Introduction
Ewing sarkom (ES) er en aggressiv kreft som påvirker barn og unge. 1 Svulstene utvikle seg i bløtvev og bein, vanligvis i lemmene. Mens tilstedeværelsen av metastaser er den mest kraftfulle negativ prognostisk faktor for ES pasienter, mekanismene bak utviklingen fortsatt uklare. 2 Tumor hypoksi er en av de få faktorer involvert i ES progresjon. I ES pasienter, er tilstedeværelsen av ikke-perfusert områder i tumorvevet assosiert med dårlig prognose. 3 In vitro øker hypoksi invasivitet av ES-celler og utløser uttrykk for pro-metastatiske gener. 4-6 Men til tross for disse linjene med bevis, finnes ingen direkte bevis for hypoksi-indusert ES progresjon og spredning. Videre er mekanismene som hypoksi utøver slike effekter finnes det i dag ukjente. Derfor har vi laget en in vivo modell for å fylle gapet mellom eksisterende in vitro data og klinisk dialektikkensjoner. Dette modellsystem muliggjør direkte testing av virkningen av hypoksi på tumorer som opptrer i sitt naturlige miljø, ved hjelp av magnetisk resonans imaging (MRI) for å følge tumorprogresjon og metastaser in vivo i kombinasjon med ex vivo patologisk og molekylære analyser (figur 1).
Siden ingen etablert transgen modell av ES er for tiden tilgjengelig, in vivo studier på metastatiske egenskaper av disse svulstene er avhengige av injeksjoner av humane celler i immunforsvar mus. Mens bruken av immunologisk svekkede dyr kan underestimere effekten av immunsystemet på sykdomsutvikling, muligheten til å bruke humane celler øker translatability av slike studier. Blant forskjellige xenograft modeller, systemiske injeksjoner i halevenen er lettest å utføre, men de utelater de første trinnene av tumorcelle intravasation og flykte fra den primære stedet for vekst. 7-12 På den annen side, orthoto pic xenografting, som involverer injeksjoner av tumorceller inn i bein (femur, ribbe) eller muskler, er mer teknisk krevende, men også mer biologisk relevant for kreft hos mennesker. 13-16 Men i det siste, høy sykelighet forbundet med rask vekst av primære svulster har ofte nødvendig dyr dødshjelp før metastaseutvikling. I denne studien vi benyttet et tidligere etablert modell av celle injeksjoner i gastrocnemius muskelen fulgt av fjerning av den resulterende primærtumor kombinert med langsgående overvåking av metastatisk progresjon av MRI. 17,18 Slike injeksjoner i gastrocnemius muskelen i umiddelbar nærhet til tibia tillate tumorvekst i to naturlige ES miljøer - muskler og bein - og føre til fjernmetastaser til steder vanligvis påvirket hos mennesker. 18 Dermed denne modellen rekapitulerer nøyaktig de metastatiske prosesser i ES pasienter under sykdomsprogresjon.
telt "> Lokaliseringen av primære tumorer i den nedre bakben letter også nøyaktig kontroll av blodtilførselen til tumorvevet. lårarterien ligering (FAL) er en veletablert teknikk som benyttes i angiogenese forskning for å blokkere blodstrømmen til fjerntliggende områder av benet og undersøke vev vaskularisering som respons på ischemi. 19,20 Viktigere, den innledende fall i blodstrømningen etterfølges av kollaterale åpning og vev reperfusjon observert ca. 3 dager etter FAL. 20 Således, når utført i en tumorbærende lem, denne modellen gjenskaper hypoksi / reperfusjonshendelser som forekommer naturlig i raskt voksende svulster og gir utslipp av metastatiske tumorceller på grunn av restaurering av perfusjon til lavere bakben via nyåpnede sivile fartøyer. 21 Viktigere, denne prosedyren må utføres når svulsten størrelse er liten nok til å hindre overdreven hypoksi i kontrolltumorer (vanligvis ved den tumor-bærende kalv volUme av 150-250 mm 3), noe som sikrer betydelige forskjeller i nivåene av tumor hypoksi mellom kontroll og FAL-behandlede grupper.I tillegg til langsgående overvåkning av effekten av hypoksi på ES latens og hyppigheten av metastaser, denne modellen gjør det også mulig for innsamling av vev, og utvikling av nye cellelinjer fra både primærsvulster og metastaser. Viktigere, tidligere arbeid fastslo at metastaser-avledede cellelinjer som oppviser forbedret metastatisk potensiale ved gjeninnføringen til dyr, noe som indikerer at tumorspredning er forbundet med permanente forandringer i tumorcelle-fenotype, og derved å validere anvendelse av disse cellelinjer for å dechiffrere de metastatiske prosesser. 18 Samlet kan disse modellene nå brukes for de genetiske og molekylære analyser som kreves for å identifisere hypoksi-indusert metastatiske veier.
Som hypoksi er en pro-metastatisk faktor styrke malignitet av ulike tumors kan vår modell brukes som en plattform for å undersøke rollen av hypoksi i andre tumortyper som naturlig utvikler seg i lemmene, så som osteosarcom og rhabdomyosarkom. 21-23 Videre kan en lignende tilnærming brukes på malignitet vokser i andre anatomiske steder med et veldefinert ruten for blodtilførsel. Til syvende og sist, kan modellen modifiseres og dens nytte ytterligere utvidet, avhengig av individuelle forskningsbehov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble godkjent av Georgetown University Institutional Animal Care og bruk komité.
1. Cell Forberedelse til ortotopiske Injeksjoner
- Kultur humane ES-celler under standardbetingelser. Bruk omtrent en 15-cm cellekulturplate som ikke overstiger 70% av konfluens for injeksjon av 5 mus.
NB: For denne studien, SK-ES1-celler ble dyrket i McCoys 5A medium med 15% føtalt bovint serum (FBS) på kollagen-belagte plater og TC71-celler ble dyrket i RPMI med 10% FBS og 1% 4- (2-hydroksyetyl ) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES). Begge media ble supplert med antibiotika - penicillin (100 enheter / ml), streptomycin (100 ug / ml) og Fungizone (1 pg / ml). - Vask ES-celler med fosfat-bufret saltvann (PBS) og trypsineres ved 70% konfluens med 0,25% trypsin / etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) i 5 min.
- Fjern ES-cellene fra platen med cellekultur medien, så sentrifuger i 5 minutter ved 200 xg ved romtemperatur. Re-suspen ES-cellene i 10 ml kald PBS og deretter telle antall celler.
- Sentrifuger ES-celler i 5 min ved 200 x g ved romtemperatur, og deretter re-suspendere på 2 x 10 7 (SK-ES1) eller 10 7 (TC71) celler pr ml i kald PBS. Hold den endelige cellesuspensjonen på is mens du utfører injeksjoner.
2. ortotopiske Injeksjon av ES-celler i Gastrocnemius Muscle
- Bruk 4-6 uker gamle kvinnelige SCID / beige mus.
- Å injisere ES-celler, hold musen og stabilisere sin venstre ben mellom fjerde og femte fingre, utsette den mediale side av nedre bakben.
- Ved hjelp av en 28 G ½ nål, injisere 0,1 ml av den tidligere fremstilte cellesuspensjonen som inneholder enten 2 x 10 6 (SK-ES1) eller 10 6 (TC71) ES-celler i gastrocnemius muskelen (figur 2A).
MERK: Selv om maksimalt volum for intramuskulær injeksjoneksjoner er typisk 0,05 ml, for denne bestemte fremgangsmåte volumøkningen til 0,1 ml er nødvendig på grunn av det høye celletallet injisert. Denne prosedyren har blitt godkjent av Georgetown University Institutional Animal Care og bruk komité.- Stikk nålen inn gastrocnemius muskelen anteriorly på ca en 30-45 graders vinkel i retning av tibial crest / tuberosity.
- Litt trekke nålen når den berører tibial crest / tuberosity. Sakte injisere cellesuspensjonen løsningen, gradvis trekke nålen for å lette trykket.
- Overvåke injisert mus over neste 24 timer for tegn på stress.
MERK: Etterforskerne med mindre erfaring i dyr håndtering bør vurdere bedøvelse mus for tumorcelle injeksjoner. Noen institusjoner kan kreve anestesi av sikkerhetsmessige grunner.
3. Overvåking Primær tumorvekst
- Overvåke veksten av primære tumorer dAily til tumorstørrelsen når det ønskede volum.
MERK: I denne studien ble en kalv volum på 250 mm 3 brukes som et utgangspunkt for forsøket (figur 2B). Vanligvis tar det ca 1-2 uker for svulster å nå denne størrelsen.- Mål kalv størrelse daglig med digitale calipers via sine mediale-lateral og anterior-posterior lengder.
- Bestem kalv volum ved formel (D XD 2/6) x 3,14, hvor D er den lengre diameter og d er den korteste diameteren av den tumor-bærende lavere bakben.
MERK: Størrelsen av den normale voksne mus kalv er på omtrent 40 - 50 mm 3. Dets volum vil øke som følge av tumorvekst og på de senere stadier kalven vil være i hovedsak består av tumorvev.
4. lårarterie hemorroider (FAL) for å indusere Hypoksi i tumorbærende bakben
- Forbered kirurgiske verktøy som trengs for denne operasjonen: curVed eller spisse fin pinsett, spisse pinsett, kirurgisk saks og en nål holder. Steriliser disse verktøyene før kirurgi ved bruk av en autoklav eller en varm perle-sterilisatoren. I tillegg har fine bomullspinner klar for denne operasjonen.
MERK: Det anbefales at verktøyene steriliseres på tips som trengs under prosedyren. - Injisere smertestillende middel (Carprofen 5 mg / kg) subkutant (SQ). For å oppdage og bekrefte hypoksi, injisere hypoxyprobe-en (pimonidazole, 60 mg / kg).
MERK: Denne dose tilsvarer 1,5 mg pr mus og oppnås ved å injisere 0,1 ml av 15 mg / ml hypoxyprobe oppløsning i PBS intraperitonealt (IP). Den hypoxyprobe er så påviselig post mortem i animalsk vev ved immunhistokjemi. - Plassere musen i en anestesi induksjon kammer inneholdende 3 - 5% isofluran i 100% oksygen ved en strømningshastighet på 1 l / min.
- La musen i induksjon kammer før det svarer ikke på ytre stimuli. Deretter fjerner dyret fra jegnduction kammeret. Plasser dyret i liggende stilling på en steril drapere plassert på toppen av en oppvarming pad på brukerflate. Bruke en nesekonus for å koble den til en kontinuerlig strøm av 1 - 3% isofluran i 100% oksygen ved en strømningshastighet på 0,8 l / min.
- Påfør sterile ikke-medisinert oftalmisk salve til hvert øye for å hindre hornhinnen tørking. Å grundig fjerne håret operasjonsområdet, gjelder hårfjerning krem, la det på huden i mer enn 10 sek. Tørk deretter av hårfjerning krem bruker en etanol prep pad.
- Forlenge og sikre bakben med et stykke tape ca. 45 ° fra midtlinjen av mus. Når bakben er sikker, tørk den eksponerte huden med 10% povidon / jod pinne / løsning, etterfulgt av etanol, gjenta to ganger hver. For resten av den kirurgiske prosedyren, bruker et stereomikroskop for å få et forstørret riss av bakben-regionen.
- Ved hjelp av spisse pinsett og kirurgiske sakser, gjør et snitt av ski, ca 1 cm lang, fra midten av låret mot lyskeområdet. Ved hjelp av saltvann fuktet fint bomullspinner, forsiktig børste vekk underhudsfett vevet rundt låret muskelen.
- avsløre nøye underliggende lårarterie via stump disseksjon gjennom subkutant fettvev. Stabil såret og kirurgiske feltet for å avsløre blodkar i midten av øvre lukkemuskelen.
- Bruke fin pinsett, forsiktig pierce gjennom membran lårbens slire å avsløre neurovascular bunten. Ved hjelp av en ren sett med fin pinsett, dissekere og skille lårarterie fra femoralvenepunksjon og nerve ved det nære beliggenhet nær lysken, distalt for lyskeligament. Vær forsiktig for å unngå piercing lårvenen veggen.
- Etter disseksjon, passerer en strand av 6-0 silke sutur under lårarterie og distal til den grenen av den laterale cirkumfleks lårarterie (LCFA). Tilstoppe lårarterie bruke doble knuter (figur 3). Lukk snittet ved hjelp av 6-0 polypropylen sting. Etter stengetid snittet, injisere SQ 0,5 ml varmt saltvann for væskebalansen terapi. Plasser dyret på toppen av en drapert varm pad i utvinningen buret og overvåke kontinuerlig inntil våken.
- Overvåk dyrene i løpet av første seks timer etter operasjonen og injisere smertestillende middel (Carprofen 5 mg / kg, SQ) hver dag i 3 dager. Fjern suturer 10 dager etter operasjonen ved hjelp av steril saks.
5. Primær Tumor Eksisjon av Leg Amputasjon
MERK: Amputere den tumor-bærende nedre bakben når kalven størrelse når 250 mm 3 for kontrollgruppen eller 3 dager etter FAL for den hypoksiske gruppen.
- Barbere håret fra tumorbærende lem fra den distale tibia til bekkenregionen med hårklippe mens forsiktig holder dyret. Injisere smertestillende middel (karprofen 5 mg / kg, SQ) før prosedyren.
- Plasser musen i en anestesi induksjon chrav inneholdende 3 - 5% isofluran i 100% oksygen ved en strømningshastighet på 1 l / min. La musen i induksjon kammer før det svarer ikke på ytre stimuli. Deretter fjerner dyret fra induksjonskammeret.
- Plasserer dyret i riktig sideveis liggende posisjon på et sterilt drapere plassert på en varmepute på operasjonsoverflaten. Bruke en nesekonus for å koble den til en kontinuerlig strøm av isofluran 1 - 3% i 100% oksygen ved en strømningshastighet på 0,8 l / min. Påfør sterile ikke-medisinert oftalmisk salve til hvert øye for å hindre hornhinnen tørking
- Forbered kirurgiske området ved hjelp av 10% povidon / jod pinne / løsning, etterfulgt av etanol, gjenta 3 ganger. Påfør en steril kompress (f.eks kirurgisk drapere) over musen for å få en steril kirurgisk felt.
- Lag en middel femoral rundtgående snitt i huden, etterfulgt av stump disseksjon og tilbaketrekking av huden proksimalt. Expose den mediale femur neurovascular pedicle på median siden av beinet, og deretter ligatenær lyskeligament bruker 4-0 røket (polyglaktin 910) absorberbare sutur materiale.
- Utfør en mid-femoral tran av muskelgrupper med saks, etterfulgt av stump disseksjon av mykt vev til coxofemoral felles. Ved hjelp av en bein kutter, utføre en mid-femoral osteotomi. Ved hjelp av en steril fin bomullspinne eller en absorberbare gelatin svamp, trykk forsiktig osteotomistedet å redusere og forebygge blødning.
- Lukk liggende huden ved hjelp av kirurgiske sår klipp og injisere 0,5 ml varmt saltvann SQ for væskebalansen terapi. Plasser dyret på toppen av en drapert varm pad i utvinningen buret og overvåke kontinuerlig inntil våken.
- Ved kirurgi, samle vevsprøver fra primærsvulster for RNA, DNA eller protein isolasjon, knipse fryse i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C. For primærcellekultur, samle vevsprøver på dette trinnet, som beskrevet i kapittel 9 nedenfor. Fest den gjenværende lem vev i 10% nøytral-bufret formalin for histologi og immunochemisprøve, inkludert hypoxyprobe-en oppdagelse.
- Overvåke dyr for bevegelse, smerte og matforbruk i løpet av de første 6 timene etter operasjonen, og deretter hver eneste dag i 3 dager. Injisere smertestillende middel (karprofen 5 mg / kg, SQ) daglig i 3 dager. Fjern såret klippene 10 dager etter amputasjon ved hjelp av et sår klipp fjerner.
6. Overvåking Mus for tilstedeværelse av metastaser
- Observer mus daglig, og vurdere dem for kliniske tegn på metastase minst to ganger i uken.
- Observer dyrene for tilstedeværelse av macrometastases presentere som massene som utvikler seg på forskjellige steder, typisk skuldre, kontralaterale ben og kjever. For å oppnå dette, nøye palpere hode, nakke og aksillære regioner, og motsatt bakben. Sjekk for interne organmetastaser via oppblåst mage sammen med MR-røntgen.
- Sjekk for tilstedeværelse av lungemetastaser ved å trykke på xyphoid prosessen (den nedre ende av brystbenet) med index finger. 24
MERK: Dette trykket avtar den diaphragmatic respirasjon evne. Mus med avanserte lungemetastaser viser tegn til åndenød manifestert av arbeidskrevende å puste. - Observer dyrene for nevrologiske symptomer som leg lammelse og ataksi tyder metastaser i sentralnervesystemet.
- Overvåk mus minst en gang per uke for vekttap, som en indikasjon på potensiell sykdomsprogresjon. Kroppsvekttap overstiger 15% av den pre-prosess vekt er ansett som en human endepunkt.
7. Magnetic Resonance Imaging (MRI) for å påvise metastaser
- Utføre MR for å påvise metastaser på ønskede tidspunkter. 18
MERK: I denne studien ble en 7-Tesla horisontal spektrometer brukt. MR ble utført på dag 15 og 35 etter amputasjon for SK-ES1 celler og på dag 15 for TC71 celler. - Plasser musen i en anestesi induksjon chamber inneholdende 1 - 3% isofluran i en gassblanding av 30% oksygen og 70% dinitrogenoksid.
- La musen i induksjon kammer før det svarer ikke på ytre stimuli. Deretter fjerner dyret fra induksjonskammeret.
- Overføre bedøvet mus på en stereotaksisk holder med åndedrett og temperatur monitorization med kontinuerlig administrering av 1,5% isofluran og 30% dinitrogenoksid. Påfør sterile ikke-medisinert oftalmisk salve til hvert øye for å hindre hornhinnen tørrhet. Bilde dyret enten i en 40 eller 23 mm Bruker mus volum spole for hele kroppen eller avbildning av hjernen, respektive.
- Bruk en todimensjonal, T2-vektet RARE sekvens: TR = 3000 msek, TE = 24 msek, matrix = 256, FOV = 4,35 x 3,0 cm, skivetykkelse = 0,5 mm, RARE faktor = 4 og gjennomsnitt = 4. 18
- Plasser dyret i et varmt utvinning bur og overvåke kontinuerlig inntil våken.
MERK: Musene vil komme seg raskt siden et grunt plan anestesi brukes. Overvåk dyrene i løpet av de første 6 timer etter bildebehandling for å forsikre deg om at det ikke er noen negative effektene av anestesi.
8. Eutanasi og Obduksjon
- Avlive mus gang dyrene stede med metastaser detekterbare ved MR og / eller kliniske symptomer på sykdomsprogresjon.
MERK: I denne studien, ble musene avlivet på dag 50 og 25 etter amputasjon for dyr som bærer SK-ES1 og TC71 xenografter, henholdsvis. I noen tilfeller, før avlivning var nødvendig på grunn av en høy byrde metastase. - Avlive musene ved eksponering til CO 2 ved 1,5 l / min (CO 2 ved 10 - 30% av eutanasikammeret vol / min). For å sikre dyr død, utføre halshugging etter CO 2 eksponering.
- Spray hele mus med 70% etanol og plassere den i laminær hette. Samle opp blod ved hjertepunksjon ved anvendelse av en 25 G nål ½ med en 1 ml sprøyte og overføring til en blodsamle tuvære inneholdende 2 mg av EDTA.
- Samle følgende vev: milt, binyrene, eggstokkene, nyrer, lever, lunger, hjerne, høyre bein, benmarg fra både humeri og ryggrad, samt makroskopiske metastaser som finnes i andre steder. 25,26
- Fix halvparten av hver vev i 10% nøytral-bufret formalin for histologi og immunkjemi, inkludert hypoxyprobe-en oppdagelse. Snap fryse den andre halvparten i flytende nitrogen, og deretter lagre ved -80 ° C for RNA, DNA eller protein isolasjon. 25,26 For primærcellekultur, samle vevsprøver som beskrevet i kapittel 9 nedenfor.
9. Primær Cell Culture
- For å utføre primærcellekultur, dissekere vev fra amputert lem (kapittel 5 ovenfor) eller under obduksjon (§ 8 ovenfor) under sterile forhold i en laminær hette.
- Fremstille cellekulturmedier egnet for cellelinje som brukes for ortotopiske injeksjoner, supplert med penicillin (200 enheter / ml),streptomycin (200 ug / ml), Fungizone (1 pg / ml), og 0,2% mycoplasma profylaktisk antibiotika. Plassere 2,5 ml av de primære dyrkningsmediet inn i en 6 cm cellekulturplate.
- Velg levedyktige tumorvev områder fra primære svulster eller metastaser, og deretter isolere to til tre segmentene på 2-3 mm hver bruker steril saks.
MERK: levedyktig tumorvevet er vanligvis funnet på kantene av svulsten og kan bli diskriminert fra nekrose ved sin lyserød eller rødbrun farge, sterk glans og generelt utseende våt. I motsetning til dette er nekrotisk vev ofte sett i sentrum av tumoren, og viser som et hvitaktig / kremfarge masse med et matt, simpelt utseende. 27 - Overfør isolerte segmenter til en 6 cm cellekultur plate inneholdende primære dyrkningsmedium som er beskrevet i trinn 9,2.
- Kultur cellene under standardbetingelser, som beskrevet i kapittel 1 (NB) og 9.2. 18,28 Sjekk kulturen for mobil utvekst som følge av vev stykker, which bør observeres i løpet av noen dager. Når cellene når konfluens, trypsineres og forplante dem i henhold til standard cellekulturteknikker.
NB: Den primære cellekultur kan senere brukes til å evaluere vekst og metastatiske egenskaper av celler avledet fra kontroll- og hypoksiske tumorer, så vel som deres molekylære egenskaper, som tidligere beskrevet. 18
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter injeksjon av ES-celler i gastrocnemius muskelen, er de primære tumorene tillatt å vokse til en kalv størrelse på 250 mm 3 (figur 1, 2). Den tid som er nødvendig for svulstene å nå dette volumet vanligvis varierer fra 10 - 15 dager for TC71 til 20-25 dager for SK-ES1 xenografter, henholdsvis. Svulster på en kalv volum på 250 mm 3 oppviser et forholdsvis lavt nivå av endogen hypoksi (ca. 3% av tumorvev), basert på hypoxybrobe-1 (pimonidazole) farging (figur 4A, C). Viktigere, i disse kontrolltumorer ble positiv farging for hypoxyprobe-1 observert bare i de områder av fysiologisk hypoksi, dvs. i tumorceller som er fjernt fra vaskulaturen og begynne å gjennomgå celledød (figur 4A). Slike flekker viser en karakteristisk "air-brush" mønster, mens mesteparten av sunn svulstvev fortsatt negativ for hypoxyprobe-en. <sup> 6 I motsetning til dette, FAL utført ved dette stadiet skaper dyp hypoksi, som vist ved positiv farging for hypoxyprobe-1 ble observert i de aller fleste av tumorcellene ved 4 timer post-FAL (figur 4B). Spesielt er de hypoxyprobe-1-positive tumorceller også observert i umiddelbar nærhet til blodkar og det karakteristiske mønster av fysiologisk hypoksi går tapt. I disse FAL-behandlede tumorer var 73% av vev består av hypoksiske tumorceller (Figur 4C). Svulstvev også viser de første tegn på hypoksi-indusert skade, inkludert cellen krymping og løs struktur (figur 4B).
Effektiviteten av FAL ble ytterligere understøttet av den fullstendig hemming av primær tumorvekst. I løpet av tre-dagers periode mellom FAL og amputasjon, gjorde størrelsen på primærsvulster ikke øke (figur 5A). I motsetning til dette primære svulster fra mus utsatt for imitert surgery fortsatte å vokse raskt, og nådde et volum på ca 650 mm3, således etterligner veksten av tumorer hos kontrollmusene ikke utsatt for kirurgi (figur 5A). 18 I tråd med disse dataene, histopatologiske analyse avdekket store områder av nekrose i FAL-behandlede primære svulster høstet 3 dager etter operasjonen (figur 5B). Ikke desto mindre var det grupper av levedyktige tumorceller som er til stede i tumorvevet, vanligvis ligger på kantene av tumoren, i nærheten av blodkar (figur 5B). For å undersøke status oksygenering av disse cellene vi brukte hypoxyprobes, som aktiveres i levende hypoksiske celler, senere få muligheten til kovalent binding til proteiner i disse cellene. 29 Som sådan, er disse prober tjene som en permanent markør av cellene som opplevde hypoksi til enhver tid. Derfor, for å detektere endringer i oksygennivået av tumorcellene i løpet av varigheten av experiment, brukte vi to forskjellige hypoxyprobes som kan registreres uavhengig av immunhistokjemi. Probene ble administrert ved to tidspunkter - umiddelbart før FAL (hypoxyprobe-1) og før amputasjon (hypoxyprobe-2, CCI-103F) - og deres lokalisering ble påvist i tumorer høstet 3 dager post-FAL (figur 1). Hypoxyprobe-1, som var til stede i systemet ved tidspunktet for FAL, markert et flertall av tumorcellene, som vevet fikk en alvorlig hypoksisk (figur 5C). Denne merking er også tydelig i områder med nekrose / apoptose, siden disse cellene var fremdeles i live ved FAL og derfor i stand til permanent å binde hypoxyprobe-1, som vist i figur 4B. I motsetning til dette, hypoxyprobe-2 administrert 2 dager post-FAL bare farget levedyktige celler, som cellene i nekrotiske områder var allerede døde og ute av stand til å aktivere sonden ved tidspunktet for administreringen (figur 5D). Interessant, vi også observed levedyktig tumorvevet ved siden av blodkar som i utgangspunktet var hypoksisk (hypoxyprobe-1-positive), men tilfredsstillende oksygenert på det senere tidspunkt (hypoxyprobe-2-negativ) (figur 5C, D). Dette funnet er i samsvar med tidligere rapporter som indikerer at sivile fartøy avhengig vev reperfusjon gjenoppretter blodstrømmen i bakben 3 dager etter FAL. 20 De levedyktige tumorceller som er igjen i tumorvevet 3 dager post-FAL var meget invasiv, som gjenspeiles av deres massive intravasation på vaskulariserte kantene av tumor (figur 5E). Noen av cellene i karlumenet var positive for hypoxyprobe-en, noe som indikerer at de hadde blitt hypoksisk på FAL, men forble levedyktig. Sammen er disse data tyder på at vev reperfusjon etter alvorlig hypoksi kan lette rømning av celler fra de primære svulster.
Basert på pilotforsøk, utbredt metastaser varpåvises ved MR ca 35 dager etter amputasjon for SK-ES1 xenografter, mens TC71 celler vanligvis spredning innen 15 dager. Følgelig, for komparativ analyse av metastaser ventetid og frekvens, MRI ble utført på dag 15 og 35 etter amputasjon for dyrene bærer SK-ES1 svulster, mens en avbildning på dag 15 var tilstrekkelig for mus med TC71 svulster. Eutanasi ble utført på dag 50 og dag 25 for dyrene med SK-ES1 og TC71 xenografter, henholdsvis. Som tidligere rapportert, de vanligste typene av metastaser inkludert bløtvev massene i skulderområdet, samt skjelettmetastaser til kontralaterale ben, kjeveområdet og ryggrad for SK-ES1 celler og lunge og bekkensvulster for TC71. 18 I tillegg hyppige metastaser i indre organer, inkludert binyrer, lunger og lever, samt benmargsinfiltrasjon, ble observert hos mus som bærer FAL-behandlede SK-ES1 xenotransplantater (figur 6). Generelt, hypoksi betydelig øktden samlede (SK-ES1) eller stedsspesifikke (TC71) frekvens og mangfold av metastaser i begge cellelinjer. Imidlertid TC71 xenotransplantater utviklet også hyppig tilbakevendende masser på stedet av amputasjon (25% for kontrollen og 40% for FAL-behandlede tumorer), som tidligere beskrevet for de store TC71 primære svulster. 18
Vevene fra kontroll og FAL-behandlede primære tumorer og metastaser kan også være en kilde av materiale for omfattende molekylære analyser rettet mot identifisering av hypoksi-aktiverte reaksjonsveier som er involvert i formidling ES. For eksempel, ble det observert betydelige forskjeller i metabolomic profiler av kontroll og hypoksiske primære tumorer (data ikke vist). Vi var også i stand til å isolere flere cellelinjer fra alle de ovennevnte vev. I mange tilfeller, de celler avledet fra FAL-behandlede tumorer viste merkbare forandringer i morfologi, sammenlignet med de opprinnelige cellene og de som er avledet fra styre tumors (figur 7A). Renheten av disse cellekulturer ble bekreftet ved positiv farging for Ewing sarkom markør, CD99 (figur 7B). Videre er 100% av cellene i de etablerte cellelinjer som hadde et positivt signal i fluorescens in situ hybridisering (FISH) med humane centromeric prober, ofte presenterer med økt kromosomtall (Figur 8A). Det humane opprinnelsen til disse celler, ble ytterligere bekreftet ved analyse av metafase-kromosomer (figur 8B) som viste cytogenetisk rearrangementer som tidligere er beskrevet for SK-ES1-celler i både den opprinnelige cellelinjen og celler avledet fra FAL-behandlede tumorer (figur 8B). 30
Figur 1. Oversikt over ES Hypoksi Model. ES-celler (1 - 2 x 10 6) ble injisert inn i gastrocnemius musklene SCID / beige mus. Så snart de resulterende primære tumorene nådde en kalv volum på 250 mm3, ble musene delt i to forsøksgrupper. Mus fra kontrollgruppen ble injisert med hypoxyprobe-1 (HP-1), og de primære tumorene ble spaltet ut av lem amputasjon. Mus fra den hypoksiske gruppen ble injisert med hypoxyprobe-1, og deretter utsatt for femoral arterie ligering (FAL). To dager senere ble musene injisert med hypoxyprobe-2 (HP-2), og deretter de tumorbærende lemmer ble amputert tre dager etter FAL. Dyrene fra begge gruppene ble overvåket ved periodisk magnetisk resonansavbildning (MRI). Når metastaser ble klart på grunnlag av avbildnings og kliniske tegn ble musene avlivet, og nærværet av metastaser ble bekreftet ved obduksjon og histopatologiske analyser. Tidspunktet for tumorvekst, avbildning og eutanasi er basert på SK-ES1 celle vekst og metastasering. Legg merke til at mens hypoxyprobe-2 var nødvendig å etablere metoden og visuAlize endringer i hypoksi nivåer i perioden mellom FAL og lem amputasjon, er bruken ikke avgjørende for den faktiske eksperimenter. Derfor er dette trinnet ikke inkludert i protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Primær tumorvekst. A. Magnetisk resonans bilde (MR) av en intakt bakben. Den røde pilen indikerer stedet og retningen av tumorcelle ortotopisk injeksjon. B. Primær svulst på en kalv volum på ca 250 mm tre vokser i gastrocnemius muskelen (rød kontur). Røde pilspisser indikerer områder av beinødeleggelse. T - tibia. Vennligst cslikke her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Site of lårarterie hemorroider. En representant postmortem røntgen arteriogram av en 129S1 / SVJ mus dynket med bariumsulfat umiddelbart etter ligation er vist å markere tilstedeværelsen av pre-eksisterende sivile fartøy. Legg merke til at mens bildet viser to ligeringer (xs), en distalt til den laterale cirkumfleks lårarterie (LCFA) (rød X) og en annen proksimal til den ekt arterie (hvit X), tumor hypoksi modellen bare brukt den proksimale ligering, nær lyskeligament og distalt for LCFA (rød X). Regionen av sivile fartøy utvikling er vist som beskrevet (svake fartøy), og de er identifisert av sin kronglete, kork-skrue form. Klikk hanre for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Tumor Hypoksi indusert av lårarterie hemorroider (FAL). A. En kontrolltumor ved en kalv volum på 250 mm3 farget med hematoxylin og eosin (H & E) og immunofarget for hypoxyprobe-1 (brun). Hypoxyprobe-1-immunfarging blir kun observert i de områdene av fysiologisk tumor hypoksi, hvor tumorcellene fjernt fra vaskulaturen er ute av oksygen og begynner å gjennomgå celledød. B. FAL behandlet primærtumor ved en tilsvarende størrelse høstet 4 timer etter ligation og farget med H & E og immunostained for hypoxyprobe-en. Majoriteten av tumorceller er svært positive for hypoxyprobe-1, inkludert de som er i umiddelbar nærhet til blodkar. V - blodåre. C. Arealet av positiv farging for hypoxyprobe-1 var quantifIED i kontroll- og FAL-behandlede svulster ved hjelp ImageJ programvare. Feilfelt representerer SEM. *** - P <0,001 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Effekt av lårarteriens hemorroider (FAL) på primærtumorvekst. A. Primær tumorvekst i løpet av tre-dagers periode mellom kirurgi og amputasjon i FAL- (n = 4) og humbug kirurgi-behandlet (n = 4) dyr, sammenlignet med intakte kontroll tumorer (n = 6). Feilfelt representerer SD. *** - P <0,001, sammenlignet med både kontroll og sham kirurgi-behandlede tumorer. B. Hematoxylin og eosin (H & E) farging av en FAL-behandlede tumor høstet 3 dager etter ligering viser utstrakt nekrose i tumoren. Den røde omriss indikerer et område på levedyktig svulst cells i umiddelbar nærhet av et høyt vaskularisert region dynket 3 dager etter FAL. C. FAL behandlet svulstvev høstet 3 dager etter operasjonen immunostained for hypoxyprobe-en. Hypoxyprobe-en ble injisert før FAL. Derfor indikerer positiv farging eksistensen av omfattende vevshypoksi umiddelbart etter kirurgi. D. Hypoxyprobe-2 ble injisert 2 dager etter FAL, og vevet samlet 24 senere, ved amputasjon. Positive hypoxyprobe-2-farging identifiserer vevshypoksi ved amputasjon. Den røde pilen indikerer vev som er hypoksisk på begge tidspunkter, mens den gule pilen indikerer et område som grenser til blodkar som var hypoksisk umiddelbart etter FAL (hypoxyprobe-1-positive), men negativt for hypoxyprobe-2 på tidspunktet for excision, som er en indikasjon på vev reperfusjon. Mangelen på hypoxyprobe-2-farging i nekrotiske områder antyder at cellene i denne regionen var ikke levedyktig ved tidspunktet for dens administrasjon og derforute av stand til aktivt å binde proben. Fargingen presentert i paneler BD ble utført på seriesnitt vev. E. Intravasation i FAL-behandlede tumor 3 dager etter FAL. Den farging identifiserer levedyktige celler positive for hypoxyprobe-en innen karlumenet (rød pil). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Eksempler på metastaser i mus med FAL-behandlede SK-ES1 svulster. De metastaser ble oppdaget av magnetisk resonans imaging (MRI) og bekreftet ved obduksjon og histopatologiske analyser (hematoxylin og eosin farging, H & E). M - metastaser. Klikk her for å se et større vers ion av denne figuren.
Figur 7. Kjennetegn på celler avledet fra FAL-behandlede primære svulster. A. Levedyktige cellekulturer ble etablert fra vev høstet fra kontroll og hypoksiske primære tumorer og deres morfologi ble sammenlignet med den opprinnelige cellelinjer som benyttes for innledende ortotopiske injeksjoner. Cellene avledet fra FAL-behandlede primære tumorer utviser dramatiske endringer i deres størrelse og morfologi. Representative bilder av de opprinnelige og primære tumor-avledet SK-ES1 celler er vist. B. Representative bilder av celler avledet fra FAL-behandlede tumorer immunofarget for ES markør, CD99, og motfarget med den DNA-bindende fargestoff, DAPI. Alle celler er CD99-positive, inkludert hypertrofisk celler som inneholder forstørret kjerner (hvit pil). OAD / 54532 / 54532fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8. kromosom Analyse av celler avledet fra FAL-behandlede svulster. A. Fluorescens in situ hybridisering (FISH) analyse i interfase celler som viser to kjerner med signaler for menneskelig centromeric 4 sonde. Det stor kjerne med fire signaler som indikerer en tetraploid (4n) celle (hvit pil). B. FISH-analyse i representative metafaser av SK-ES1 opprinnelige cellelinje og av cellen avledet fra FAL behandlet primærtumor. Røde piler indikerer inv (1) (p13.1q21), et ikke-tilfeldig cytogenetisk omleiring karakteristisk for SK-ES1-celler. Røde signaler: menneskelig centromeric 4 sonde; Grønne signaler i de opprinnelige SK-ES1 celler: NPY5R sonde på kromosom 4q32.2.e.com/files/ftp_upload/54532/54532fig8large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår modell innebærer sammenligning av metastase i to forsøksgrupper - en kontrollgruppe, hvor tumorer får lov til å utvikle seg i bakben, etterfulgt av amputasjon ved oppnåelse av en kalv volum på 250 mm3, og en hypoksi-eksponert gruppe, hvori tumor- bærende bakben utsettes for FAL på samme volum, etterfulgt av amputasjon 3 dager senere. Selv om det i disse forsøkene Fal-behandlede tumorer er amputert med en liten forsinkelse, som sammenlignet med kontrolltumorer, deres størrelse ikke øker i løpet av tre-dagers perioden mellom ligering og amputasjon. Derfor gjør denne tilnærmingen sammenligning av metastatisk potensial mellom svulster i sammenlignbare størrelser, men med dramatisk forskjellige nivåer av hypoksi. I motsetning til dette, ved hjelp av falsk operasjon, ville en vanlig anvendt kontroll for kirurgiske inngrep, fulgt av 3 dager etter tumorvekst føre til betydelige forskjeller i tumorstørrelse mellom forsøksgruppene, med sham kirurgi-treated primære svulster i besittelse av betydelige nivåer av endogen hypoksi. Basert på pilotforsøk, ikke falsk operasjon ikke i vesentlig grad påvirker tumorvekst eller dets hypoksi nivåer, og kan således bli eliminert fra eksperimentell design. I stedet, strategien for å sammenligne svulster av samme størrelse og forskjellige hypoksi nivåer er et svært relevant modell for å belyse effekten av hypoksi på formidling av sykdommen. Viktigere, i motsetning til tidligere in vitro-studier, gir denne tilnærmingen for omfattende evaluering av de pro-metastatiske handlingene til hypoksi i en naturlig svulstens mikromiljø. 4-6
Målet med eksperimentell design var å oppnå et lavt nivå av basal metastaser som ville tillate for påvisning av en hypoksi-indusert stimulerende effekt på deres formasjonen. Vi fastslått at en kalv størrelse på 250 mm 3 i FAL og amputasjon var optimal for SK-ES1 primære svulster. Imidlertid vil denne parameteren må være optimalisert for ea ch cellelinje, avhengig av deres metastatiske potensial og lokal invasivitet. For svulster med høyere metastatisk potensial, kan trenge den primære svulsten størrelse på amputasjon til å bli redusert. For eksempel TC71 svulster viser en høy lokal invasivitet manifestert ved hyppig dannelse av tilbakevendende svulster på stedet av amputasjon. 18 Når slike masser utvikler, dyrene har til å bli ekskludert fra analysene, da det ikke ville være klart om etterfølgende fjernmetastaser stammer fra de primære tumorer eller fra tilbakevendende tumorer som ofte vokser raskt og utviser høye nivåer av endogen hypoksi. Fra tidligere erfaring, uavhengig av cellelinje som brukes, 150 mm 3 er minimal tumorbærende kalv størrelse som kan måles pålitelig og normalisert. Ved reduksjon av tumorstørrelsen ved FAL og amputasjon ikke eliminere tilbakevendende tumorer eller redusere basal metastase hastighet som er tilstrekkelig, kan den spesielle cellelinjen i spørsmålet ikke være egnet for disse eksperimentene.
ve_content "> Likeledes er det viktig å etablere tidslinjen for MR og aktiv dødshjelp for hver enkelt cellelinje, avhengig av ventetiden for sin metastaser. Spesielt, kan operasjonssåret klipp som forstyrrer MR fjernes tidligst 10 dager post- kirurgi, og denne perioden må noen ganger forlenges på grunn av komplikasjoner med helbredelse. Derfor, i denne studien vi etablert dag 15 som tidspunktet for den første MRI.Et annet viktig hensyn i denne modellen er å opprettholde et nivå av hypoksi stand til å indusere metastatiske prosesser uten å bevirke fullstendig tumor-nekrose, noe som ville forhindre tumorcellespredning. Selv om vi ikke har støtt på dette problem i denne studien, om nødvendig, alvorlighetsgraden av hypoksi kan reguleres ved å forandre den eksakte området og antall av ligeringer i forhold til grenene i lårarterien, slik som LCFA og ekt arterie. 20 Således vil en ligering proksimalt til LCFA skape mer alvorlig ischemi i hindlimb sirkulasjon, og øker derved hypoksiske betingelser i den distale benet. I motsetning til dette, vil ligere distalt til påfølgende grener av lårarterien redusere den resulterende hypoksi i den nedre bakben.
Viktigere var det ingen alvorlige bivirkninger av kombin FAL og amputasjon prosedyrer og ingen dødsfall knyttet til operasjoner, som tidligere rapportert for disse teknikkene utføres separat. 18-20 er således suksessen til fremgangsmåten begrenses hovedsakelig av hastigheten av tumor ta på det primære stedet og hyppigheten av tilbakevendende tumorer, som begge er cellelinje avhengig.
Som hypoksi har vært implisert som en pro-metastatisk faktor i mange tumortyper, kan denne fremgangsmåten også er egnet for direkte å teste dens effekter og som avgrenser dens mekanismer handlinger i andre sarkomer som utvikler seg i lemmer. 23 Videre kan en lignende strategi brukes til andre kreftformer vokser i ortotopiske miljøer wed en veldefinert blodforsyningsrute. Dermed, med passende modifikasjoner, kan denne modellen være et nyttig verktøy i forskning utover innen ES biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 ml Insulin syringes with permanently attached 28 G ½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges - Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25 G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 ml syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3-EDTA Micro tube 1.3 ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
References
- Lessnick, S. L., Ladanyi, M. Molecular pathogenesis of Ewing sarcoma: new therapeutic and transcriptional targets. Annu Rev Pathol. 7, 145-159 (2012).
- Ladenstein, R. Primary disseminated multifocal Ewing sarcoma: results of the Euro-EWING 99 trial. J Clin Oncol. 28, 3284-3291 (2010).
- Dunst, J., Ahrens, S., Paulussen, M., Burdach, S., Jurgens, H. Prognostic impact of tumor perfusion in MR-imaging studies in Ewing tumors. Strahlenther Onkol. 177, 153-159 (2001).
- Aryee, D. N. Hypoxia modulates EWS-FLI1 transcriptional signature and enhances the malignant properties of Ewing's sarcoma cells in vitro. Cancer Research. 70, 4015-4023 (2010).
- Knowles, H. J., Schaefer, K. L., Dirksen, U., Athanasou, N. A. Hypoxia and hypoglycaemia in Ewing's sarcoma and osteosarcoma: regulation and phenotypic effects of Hypoxia-Inducible Factor. BMC cancer. 10, 372 (2010).
- Tilan, J. U. Hypoxia shifts activity of neuropeptide Y in Ewing sarcoma from growth-inhibitory to growth-promoting effects. Oncotarget. 4, 2487-2501 (2013).
- Franzius, C. Successful high-resolution animal positron emission tomography of human Ewing tumours and their metastases in a murine xenograft model. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 33, 1432-1441 (2006).
- Hauer, K. DKK2 mediates osteolysis, invasiveness, and metastatic spread in Ewing sarcoma. Cancer Research. 73, 967-977 (2012).
- Manara, M. C. Preclinical in vivo study of new insulin-like growth factor-I receptor--specific inhibitor in Ewing's sarcoma. Clin Cancer Res. 13, 1322-1330 (2007).
- Scotlandi, K. Murine model for skeletal metastases of Ewing's sarcoma. J Orthop Res. 18, 959-966 (2000).
- Vormoor, J. Establishment of an in vivo model for pediatric Ewing tumors by transplantation into NOD/scid mice. Pediatr Res. 49, 332-341 (2001).
- Picarda, G. Preclinical evidence that use of TRAIL in Ewing's sarcoma and osteosarcoma therapy inhibits tumor growth, prevents osteolysis, and increases animal survival. Clin Cancer Res. 16, 2363-2374 (2010).
- Vormoor, B. Development of a preclinical orthotopic xenograft model of ewing sarcoma and other human malignant bone disease using advanced in vivo imaging. PLoS One. 9, e85128 (2014).
- Wang, Y. Platelet-derived growth factor receptor beta inhibition increases tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) sensitivity: imatinib and TRAIL dual therapy. Cancer. 116, 3892-3902 (2010).
- Wang, Y. X. Inhibiting platelet-derived growth factor beta reduces Ewing's sarcoma growth and metastasis in a novel orthotopic human xenograft model. In Vivo. 23, 903-909 (2009).
- Odri, G. A. Zoledronic acid as a new adjuvant therapeutic strategy for Ewing's sarcoma patients. Cancer Research. 70, 7610-7619 (2010).
- Merchant, M. S. Interferon gamma enhances the effectiveness of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonists in a xenograft model of Ewing's sarcoma. Cancer Research. 64, 8349-8356 (2004).
- Hong, S. H. High neuropeptide Y release associates with Ewing sarcoma bone dissemination - in vivo model of site-specific metastases. Oncotarget. 6, 7151-7165 (2015).
- Lee, E. W. Neuropeptide Y induces ischemic angiogenesis and restores function of ischemic skeletal muscles. J Clin Invest. 111, 1853-1862 (2003).
- Tilan, J. U. Platelet neuropeptide Y is critical for ischemic revascularization in mice. FASEB J. , (2013).
- Toffoli, S., Michiels, C. Intermittent hypoxia is a key regulator of cancer cell and endothelial cell interplay in tumours. The FEBS journal. 275, 2991-3002 (2008).
- Das, B. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem cells (Dayton, Ohio). 26, 1818-1830 (2008).
- Arndt, C. A., Rose, P. S., Folpe, A. L., Laack, N. N. Common musculoskeletal tumors of childhood and adolescence. Mayo Clin Proc. 87, 475-487 (2012).
- Mendoza, A. A novel noninvasive method for evaluating experimental lung metastasis in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52, 584-589 (2013).
- Feldman, D. B., Seely, J. C. Necropsy Guide: Rodents and the Rabbit. , CRC Press. (1988).
- Parkinson, C. M. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J Vis Exp. , (2011).
- Raymond, A. K., Lazar, A. J. Bone Sarcoma. PP, L. in, S, P. atel , Springer. (2013).
- Dietel, M., Arps, H., Gerding, D., Trapp, M., Niendorf, A. Establishment of primary cell cultures: experiences with 155 cell strains. Klin Wochenschr. 65, 507-512 (1987).
- Varghese, A. J., Gulyas, S., Mohindra, J. K. Hypoxia-dependent reduction of 1-(2-nitro-1-imidazolyl)-3-methoxy-2-propanol by Chinese hamster ovary cells and KHT tumor cells in vitro and in vivo. Cancer Research. 36, 3761-3765 (1976).
- ATCC. , http://www.atcc.org/products/all/HTB-86.aspx#characteristics (2014).
