Introduction
Ewing sarkom (ES) er en aggressiv malignitet rammer børn og unge. 1 Tumorerne udvikle sig i blødt væv og knogler, almindeligvis i lemmerne. Mens tilstedeværelsen af metastaser er den mest kraftfulde negativ prognostisk faktor for ES patienter, mekanismerne bag deres udvikling er fortsat uklare. 2 Tumor hypoxia er en af de få faktorer er impliceret i ES progression. I ES-patienter, er tilstedeværelsen af ikke-perfunderede områder i tumorvævet forbundet med dårlig prognose. 3 In vitro hypoxi øger invasionsevne af ES-celler og udløser ekspression af pro-metastatiske gener. 4-6 på trods af disse linjer af beviser, eksisterer imidlertid ingen direkte beviser for hypoxi-induceret ES progression og spredning. Desuden er de mekanismer, hvormed hypoxi udøver sådanne virkninger er i øjeblikket, ukendte. Derfor har vi skabt en in vivo model for at udfylde hullet mellem de eksisterende in vitro data og klinisk obserbemærkninger. Denne model system muliggør direkte test af virkningerne af hypoxi på tumorer, der forekommer i deres naturlige miljø, ved hjælp af magnetisk resonans imaging (MRI) for at følge tumorprogression og metastase in vivo i kombination med ex vivo patologiske og molekylære analyser (figur 1).
Da ingen etableret transgen model af ES er i øjeblikket tilgængelig, in vivo undersøgelser af metastatiske egenskaber af disse tumorer er afhængige af injektioner af humane celler i immunkompromitterede mus. Mens anvendelsen af immunologisk svækkede dyr kan undervurdere virkningen af immunsystemet på sygdomsprogression, evnen til at anvende humane celler øger oversættelighed af sådanne undersøgelser. Blandt forskellige xenograftmodeller, systemiske injektioner i halen vene er de nemmeste at udføre, men de udelader de indledende trin i tumor celle intravasation og flygte fra det primære sted for vækst. 7-12 På den anden side orthoto pic xenografting, som involverer injektioner af tumorceller i knogler (femur, ribben) eller muskler, er mere teknisk udfordrende, men også mere biologisk relevant for human cancer. 13-16 Men i fortiden, den høje sygelighed forbundet med hurtig vækst af primære tumorer har ofte nødvendiggjort dyr eutanasi før metastase udvikling. I denne undersøgelse anvendte vi en tidligere etableret model af celle- injektioner i musculus gastrocnemius efterfulgt af udskæring af den resulterende primære tumor kombineret med langsgående overvågning af metastatisk progression af MRI. 17,18 Sådanne injektioner i musculus gastrocnemius i umiddelbar nærhed af tibia tillader tumorvækst i to naturlige ES miljøer - muskler og knogler - og resultere i fjerne metastaser til steder typisk ramt hos mennesker. 18 Derved denne model rekapitulerer nøjagtigt de metastatiske processer, der forekommer i ES-patienter under sygdomsprogression.
telt "> Lokaliseringen af primære tumorer i den nedre bagbenet letter også præcis styring af blodforsyningen til tumorvævet. femorale arterie ligering (FAL) er en veletableret teknik brugt i angiogenese forskning for at blokere blodstrømmen til distale regioner i benet og undersøge væv vaskularisering som reaktion på iskæmi. 19,20 Vigtigere er det indledende fald i blodstrømning er efterfulgt af sikkerhed beholderåbningen og væv reperfusion observeret ca. 3 dage efter FAL. 20 når således udføres i en tumor-bærende lemmer, denne model genskaber hypoxi / reperfusionshændelser, der forekommer naturligt i hurtigt voksende tumorer og muliggør udslip af metastatiske tumorceller på grund af restaurering af perfusion til den nedre bagbenet via nyligt åbnede kollaterale kar. 21 er vigtigt, denne fremgangsmåde skal udføres, når tumorstørrelsen er lille nok til at forhindre overdreven hypoxi i kontroltumorer (typisk ved tumorbærende kalv volume på 150 - 250 mm 3), sikrer signifikante forskelle i tumor hypoxi mellem kontrol og FAL-behandlede grupper.Foruden langsgående overvågning af effekten af hypoxi på ES latens og hyppigheden af metastaser, denne model giver også mulighed for indsamling af væv og udviklingen af nye cellelinjer fra både primære tumorer og metastaser. Vigtigere, tidligere arbejde fastslået, at metastaser-afledte cellelinier udvise forøget metastatisk potentiale ved genindførelse til dyr, hvilket indikerer at spredning tumor er forbundet med permanente ændringer i tumorcellen fænotype, og derved validere anvendelse af disse cellelinjer til at dechifrere de metastatiske processer. 18 Tilsammen kan disse modeller nu anvendes til de genetiske og molekylære analyser nødvendige for at identificere hypoxi-induceret metastatiske pathways.
Som hypoxi er en pro-metastatisk faktor øge malignitet af forskellige tumors, kan vores model bruges som en platform til at undersøge den rolle, hypoxi ved andre tumorer, der naturligt udvikler i lemmerne, såsom osteosarkom og rhabdomyosarcoma. 21-23 Desuden kan en lignende fremgangsmåde anvendes på maligniteter vokser i andre anatomiske steder med en veldefineret rute blodtilførsel. I sidste ende kan modellen ændres og dens anvendelighed yderligere udvidet, afhængigt af individuelle forskningsbehov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev godkendt af Georgetown University Institutional Animal Care og brug Udvalg.
1. Cell Forberedelse til ortotopisk Injektioner
- Kultur humane ES-celler under standardbetingelser. Brug cirka en 15-cm cellekultur plade, der ikke overstiger 70% af konfluens til injektion af 5 mus.
BEMÆRK: Til denne undersøgelse SK-ES1 celler blev dyrket i McCoys 5A-medium med 15% føtalt bovint serum (FBS) på collagen-coatede plader og TC71-celler blev dyrket i RPMI med 10% FBS og 1% 4- (2-hydroxyethyl ) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES). Begge medier blev suppleret med antibiotika - penicillin (100 enheder / ml), streptomycin (100 ug / ml) og fungizon (1 ug / ml). - Vask ES-cellerne med phosphatbufret saltvand (PBS) og Trypsinisér ved 70% konfluens med 0,25% trypsin / ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) i 5 minutter.
- Fjern ES-cellerne fra pladen med cellekultur media, centrifugeres i 5 minutter ved 200 xg ved stuetemperatur. Resuspender ES-cellerne i 10 ml kold PBS og derefter tælle antallet af celler.
- Centrifuge ES-celler i 5 minutter ved 200 xg ved stuetemperatur, og derefter igen suspendere på 2 x 10 7 (SK-ES1) eller 10 7 (TC71) celler pr ml i kold PBS. Hold den endelige cellesuspension på is, mens de udfører injektioner.
2. ortotopisk Injektion af ES-celler i musculus gastrocnemius
- Brug 4-6 uger gamle kvindelige SCID / beige mus.
- For at injicere ES-celler, hold forsigtigt musen og stabilisere sin venstre ben mellem fjerde og femte fingre, udsætter den mediale side af den nederste bagben.
- Ved hjælp af en 28 G ½ nål injiceres 0,1 ml af den tidligere fremstillede cellesuspension, der indeholder enten 2 x 10 6 (SK-ES1) eller 10 6 (TC71) ES-celler i musculus gastrocnemius (figur 2A).
BEMÆRK: Selvom maksimale lydstyrke til intramuskulær injtninger er typisk 0,05 ml, for denne særlige procedure volumenforøgelse til 0,1 ml er nødvendig på grund af det høje celletal injiceres. Denne procedure er blevet godkendt af Georgetown University Institutional Animal Care og brug Udvalg.- Stik nålen ind i musculus gastrocnemius fortil ved omtrent en 30 - 45 graders vinkel i retning af den tibiale crest / tuberositas.
- Lidt trække nålen, når det rører tibial våbenskjold / tuberositas. Injicer langsomt cellesuspensionen løsning, efterhånden trække nålen til at frigive pres.
- Overvåg de injicerede mus over de næste 24 timer for tegn på nød.
BEMÆRK: Efterforskere med mindre erfaring i håndtering af dyr bør overveje bedøve mus for tumor celle injektioner. Nogle institutioner kan kræve anæstesi af sikkerhedsmæssige årsager.
3. Overvågning primær tumor vækst
- Overvåg væksten af primære tumorer daily indtil tumorstørrelsen når den ønskede volumen.
BEMÆRK: I den aktuelle undersøgelse blev en kalv volumen på 250 mm3 anvendt som udgangspunkt af forsøget (figur 2B). Det tager typisk ca. 1 - 2 ud uger for tumorerne at nå denne størrelse.- Mål kalv størrelse dagligt med digitale skydelærer via sine mediale-laterale og anterior-posterior længder.
- Bestem kalven volumen ved formlen (D xd 2/6) x 3,14, hvor D er den længere diameter, og d er kortere diameter af tumorbærende lavere bagben.
BEMÆRK: Størrelsen af den normale voksne mus kalv er på ca. 40 - 50 mm 3. Dens volumen vil stige på grund af tumorvækst og på de senere faser kalven vil hovedsagelig bestå af tumorvæv.
4. lårarterien Ligering (FAL) til at inducere Hypoxi i det tumor-bærende bagben
- Forbered kirurgiske nødvendige redskaber til denne operation: curaba eller spidse fine pincet, spidse pincet, kirurgiske sakse og en nåleholder. Sterilisere disse værktøjer før kirurgi ved anvendelse af en autoklave eller en hot-bead sterilisator. Derudover har fine vatpinde klar til denne operation.
BEMÆRK: Det anbefales, at de værktøjer, re-steriliseres ved spidserne efter behov under proceduren. - Injicere analgetisk middel (Carprofen 5 mg / kg) subkutant (SQ). At opdage og bekræfte hypoxi, injicere hypoxyprobe-1 (pimonidazole, 60 mg / kg).
BEMÆRK: Denne dosis svarer til 1,5 mg pr mus og opnås ved indblæsning 0,1 ml 15 mg / ml hypoxyprobe opløsning i PBS intraperitonealt (IP). Den hypoxyprobe er så påviselig obduktion i animalske væv ved immunhistokemi. - Placer musen i en anæstesi induktion kammer indeholdende 3 - 5% isofluran i 100% oxygen ved en strømningshastighed på 1 l / min.
- Efterlad musen i induktionen kammeret, indtil det ikke reagerer på eksterne stimuli. Fjern derefter dyret fra induction kammer. Placer dyret i liggende stilling på et sterilt afdækningsstykke placeret oven på en opvarmning pad på operationsbordet overflade. Brug en næsekegle at tilslutte den til en kontinuerlig strøm af 1 - 3% isofluran i 100% oxygen ved en strømningshastighed på 0,8 l / min.
- Påfør steril ikke-medicineret oftalmologiske salve til hvert øje for at forhindre corneal tørring. For at grundigt fjerne hår det kirurgiske område, gælder hårfjerning creme, der forlader det på huden for ikke mere end 10 sek. Derefter tørres hårfjerning creme ved hjælp af en ethanol prep pad.
- Udvide og fastgør bagbenet med et stykke tape ca. 45 grader fra midterlinjen af musen. Når bagbenet er sikker, tørre eksponeret hud med 10% povidon / iod vatpind / løsning, efterfulgt af ethanol, gentage to gange mere hver. For resten af den kirurgiske procedure, bruge et stereomikroskop for at opnå et forstørret billede af bagbenet region.
- Brug spidse pincet og kirurgiske sakse, gøre en indsnit i ski, ca. 1 cm lange, fra midt på låret mod lyskeområdet. Brug saltvand-fugtet fine vatpinde, forsigtigt børste væk subkutant fedtvæv omkring lårmusklen.
- afslører omhyggeligt den underliggende femorale arterie via stump dissektion gennem det subkutane fedtvæv. Stabiliser såret og kirurgiske område at eksponere vaskulaturen af midten af øvre lukkemuskel.
- Ved hjælp af fine pincet, blidt gennembore gennem membranøs femorale skede at eksponere nerveforgrening. Ved hjælp af en ren sæt af fine tænger, dissekere og adskille den femorale arterie fra den femorale vene og nerve ved den proximale beliggenhed nær lysken, distalt til lyskeligamentet. Vær forsigtig for at undgå piercing lårvenen væg.
- Efter dissektion, bestå en streng af 6-0 silkesutur under den femorale arterie og distalt til den gren af den laterale circumflex femorale arterie (LCFA). Okkludere den femorale arterie ved hjælp af dobbelte knuder (figur 3). Lukke snittet under anvendelse 6-0 polypropylen suturer. Efter lukning af snittet, injicere SQ 0,5 ml varm saltvand til væskebalancen terapi. Placer dyret på toppen af en draperet varm pude i inddrivelsen bur og løbende overvåge indtil vågen.
- Overvåg dyrene under første 6 timer efter operationen og sprøjt analgetisk middel (Carprofen 5 mg / kg, SQ) hver dag i 3 dage. Fjern suturer 10 dage efter kirurgi ved anvendelse af steril saks.
5. primær tumor Excision af benamputation
BEMÆRK: amputere tumorbærende lavere bagben når kalven størrelse på 250 mm3 for kontrolgruppen eller 3 dage efter FAL for hypoxiske gruppe.
- Barbering hår fra tumor-bærende lemmer fra den distale tibia til bækkenpartiet med hårklippere mens der forsigtigt holder dyret. Injicere analgetisk middel (Carprofen 5 mg / kg, SQ) før proceduren.
- Placer musen i en anæstesi induktion chrav indeholdende 3 - 5% isofluran i 100% oxygen ved en strømningshastighed på 1 l / min. Efterlad musen i induktionen kammeret, indtil det ikke reagerer på eksterne stimuli. Fjern derefter dyret fra induktion kammeret.
- Sende dyret i den rigtige laterale liggende stilling på et sterilt afdækningsstykke anbragt på en varmepude på operationsbordet overflade. Brug en næse kegle at tilslutte den til en kontinuerlig strøm af isofluran 1 - 3 ud% i 100% oxygen ved en flowhastighed på 0,8 l / min. Påfør steril ikke-medicineret oftalmologiske salve til hvert øje for at forhindre corneal tørring
- Forbered operationsstedet ved anvendelse af 10% povidon / iod vatpind / opløsning, efterfulgt af ethanol, gentaget 3 gange. Anvende en steril gaze (f.eks kirurgisk afdækningsstykke) over musen for at opnå et sterilt kirurgisk felt.
- Lav en midterste femoral omkredsen hud incision, efterfulgt af stump dissektion og tilbagetrækning af huden proximalt. Udsætte den mediale femorale neurovaskulær pedicle på medianen side af benet, og derefter ligerenær lyskeligamentet hjælp 4-0 belagt (polyglactin 910) absorberbar sutur materiale.
- Udfør en mid-femoral transsektion af muskelgrupper med en saks, efterfulgt af stump dissektion af blødt væv til coxofemoral fælles. Ved hjælp af en knogle cutter, udføre en mid-femoral osteotomi. Ved hjælp af en steril fin vatpind eller en absorberbar gelatine svamp, forsigtigt trykke på osteotomien websted for at minimere og forebygge blødninger.
- Luk overliggende huden ved hjælp af kirurgiske sår klip og injicere 0,5 ml varmt saltvand SQ for væskebalancen terapi. Placer dyret på toppen af en draperet varm pude i inddrivelsen bur og løbende overvåge indtil vågen.
- Efter operationen, indsamle vævsprøver fra primære tumorer til RNA, DNA eller protein isolation, snap fryse i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ˚C. For primær cellekultur, indsamle vævsprøver på dette trin, som beskrevet i afsnit 9 nedenfor. Fastgør resterende lemmer væv i 10% neutral-bufferet formalin til histologi og immunochemisprøve, herunder hypoxyprobe-1 detektion.
- Overvåg dyrene til brug, smerte og fødeindtagelse i de første 6 timer efter operationen, derefter hver dag i 3 dage. Injicere analgetisk middel (Carprofen 5 mg / kg, SQ) dagligt i 3 dage. Fjern såret clips 10 dage efter amputation ved hjælp af et sår klip remover.
6. Overvågning Mus for tilstedeværelsen af metastaser
- Overhold musene dagligt og vurdere dem for kliniske tegn på metastaser mindst to gange om ugen.
- Observere dyrene for tilstedeværelsen af macrometastases fremstående som masser, der udvikler sig i forskellige steder, typisk skuldre, kontralaterale ben og kæber. Med henblik herpå omhyggeligt palpere hoved, hals og armhuleregioner, og kontralaterale bagben. Check for indre organ metastaser via abdominal udspiling sammen med MRI-scanning.
- Kontrollere tilstedeværelsen af lungemetastaser ved at trykke på xyphoid proces (den nedre ende af brystbenet) med uafhænx finger. 24
BEMÆRK: Dette tryk formindsker diafragma respiration kapacitet. Mus med fremskredne lungemetastaser viser tegn på åndedrætsbesvær manifesterer sig ved arbejdskrævende vejrtrækning. - Observere dyrene for neurologiske symptomer, såsom benet lammelse og ataksi tyder metastaser til centralnervesystemet.
- Overvåg musene mindst en gang om ugen for vægttab, som en indikation af potentiel sygdomsprogression. Vægttab på over 15% af præ-proceduremæssige vægt betragtes som en human endepunkt.
7. Magnetisk Resonans Imaging (MRI) til påvisning Metastaser
- Udfør MRI at opdage metastaser på ønskede tidspunkter. 18
BEMÆRK: I den aktuelle undersøgelse blev en 7-Tesla vandret spektrometer anvendes. MRI blev udført på dag 15 og 35 efter amputering for SK-ES1-celler og på dag 15 for TC71 celler. - Placer musen i en anæstesi induktion chamber indeholdende 1 - med 3% isofluran i en gasblanding af 30% oxygen og 70% dinitrogenoxid.
- Efterlad musen i induktionen kammeret, indtil det ikke reagerer på eksterne stimuli. Fjern derefter dyret fra induktion kammeret.
- Overfør bedøvet mus på en stereotaktisk holder med åndedræt og temperatur monitorization med kontinuerlig administration af 1,5% isofluran og 30% dinitrogenoxid. Påfør steril ikke-medicineret oftalmologiske salve til hvert øje for at forhindre hornhindens tørhed. Billede dyret enten i en 40 eller 23 mm Bruker mus volumen spole til hele kroppen eller hjernescanning hhv.
- Brug en to-dimensionel, T2-vægtet RARE sekvens: TR = 3000 ms, TE = 24 ms, matrix = 256, FOV = 4.35 x 3,0 cm, skive tykkelse = 0,5 mm, RARE faktor = 4 og gennemsnit = 4. 18
- Placer dyret i en varm opsving bur og løbende overvåge indtil vågen.
BEMÆRK: Musene vil hurtigt komme sig, da der anvendes en overfladisk plan anæstesi. Overvåg dyrene i den første 6 timer efter billedbehandling for at sikre, at der ikke er negative virkninger af anæstesi.
8. Eutanasi og Obduktion
- Afliv musene gang dyrene med metastaser kan påvises ved MR og / eller kliniske symptomer på sygdomsprogression.
BEMÆRK: I den aktuelle undersøgelse blev musene aflivet på dag 50 og 25 efter amputering for dyr, der bærer SK-ES1 og TC71 xenotransplantater hhv. I nogle tilfælde tidligere eutanasi var nødvendigt på grund af en høj metastase byrde. - Aflive musene ved eksponering for CO2 ved 1,5 l / min (CO2 ved 10 - 30% af eutanasi kammerets vol / min). For at sikre dyrenes død, udføre cervikal dislokation efter CO 2 eksponering.
- Spray hele mus med 70% ethanol og placere den ind i laminær strømning. Opsaml blod ved hjertepunktur ved anvendelse af en 25 G ½ nål med en 1 ml sprøjte og overføres til en tapning tuvære indeholdende 2 mg EDTA.
- Saml følgende væv: milt, binyrerne, æggestokke, nyrer, lever, lunger, hjerne, højre ben, knoglemarv fra både humeri og rygrad, samt makroskopiske metastaser til stede andre steder. 25,26
- Fix halvdelen af hvert væv i 10% neutral-pufret formalin til histologi og immunkemi, herunder hypoxyprobe-1 detektion. Snap fryse den anden halvdel i flydende nitrogen og opbevar ved -80 C Til RNA, DNA eller protein isolation. 25,26 For primær cellekultur, indsamle vævsprøver som beskrevet i afsnit 9 nedenfor.
9. primær cellekultur
- For at udføre primær cellekultur, dissekere væv fra den amputerede lemmer (afsnit 5 ovenfor) eller under obduktion (§ 8) under sterile forhold i en laminar flow hætte.
- Forbered celledyrkningsmedier passende for cellelinjen anvendt til ortotopisk injektioner, suppleret med penicillin (200 enheder / ml),streptomycin (200 ug / ml), fungizon (1 ug / ml) og 0,2% mycoplasma profylaktisk antibiotikum. Anbring 2,5 ml af primære dyrkningsmedium i en 6 cm cellekultur plade.
- Vælg levedygtige områder tumor væv fra primære tumorer eller metastaser, og derefter isolere to til tre segmenter på 2-3 mm med hver steril saks.
BEMÆRK: levedygtig tumor væv er normalt findes på kanterne af tumoren og kan skelnes fra nekrose ved sin rosa eller rødlig farve, betydelig glans og samlet våd udseende. I modsætning hertil er nekrotisk væv almindeligvis ses i midten af tumoren og præsenterer som et hvidligt / cremefarvet masse med en kedelig, osteagtig udseende. 27 - Overfør isolerede segmenter til en 6 cm cellekultur plade indeholdende primær dyrkningsmedium beskrevet i trin 9.2.
- Kultur celler under standardbetingelser, som beskrevet i afsnit 1 (BEMÆRK) og 9.2. 18,28 Tjek kulturen for cellulær udvækst som følge af de væv stykker, which bemærkes inden for få dage. Når cellerne når sammenløb, Trypsinisér og udbrede dem i henhold til standard celledyrkningsteknikker.
BEMÆRK: primær cellekultur kan efterfølgende anvendes til at evaluere vækst og metastatiske egenskaber af celler afledt fra kontrol- og hypoxiske tumorer samt deres molekylære funktioner, som tidligere beskrevet. 18
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter injektion af ES-celler i musculus gastrocnemius er de primære tumorer fik lov til at vokse til en kalv størrelse på 250 mm3 (figur 1, 2). Den nødvendige tid til tumorerne til at nå denne mængde typisk spænder fra 10 - 15 dage for TC71 til 20-25 dage for SK-ES1 xenografter hhv. Tumorer ved en kalv volumen på 250 mm3, udviser et relativt lavt niveau af endogen hypoxi (ca. 3% af tumorvæv), baseret på hypoxybrobe-1 (pimonidazole) farvning (figur 4A, C). Vigtigere er det, i disse kontrolforanstaltninger tumorer blev observeret positiv farvning for hypoxyprobe-1 alene i de områder af fysiologisk hypoxi, dvs i tumorceller, der er fjernt fra vaskulaturen og begynde at undergå celledød (figur 4A). En sådan farvning udviser en karakteristisk "air-brush" mønster, mens størstedelen af raske tumorvæv forbliver negative for hypoxyprobe-1. <sup> 6 Derimod FAL udført på dette tidspunkt skaber dybe hypoxi, som det fremgår af den positive farvning for hypoxyprobe-1 observeret i langt størstedelen af tumorcellerne ved 4 timer efter FAL (figur 4B). Navnlig er de hypoxyprobe-1-positive tumorceller også observeret i umiddelbar nærhed af blodkar og karakteristisk mønster af fysiologiske hypoxi er tabt. I disse FAL-behandlede tumorer, 73% af væv består af hypoksiske tumorceller (figur 4C). Tumorvævet også udviser de første tegn på hypoxi-induceret skade, herunder celle svind og løs struktur (figur 4B).
Effektiviteten af FAL blev yderligere understøttet af den fuldstændig inhibering af primær tumorvækst. I perioden 3-dages mellem FAL og amputation, har størrelsen af primære tumorer ikke stige (figur 5A). I modsætning hertil primære tumorer fra mus udsat for sham surgery fortsatte med at vokse hurtigt og nåede et volumen på ca. 650 mm 3, og dermed efterligne væksten af tumorer i kontrol mus ikke udsættes for kirurgi (figur 5A). 18 I overensstemmelse med disse data, histopatologisk analyse viste store områder af nekrose i FAL-behandlede primære tumorer høstet 3 dage efter kirurgi (figur 5B). Alligevel var der grupper af levedygtige tumorceller til stede i tumorvævet, sædvanligvis placeret ved kanterne af tumoren, tæt på vaskulaturen (figur 5B). For at undersøge iltning status for disse celler vi brugte hypoxyprobes, der aktiveres med levende hypoxiske celler, efterfølgende få evnen til covalent at binde til proteiner i disse celler. 29 Som sådan er disse sonder tjener som permanent markør af cellerne, der oplevede hypoxi på ethvert tidspunkt. Således at påvise ændringer i iltindholdet af tumorcellerne under hele den experiment, vi brugte to forskellige hypoxyprobes der kan påvises uafhængigt ved immunhistokemi. Proberne blev administreret i to tidspunkter - umiddelbart før FAL (hypoxyprobe-1) og før amputation (hypoxyprobe-2, CCI-103F) - og deres lokalisering påvistes i tumorer høstet 3 dage efter FAL (figur 1). Hypoxyprobe-1, som var til stede i systemet på tidspunktet for FAL, markerede et flertal af tumorcellerne, som vævet blev alvorligt hypoxisk (figur 5C). Denne mærkning er også tydeligt i områder med nekrose / apoptose, da disse celler stadig var i live på tidspunktet for FAL og derfor i stand til permanent at binde hypoxyprobe-1, som vist i figur 4B. I modsætning hertil hypoxyprobe-2 administreret 2 dage efter FAL kun farvede levedygtige celler, som cellerne i nekrotiske områder var allerede død og ude af stand til at aktivere proben på tidspunktet for dens indgivelse (figur 5D). Interessant, vi også observed levedygtigt tumorvæv støder op til vaskulaturen, der var oprindeligt hypoxisk (hypoxyprobe-1-positive), men tilstrækkeligt iltet på det senere tidspunkt (hypoxyprobe-2-negativ) (figur 5C, D). Dette fund er i overensstemmelse med tidligere rapporter indikerer, at sikkerhed fartøj-afhængige væv reperfusion genskaber blodgennemstrømningen i bagbenet 3 dage efter FAL. 20 De levedygtige tumorceller tilbage i tumorvævet 3 dage efter FAL var særdeles invasiv, hvilket fremgår af deres massive intravasation på vaskulariserede kanter af tumoren (figur 5E). Nogle af cellerne i karhulrummet var positive for hypoxyprobe-1, hvilket indikerer, at de var blevet hypoxisk upon FAL, men forblev levedygtige. Kollektivt antyder disse data, at vævs- reperfusion efter alvorlig hypoxi kan lette udslip af celler fra primære tumorer.
Baseret på pilotforsøget, udbredte metastaser varpåvises ved MRI cirka 35 dage efter amputation for SK-ES1 xenografter, mens TC71-celler typisk metastaseret inden for 15 dage. Derfor for sammenlignende analyse af metastaser ventetid og frekvens, MRI blev udført på dag 15 og 35 efter amputation for dyrene bærer SK-ES1 tumorer, mens en billeddannelse på dag 15 var tilstrækkeligt for mus med TC71 tumorer. Eutanasi blev udført på dag 50 og dag 25 for dyrene med SK-ES1 og TC71 xenografter hhv. Som tidligere rapporteret, de mest almindelige typer af metastaser omfattede blødt væv masserne i skulderen området, samt knoglemetastaser til kontralaterale ben, maxillary område og ryg for SK-ES1 celler og lunge og bækken tumorer til TC71. 18 Endvidere hyppige metastaser på indre organer, herunder binyrer, lunger og lever samt knoglemarvsinfiltration, blev observeret hos mus, som bærer FAL-behandlede SK-ES1 xenografter (figur 6). Generelt hypoxi steget betydeligtden samlede (SK-ES1) eller site-specifik (TC71) hyppigheden og mangfoldighed af metastaser i begge cellelinier. Imidlertid TC71 xenografter udviklede også hyppige tilbagevendende masserne ved stedet for amputation (25% for kontrol og 40% for FAL-behandlede tumorer), som tidligere beskrevet for de store TC71 primære tumorer. 18
De væv fra kontrol og FAL-behandlede primære tumorer og metastaser kan også være en kilde til materiale til omfattende molekylære analyser rettet mod identifikation af hypoxi-aktiverede involverede veje i ES formidling. For eksempel har vi observeret signifikante forskelle i metabolomiske profiler af kontrol og hypoxiske primære tumorer (data ikke vist). Vi var også i stand til at isolere multiple cellelinier fra alle de ovennævnte væv. I mange tilfælde er de celler afledt fra FAL-behandlede tumorer udviste mærkbare ændringer i morfologi i forhold til de oprindelige celler og sådanne afledt af kontrol tumors (figur 7A). Renheden af disse cellekulturer blev bekræftet ved positiv immunfarvning for Ewing sarkom markering, CD99 (figur 7B). Desuden 100% af cellerne i de etablerede cellelinjer havde et positivt signal i fluorescens in situ hybridisering (FISH) med humane centromere prober, hvilket ofte har med øget kromosom numre (figur 8A). Den humane oprindelse af disse celler blev yderligere bekræftet ved analyse af metafasekromosomer (figur 8B), som udviste cytogenetiske omlejringer beskrevet tidligere for SK-ES1 celler i både den oprindelige cellelinie og celler afledt af FAL-behandlede tumorer (figur 8B). 30
Figur 1. Oversigt over ES Hypoxi Model. ES-celler (1 - 2 x 10 6) blev injiceret i gastrocnemius muskler SCID / beige-mus. Når de resulterende primære tumorer nåede en kalv volumen på 250 mm3, blev musene inddelt i to forsøgsgrupper. Mus fra kontrolgruppen blev injiceret med hypoxyprobe-1 (HP-1), og de primære tumorer blev udskåret ved amputation af lemmer. Mus fra den hypoxiske gruppe blev injiceret med hypoxyprobe-1 og derefter udsat for femoral arterie ligering (FAL). To dage senere blev musene injiceret med hypoxyprobe-2 (HP-2), og derefter tumorbærende lemmer amputeret tre dage efter FAL. Dyr fra begge grupper blev overvåget ved periodisk magnetisk resonans billeddannelse (MRI). Når metastaser blev klart baseret på billedbehandling og kliniske tegn blev musene aflivet, og tilstedeværelsen af metastaser blev bekræftet ved obduktion og histopatologiske analyser. Tidspunktet for tumorvækst, billedbehandling og eutanasi er baseret på SK-ES1 celle vækst og metastase. Bemærk, at mens hypoxyprobe-2 var nødvendige for at fastslå den metode og visuAlize ændringer i hypoxi niveauer i perioden mellem FAL og lemmer amputation, dets anvendelse er ikke afgørende for den faktiske eksperimenter. Derfor er dette trin ikke inkluderet i protokollen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Primær tumorvækst. A. Magnetisk resonans-billede (MRI) af en intakt bagben. Den røde pil angiver sitet og retningen af tumorcellen ortotopisk injektion. B. Primær tumor ved en kalv volumen på ca. 250 mm3 vokser i musculus gastrocnemius (rød omrids). Røde pilespidser angiver steder af knogle ødelæggelse. T - skinneben. venligst cslikke her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. websted af femorale arterie Ligation. Et repræsentativt postmortem røntgen arteriogram af en 129S1 / SVJ mus perfunderet med bariumsulfat umiddelbart efter ligering er vist at fremhæve tilstedeværelsen af præ-eksisterende kollaterale kar. Bemærk, at mens billedet viser to ligeringer (xs), en distal til den laterale circumflex femorale arterie (LCFA) (rød X) og en anden proximalt til ægt arterie (hvidt X), tumor hypoxia model anvendes kun den proximale ligering nær lyskeligamentet og distalt for LCFA (rødt X). Regionen kollateraludvikling fartøj er vist som beskrevet (svage fartøjer), og de er identificeret ved deres snoede, kork-skrue form. Klik hanre for et større version af denne figur.
Figur 4. Tumor Hypoxi induceret af lårarterien Ligering (FAL). A. En kontrol tumor ved en kalv volumen på 250 mm3 farvet ved hematoxylin & eosin (H & E) og immunfarvet for hypoxyprobe-1 (brun). Hypoxyprobe-1 immunfarvning udelukkende observeret i de områder af fysiologisk tumor hypoxi, hvor tumorcellerne fjernt fra vaskulaturen er berøvet oxygen og begynde at undergå celledød. B. FAL-behandlede primær tumor på et tilsvarende størrelse høstet 4 timer efter ligering og farvet med H & E og immunfarvet for hypoxyprobe-1. Størstedelen af tumorceller er yderst positivt for hypoxyprobe-1, herunder dem i umiddelbar nærhed af vaskulaturen. V - blodkar. C. Området med positiv farvning for hypoxyprobe-1 var quantifIED i kontrol- og FAL-behandlede tumorer ved hjælp ImageJ software. Fejl- søjler repræsenterer SEM. *** - P <0,001 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Effekt af lårarterien æggelederne (FAL) om primær tumorvækst. A. vækst Primær tumor i 3-dages periode mellem kirurgi og amputation i FAL- (n = 4) og skinkirurgi-behandlede (n = 4) dyr, i sammenligning med intakte kontroltumorer (n = 6). Fejl- søjler repræsenterer SD. *** - P <0,001 sammenlignet med både kontrol- og skinkirurgi-behandlede tumorer. B. hematoxylin og eosin (H & E) farvning af en FAL-behandlede tumor høstet 3 dage efter ligering afslører udbredt nekrose inden tumor. Den røde omrids angiver et område af levedygtig tumor ceLLS i umiddelbar nærhed af en stærkt vaskulariseret region perfunderet 3 dage efter FAL. C. FAL-behandlede tumorvæv høstet 3 dage efter kirurgi immunfarvet for hypoxyprobe-1. Hypoxyprobe-1 blev injiceret før FAL. Derfor er den positive immunfarvning indikerer eksistensen af omfattende vævshypoksi umiddelbart efter kirurgi. D. Hypoxyprobe-2 blev injiceret 2 dage efter FAL, og vævet opsamlet 24 timer senere, ved amputation. Positive hypoxyprobe-2-farvning identificerer vævshypoksi på tidspunktet for amputation. Den røde pil viser væv, der er hypoxisk ved begge tidspunkter, mens den gule pil angiver et område støder op til vaskulaturen, der var hypoxisk umiddelbart efter FAL (hypoxyprobe-1-positive), men negative for hypoxyprobe-2 ved udskæring, som er indikativ for væv reperfusion. Manglen på hypoxyprobe-2-farvning i nekrotiske områder antyder, at cellerne i denne region ikke var levedygtige på tidspunktet for dens indgivelse og derforude af stand til aktivt at binde proben. Farvningen præsenteret i paneler BD blev udført på vævssnit serielle. E. Intravasation i FAL-behandlede tumor 3 dage efter FAL. Den immunfarvning identificerer levedygtige celler positive for hypoxyprobe-1 inden fartøjet lumen (rød pil). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Eksempler på metastaser i mus med FAL-behandlede SK-ES1 tumorer. Metastaserne blev detekteret ved magnetisk resonans billeddannelse (MRI) og bekræftet ved obduktion og histopatologiske analyser (hematoxylin & eosin-farvning H & E). M - metastase. Klik her for at se et større vers ion af dette tal.
Figur 7. Karakteristik af celler, der stammer fra FAL-behandlede primære tumorer. A. levedygtige cellekulturer blev etableret fra væv høstet fra kontrol og hypoxiske primære tumorer og deres morfologi blev sammenlignet med de oprindelige cellelinjer anvendes til indledende ortotopisk injektioner. De celler, der stammer fra FAL-behandlede primære tumorer udviser dramatiske ændringer i deres størrelser og morfologi. Repræsentative billeder af de oprindelige og primære tumor-afledt SK-ES1 celler er vist. B. Repræsentative billeder af celler afledt af FAL-behandlede tumorer immunofarvede for ES markering, CD99, og modfarvet med DNA-bindende farvestof, DAPI. Alle celler er CD99-positive, herunder hypertrofe celler indeholdende udvidede kerner (hvid pil). OAD / 54.532 / 54532fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8. Kromosomal Analyse af celler, der stammer fra FAL-behandlede tumorer. A. Fluorescens in situ hybridisering (FISH) analyse i interfaseceller viser to kerner med signaler for human centromere 4 probe. Den store kerne med fire signaler angiver en tetraploid (4n) celle (hvid pil). B. FISH-analyse i repræsentative metafaser for SK-ES1 oprindelige cellelinje og af cellen afledt af FAL-behandlede primære tumor. Røde pile angiver inv (1) (p13.1q21), en ikke-tilfældig cytogenetisk omlejring karakteristisk for SK-ES1 celler. Røde signaler: menneskelig centromerregionen 4 sonde; Grønne signaler i de oprindelige SK-ES1 celler: NPY5R sonde på kromosom 4q32.2.e.com/files/ftp_upload/54532/54532fig8large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores model involverer sammenligning af metastase i to forsøgsgrupper - en kontrolgruppe, hvor tumorerne får lov at udvikle sig i bagbenet efterfulgt af amputation efter at have nået en kalv volumen på 250 mm3, og en hypoxi-eksponerede gruppe, hvor tumor- bærende bagben udsættes for FAL ved samme volumen, efterfulgt af amputation 3 dage senere. Selvom i disse eksperimenter de FAL-behandlede tumorer er amputeret med en lille forsinkelse, sammenlignet med kontrol tumorer, er deres størrelse ikke stige i perioden 3-dages mellem ligation og amputation. Derfor er denne fremgangsmåde muliggør sammenligningen af metastatisk potentiale mellem tumorer af sammenlignelige størrelser, men med dramatisk forskellige niveauer af hypoxi. I modsætning hertil ved hjælp af simuleret kirurgi, ville en almindeligt anvendt kontrol til kirurgiske indgreb, efterfulgt af 3 dages tumorvækst medføre betydelige forskelle i tumorstørrelse mellem forsøgsgrupperne, med skinkirurgi-treated primære tumorer besidder signifikante niveauer af endogen hypoxi. Baseret på piloteksperimenter, går skinkirurgi ikke signifikant påvirker tumorvækst eller dets hypoxi niveauer og kan således fjernes fra det eksperimentelle design. I stedet er strategien at sammenligne tumorer af lignende størrelser og forskellige hypoxi niveauer er et yderst relevant model til at belyse effekten af hypoxi på udbredelse af sygdommen. Vigtigere er det, i modsætning til tidligere in vitro-undersøgelser, denne tilgang giver mulighed for omfattende evaluering af de pro-metastatiske handlinger hypoxi i en naturlig tumor mikromiljø. 4-6
Målet med den eksperimentelle design var at opnå en lav basalniveau af metastaser, der ville give mulighed for påvisning af en hypoxi-induceret stimulerende virkning på deres dannelse. Vi konstaterede, at en kalv størrelse på 250 mm 3 ved FAL og amputation var optimal for SK-ES1 primære tumorer. Imidlertid vil denne parameter skal optimeres for ea CH cellelinie, afhængigt af deres metastatiske potentiale og lokal invasionsevne. For tumorer med højere metastatisk potentiale, kan den primære tumorstørrelse ved amputation være nødvendigt at reducere. F.eks TC71 tumorer udviser en høj lokal invasionsevne manifesteret ved hyppig dannelse af tilbagevendende tumorer på stedet for amputation. 18 Når sådanne masser udvikle sig, skal udelukkes fra analyser, da det ikke ville være klart, om de efterfølgende fjernmetastaser stammede fra de primære tumorer eller fra tilbagevendende tumorer, der ofte vokser hurtigt, og udviser en høj grad af endogen hypoxi dyrene. Fra tidligere erfaringer, uafhængig af cellelinje anvendte, 150 mm 3 er den minimale tumorbærende kalv størrelse, der kan måles pålideligt og normaliseret. Hvis faldende tumorstørrelsen på FAL og amputation eliminerer ikke tilbagevendende tumorer eller formindske basal metastase sats tilstrækkeligt, kan den særlige cellelinie pågældende ikke være egnet til disse eksperimenter.
ve_content "> Ligeledes er det vigtigt at fastslå tidslinjen af MRI og eutanasi for hver enkelt cellelinie, afhængigt latenstiden for dens metastaser. Især kan de kirurgiske sårklemmer som interfererer med MRI fjernes tidligst 10 dage post- kirurgi, og denne periode må undertiden forlænges på grund af komplikationer med healing. således i denne undersøgelse vi etableret dag 15 som tidspunktet for den første MRI.En anden vigtig overvejelse i denne model er at opretholde et niveau af hypoxi stand til at inducere metastatiske processer uden at forårsage fuldstændig tumor nekrose, hvilket ville forhindre spredning af tumorceller. Selvom vi ikke har stødt på dette problem i denne undersøgelse, hvis det er nødvendigt, sværhedsgraden af hypoxi kan reguleres ved at ændre det præcise sted og antal ligeringer i forhold til grenene af den femorale arterie, såsom LCFA Genu arterie. 20 Således vil en ligering proximalt til LCFA skabe mere alvorlig iskæmi i hindlimb cirkulation, og derved øge de hypoxiske betingelser i den distale ben. I modsætning hertil vil ligering distalt til efterfølgende grene af den femorale arterie formindske resulterende hypoxi i den nedre bagben.
Vigtigere er det, var der ingen alvorlige bivirkninger af kombineret FAL og amputation procedurer og ingen dødsfald relateret til operationer, som tidligere rapporteret for disse teknikker udføres separat. 18-20 er således succes af metoden primært begrænset af hastigheden af tumor take ved det primære sted og hyppigheden af tilbagevendende tumorer, som begge er cellelinie-afhængige.
Som hypoxi er blevet impliceret som en pro-metastatisk faktor i mange tumortyper, kan denne tilgang også være egnet til direkte at teste dens virkninger og definere dens mekanismer for aktioner i andre sarkomer, der udvikler i lemmerne. 23 Desuden kan en lignende strategi anvendes på andre maligniteter vokser i ortotopisk miljøer wed en veldefineret blodforsyning rute. Således med passende modifikationer, kan denne model være et nyttigt redskab i forskning ud over området for ES biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 ml Insulin syringes with permanently attached 28 G ½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges - Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25 G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 ml syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3-EDTA Micro tube 1.3 ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
References
- Lessnick, S. L., Ladanyi, M. Molecular pathogenesis of Ewing sarcoma: new therapeutic and transcriptional targets. Annu Rev Pathol. 7, 145-159 (2012).
- Ladenstein, R. Primary disseminated multifocal Ewing sarcoma: results of the Euro-EWING 99 trial. J Clin Oncol. 28, 3284-3291 (2010).
- Dunst, J., Ahrens, S., Paulussen, M., Burdach, S., Jurgens, H. Prognostic impact of tumor perfusion in MR-imaging studies in Ewing tumors. Strahlenther Onkol. 177, 153-159 (2001).
- Aryee, D. N. Hypoxia modulates EWS-FLI1 transcriptional signature and enhances the malignant properties of Ewing's sarcoma cells in vitro. Cancer Research. 70, 4015-4023 (2010).
- Knowles, H. J., Schaefer, K. L., Dirksen, U., Athanasou, N. A. Hypoxia and hypoglycaemia in Ewing's sarcoma and osteosarcoma: regulation and phenotypic effects of Hypoxia-Inducible Factor. BMC cancer. 10, 372 (2010).
- Tilan, J. U. Hypoxia shifts activity of neuropeptide Y in Ewing sarcoma from growth-inhibitory to growth-promoting effects. Oncotarget. 4, 2487-2501 (2013).
- Franzius, C. Successful high-resolution animal positron emission tomography of human Ewing tumours and their metastases in a murine xenograft model. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 33, 1432-1441 (2006).
- Hauer, K. DKK2 mediates osteolysis, invasiveness, and metastatic spread in Ewing sarcoma. Cancer Research. 73, 967-977 (2012).
- Manara, M. C. Preclinical in vivo study of new insulin-like growth factor-I receptor--specific inhibitor in Ewing's sarcoma. Clin Cancer Res. 13, 1322-1330 (2007).
- Scotlandi, K. Murine model for skeletal metastases of Ewing's sarcoma. J Orthop Res. 18, 959-966 (2000).
- Vormoor, J. Establishment of an in vivo model for pediatric Ewing tumors by transplantation into NOD/scid mice. Pediatr Res. 49, 332-341 (2001).
- Picarda, G. Preclinical evidence that use of TRAIL in Ewing's sarcoma and osteosarcoma therapy inhibits tumor growth, prevents osteolysis, and increases animal survival. Clin Cancer Res. 16, 2363-2374 (2010).
- Vormoor, B. Development of a preclinical orthotopic xenograft model of ewing sarcoma and other human malignant bone disease using advanced in vivo imaging. PLoS One. 9, e85128 (2014).
- Wang, Y. Platelet-derived growth factor receptor beta inhibition increases tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) sensitivity: imatinib and TRAIL dual therapy. Cancer. 116, 3892-3902 (2010).
- Wang, Y. X. Inhibiting platelet-derived growth factor beta reduces Ewing's sarcoma growth and metastasis in a novel orthotopic human xenograft model. In Vivo. 23, 903-909 (2009).
- Odri, G. A. Zoledronic acid as a new adjuvant therapeutic strategy for Ewing's sarcoma patients. Cancer Research. 70, 7610-7619 (2010).
- Merchant, M. S. Interferon gamma enhances the effectiveness of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonists in a xenograft model of Ewing's sarcoma. Cancer Research. 64, 8349-8356 (2004).
- Hong, S. H. High neuropeptide Y release associates with Ewing sarcoma bone dissemination - in vivo model of site-specific metastases. Oncotarget. 6, 7151-7165 (2015).
- Lee, E. W. Neuropeptide Y induces ischemic angiogenesis and restores function of ischemic skeletal muscles. J Clin Invest. 111, 1853-1862 (2003).
- Tilan, J. U. Platelet neuropeptide Y is critical for ischemic revascularization in mice. FASEB J. , (2013).
- Toffoli, S., Michiels, C. Intermittent hypoxia is a key regulator of cancer cell and endothelial cell interplay in tumours. The FEBS journal. 275, 2991-3002 (2008).
- Das, B. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem cells (Dayton, Ohio). 26, 1818-1830 (2008).
- Arndt, C. A., Rose, P. S., Folpe, A. L., Laack, N. N. Common musculoskeletal tumors of childhood and adolescence. Mayo Clin Proc. 87, 475-487 (2012).
- Mendoza, A. A novel noninvasive method for evaluating experimental lung metastasis in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52, 584-589 (2013).
- Feldman, D. B., Seely, J. C. Necropsy Guide: Rodents and the Rabbit. , CRC Press. (1988).
- Parkinson, C. M. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J Vis Exp. , (2011).
- Raymond, A. K., Lazar, A. J. Bone Sarcoma. PP, L. in, S, P. atel , Springer. (2013).
- Dietel, M., Arps, H., Gerding, D., Trapp, M., Niendorf, A. Establishment of primary cell cultures: experiences with 155 cell strains. Klin Wochenschr. 65, 507-512 (1987).
- Varghese, A. J., Gulyas, S., Mohindra, J. K. Hypoxia-dependent reduction of 1-(2-nitro-1-imidazolyl)-3-methoxy-2-propanol by Chinese hamster ovary cells and KHT tumor cells in vitro and in vivo. Cancer Research. 36, 3761-3765 (1976).
- ATCC. , http://www.atcc.org/products/all/HTB-86.aspx#characteristics (2014).
