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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

ट्यूमर मेटास्टेसिस पर हाइपोक्सिया का परीक्षण प्रभाव के लिए vivo मॉडल में

Published: December 9, 2016 doi: 10.3791/54532
Automatic Translation
*1, *2,3, 1, 3, 4, 1, 3, 3, 5, 6, 6, 6, 6,7, 1
1Department of Biochemistry and Molecular & Cellular Biology, Georgetown University Medical Center, 2Department of Nursing, Georgetown University, School of Nursing and Health Studies, 3Department of Human Science, Georgetown University, School of Nursing and Health Studies, 4School of Medicine, Georgetown University Medical Center, 5Department of Pathology and Neuropathology, Medical University of Gdańsk, 6Department of Oncology, Georgetown University Medical Center, 7Department of Pathology, Georgetown University Medical Center
* These authors contributed equally

Introduction

इविंग सारकोमा (ते) एक आक्रामक बच्चों और किशोरों को प्रभावित करने द्रोह है। 1 ट्यूमर, मुलायम ऊतकों और हड्डियों में विकसित सामान्यतः अंगों में। जबकि मेटास्टेसिस की उपस्थिति ते रोगियों के लिए सबसे शक्तिशाली प्रतिकूल शकुन कारक है, तंत्र उनके विकास अंतर्निहित अस्पष्ट रहते हैं। 2 ट्यूमर हाइपोक्सिया ते प्रगति में फंसा कुछ कारकों में से एक है। ते रोगियों में, ट्यूमर के ऊतक के भीतर गैर-भरकर रखा क्षेत्रों की उपस्थिति गरीब रोग का निदान के साथ जुड़ा हुआ है। 3 इन विट्रो में, हाइपोक्सिया ES कोशिकाओं के invasiveness बढ़ जाती है और समर्थक मेटास्टेटिक जीनों की अभिव्यक्ति हो सके। 4-6 हालांकि, सबूत की इन पंक्तियों के बावजूद, हाइपोक्सिया प्रेरित ते प्रगति और प्रसार के लिए कोई सीधा सबूत मौजूद है। इसके अलावा, तंत्र है जिसके द्वारा हाइपोक्सिया डाल रही है इस तरह के प्रभाव होते हैं, वर्तमान में, अज्ञात है। इसलिए, हम vivo मॉडल बनाया है विट्रो डेटा और नैदानिक obser में मौजूदा बीच की खाई को भरने के लिएvations। इस मॉडल प्रणाली उनके प्राकृतिक वातावरण में होने वाली ट्यूमर पर हाइपोक्सिया के प्रभाव से प्रत्यक्ष परीक्षण के लिए सक्षम बनाता है, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) का उपयोग ट्यूमर प्रगति और पूर्व vivo रोग और आणविक विश्लेषण (चित्रा 1) के साथ संयोजन में विवो में मेटास्टेसिस का पालन करें।

चूंकि ते की कोई स्थापित ट्रांसजेनिक मॉडल वर्तमान में उपलब्ध है, इन ट्यूमर के मेटास्टेटिक संपत्तियों पर vivo अध्ययन immunocompromised चूहों में मानव कोशिकाओं के इंजेक्शन पर भरोसा करते हैं। प्रतिरक्षा के बिगड़ा पशुओं के उपयोग रोग प्रगति पर प्रतिरक्षा प्रणाली के प्रभाव को नजरअंदाज कर सकते हैं, वहीं मानव कोशिकाओं का उपयोग करने की क्षमता इस तरह के अध्ययन के translatability बढ़ जाती है। विभिन्न मॉडलों के बीच जेनोग्राफ्ट, पूंछ नस में इंजेक्शन प्रणालीगत सबसे आसान प्रदर्शन कर रहे हैं, फिर भी वे ट्यूमर सेल intravasation की प्रारंभिक कदम न आना और विकास की प्राथमिक साइट से बचने। 7-12 दूसरी ओर, orthoto पिक xenografting है, जो हड्डियों (फीमर, रिब) या मांसपेशियों में ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन शामिल है, और अधिक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, लेकिन यह भी अधिक जैविक रूप से मानव कैंसर के लिए प्रासंगिक है। 13-16 मेटास्टेसिस विकास से पहले हालांकि, अतीत में, उच्च प्राथमिक ट्यूमर का तेजी से विकास के साथ जुड़े रुग्णता अक्सर जरूरी हो गया है पशु इच्छामृत्यु। इस अध्ययन में, हम gastrocnemius मांसपेशी एमआरआई द्वारा मेटास्टेटिक प्रगति के अनुदैर्ध्य निगरानी के साथ संयुक्त जिसके परिणामस्वरूप प्राथमिक ट्यूमर के छांटना के द्वारा पीछा में सेल इंजेक्शन के एक पहले से स्थापित मॉडल कार्यरत हैं। मांसपेशियों और हड्डियों - - 17,18 टिबिया के पास में gastrocnemius मांसपेशी में इस तरह के इंजेक्शन दो प्राकृतिक ते वातावरण में ट्यूमर के विकास के लिए अनुमति देते हैं और स्थानों को आम तौर पर मानव में प्रभावित करने के लिए दूर के मेटास्टेसिस में परिणाम। 18 इस प्रकार, इस मॉडल सही रोग प्रगति दौरान ते रोगियों में होने वाली प्रक्रियाओं मेटास्टेटिक स्मरण दिलाता है।

तम्बू "> कम hindlimb में प्राथमिक ट्यूमर के स्थानीयकरण भी ट्यूमर के ऊतक को रक्त की आपूर्ति के सटीक नियंत्रण की सुविधा। और्विक धमनी बंधाव (फल) एक अच्छी तरह से स्थापित angiogenesis अनुसंधान में उपयोग के बाहर के क्षेत्रों के लिए रक्त के प्रवाह को ब्लॉक करने के लिए तकनीक है पैर और इस प्रकार ischemia के जवाब में ऊतक vascularization की जाँच। 19,20 महत्वपूर्ण बात है, रक्त प्रवाह में प्रारंभिक बूंद जमानत के पोत उद्घाटन और ऊतक reperfusion मनाया लगभग 3 दिनों के बाद फल द्वारा पीछा किया जाता है। 20, जब एक ट्यूमर असर अंग में प्रदर्शन किया, इस मॉडल तेजी से बढ़ ट्यूमर में हाइपोक्सिया / reperfusion की घटनाओं है कि स्वाभाविक रूप से हो recreates और नए खुले जमानत के जहाजों के माध्यम से कम करने के लिए hindlimb छिड़काव की बहाली के कारण मेटास्टेटिक ट्यूमर कोशिकाओं के भागने के लिए सक्षम बनाता है। 21 महत्वपूर्ण बात है, ट्यूमर के आकार है जब इस प्रक्रिया का प्रदर्शन किया जाना चाहिए काफी छोटा नियंत्रण ट्यूमर में अत्यधिक हाइपोक्सिया (आमतौर पर ट्यूमर असर बछड़ा खंड पर रोकने के लिए150 के ume - 250 मिमी 3), नियंत्रण और फल का इलाज समूहों के बीच ट्यूमर हाइपोक्सिया के स्तर में काफी अंतर को सुनिश्चित करने।

ते विलंबता पर हाइपोक्सिया के प्रभाव और मेटास्टेसिस की आवृत्ति के अनुदैर्ध्य निगरानी के अलावा, इस मॉडल को भी ऊतकों के संग्रह और दोनों को प्राथमिक ट्यूमर और मेटास्टेसिस से नए सेल लाइनों के विकास के लिए अनुमति देता है। महत्वपूर्ण बात है, पिछले काम स्थापना की है कि मेटास्टेसिस व्युत्पन्न सेल लाइनों जानवरों के reintroduction पर बढ़ाया metastatic क्षमता का प्रदर्शन है, यह दर्शाता है कि ट्यूमर प्रसार ट्यूमर सेल phenotype में स्थायी बदलाव, और इस तरह इन सेल लाइनों का उपयोग मेटास्टेटिक प्रक्रियाओं को समझने के लिए मान्य के साथ जुड़ा हुआ है। 18 सामूहिक रूप से, इन मॉडलों अब हाइपोक्सिया प्रेरित मेटास्टेटिक रास्ते की पहचान करने के लिए आवश्यक आनुवंशिक और आणविक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

हाइपोक्सिया के रूप में एक समर्थक मेटास्टेटिक कारक विभिन्न टी के द्रोह बढ़ाने हैumors, हमारे मॉडल अन्य ट्यूमर प्रकार है कि स्वाभाविक रूप से अंगों में विकसित करने, ऐसे osteosarcoma और rhabdomyosarcoma के रूप में हाइपोक्सिया की भूमिका की जांच करने के लिए एक मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। 21-23 इसके अलावा, एक समान दृष्टिकोण रक्त की आपूर्ति की एक अच्छी तरह से परिभाषित मार्ग के साथ अन्य शारीरिक स्थानों में बढ़ रहा है कैंसर के लिए लागू किया जा सकता है। अंत में, मॉडल संशोधित किया जा सकता है और इसकी उपयोगिता आगे बढ़ाया, व्यक्तिगत अनुसंधान की जरूरत पर निर्भर करता है।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं जॉर्ज टाउन विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. Orthotopic इंजेक्शन के लिए सेल तैयार

  1. मानक स्थितियों के तहत संस्कृति मानव ES कोशिकाओं। 5 चूहों के इंजेक्शन के लिए confluency के 70% से अधिक नहीं लगभग एक 15 सेमी सेल कल्चर प्लेट का प्रयोग करें।
    नोट: इस अध्ययन के लिए, एस-ES1 कोशिकाओं मैककॉय के 5 ए माध्यम में सुसंस्कृत कोलेजन लेपित प्लेटें और TC71 कोशिकाओं पर 15% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ कर रहे थे सुसंस्कृत RPMI में 10% FBS और 1% 4- (2-hydroxyethyl साथ थे ) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES)। दोनों मीडिया एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक थे - पेनिसिलिन (100 इकाइयों / एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) और fungizone (1 माइक्रोग्राम / एमएल)।
  2. ES कोशिकाओं 5 मिनट के लिए 0.25% / trypsin ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के साथ 70% संगम पर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और Trypsinize के साथ धोएं।
  3. सेल संस्कृति दवा के साथ थाली से ते कोशिकाओं निकालेंएक, तो कमरे के तापमान पर 200 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। पुनः निलंबित ठंड पीबीएस के 10 मिलीलीटर में ES कोशिकाओं और फिर कोशिकाओं की संख्या गिनती।
  4. कमरे के तापमान पर 200 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र ते कोशिकाओं, और उसके बाद फिर से निलंबित 2 एक्स 10 7 (SK-ES1) या ठंड पीबीएस में मिलीलीटर प्रति 10 7 (TC71) कोशिकाओं पर। इंजेक्शन प्रदर्शन करते हुए बर्फ पर अंतिम सेल निलंबन रखें।

Gastrocnemius मांसपेशी में ES कोशिकाओं के 2. Orthotopic इंजेक्शन

  1. 4-6 सप्ताह पुराने महिला एस.सी.आई.डी / बेज चूहों का प्रयोग करें।
  2. ES कोशिकाओं इंजेक्षन करने के लिए, धीरे माउस पकड़ और चौथे और पांचवें उंगलियों के बीच अपने बाएं पैर को स्थिर, कम hindlimb की औसत दर्जे का पक्ष को उजागर।
  3. एक 28 जी आधा सुई का प्रयोग, इंजेक्षन पहले से तैयार सेल निलंबन है कि या तो 2 एक्स 10 6 (SK-ES1) या 10 6 (TC71) ते gastrocnemius मांसपेशी में कोशिकाओं (चित्रा 2A) शामिल हैं के 0.1 मिलीलीटर।
    नोट: हालांकि इंट्रामस्क्युलर Inj के लिए अधिकतम मात्राections आम तौर पर 0.05 मिलीलीटर, इस विशेष प्रक्रिया के लिए 0.1 मिलीलीटर आवश्यक है करने के लिए खंड वृद्धि इंजेक्शन उच्च सेल नंबर की वजह से है। इस प्रक्रिया के जॉर्ज टाउन विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है।
    1. tibial शिखा / गाठदारपन की दिशा में 45 डिग्री के कोण - पूर्व में लगभग एक 30 gastrocnemius मांसपेशी में सुई डालें।
    2. थोड़ा सुई को वापस लेने के लिए एक बार इसे छू tibial शिखा / गाठदारपन। धीरे धीरे, सेल निलंबन समाधान इंजेक्षन धीरे-धीरे दबाव जारी करने के लिए सुई वापस लेने।
  4. संकट के संकेत के लिए अगले 24 घंटा से अधिक इंजेक्शन चूहों की निगरानी।
    नोट: जानवर से निपटने में कम अनुभव के साथ जांचकर्ता ट्यूमर सेल इंजेक्शन के लिए चूहों anesthetizing विचार करना चाहिए। कुछ संस्थानों में सुरक्षा कारणों के लिए संज्ञाहरण की आवश्यकता हो सकती है।

3. प्राथमिक ट्यूमर के विकास को निगरानी

  1. प्राथमिक ट्यूमर के डी विकास की निगरानीaily तक ट्यूमर के आकार वांछित मात्रा में पहुंचता है।
    नोट: वर्तमान अध्ययन में, 250 मिमी 3 में से एक बछड़ा मात्रा प्रयोग (चित्रा 2 बी) की एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया गया था। 2 सप्ताह ट्यूमर इस आकार तक पहुँचने के लिए - आमतौर पर, यह लगभग 1 लेता है।
    1. बछड़ा आकार दैनिक उपाय इसकी औसत दर्जे का पार्श्व और पूर्वकाल पीछे लंबाई के माध्यम से डिजिटल नली का व्यास के साथ।
    2. सूत्र (डी एक्सडी 2/6) द्वारा बछड़ा मात्रा x 3.14, जहां डी लंबे समय तक व्यास है और डी ट्यूमर असर कम hindlimb के छोटे व्यास है निर्धारित करते हैं।
      नोट: - 50 मिमी 3 सामान्य वयस्क माउस बछड़े के आकार लगभग 40 वर्ष की है। इसकी मात्रा ट्यूमर के विकास के कारण और बाद के चरणों बछड़ा मुख्य रूप से ट्यूमर के ऊतक के शामिल हो जाएगा पर वृद्धि होगी।

4. ट्यूमर असर hindlimb में hypoxia उत्प्रेरण के लिए और्विक धमनी Ligation (फल)

  1. इस आपरेशन के लिए आवश्यक सर्जिकल उपकरण तैयार: चालूवेद या इशारा ठीक संदंश, संदंश, शल्य कैंची और एक सुई धारक इशारा किया। एक आटोक्लेव या एक गर्म मनका अजीवाणु का उपयोग कर सर्जरी से पहले इन उपकरणों जीवाणुरहित। इसके अतिरिक्त, ठीक कपास इस सर्जरी के लिए तैयार swabs है।
    नोट: यह सिफारिश की है कि उपकरणों के सुझावों के रूप में प्रक्रिया के दौरान की जरूरत पर फिर से निष्फल हो।
  2. एनाल्जेसिक एजेंट (Carprofen 5 मिलीग्राम / किग्रा) subcutaneously (वर्ग) इंजेक्षन। का पता लगाने और हाइपोक्सिया पुष्टि करने के लिए, इंजेक्षन hypoxyprobe-1 (pimonidazole, 60 मिलीग्राम / किग्रा)।
    नोट: यह खुराक माउस प्रति 1.5 मिलीग्राम के लिए equates और पीबीएस intraperitoneally (आईपी) में 15 मिलीग्राम / एमएल hypoxyprobe समाधान के 0.1 मिलीलीटर इंजेक्शन द्वारा हासिल की है। hypoxyprobe तो immunohistochemistry द्वारा जानवरों के ऊतकों में detectable पोस्टमार्टम है।
  3. 1 एल / मिनट की एक प्रवाह दर पर 100% ऑक्सीजन में 5% isoflurane - 3 युक्त एक संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष में माउस रखें।
  4. प्रेरण कक्ष में माउस छोड़ दें जब तक यह बाहरी उत्तेजनाओं को अनुत्तरदायी है। तो फिर मैं से पशु हटा देंnduction चैंबर। ऑपरेटिंग सतह पर एक वार्मिंग पैड के ऊपर रखा एक बाँझ कपड़ा पर लापरवाह स्थिति में पशु रखें। 100% ऑक्सीजन में 3% isoflurane 0.8 एल / मिनट की एक प्रवाह दर पर - 1 का एक सतत प्रवाह के लिए इसे कनेक्ट करने के लिए एक नाक शंकु का प्रयोग करें।
    1. हर आंख को बाँझ गैर औषधीय नेत्र मरहम लागू कार्निया सुखाने को रोकने के लिए। अच्छी तरह से शल्य चिकित्सा क्षेत्र बाल हटाना करने के लिए, कोई 10 से अधिक सेकंड के लिए त्वचा पर इसे छोड़ने के बालों को हटाने क्रीम लागू होते हैं। फिर एक इथेनॉल प्रस्तुत करने का पैड का उपयोग कर बालों को हटाने क्रीम पोंछ।
  5. बढ़ाएँ और माउस के midline से लगभग 45 डिग्री टेप का एक टुकड़ा के साथ hindlimb सुरक्षित। एक बार जब hindlimb सुरक्षित है, 10% povidone / आयोडीन झाड़ू / समाधान, इथेनॉल के बाद से उजागर त्वचा पोंछ दो बार प्रत्येक दोहरा। शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के शेष के लिए, hindlimb क्षेत्र के एक बढ़े हुए दृश्य प्राप्त करने के लिए एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
  6. बताया संदंश और शल्य कैंची का प्रयोग, एसके का एक चीरा बनाने, में लगभग 1 सेमी लंबा, वंक्षण क्षेत्र की ओर मध्य जांघ से। खारा सिक्त ठीक कपास swabs का प्रयोग, धीरे दूर ब्रश जांघ की मांसपेशी आसपास वसा ऊतक।
  7. ध्यान से वसा ऊतकों के माध्यम से कुंद विच्छेदन के माध्यम से अंतर्निहित और्विक धमनी प्रकट करते हैं। घाव और शल्य चिकित्सा क्षेत्र को स्थिर मध्य ऊपरी पेशी में पेशी के वाहिका को बेनकाब करने के लिए।
  8. ठीक संदंश का प्रयोग, धीरे पियर्स झिल्लीदार ऊरु म्यान के माध्यम से neurovascular बंडल बेनकाब करने के लिए। ठीक संदंश की एक स्वच्छ सेट का उपयोग कर काटना और कमर, वंक्षण बंधन के लिए बाहर का पास समीपस्थ स्थान पर ऊरु नस और तंत्रिका से और्विक धमनी अलग। सावधानी बरतें भेदी ऊरु नस दीवार से बचने के लिए।
  9. विच्छेदन के बाद, और्विक धमनी और पार्श्व सिकमफ़्लक्स और्विक धमनी (LCFA) की शाखा के लिए बाहर के नीचे 6-0 रेशम सीवन का एक कतरा गुजरती हैं। और्विक धमनी डबल समुद्री मील (चित्रा 3) का उपयोग रोक देना। चीरा 6-0 polypropylene टांके का उपयोग कर बंद कर दें। चीरा बंद करने के बाद, द्रव संतुलन थेरेपी के लिए गर्म खारा वर्ग 0.5 मिलीलीटर इंजेक्षन। वसूली पिंजरे में एक लिपटी गर्म पैड के शीर्ष पर पशु प्लेस और जाग जब तक लगातार निगरानी।
  10. सर्जरी के बाद पहले 6 घंटे के दौरान जानवरों पर नजर रखने और एनाल्जेसिक एजेंट इंजेक्षन (Carprofen 5 मिलीग्राम / किग्रा, वर्ग) 3 दिनों के लिए हर दिन है। टांके हटाये 10 दिनों के बाद सर्जरी बाँझ कैंची का उपयोग।

पैर विच्छेदन द्वारा 5. प्राथमिक ट्यूमर छांटना

नोट: ट्यूमर असर कम hindlimb काटना जब बछड़ा आकार नियंत्रण समूह के लिए 250 मिमी 3 या hypoxic समूह के लिए फल के बाद 3 दिन तक पहुँचता है।

  1. बाल बाल कतरनी के साथ श्रोणि क्षेत्र के लिए बाहर का टिबिअ से ट्यूमर असर अंग से दाढ़ी जबकि धीरे पशु पकड़े। प्रक्रिया से पहले एनाल्जेसिक एजेंट (Carprofen 5 मिलीग्राम / किग्रा, वर्ग) इंजेक्षन।
  2. माउस एक संज्ञाहरण प्रेरण चर्चा में रखें1 एल / मिनट की एक प्रवाह दर पर 100% ऑक्सीजन में 5% isoflurane - एम्बर 3 से युक्त। प्रेरण कक्ष में माउस छोड़ दें जब तक यह बाहरी उत्तेजनाओं को अनुत्तरदायी है। तब प्रेरण कक्ष से पशु हटा दें।
  3. सही पार्श्व लेटा हुआ स्थिति में पशु ऑपरेटिंग सतह पर एक वार्मिंग पैड पर रखा एक बाँझ कपड़ा पर रखें। 100% ऑक्सीजन में 3% से 0.8 एल / मिनट की एक प्रवाह दर पर - isoflurane 1 की एक सतत प्रवाह के लिए इसे कनेक्ट करने के लिए एक नाक शंकु का प्रयोग करें। हर आंख को बाँझ गैर औषधीय नेत्र मरहम लागू कार्निया सुखाने को रोकने के लिए
  4. 10% povidone / आयोडीन झाड़ू / समाधान का उपयोग शल्य साइट, इथेनॉल के बाद, 3 बार दोहरा तैयार करें। माउस पर एक बाँझ धुंध (जैसे, सर्जिकल कपड़ा) लागू एक बाँझ शल्य चिकित्सा क्षेत्र प्राप्त करने के लिए।
  5. एक मध्यम ऊरु परिधीय त्वचा चीरा, कुंद विच्छेदन और त्वचा proximally का त्याग द्वारा पीछा किया। पैर की औसत पक्ष पर औसत दर्जे का ऊरु neurovascular डंडी का पर्दाफाश, और फिर ligateवंक्षण बंधन 4-0 लेपित (polyglactin 910) absorbable सीवन सामग्री का उपयोग कर के पास।
  6. coxofemoral संयुक्त करने के लिए मुलायम ऊतकों की कुंद विच्छेदन के द्वारा पीछा कैंची से मांसपेशी समूहों के एक मध्य ऊरु transection प्रदर्शन करना। एक हड्डी कटर का उपयोग करना, एक मध्य ऊरु osteotomy प्रदर्शन करते हैं। एक बाँझ ठीक कपास झाड़ू या एक absorbable जिलेटिन स्पंज का प्रयोग, धीरे कम करने और रक्तस्राव को रोकने के osteotomy साइट दबाएँ।
  7. शल्य घाव क्लिप का उपयोग कर overlying त्वचा को बंद करें और तरल पदार्थ संतुलन थेरेपी के लिए गर्म खारा वर्ग के 0.5 मिलीलीटर इंजेक्षन। वसूली पिंजरे में एक लिपटी गर्म पैड के शीर्ष पर पशु प्लेस और जाग जब तक लगातार निगरानी।
  8. सर्जरी पर, आरएनए, डीएनए या प्रोटीन अलगाव के लिए प्राथमिक ट्यूमर से ऊतकों के नमूनों को इकट्ठा -80 सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में फ्रीज तस्वीर। प्राथमिक सेल संस्कृति के लिए, नीचे धारा 9 में वर्णित है, इस कदम पर ऊतकों के नमूनों को इकट्ठा। ऊतक विज्ञान और immunochemis के लिए 10% तटस्थ बफर formalin में शेष अंग के ऊतकों को ठीक करेंhypoxyprobe -1 पता लगाने सहित, कोशिश करते हैं।
  9. उसके बाद 3 दिनों के लिए हर दिन सर्जरी के बाद पहले 6 घंटे के दौरान हरकत, दर्द और भोजन की खपत के लिए जानवरों पर नजर रखने,। 3 दिन के लिए एनाल्जेसिक एजेंट (Carprofen 5 मिलीग्राम / किग्रा, वर्ग) दैनिक इंजेक्षन। एक घाव क्लिप पदच्युत का उपयोग कर विच्छेदन के बाद घाव क्लिप 10 दिनों निकालें।

6. मेटास्टेसिस की उपस्थिति के लिए निगरानी चूहे

  1. दैनिक चूहों का निरीक्षण करें और कम से कम दो बार एक सप्ताह मेटास्टेसिस के नैदानिक ​​लक्षण के लिए उन्हें मूल्यांकन।
    1. आम जनता है कि विभिन्न स्थानों, आम तौर पर कंधे, contralateral पैर और जबड़े में विकास के रूप में पेश करने macrometastases की उपस्थिति के लिए जानवरों का निरीक्षण करें। यह अंत करने के लिए, ध्यान से सिर, गर्दन और कक्षा क्षेत्रों, और contralateral hindlimb टटोलना। एमआरआई स्कैन के साथ-साथ पेट बढ़ाव के माध्यम से आंतरिक अंग मेटास्टेसिस के लिए जाँच करें।
    2. स्वतंत्र साथ xyphoid प्रक्रिया (उरोस्थि के निचले सिरे) दबाकर फेफड़ों मेटास्टेसिस की उपस्थिति के लिए जाँच करेंएक्स उंगली। 24
      नोट: यह दबाव डायाफ्राम श्वसन क्षमता कम हो। उन्नत फेफड़ों मेटास्टेसिस के साथ चूहे श्रमसाध्य सांस लेने से प्रकट श्वसन संकट के लक्षण दिखाई।
    3. ऐसे पैर पक्षाघात और गतिभंग केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए मेटास्टेसिस सुझाव के रूप में स्नायविक लक्षण, के लिए जानवरों का निरीक्षण करें।
    4. कम से कम एक बार प्रति सप्ताह वजन घटाने के लिए चूहों पर नजर रखने, संभावित रोग प्रगति का एक संकेत के रूप में। शरीर का वजन पूर्व प्रक्रियात्मक वजन के 15% से अधिक की हानि एक मानवीय समापन बिंदु माना जाता है।

7. चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) का पता लगाने के लिए मेटास्टेसिस

  1. वांछित समय बिंदुओं पर मेटास्टेसिस पता लगाने के लिए एमआरआई प्रदर्शन करना। 18
    नोट: वर्तमान अध्ययन में, एक 7 टेस्ला क्षैतिज स्पेक्ट्रोमीटर का इस्तेमाल किया गया था। एमआरआई दिनों 15 पर प्रदर्शन किया और एस-ES1 कोशिकाओं के लिए और TC71 कोशिकाओं के लिए 15 दिन में 35 पोस्ट-विच्छेदन किया गया था।
  2. माउस एक संज्ञाहरण प्रेरण chambe में रखेंआर 1 युक्त - 30% और 70% ऑक्सीजन नाइट्रस ऑक्साइड की एक गैस मिश्रण में 3% isoflurane।
  3. प्रेरण कक्ष में माउस छोड़ दें जब तक यह बाहरी उत्तेजनाओं को अनुत्तरदायी है। तब प्रेरण कक्ष से पशु हटा दें।
  4. 1.5% isoflurane की निरंतर प्रशासन और 30% नाइट्रस ऑक्साइड के साथ श्वसन और तापमान monitorization साथ एक stereotaxic धारक पर anesthetized माउस स्थानांतरण। हर आंख को बाँझ गैर औषधीय नेत्र मरहम लागू कार्निया सूखापन को रोकने के लिए। छवि जानवर या तो पूरे शरीर या मस्तिष्क इमेजिंग, क्रमशः के लिए एक 40 या 23 मिमी Bruker माउस मात्रा कुंडली में।
  5. टी.आर. = 3,000 मिसे, ते = 24 मिसे, मैट्रिक्स = 256, FOV = 4.35 x 3.0 सेमी, टुकड़ा मोटाई = 0.5 मिमी, दुर्लभ कारक = 4 और औसत = 4. 18: एक दो आयामी, टी 2 भारित दुर्लभ दृश्य का उपयोग करें
  6. एक गर्म वसूली पिंजरे में पशु रखें और जाग जब तक लगातार निगरानी।
    नोट: चूहों तेजी से ठीक हो जाएगी क्योंकि संज्ञाहरण के एक उथले विमान प्रयोग किया जाता है। इमेजिंग के बाद पहले 6 घंटे के दौरान जानवरों पर नजर रखने के लिए सुनिश्चित करें संज्ञाहरण का कोई प्रतिकूल प्रभाव देखते हैं कि बनाने के लिए।

8. इच्छामृत्यु और Necropsy

  1. एक बार एमआरआई और / या रोग प्रगति के नैदानिक ​​लक्षण द्वारा detectable मेटास्टेसिस के साथ मौजूद जानवरों चूहों euthanize।
    नोट: वर्तमान अध्ययन में, चूहों दिनों 50 में बलिदान और थे असर बड़ी-ES1 और TC71 xenografts क्रमश: जानवरों के लिए 25 पद-विच्छेदन। कुछ मामलों में, पहले इच्छामृत्यु एक उच्च मेटास्टेसिस बोझ के कारण जरूरी हो गया था।
  2. जोखिम से चूहों euthanize 1.5 एल / मिनट (सीओ 2 10 पर - इच्छामृत्यु चैम्बर खंड / मिनट का 30%) में 2 सह करने के लिए। पशु मौत सुनिश्चित करने के लिए सीओ 2 के प्रदर्शन के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन करते हैं।
  3. 70% इथेनॉल के साथ पूरे माउस स्प्रे और लामिना का प्रवाह हुड में जगह। 1 मिलीलीटर सिरिंज और एक रक्त संग्रह Tu करने के हस्तांतरण के साथ एक 25 जी आधा सुई का उपयोग दिल पंचर द्वारा रक्त एकत्रEDTA के 2 मिलीग्राम से युक्त हो।
  4. तिल्ली, अधिवृक्क ग्रंथियों, अंडाशय, गुर्दे, जिगर, फेफड़े, मस्तिष्क, दाहिना पैर, अस्थि मज्जा दोनों humeri और रीढ़ की हड्डी है, साथ ही अन्य स्थानों में मौजूद स्थूल मेटास्टेसिस से: निम्नलिखित ऊतकों लीजिए। 25,26
  5. ऊतक विज्ञान और immunochemistry, hypoxyprobe -1 पता लगाने सहित 10% तटस्थ बफर formalin में प्रत्येक ऊतक के आधे को ठीक करें। स्नैप तरल नाइट्रोजन में अन्य आधा फ्रीज, तो आरएनए, डीएनए या प्रोटीन अलगाव के लिए -80 सेल्सियस पर स्टोर। 25,26 प्राथमिक सेल संस्कृति के लिए, नीचे धारा 9 में वर्णित के रूप में ऊतकों के नमूनों को इकट्ठा।

9. प्राथमिक सेल संस्कृति

  1. प्राथमिक सेल संस्कृति को करने के लिए काट अंग (ऊपर धारा 5) या से ऊतकों काटना एक लामिना का प्रवाह हुड में शव-परीक्षा (ऊपर धारा 8) बाँझ शर्तों के तहत के दौरान।
  2. सेल ओर्थोटोपिक इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल लाइन, पेनिसिलिन के साथ पूरक (200 इकाइयों / एमएल) के लिए सेल संस्कृति मीडिया उचित तैयार है,स्ट्रेप्टोमाइसिन (200 माइक्रोग्राम / एमएल), fungizone (1 माइक्रोग्राम / एमएल), और 0.2% माइकोप्लाज्मा रोगनिरोधी एंटीबायोटिक। एक 6 सेमी सेल संस्कृति की थाली में प्राथमिक संस्कृति के माध्यम से 2.5 मिलीलीटर रखें।
  3. प्राथमिक ट्यूमर या मेटास्टेसिस से व्यवहार्य ट्यूमर के ऊतक क्षेत्रों का चयन करें, और उसके बाद प्रत्येक बाँझ कैंची का उपयोग 2-3 मिमी से कम दो से तीन खंडों को अलग।
    नोट: व्यवहार्य ट्यूमर के ऊतक आमतौर पर ट्यूमर के किनारों पर पाया जाता है और उसके गुलाबी या लाल रंग, महत्वपूर्ण चमक और समग्र गीला उपस्थिति से नेक्रोसिस से भेदभाव किया जा सकता है। इसके विपरीत, परिगलित ऊतक आमतौर पर ट्यूमर के केंद्र में देखा और एक सुस्त, घटिया उपस्थिति के साथ एक सफेद / क्रीम रंग जन के रूप में प्रस्तुत करता है। 27
  4. एक 6 सेमी सेल संस्कृति कदम 9.2 में वर्णित प्राथमिक संस्कृति के माध्यम युक्त थाली करने के लिए अलग खंडों स्थानांतरण।
  5. मानक स्थितियों के तहत संस्कृति कोशिकाओं, के रूप में धारा 1 (नोट) और 9.2 में वर्णित है। 18,28 क सेलुलर परिणाम ऊतक के टुकड़े, से उत्पन्न होने के लिए संस्कृति की जाँच करेंजहाँ कुछ दिनों के भीतर मनाया जाना चाहिए। एक बार कोशिकाओं संगम तक पहुँचने, trypsinize और मानक सेल संस्कृति तकनीक के अनुसार उन्हें प्रचार।
    नोट: प्राथमिक सेल संस्कृति बाद में के रूप में पहले से वर्णित है, विकास और कोशिकाओं नियंत्रण और hypoxic ट्यूमर, साथ ही उनके आणविक सुविधाओं से प्राप्त की मेटास्टेटिक गुणों का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 18

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Representative Results

Gastrocnemius मांसपेशी में ES कोशिकाओं के इंजेक्शन के बाद, प्राथमिक ट्यूमर 250 मिमी 3 में से एक बछड़ा आकार करने के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दी जाती है (चित्रा 1, 2)। क्रमश: SK-ES1 xenografts के लिए TC71 20-25 दिनों के लिए 15 दिन - समय ट्यूमर के लिए आवश्यक इस मात्रा आम तौर पर 10 से पर्वतमाला तक पहुंचने के लिए। 250 मिमी 3 प्रदर्शनी अंतर्जात हाइपोक्सिया की एक अपेक्षाकृत कम स्तर पर एक बछड़ा मात्रा में ट्यूमर, पर hypoxybrobe-1 (pimonidazole) आधारित (ट्यूमर के ऊतक के लगभग 3%) धुंधला (चित्रा -4 ए, सी)। महत्वपूर्ण बात, इन पर नियंत्रण के ट्यूमर में, hypoxyprobe-1 के लिए सकारात्मक धुंधला पूरी तरह से शारीरिक हाइपोक्सिया, यानी के क्षेत्रों में मनाया गया, ट्यूमर कोशिकाओं है कि वाहिका से दूर हैं और कोशिका मृत्यु (चित्रा -4 ए) से गुजरना करने के लिए शुरू में। इस तरह धुंधला एक विशेषता "एयर ब्रश" पैटर्न दर्शाती है, जबकि स्वस्थ ट्यूमर के ऊतक के थोक hypoxyprobe-1 के लिए नकारात्मक बनी हुई है। <के रूप में hypoxyprobe-1 से 4 घंटे बाद फल (चित्रा 4 बी) में ट्यूमर कोशिकाओं के विशाल बहुमत में मनाया के लिए सकारात्मक धुंधला इसका सबूत sup> 6 इसके विपरीत, फल इस स्तर पर प्रदर्शन किया, गहरा हाइपोक्सिया बनाता है। विशेष रूप से, hypoxyprobe -1 पॉजिटिव ट्यूमर कोशिकाओं को भी रक्त वाहिकाओं के लिए करीब निकटता और शारीरिक हाइपोक्सिया की विशेषता पैटर्न खो दिया है में मनाया जाता है। इन फल का इलाज ट्यूमर में, ऊतक के 73% hypoxic ट्यूमर कोशिकाओं (चित्रा 4C) के होते हैं। ट्यूमर के ऊतक भी सेल संकोचन और ढीली संरचना (चित्रा 4 बी) सहित हाइपोक्सिया प्रेरित नुकसान का पहला लक्षण, दर्शाती है।

फल के प्रभाव को आगे प्राथमिक ट्यूमर के विकास की पूरी निषेध द्वारा समर्थित किया गया। फल और विच्छेदन के बीच 3 दिन की अवधि के दौरान प्राथमिक ट्यूमर के आकार (चित्रा 5 ए) में वृद्धि नहीं था। इसके विपरीत, चूहों से प्राथमिक ट्यूमर surger दिखावा के अधीनY तेजी से विकसित करने के लिए जारी रखा, लगभग 650 मिमी 3 की मात्रा तक पहुंच गया है, इस प्रकार नियंत्रण चूहों में ट्यूमर सर्जरी (चित्रा 5 ए) के अधीन नहीं की वृद्धि दर नकल उतार। 18 इन आंकड़ों के साथ लाइन में, histopathological विश्लेषण फल का इलाज प्राथमिक काटा 3 दिनों के बाद सर्जरी (चित्रा 5 ब) ट्यूमर में नेक्रोसिस के व्यापक क्षेत्रों का पता चला। फिर भी, वहाँ व्यवहार्य ट्यूमर कोशिकाओं के समूह ट्यूमर के ऊतक के भीतर मौजूद है, आमतौर पर ट्यूमर के किनारों पर स्थित है, वाहिका (चित्रा 5 ब) के करीब थे। इन कोशिकाओं है, जो लाइव hypoxic कोशिकाओं में सक्रिय कर रहे हैं, बाद में covalently इन कोशिकाओं के भीतर प्रोटीन के लिए बाध्य करने की क्षमता प्राप्त कर रहा है हम hypoxyprobes इस्तेमाल की ऑक्सीजन स्थिति की जांच करने के लिए। 29 के रूप में इस तरह के, इन जांच कोशिकाओं है कि समय में किसी भी बिंदु पर हाइपोक्सिया अनुभव की एक स्थायी मार्कर के रूप में सेवा करते हैं। इस प्रकार, experim की अवधि के दौरान ट्यूमर कोशिकाओं की ऑक्सीजन के स्तर में परिवर्तन का पता लगाने के लिएईएनटी, हम दो अलग अलग hypoxyprobes कि immunohistochemistry द्वारा स्वतंत्र रूप से पता लगाया जा सकता है इस्तेमाल किया। जांच दो बिंदुओं पर समय दिलाई गई - ठीक पहले फल (hypoxyprobe -1) और विच्छेदन करने से पहले (hypoxyprobe -2, सीसीआई-103F) - और उनके स्थानीयकरण ट्यूमर में काटा पता चला था 3 दिनों के बाद फल (चित्रा 1)। Hypoxyprobe -1, जो फल के समय की सिस्टम में मौजूद था, ट्यूमर कोशिकाओं के बहुमत के रूप में चिह्नित ऊतक गंभीर रूप से hypoxic (चित्रा 5C) बन गया। यह लेबलिंग, के रूप में चित्रा 4 बी में दिखाया गया नेक्रोसिस / apoptosis के क्षेत्रों में स्पष्ट भी है के बाद से इन कोशिकाओं को अभी भी फल के समय जीवित थे और इसलिए स्थायी रूप से hypoxyprobe -1 बाध्यकारी में सक्षम है। इसके विपरीत, hypoxyprobe-2, 2 दिनों के बाद फल केवल व्यवहार्य कोशिकाओं दाग प्रशासित के रूप में परिगलित क्षेत्रों में कोशिकाओं को पहले ही मर चुका है और इसके प्रशासन (चित्रा 5 डी) के समय में जांच को सक्रिय करने में असमर्थ थे। दिलचस्प है, हम भी obseव्यवहार्य ट्यूमर के ऊतक वाहिका है कि शुरू में hypoxic (hypoxyprobe -1 पॉजिटिव) था से सटे rved, लेकिन पर्याप्त रूप से बाद में समय बिंदु पर ऑक्सीजन (hypoxyprobe-2-नकारात्मक) (चित्रा 5C, डी)। यह निष्कर्ष पिछली रिपोर्टों का संकेत है कि जमानत के पोत पर निर्भर ऊतक reperfusion hindlimb 3 दिनों के बाद फल में रक्त के प्रवाह को पुनर्स्थापित करता है के साथ समझौते में है। 20 व्यवहार्य ट्यूमर ट्यूमर के ऊतक 3 दिनों के बाद फल में शेष कोशिकाओं के रूप में ट्यूमर (चित्रा 5E) के vascularized किनारों पर उनके बड़े पैमाने पर intravasation इसका सबूत है, अत्यधिक आक्रामक थे। पोत लुमेन के भीतर कोशिकाओं में से कुछ hypoxyprobe-1 के लिए सकारात्मक थे, यह दर्शाता है कि वे फल पर hypoxic बन गया था, फिर भी व्यवहार्य बने रहे। सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों गंभीर हाइपोक्सिया निम्नलिखित प्राथमिक ट्यूमर से कोशिकाओं के भागने की सुविधा हो सकती है कि ऊतक reperfusion सुझाव देते हैं।

पायलट प्रयोग के आधार पर, व्यापक मेटास्टेसिस थेSK-ES1 xenografts के लिए पहचाने जाने एमआरआई द्वारा लगभग 35 दिनों के बाद विच्छेदन, जबकि TC71 कोशिकाओं आम तौर पर 15 दिनों के भीतर metastasized। नतीजतन, मेटास्टेसिस विलंबता और आवृत्ति के तुलनात्मक विश्लेषण के लिए, एमआरआई दिन 15 और असर बड़ी-ES1 ट्यूमर जानवरों के लिए 35 पद-विच्छेदन पर प्रदर्शन किया, जबकि 15 दिन में एक इमेजिंग TC71 ट्यूमर के साथ चूहों के लिए पर्याप्त था। इच्छामृत्यु क्रमश: SK-ES1 और TC71 xenografts के साथ जानवरों के लिए दिन 50 और 25 दिन में प्रदर्शन किया था। जैसा कि पहले बताया, मेटास्टेसिस का सबसे आम प्रकार कंधे क्षेत्र में नरम ऊतक आम जनता के साथ-साथ contralateral पैर, दाढ़ की हड्डी क्षेत्र और एस-ES1 कोशिकाओं के लिए रीढ़ की हड्डी, और फेफड़ों और TC71 के लिए पैल्विक ट्यूमर के लिए हड्डी मेटास्टेसिस शामिल थे। 18 इसके अलावा, अधिवृक्क ग्रंथि, फेफड़े और यकृत, साथ ही अस्थि मज्जा घुसपैठ सहित आंतरिक अंगों, के लिए लगातार मेटास्टेसिस, असर फल का इलाज SK-ES1 xenografts चूहों (चित्रा 6) में मनाया गया। सामान्य में, हाइपोक्सिया काफी वृद्धि हुईसमग्र (SK-ES1) या साइट विशेष (TC71) आवृत्ति और दोनों सेल लाइनों में मेटास्टेसिस की बहुलता। हालांकि, TC71 xenografts भी लगातार आवर्तक जनता (फल इलाज ट्यूमर के लिए नियंत्रण के लिए 25% और 40%) विच्छेदन के स्थल पर, जैसा कि पहले बड़े TC71 प्राथमिक ट्यूमर के लिए वर्णित विकसित की है। 18

नियंत्रण और फल का इलाज प्राथमिक ट्यूमर और मेटास्टेसिस से ऊतकों भी व्यापक आणविक ते प्रसार में शामिल हाइपोक्सिया सक्रिय रास्ते की पहचान करने के उद्देश्य से विश्लेषण के लिए सामग्री का एक स्रोत हो सकता है। उदाहरण के लिए, हम नियंत्रण और hypoxic प्राथमिक ट्यूमर के metabolomic प्रोफाइल में काफी अंतर मनाया (डेटा) नहीं दिखाया। हम भी सफलतापूर्वक ऊपर ऊतकों के सब से कई सेल लाइनों को अलग-थलग करने में सक्षम थे। कई मामलों में, कोशिकाओं फल का इलाज ट्यूमर से निकाली गई, आकृति विज्ञान में उल्लेखनीय परिवर्तन का प्रदर्शन किया मूल कोशिकाओं की तुलना में और उन पर नियंत्रण Tu से व्युत्पन्न के रूप मेंMors (चित्रा 7A)। इन सेल संस्कृतियों की पवित्रता इविंग सारकोमा मार्कर, CD99 (चित्रा 7 बी) के लिए सकारात्मक immunostaining द्वारा पुष्टि की गई। इसके अलावा, स्थापित सेल लाइनों में कोशिकाओं की 100% सीटू संकरण (मछली) मानव centromeric जांच के साथ में प्रतिदीप्ति में एक सकारात्मक संकेत था, अक्सर वृद्धि गुणसूत्र संख्या (चित्रा 8A) के साथ पेश किया। इन कोशिकाओं के मानव मूल आगे metaphase गुणसूत्रों (चित्रा 8B) कि cytogenetic rearrangements पहले दोनों मूल कोशिका लाइन और कोशिकाओं फल का इलाज ट्यूमर (चित्रा 8B) से व्युत्पन्न में एस-ES1 कोशिकाओं के लिए वर्णित प्रदर्शित के विश्लेषण के द्वारा पुष्टि की गई। 30

आकृति 1
चित्रा 1. ते हाइपोक्सिया मॉडल की रूपरेखा। ES कोशिकाओं (1 - 2 एक्स 10 6) gastrocn में इंजेक्ट किया गयाएस.सी.आई.डी / बेज चूहों के emius मांसपेशियों। एक बार जिसके परिणामस्वरूप प्राथमिक ट्यूमर 250 मिमी 3 में से एक बछड़ा मात्रा पहुंच गया, चूहों दो प्रयोगात्मक समूहों में विभाजित किया गया। नियंत्रण समूह से चूहों hypoxyprobe -1 (एचपी-1) के साथ इंजेक्शन थे, और प्राथमिक ट्यूमर अंग विच्छेदन से excised थे। hypoxic समूह से चूहे hypoxyprobe-1 के साथ इंजेक्शन थे और फिर और्विक धमनी बंधाव (फल) के अधीन है। दो दिन बाद चूहों hypoxyprobe -2 (एचपी-2) के साथ इंजेक्शन थे, और फिर ट्यूमर असर अंग तीन दिनों के बाद फल काट रहे थे। दोनों समूहों से पशु आवधिक चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) द्वारा निगरानी की गई। एक बार जब मेटास्टेसिस इमेजिंग और नैदानिक ​​लक्षण के आधार पर स्पष्ट हो गया है, चूहों euthanized थे और मेटास्टेसिस की उपस्थिति शव-परीक्षा और histopathological विश्लेषण द्वारा पुष्टि की गई। ट्यूमर के विकास, इमेजिंग और इच्छामृत्यु के समय विकास और मेटास्टेसिस के SK-ES1 सेल दर पर आधारित है। नोट: विधि और विसू स्थापित करने के लिए है कि जब hypoxyprobe -2 जरूरी हो गया थाAlize फल और अंग विच्छेदन के बीच की अवधि के दौरान हाइपोक्सिया के स्तर में परिवर्तन, इसके उपयोग वास्तविक प्रयोगों के लिए आवश्यक नहीं है। इसलिए, इस कदम प्रोटोकॉल में शामिल नहीं है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 प्राथमिक ट्यूमर के विकास। एक अक्षुण्ण hindlimb के ए चुंबकीय अनुनाद छवि (एमआरआई)। लाल तीर साइट और ट्यूमर सेल ओर्थोटोपिक इंजेक्शन की दिशा इंगित करता है। लगभग 250 मिमी 3 gastrocnemius मांसपेशी (लाल रूपरेखा) में बढ़ के एक बछड़ा मात्रा में बी प्राथमिक ट्यूमर। लाल तीर हड्डी विनाश की साइटों का संकेत मिलता है। टी - टिबिअ। कृपया देखेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ चाटना।

चित्र तीन
चित्रा 3. और्विक धमनी Ligation की साइट। एक प्रतिनिधि को पोस्टमार्टम के एक 129S1 / SVJ माउस बेरियम सल्फेट के साथ perfused का एक्स-रे arteriogram तुरंत बंधाव के बाद पूर्व मौजूदा जमानत के जहाजों की उपस्थिति को उजागर करने के लिए दिखाया गया है। ध्यान दें कि जब छवि दो ligations (XS), एक बाहर का पार्श्व सिकमफ़्लक्स और्विक धमनी (LCFA) (लाल X) और जानु धमनी (सफेद एक्स) के लिए एक और समीपस्थ को दर्शाया गया है, ट्यूमर हाइपोक्सिया मॉडल केवल समीपस्थ बंधाव इस्तेमाल किया के पास, वंक्षण बंधन और बाहर का LCFA (लाल एक्स)। जमानत के पोत विकास के क्षेत्र में वर्णित (बेहोश वाहिकाओं) के रूप में दिखाया गया है, और वे अपने कपटपूर्ण, काग-पेंच आकार से पहचाने जाते हैं। वह यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कर रहे हैं।

चित्रा 4
चित्रा 4. ट्यूमर हाइपोक्सिया और्विक धमनी Ligation (फल) द्वारा प्रेरित किया। ए 250 मिमी 3 में से एक बछड़ा मात्रा hematoxylin और eosin (एच एंड ई) से सना हुआ और hypoxyprobe-1 (ब्राउन) के लिए immunostained पर एक नियंत्रण ट्यूमर। Hypoxyprobe -1 immunostaining पूरी तरह से शारीरिक ट्यूमर हाइपोक्सिया, जहां वाहिका से दूर ट्यूमर कोशिकाओं को ऑक्सीजन से वंचित और कोशिका मृत्यु से गुजरना करने के लिए शुरू कर रहे हैं के क्षेत्रों में मनाया जाता है। एक समान आकार काटा 4 घंटे बाद बंधाव पर बी फल का इलाज प्राथमिक ट्यूमर और एच एंड ई के साथ दाग और hypoxyprobe-1 के लिए immunostained। ट्यूमर कोशिकाओं के बहुमत hypoxyprobe-1 के लिए बेहद सकारात्मक हैं, वाहिका के बहुत पास में उन सहित। वी - रक्त वाहिका। सी के लिए hypoxyprobe -1 quantif था सकारात्मक धुंधला के क्षेत्रImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग नियंत्रण और फल का इलाज ट्यूमर में आइईडी। त्रुटि सलाखों SEM प्रतिनिधित्व करते हैं। *** - पी <0.001 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. प्राथमिक ट्यूमर के विकास पर और्विक धमनी Ligation (फल) का प्रभाव। FAL- में सर्जरी और विच्छेदन के बीच 3 दिन की अवधि के दौरान ए प्राथमिक ट्यूमर के विकास (एन = 4) और नकली सर्जरी का इलाज (एन = 4) पशु, अक्षत नियंत्रण ट्यूमर की तुलना में (एन = 6)। त्रुटि सलाखों प्रतिनिधित्व करते हैं SD। *** - पी <0.001, दोनों नियंत्रण और नकली सर्जरी इलाज ट्यूमर की तुलना में। बी hematoxylin और eosin (एच एंड ई) एक फल का इलाज ट्यूमर का धुंधला 3 दिन काटा बाद के बंधाव ट्यूमर के भीतर बड़े पैमाने पर नेक्रोसिस पता चलता है। लाल रूपरेखा व्यवहार्य ट्यूमर सीई के एक क्षेत्र को इंगित करता हैएक अत्यधिक vascularized क्षेत्र के करीब निकटता में lls 3 दिन perfused के बाद फल। सी फल का इलाज ट्यूमर के ऊतक 3 दिन काटा बाद सर्जरी hypoxyprobe-1 के लिए immunostained। Hypoxyprobe -1 फल से पहले इंजेक्ट किया गया था। इसलिए, सकारात्मक immunostaining तुरंत व्यापक ऊतक हाइपोक्सिया के अस्तित्व के बाद सर्जरी इंगित करता है। डी Hypoxyprobe-2 2 दिनों के बाद फल इंजेक्ट किया गया था, और ऊतक एकत्र 24 घंटों के बाद, विच्छेदन पर। सकारात्मक hypoxyprobe -2 धुंधला विच्छेदन के समय में ऊतक हाइपोक्सिया को पहचानती है। लाल तीर ऊतक है कि दोनों समय बिंदुओं पर hypoxic है इंगित करता है, जबकि पीले तीर एक क्षेत्र वाहिका है कि तुरंत बाद hypoxic था से सटे इंगित करता है फल (hypoxyprobe -1 पॉजिटिव), लेकिन नकारात्मक hypoxyprobe-2 के लिए छांटना के समय में, जो ऊतक reperfusion का संकेत है। परिगलित क्षेत्रों में hypoxyprobe -2 धुंधला की कमी पता चलता है कि इस क्षेत्र में कोशिकाओं को अपने प्रशासन और इसलिए के समय में व्यवहार्य नहीं थेसक्रिय रूप से जांच के लिए बाध्य करने में असमर्थ है। पैनलों बी.डी. में प्रस्तुत धुंधला सीरियल ऊतक वर्गों पर प्रदर्शन किया गया था। में ई intravasation फल का इलाज ट्यूमर 3 दिनों के बाद फल। immunostaining hypoxyprobe -1 पोत लुमेन (लाल तीर) के भीतर के लिए सकारात्मक व्यवहार्य कोशिकाओं को पहचानती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 असर फल का इलाज SK-ES1 ट्यूमर चूहे में मेटास्टेसिस के उदाहरण हैं। मेटास्टेसिस चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) द्वारा पता लगाया और शव-परीक्षा और histopathological विश्लेषण (hematoxylin और eosin धुंधला हो जाना, एच एंड ई) द्वारा पुष्टि की गई। एम - मेटास्टेसिस। एक बड़ा vers देखने के लिए यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा के आयन।

चित्रा 7
7. फल का इलाज प्राथमिक ट्यूमर से ली गई कोशिकाओं के लक्षण चित्रा। ए व्यवहार्य सेल संस्कृतियों नियंत्रण और hypoxic प्राथमिक ट्यूमर से काटा ऊतकों से स्थापित किए गए थे और उनकी आकृति विज्ञान प्रारंभिक ओर्थोटोपिक इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया मूल सेल लाइनों की तुलना में था। कोशिकाओं फल का इलाज प्राथमिक ट्यूमर से निकाली गई उनके आकार और आकृति विज्ञान में नाटकीय परिवर्तन दिखा रहे हैं। मूल और प्राथमिक ट्यूमर व्युत्पन्न SK-ES1 कोशिकाओं की छवियों प्रतिनिधि दिखाए जाते हैं। ते मार्कर, CD99 के लिए immunostained फल का इलाज ट्यूमर से प्राप्त होता है, और डीएनए बाध्यकारी डाई, DAPI के साथ counterstained कोशिकाओं के बी प्रतिनिधि छवियाँ। सभी कोशिकाओं बढ़े नाभिक (सफेद तीर) युक्त कोशिकाओं सहित hypertrophic, CD99 पॉजिटिव हैं। oad / 54532 / 54532fig7large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8
प्रकोष्ठों फल का इलाज ट्यूमर से व्युत्पन्न का आंकड़ा 8. गुणसूत्र विश्लेषण। सीटू संकरण में ए प्रतिदीप्ति (मछली) मानव centromeric 4 जांच के लिए संकेतों के साथ दो नाभिक दिखा अंतरावस्था कोशिकाओं में विश्लेषण। चार संकेतों के साथ बड़े नाभिक एक टेट्राप्लोइड (4N) सेल (सफेद तीर) इंगित करता है। SK-ES1 मूल कोशिका लाइन के प्रतिनिधि metaphases में और सेल फल का इलाज प्राथमिक ट्यूमर से व्युत्पन्न के बी मछली विश्लेषण। लाल तीर से संकेत मिलता चालान (1) (p13.1q21), एस-ES1 कोशिकाओं का एक गैर यादृच्छिक cytogenetic पुनर्व्यवस्था विशेषता। लाल संकेतों: मानव centromeric 4 जांच; मूल SK-ES1 कोशिकाओं में ग्रीन संकेतों: गुणसूत्र 4q32.2 पर NPY5R जांच।e.com/files/ftp_upload/54532/54532fig8large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हमारे मॉडल दो प्रयोगात्मक समूहों में मेटास्टेसिस की तुलना शामिल है - एक नियंत्रण समूह, जहां ट्यूमर hindlimb 250 मिमी 3 में से एक बछड़ा मात्रा पर पहुंचने पर विच्छेदन के द्वारा पीछा में विकसित करने के लिए अनुमति दी जाती है, और एक हाइपोक्सिया उजागर समूह है, जो tumor- में असर hindlimb ही मात्रा में फल के अधीन है, विच्छेदन के द्वारा पीछा 3 दिन बाद में है। हालांकि इन प्रयोगों में फल का इलाज ट्यूमर नियंत्रण ट्यूमर की तुलना में कुछ देरी के साथ काट रहे हैं, उनके आकार बंधाव और विच्छेदन के बीच 3 दिन की अवधि के दौरान वृद्धि नहीं करता है। इसलिए, इस दृष्टिकोण तुलनीय आकार की लेकिन हाइपोक्सिया के नाटकीय रूप से विभिन्न स्तरों के साथ ट्यूमर के बीच metastatic क्षमता की तुलना में सक्षम बनाता है। इसके विपरीत, नकली सर्जरी का उपयोग कर, शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप के लिए एक अधिक उपयोग नियंत्रण, ट्यूमर के विकास के 3 दिनों के बाद नकली सर्जरी-इलाज के साथ प्रयोगात्मक समूहों के बीच ट्यूमर के आकार में काफी अंतर, पर नतीजा होगाएड प्राथमिक ट्यूमर अंतर्जात हाइपोक्सिया के महत्वपूर्ण स्तर रखने। पायलट प्रयोगों के आधार पर, नकली सर्जरी काफी ट्यूमर के विकास को या उसके हाइपोक्सिया के स्तर को प्रभावित नहीं करता है और इस तरह प्रयोगात्मक डिजाइन से समाप्त किया जा सकता है। इसके बजाय, समान आकार और विभिन्न स्तरों हाइपोक्सिया के ट्यूमर की तुलना की रणनीति रोग के प्रसार पर हाइपोक्सिया के प्रभाव elucidating के लिए एक अत्यधिक प्रासंगिक मॉडल है। महत्वपूर्ण बात है, इन विट्रो अध्ययन में पिछले विपरीत, इस दृष्टिकोण एक प्राकृतिक ट्यूमर microenvironment में हाइपोक्सिया के समर्थक मेटास्टेटिक कार्यों की व्यापक मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। 4-6

प्रयोगात्मक डिजाइन के लक्ष्य मेटास्टेसिस कि एक हाइपोक्सिया प्रेरित अपने गठन पर उत्तेजक प्रभाव का पता लगाने के लिए अनुमति होगी के एक कम बेसल स्तर को प्राप्त करने के लिए किया गया था। हम स्थापना की है कि एक बछड़ा और फल कम 250 मिमी 3 के आकार विच्छेदन SK-ES1 प्राथमिक ट्यूमर के लिए इष्टतम था। हालांकि, इस पैरामीटर ईए के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी चर्चा सेल लाइन, उनके मेटास्टेटिक क्षमता और स्थानीय invasiveness पर निर्भर करता है। उच्च मेटास्टेटिक क्षमता के साथ ट्यूमर के लिए, विच्छेदन पर प्राथमिक ट्यूमर के आकार में कमी आई होना पड़ सकता है। उदाहरण के लिए, TC71 ट्यूमर एक उच्च स्थानीय invasiveness विच्छेदन के स्थल पर आवर्तक ट्यूमर के लगातार गठन के द्वारा प्रकट दिखा रहे हैं। 18 बार इस तरह की आम जनता का विकास, पशु, विश्लेषण से बाहर रखा जाना के रूप में यह स्पष्ट नहीं हो सकता है अगर बाद में दूर मेटास्टेसिस प्राथमिक ट्यूमर से या आवर्तक ट्यूमर है कि अक्सर तेजी से बढ़ने और अंतर्जात हाइपोक्सिया के उच्च स्तर का प्रदर्शन से उत्पन्न है। पिछले अनुभव से, सेल लाइन के स्वतंत्र इस्तेमाल किया, 150 मिमी 3 कम से कम ट्यूमर असर बछड़ा आकार है कि मज़बूती से मापा जा सकता है और सामान्यीकृत है। तो फल और विच्छेदन पर ट्यूमर के आकार को कम आवर्तक ट्यूमर को खत्म नहीं करता या पर्याप्त बेसल मेटास्टेसिस दर में कमी, प्रश्न में विशेष सेल लाइन इन प्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता।

ve_content "> इसी तरह, यह महत्वपूर्ण है, प्रत्येक व्यक्ति के सेल लाइन के लिए एमआरआई का समय और इच्छामृत्यु की स्थापना के लिए अपनी मेटास्टेसिस के विलंबता पर निर्भर करता है। विशेष रूप से, शल्य घाव क्लिप है कि एमआरआई के साथ हस्तक्षेप कर 10 दिनों के बाद से पहले नहीं हटाया जा सकता है सर्जरी, और इस अवधि में कभी कभी इस अध्ययन से हम पहले एमआरआई के समय के रूप में दिन में 15 की स्थापना में, चिकित्सा के साथ जटिलताओं के कारण बढ़ाया जाना चाहिए। इस प्रकार।

इस मॉडल में एक अन्य महत्वपूर्ण विचार पूरा ट्यूमर नेक्रोसिस, जो ट्यूमर सेल प्रसार को रोका जा सके जिससे बिना मेटास्टेटिक प्रक्रियाओं उत्प्रेरण के लिए सक्षम हाइपोक्सिया के एक स्तर को बनाए रखने की है। हम इस अध्ययन में इस समस्या का सामना नहीं किया है हालांकि, अगर जरूरत है, हाइपोक्सिया की गंभीरता और्विक धमनी की शाखाओं, इस तरह के LCFA और जानु धमनी के रूप में के संबंध में सटीक साइट और ligations की संख्या में फेरबदल द्वारा विनियमित किया जा सकता है। 20 इस प्रकार, LCFA करने के लिए एक बंधाव समीपस्थ हाय में और अधिक गंभीर ischemia पैदा करेगाndlimb परिसंचरण, जिससे बाहर पैर में कमी वाली स्थिति बढ़ रही है। इसके विपरीत, और्विक धमनी के बाद शाखाओं के लिए बाहर का ligating कम hindlimb में जिसके परिणामस्वरूप हाइपोक्सिया में कमी होगी।

महत्वपूर्ण बात, वहाँ संयुक्त फल और विच्छेदन प्रक्रियाओं का कोई गंभीर प्रतिकूल प्रभाव और, सर्जरी से संबंधित के रूप में पहले इन अलग से प्रदर्शन किया तकनीकों के लिए सूचना नहीं मौतों थे। 18-20 इस प्रकार, विधि की सफलता के प्राथमिक साइट पर ट्यूमर लेने की दर और आवर्तक ट्यूमर, जो दोनों के सेल लाइन पर निर्भर कर रहे हैं की आवृत्ति द्वारा मुख्य रूप से सीमित है।

हाइपोक्सिया कई ट्यूमर प्रकार में एक समर्थक मेटास्टेटिक कारक के रूप में शामिल किया गया है के रूप में, इस दृष्टिकोण भी सीधे अपने प्रभाव का परीक्षण और अन्य sarcomas कि अंगों में विकसित में कार्रवाई के अपने तंत्र को परिभाषित करने के लिए उपयुक्त हो सकता है। 23 इसके अलावा, एक समान रणनीति ओर्थोटोपिक वातावरण w में बढ़ अन्य कैंसर के लिए लागू किया जा सकताएक अच्छी तरह से परिभाषित रक्त की आपूर्ति मार्ग ith। इस प्रकार, उचित संशोधनों के साथ, इस मॉडल ते जीव विज्ञान के क्षेत्र से परे अनुसंधान के क्षेत्र में एक उपयोगी उपकरण हो सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells ATCC
TC71 Human ES cells Kindly provided from Dr. Toretsky
McCoy's 5A (modified) Medium Gibco by Life Technologies 12330-031
RPMI-1640 ATCC 30-2001
PBS Corning Cellgro 21-040-CV
FBS Sigma-Aldrich F2442-500mL
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Gibco by Life Technologies 25200-056
Penicillin-Streptomycin Gibco by Life Technologies 15140-122
Fungizone® Antimycotic Gibco by Life Technologies 15290-018
MycoZap™ Prophylactic Lonza VZA-2032
Collagen Type I Rat tail high concetration BD Biosciences 354249
SCID/beige mice Harlan or Charles River 250 (Charles River) or 18602F (Harlan)
1 ml Insulin syringes with permanently attached 28 G ½ needle BD 329424
Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) Hospira, INC NDC 0409-7984-37
Digital calipers World Precision Instruments, Inc 501601
Surgical Tools Fine Science Tools
Rimadyl (Carprofen) Injectable  Zoetis
Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) HPI, Inc HP-100mg
hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg) HPI, Inc CCI-103F-250mg
Povidone-iodine Swabstick PDI S41350
Sterile alcohol prep pad Fisher HealthCare 22-363-750
LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment)  Major Pharaceuticals NDC 0904-5168-38
VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier VWR 56617-014 
Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade Oster 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade)
Nair Lotion with baby oil Church & Dwight Co., Inc.
Silk 6-0 Surgical Specialties Corp 752B
Prolene (polypropylene) suture 6-0 Ethicon 8680G
Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0  Ethicon J386H
Fisherbrand Applicators (Purified cotton) Fisher Scientific 23-400-115
GelFoam Absorbable Dental Sponges - Size 4 Pfizer Pharmaceutical 9039605
Autoclip Wound Clip Applier BD 427630
Stereo Microscope Olympus SZ61
Autoclip remover BD 427637
Aound clip BD 427631
MRI 7 Tesla Bruker Corporation
Paravision 5.0 software Bruker Corporation
CO2 Euthanasia system VetEquip
25 G 5/8 Needle (for heart-puncture) BD 305122
0.1 ml syringe (for heart-puncture) Terumo SS-01T
K3-EDTA Micro tube 1.3 ml Sarstedt 41.1395.105
10% Neutral Buttered Formalin Fisher Scientific SF100-4

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References

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ट्यूमर मेटास्टेसिस पर हाइपोक्सिया का परीक्षण प्रभाव के लिए <em>vivo</em> मॉडल <em>में</em>
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Hong, S. H., Tilan, J. U., Galli,… More

Hong, S. H., Tilan, J. U., Galli, S., Acree, R., Connors, K., Mahajan, A., Wietlisbach, L., Polk, T., Izycka-Swieszewska, E., Lee, Y. C., Cavalli, L. R., Rodriguez, O. C., Albanese, C., Kitlinska, J. B. In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis. J. Vis. Exp. (118), e54532, doi:10.3791/54532 (2016).

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