
- 采用手术创口夹子关闭覆皮肤，注入0.5毫升温生理盐水SQ的流体平衡疗法。广场上的恢复笼中披保暖垫的顶部动物和连续监测，直到清醒。
- 在手术，收集来自原发性肿瘤为RNA，DNA或蛋白分离组织样品，在-80℃管理单元在液氮中并储存冷冻。对原代细胞培养，收集组织样品在此步骤中，如在下面章节9所述。固定在10％中性缓冲的福尔马林剩余肢组织用于组织学和immunochemis尝试，包括hypoxyprobe-1检测。
- 监测动物运动，疼痛和食品消费在首6个小时的手术后，每天都有3天，然后。注入每日镇痛剂（卡洛芬5毫克/公斤，SQ）3天。用夹子伤口卸妆截肢后取出伤口夹10天。
6.监测小鼠转移的存在
- 每日观察小鼠并且每周评估它们对转移的临床体征的至少两倍。
- 观察动物对macrometastases表现为，在各个位置，典型地肩，对侧腿和爪发展群众的存在。为此，仔细触诊头部，颈部和腋下部位，及对侧后肢。检查与MRI扫描一起通过腹胀内部器官转移。
- 通过与印出按xyphoid处理（胸骨的下端）检查肺转移的存在点¯x手指。 24
注：这种压力减少膈肌呼吸的能力。晚期肺癌转移的小鼠显示了由呼吸费力表现呼吸困难的症状。 - 观察动物对于神经症状，如腿瘫痪和共济失调提示转移到中枢神经系统。
- 监测小鼠每周至少一次，体重减轻，作为潜在的疾病进展的指示。体重损失超过预程序重量的15％，被认为是一种人道终点。
7.磁共振成像（MRI），用于检测转移
- 执行的MRI在所需的时间点来检测转移。 18
注：在目前的研究中，使用了7特斯拉水平分光计。 MRI是在15日进行，35后截肢的SK-ES1细胞，并在为TC71细胞15天。 - 鼠标放置到麻醉诱导chambe在30％的氧气和70％一氧化二氮的气体混合物3％异氟烷 - 含1河
- 留在感应腔室中的小鼠，直到它是响应于外部刺激。然后取出从感应室的动物。
- 与呼吸和温度monitorization用1.5％异氟烷的连续施用和30％的一氧化二氮传送麻醉鼠标到立体定位架。应用无菌非药物眼药膏每只眼睛防止角膜干燥。图像动物无论是在全身或脑成像，分别为40或23毫米布鲁克鼠标体积线圈。
- 使用二维，T2加权RARE序列：TR = 3000毫秒，TE = 24毫秒，矩阵= 256，FOV = 4.35点¯x3.0厘米，层厚= 0.5毫米，稀有因子= 4和平均数= 4 18
- 将动物在一个温暖的笼子里恢复并持续监测，直到清醒。
注：由于使用麻醉浅平面老鼠会迅速恢复。 监视第一6小时期间，动物成像后，以确保有所述麻醉无不良影响。
8.安乐死和尸检
- 安乐死一旦本与转移通过MRI和/或疾病进展的临床症状可检测动物的小鼠。
注：在目前的研究，小鼠在50天处死25后截肢动物轴承SK-ES1和TC71移植，分别。在某些情况下，较早的安乐死是必要的，因为高转移负担。 - 通过暴露安乐死小鼠（在10 CO 2 -安乐死室体积/分钟的30％）1.5升/分钟到CO 2。为了确保动物死亡，CO 2的曝光之后进行颈椎脱位。
- 喷用70％乙醇在整个鼠标，并将其放置到层流罩。用25 G½针用1ml注射器，并转移到一个收集血液涂通过心脏穿刺收集的血液是含有2mg EDTA中。
- 收集以下组织：脾，肾上腺，卵巢，肾，肝，肺，脑，右腿，骨髓来自肱骨和脊椎，以及存在于其他地方的宏观转移。 25,26
- 固定半在10％的中性缓冲的福尔马林每个组织用于组织学和免疫组织化学，包括hypoxyprobe-1检测。卡扣冷冻在液氮中的另一半，然后在-80℃下的RNA，DNA或蛋白质分离储存。 25,26对于原代细胞培养，采集组织样本，如下面第9节。
9.原代细胞培养
- 执行原代细胞培养，解剖在层流罩剖检（上述第8节）在无菌条件下在从截断肢（上述第5节）或组织。
- 对于用于原位注射的细胞系，补充有青霉素（200单位/ ml）制备细胞培养基适当链霉素（200微克/毫升），两性霉素B（1微克/毫升），和0.2％支原体预防性抗生素。放置把2.5ml主培养培养基到6厘米细胞培养板。
- 选择从原发肿瘤或转移瘤存活肿瘤组织的区域，然后在2-3毫米的每个使用无菌剪刀隔离两到三个段。
注：存活肿瘤组织通常是在肿瘤的边缘发现，可以从坏死由其带粉红色或红色色彩，显著光泽和整体湿外观来区分。相比之下，坏死组织通常出现在肿瘤中心，并提出与沉闷的，俗气的外观白色/奶油色质量。 27 - 传送分离段包含在步骤9.2中描述的初级培养基6厘米细胞培养板。
- 在标准条件下培养的细胞，如第1（NOTE）和9.2描述。 18,28检查从组织碎片，所产生的细胞生长的文化WHICH应在几天内进行观察。一旦细胞达到汇合时，trypsinize并根据标准细胞培养技术繁殖它们。
注：原代细胞培养可随后用于评估的生长和从对照和缺氧肿瘤，以及它们的分子特征衍生细胞的转移特性，如先前所述。 18
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Representative Results
以下的ES细胞入腓肠肌注入，原发肿瘤被允许生长至250mm的3小腿尺寸（ 图1，2）。所需的肿瘤的时间来达到这个体积典型地从10范围 - 15天为TC71至20-25天SK-ES1异种移植物，分别。以250mm 3显示出内源性缺氧的相对低水平的小牛体积的肿瘤，根据hypoxybrobe-1（pimonidazole）（肿瘤组织的约3％）染色（ 图4A中的C）。重要的是，在这些对照肿瘤中，观察到只在生理缺氧， 即的领域hypoxyprobe-1阳性染色，在从脉管遥远，并开始经历细胞死亡（ 图4A）的肿瘤细胞。这样染色表现出特有的“空气刷”的模式，而健康的肿瘤组织的大部分仍然为阴性hypoxyprobe-1 <SUP> 6相反，FAL此阶段执行创建深刻缺氧，通过对hypoxyprobe-1在4小时后FAL（ 图4B）中的绝大多数的肿瘤细胞中观察到的阳性染色所证明。值得注意的是，hypoxyprobe-1阳性肿瘤细胞也靠近血管和生理缺氧特征模式丢失观察。在这些FAL治疗的肿瘤，组织的73％由低氧肿瘤细胞（ 图4C）的。肿瘤组织也表现出的缺氧诱导损伤的第一个迹象，包括细胞皱缩和松散结构（ 图4B）。
FAL的有效性通过原发性肿瘤生长的完全抑制进一步的支持。期间FAL和截肢之间的3天期间，原发肿瘤的大小没有增加（ 图5A）。与此相反，从小鼠的原发肿瘤进行假surgerŸ继续保持快速增长，达到大约有650 立方毫米的体积，从而模仿对照小鼠的肿瘤不进行手术（ 图5A）的增长速度。 18在这些数据线，组织病理学分析显示，在收获后3天手术（ 图5B）FAL治疗原发性肿瘤坏死的广泛领域。尽管如此，有存活的肿瘤细胞的组中的肿瘤组织中存在的，通常位于在肿瘤的边缘，靠近脉管（ 图5B）。为了研究这些细胞，我们使用hypoxyprobes，其在活低氧细胞活化，随后获得共价结合到这些细胞内的蛋白质的能力的氧合状态。 29这样，这些探针作为，在任何时间点经历缺氧的细胞的永久标记。因此，为了检测整个experim的持续时间在肿瘤细胞中的氧水平的变化耳鼻喉科，我们使用了可以独立通过免疫组化检测到两个不同的hypoxyprobes。该探针在两个时间点施用- FAL（hypoxyprobe-1）和前截肢（hypoxyprobe-2，CCI-103F）在紧接前-和其定位在肿瘤中检测到收获后3天-FAL（ 图1）。 Hypoxyprobe-1，这是存在于系统中在FAL的时间，标志着大多数肿瘤细胞，作为组织变得严重缺氧（ 图5C）。这个标记也坏死/凋亡领域显而易见的，因为这些细胞仍存活在FAL时间，因此能够永久地结合hypoxyprobe-1， 如图4B所示 。与此相反，hypoxyprobe-2给药后2天-FAL仅染色的活细胞，如在坏死区的细胞已经死亡，无法在其施用（ 图5D）的时间来激活探针。有趣的是，我们也表外实体RVED毗连该最初缺氧（hypoxyprobe -1阳性）脉管存活的肿瘤组织中，但在稍后的时间点充分充氧（hypoxyprobe -2-负）（ 图5C，D）。这一发现是在表明侧支血管相关组织灌注恢复的后肢后3天-FAL血流早先的报告一致。 20残留在肿瘤组织后3天-FAL的存活的肿瘤细胞是高度侵入性的，可以通过对肿瘤（ 图5E）的血管边缘大规模血管内所证明。某些血管腔中的细胞的阳性hypoxyprobe-1，这表明它们已在FAL变得缺氧，但仍是可行的。总的来说，这些数据表明，组织再灌注以下严重缺氧可促进细胞的逃逸从原发肿瘤。
根据试点实验，广泛转移是检测通过MRI约35天截肢后的SK-ES1移植，而TC71细胞通常在15天内转移。因此，用于转移延迟和频率的比较分析，MRI检查在第15天及35截肢后为动物承载的SK-ES1肿瘤进行的，而在第15天一个成像足以用于与TC71肿瘤的小鼠。在50天和25天，分别执行用于与SK-ES1和TC71异种移植物的动物安乐死。如先前报道的，最常见的类型转移包括在胎肩区软组织肿块，以及骨转移到对侧腿，上颌区域和脊柱对于SK-ES1细胞，肺和骨盆肿瘤为TC71。 18此外，经常转移到内脏器官，包括肾上腺，肺和肝脏，以及骨髓浸润，是在荷FAL处理的SK-ES1异种移植物（ 图6）观察到的。在一般情况下，低氧显著增加整体（SK-ES1）或位点特异性的（TC71）在两种细胞系的频率和转移的多重性。然而，TC71异种移植物还开发频繁复发群众在截肢的位点（用于控制的25％和40％为FAL治疗的肿瘤），如先前对于大TC71原发性肿瘤说明。 18
从控制和FAL-治疗原发性肿瘤和转移的组织也可以是材料的目的是参与ES传播低氧激活途径的鉴定综合分子分析的来源。例如，我们观察到在控制和缺氧原发性肿瘤的代谢概况显著差异（数据未显示）。我们也能够成功地从上述所有组织中分离出多种细胞系。在许多情况下，相比于原始细胞和那些来自控制涂衍生自FAL治疗的肿瘤来源的细胞显示在形态显着的变化，MORS（ 图7A）。这些细胞培养物的纯度通过在尤因肉瘤标志物CD99（ 图7B）阳性免疫染色证实。此外，在建立的细胞系的细胞的100％的在原位杂交（FISH）与人类着丝粒探针荧光阳性信号，常常具有增加的染色体数目（ 图8A）呈递。这些细胞的人类来源由中期染色体（ 图8B），该显示出对SK-ES1细胞在原细胞系和细胞从FAL治疗的肿瘤（ 图8B）衍生的先前描述的细胞遗传学的重排的分析进一步证实。 三十
图1. ES缺氧模型论纲。 ES细胞（1 - 2×10 6）注射到gastrocnSCID /米色小鼠的肌肉emius。一旦将所得初级肿瘤达到250 立方毫米小牛体积时，将小鼠分成两个实验组。来自对照组的小鼠hypoxyprobe-1（HP-1）注射，并在原发肿瘤通过截肢切除。从低氧组小鼠hypoxyprobe-1注射，然后进行股动脉结扎（FAL）。两天后的小鼠用hypoxyprobe -2-（HP-2）注射，然后将荷瘤肢体被截肢3天后FAL。从两组动物通过周期性磁共振成像（MRI）监测。一旦转移根据成像和临床体征变得明显，将小鼠安乐死，转移的存在通过尸体剖检和组织病理学分析证实。肿瘤的生长，成像和安乐死的时间是基于生长和转移的SK-ES1信元速率。请注意，虽然hypoxyprobe -2-必须建立的方法和VISU阿利兹期间FAL和截肢之间的周期在低氧水平的变化，它的使用是不实际的实验是必不可少的。因此，该步骤不包括在该协议。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. 原发性肿瘤生长。一个完整的后肢A.磁共振成像（MRI）。红色箭头指示肿瘤细胞原位注射部位和方向。 B.原发肿瘤在腓肠肌（红色轮廓线）大约有250 立方毫米成长小牛量。红色箭头指示骨质破坏的网站。笔 - 胫骨。 请ç舔此处查看该图的放大版本。
图3. 股动脉进行结扎的部位。一个129S1 / SVJ小鼠用硫酸钡灌注的代表性死后x射线动脉造影结扎后立即被示为突出预先存在的侧支血管的存在。注意，虽然图像描绘了两个结扎（XS），一个远端的旋股外侧动脉（LCFA）（红色X），另一个邻近膝部动脉（白色X）的肿瘤缺氧模型仅用于近端结扎，近腹股沟韧带和远端的长链脂肪酸（红色的X）。侧支血管发育的区域被示出为说明（微弱血管），并且它们可以通过曲折，软木螺杆形状识别。 请点击他再查看该图的放大版本。
图4. 肿瘤缺氧通过股动脉进行结扎（FAL）所致。 A.在苏木＆曙红（H＆E）染色和免疫染色hypoxyprobe-1（棕色）250mm的3小牛音量控制肿瘤。 Hypoxyprobe-1免疫染色在生理肿瘤缺氧，其中远离脉管系统的肿瘤细胞被剥夺氧气并开始经历细胞死亡的区域只观察到。 B. FAL治疗原发肿瘤在收获了同样大小的4小时后结扎，并与H＆E染色和免疫染色hypoxyprobe-1。大多数肿瘤细胞是高度阳性hypoxyprobe-1，包括那些在靠近脉管。 v - 输出血管。 C.阳性染色为hypoxyprobe-1 quantif面积组卷在使用ImageJ软件控制和FAL治疗的肿瘤。误差棒表示SEM。 *** - P <0.001 请点击此处查看该图的放大版本。
图5. 影响股动脉进行结扎（FAL）原发肿瘤生长的影响。期间在FAL-手术和截肢之间的3天期间A.原发性肿瘤生长（n = 4时）和假手术组（n = 4）的动物相比，完整的对照肿瘤（N = 6）。误差棒表示标准差。 *** - P <0.001，相对于对照和假手术治疗的肿瘤。一个FAL治疗肿瘤B.伊红（H＆E）染色收获三天-结扎后发现肿瘤内广泛坏死。红色轮廓表明存活肿瘤CE面积LLS靠近高度血管化区域灌注后3天-FAL。 C. FAL治疗的肿瘤组织收获三天-手术后免疫染色hypoxyprobe-1。 Hypoxyprobe-1 FAL前注射。因此，阳性表达表示广泛组织缺氧的存在外科术后立即出现。 D. Hypoxyprobe-2注射后2天-FAL，和组织收集24小时后，在截肢。正hypoxyprobe-2染色在截肢时确定组织缺氧。红色箭头指示组织是缺氧在两个时间点，而黄色箭头表示邻近于这是缺氧后立即脉管的区域FAL（hypoxyprobe-1-阳性），但阴性hypoxyprobe-2在切除的时间，这指示组织灌注。缺乏坏死区域hypoxyprobe-2染色表明，在这个区域中的细胞不存活在其施用，因此时间无法积极地结合探针。在面板BD提出的染色串行组织切片进行。 E.血管内的FAL-肿瘤治疗后3天-FAL。免疫染色识别阳性血管腔（红色箭头）内hypoxyprobe-1的活细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6. 荷瘤小鼠FAL处理SK-ES1肿瘤的转移例子。该转移通过磁共振成像（MRI）检测到的和由尸体剖检和组织病理学分析（苏木＆曙红染色，H＆E）证实。米 - 转移。 请点击此处查看大VERS这个数字的离子。
图7. 从FAL治疗原发性肿瘤衍生细胞的生物学特性。 A.活细胞培养物从控制和低氧原发性肿瘤收获组织建立及它们的形态进行比较用于初始原位注射的原始细胞系。从FAL处理的原发肿瘤得到的细胞表现出在它们的尺寸和形态的急剧变化。原始和初级肿瘤来源的SK-ES1细胞的代表性图像示。从免疫染色为ES标记，CD99 FAL治疗的肿瘤衍生的，并与DNA结合染料，DAPI复染细胞B.代表性图像。所有细胞是CD99阳性的，包括含有扩大核（白色箭头）肥大细胞。 OAD / 54532 / 54532fig7large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图 从FAL治疗的肿瘤来源细胞的染色体 8 分析。 A. 荧光原位杂交间期细胞显示人类着丝粒4探头双核与信号（FISH）分析。大核与四个信号指示四倍体（4N）细胞（白色箭头）。在SK-ES1原始细胞系的代表性中期分裂和从FAL-治疗原发性肿瘤来源的细胞的B. FISH分析。红色箭头指示INV（1）（p13.1q21），对SK-ES1细胞的非随机细胞遗传学重排的特征。红色信号：人的着丝粒4探头;在原有的SK-ES1细胞绿色信号：在染色体4q32.2 NPY5R探针。e.com/files/ftp_upload/54532/54532fig8large.jpg“目标=”_空白“> 点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
我们的模型涉及转移的两个实验组的比较-对照组，其中，肿瘤被允许在后肢在达到250 立方毫米小牛体积随后截肢开发和缺氧暴露组，其中，肿瘤轴承后肢经受FAL在相同体积，随后截肢3天后。即使在这些实验中FAL治疗的肿瘤都具有稍微延迟的截肢，相比于对照肿瘤，其大小不期间结扎和截肢之间的3天期间增加。因此，这种方法能够相媲美的大小但显着不同程度的缺氧肿瘤的转移潜能的比较。相反，使用假手术，通常使用的控制为外科手术，随后肿瘤生长3天会导致在实验组之间的肿瘤大小显著差异，与假手术性治疗编原发肿瘤具有内源性缺氧显著水平。基于导频的实验中，假手术不显著影响肿瘤生长或它的低氧水平，因此可以从实验设计消除。相反，比较类似的尺寸和不同低氧程度的肿瘤的策略是阐明疾病的传播缺氧的影响的高度相关的模型。重要的是，不像在体外研究以前，这种方法使缺氧的自然肿瘤微环境的亲转移行动的综合评价。 4-6
实验设计的目标是实现转移，将允许用于检测在其形成缺氧诱导的刺激作用的低基础水平。我们建立了在FAL 250mm的3牛犊大小和截肢是最佳选择SK-ES1原发肿瘤。然而，该参数将需要EA进行优化通道的细胞系，根据他们的转移潜能和局部侵袭。对于具有较高的转移潜能的肿瘤，原发肿瘤的大小在截肢可能需要被减少。例如，TC71肿瘤表现出截肢的部位频繁复发形成肿瘤的表现局部高侵袭。 18一旦这样群众发展，动物必须从分析中排除，因为它不会清楚，如果后续的远处转移源自原发性肿瘤或从复发肿瘤往往迅速增大，并表现出高水平的内源缺氧。从以前的经验，独立的细胞系使用150 mm 3的是，可以可靠地测出最小的荷瘤小腿尺寸和规范化。如果在FAL和截肢减小肿瘤大小并没有消除肿瘤复发或充分降低基础转移率，所讨论的特定细胞系可能不适合用于这些实验。
ve_content“>同样，它建立的MRI的时间轴和安乐死为每个单独的细胞系，根据其转移的延迟是重要的。值得注意的是，与磁共振成像干扰手术伤口夹子可以不早于10天后除去手术，这期间有时必须由于与愈合并发症延长。因此，在这个研究中，我们建立了15日为第一MRI的时间。在此模型中的另一个重要的考虑是保持能够诱导转移性过程，而不会导致完全的肿瘤坏死，这会阻止肿瘤细胞的传播的低氧水平。尽管我们没有在这项研究中遇到了这个问题，如果需要的话，缺氧的严重程度可以通过改变的确切位点和结扎的数目相对于所述股动脉的分支，如长链脂肪酸和膝动脉调节。 20因此，结扎近端LCFA将在喜创造更多的严重缺血ndlimb循环，从而在远端腿增加低氧条件。与此相反，结扎远端股动脉的后续分支会降低所得缺氧在较低的后肢。
重要的是，有结合FAL和截肢程序没有严重的不良影响，并没有，涉及到手术如前面对分别执行这些技术报告的死亡。 18-20因此，该方法的成功是由肿瘤取的在主站点的速率和复发性的肿瘤，这两者都是细胞依赖性的频率主要的限制。
缺氧已经牵涉在许多肿瘤类型促转移性因素，这种方法也可以适用于直接测试其效果和限定在肢体开发其他肉瘤其动作的机制。 23此外，类似的策略可以应用到其他恶性肿瘤中原位环境瓦特生长第i定义良好的血液供应路线。因此，通过适当的修改，这种模式可在研究的有用工具超出ES生物学领域。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 ml Insulin syringes with permanently attached 28 G ½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges - Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25 G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 ml syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3-EDTA Micro tube 1.3 ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
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