Introduction
Ewing sarkomu (ES) çocukları ve ergenleri etkileyen agresif bir kanseridir. 1 tümörler genellikle bacaklarda, yumuşak dokular ve kemikleri de gelişebilir. metastaz varlığı ES hastalar için tek ve en güçlü kötü prognostik faktör iken, onların gelişimini altında yatan mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. 2 tümör hipoksi ES ilerlemesinde rol birkaç faktörlerden biridir. ES hastalarda, tümör dokusu içinde perfüze olmayan alanlarının varlığı kötü prognoz ile ilişkilidir. 3 in vitro, hipoksi ES hücrelerinin invazivliğini artırır ve pro-metastatik genlerin ifade tetikler. 4-6 Bununla birlikte, kanıt bu satırları rağmen, hipoksi kaynaklı ES ilerlemesi ve yayılması için doğrudan kanıt var. Ayrıca, bilinmeyen hipoksi şu anda bu tür etkiler uygular hangi mekanizmalar. Dolayısıyla, biz in vitro verileri ve klinik glikozu mevcut arasındaki boşluğu doldurmak için bir in vivo model oluşturdukyenilikçiliklere. Bu model sistemi, ex vivo olarak, patolojik ve moleküler analizleri (Şekil 1) ile kombinasyon halinde, in vivo olarak tümör ilerlemesi ve metastaz takip manyetik rezonans görüntüleme (MRI) kullanılarak, doğal ortamında oluşan tümör üzerindeki hipoksiye doğrudan test sağlar.
ES yerleşik bir transgenik modeli mevcut olduğundan, bu tümörlerin metastatik özelliklerine in vivo çalışmalar immün sistemi baskılanmış farelere insan hücrelerinin enjeksiyonu güveniyor. immünolojik engelli hayvanların kullanımı hastalığın ilerlemesi üzerinde bağışıklık sisteminin etkisini hafife olsa da, insan hücrelerini kullanma yeteneği bu tür çalışmaların çevirilebilirlik artırır. Farklı ksenograft modelleri arasında, kuyruk damar içine sistemik enjeksiyonlar gerçekleştirmek için en kolay, henüz onlar tümör hücre intravazasyonunda ilk adımları ihmal ve büyümenin birincil sitesinden kaçmak. Öte yandan, 7-12, orthoto kemikler (femur, kaburga) ya da kas içine tümör hücrelerinin enjekte içeren pic Xenografting, biyolojik olarak daha insan kanser ile ilgili daha teknik açıdan zorlayıcı, ama aynı zamanda. Metastaz gelişmeden önce 13-16 Bununla birlikte, geçmişte, primer tümörlerin hızlı büyüme ile ilişkili yüksek morbidite genellikle gerekli kılmıştır hayvan ötenazi. Bu çalışmada, biz MRG ile metastatik ilerlemesi boyuna izlenmesi ile birlikte ortaya çıkan primer tümörün eksizyonu takiben gastroknemius kasının içine hücre enjeksiyonu, önceden belirlenmiş bir model kullandı. Kaslar ve kemikler - - tibia yakın gastroknemius kas içine 17,18 tür enjeksiyonlar iki doğal ES ortamlarında tümör büyümesi için izin ve tipik insanlarda etkilenen yerlere uzak metastaz ile sonuçlanır. 18 Böylece, bu model doğru hastalığın ilerlemesi sırasında ES hastalarda görülen metastatik süreçleri tartışıldı.
tert "> düşük hindlimb birincil tümörlerin lokalizasyonu, tümör dokusuna kan akımı hassas kontrolünü kolaylaştırır. femoral arter ligasyonu (FAL) uzak bölgelere kan akışını engellemek için anjiyojenez araştırmada kullanılan iyi bilinen bir tekniktir ayak ve iskemi tepki doku vaskülarizasyonu araştırılması. 19,20 Önemli olarak, kan akımının başlangıç damla yaklaşık olarak 3 gün FAL sonra gözlenen kollateral açma ve reperfüzyonun takip etmektedir. 20 Bu durumda, bir tümör taşıyan ekstremitede yapıldığında, Bu model, hızla büyüyen tümörlerde doğal olarak hipoksi / reperfüzyon olayları yeniden ve yeni açılan kollateral damarlar yoluyla alt hindlimb için perfüzyon restorasyon nedeniyle metastatik tümör hücrelerinin kaçmasını sağlar. 21 önemlisi, tümör boyutu olduğunda bu işlem yapılmalıdır tipik olarak tümör taşıyan buzağı VOL'de kontrol tümörlerinin aşırı hipoksi (önleyecek kadar küçükKontrol ve FAL tedavi edilen gruplar arasında, tümör hipoksi düzeylerinde anlamlı farklılıklar sağlanması 250 mm3), - 150 ume.ES süresi için hipoksi etki ve metastaz frekans uzunlamasına izlenmesine ek olarak, bu model, doku toplanması ve primer tümörler ve metastazlar, hem yeni hücre çizgilerinin geliştirilmesine izin verir. Önemli bir şekilde, önceki çalışma metastaz türetilmiş hücre çizgileri, tümör yayılması, tümör sürekli hücre fenotipinde değişiklikler ve böylece metastatik işlemleri deşifre bu hücre çizgilerinin kullanımını geçerli ile ilişkili olduğunu gösteren hayvanlara yeniden yerleştirilmesi sırasında gelişmiş metastatik potansiyelini gösteren karar vermişlerdir. 18. Toplu olarak, bu model artık hipoksi kaynaklı metastatik yollarının tanımlanması için gerekli olan genetik ve moleküler analiz için kullanılabilir.
hipoksi gibi çeşitli t malignite arttırıcı yanlısı metastatik faktördürumors, bizim model, osteosarkom ve rabdomyosarkomu doğal olarak bacaklarda geliştirmek diğer tümör türleri, hipoksi rolünü araştırmak için bir platform olarak kullanılabilir. 21-23 Ayrıca, benzer bir yaklaşım, kan akışının iyi tanımlanmış bir yol ile anatomik yerle artan maligniteleri de uygulanabilir. Sonuçta, model modifiye edilebilir ve onun yarar daha bireysel araştırma ihtiyaçlarına bağlı olarak, genişletilmiş.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm işlemler, Georgetown Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.
Ortotopik Enjeksiyonluk 1. Hücre Hazırlanması
- standart koşullar altında kültür, insan ES hücreleri. değil 5 farelerin enjeksiyon için confluency% 70 aşan yaklaşık bir 15 cm hücre kültürü plakası kullanın.
NOT: Bu çalışma için, SK-ES1 hücreleri,% 10 FBS ve% 1 4- (2-hidroksietil RPMI kolajen kaplı plakalar ve TC71 hücreleri% 15 fetal sığır serumu (FBS) ile kültürlenmiş McCoy'un 5A ortamı içinde kültüre edildi ) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES). Her iki ortam antibiyotik ile takviye edilmiştir - penisilin (100 birim / ml), streptomisin (100 ug / ml) ve fungizon (1 ug / ml). - 5 dakika için% 0.25 tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile% 70 izdiham fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) trypsinize ES hücreleri yıkayın.
- Hücre kültürü medi plakadan ES hücreleri çıkarınA, daha sonra oda sıcaklığında, 200 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj. Yeniden askıya soğuk PBS, 10 ml ES hücreleri ve daha sonra hücre sayısı.
- Daha sonra santrifüje ES oda sıcaklığında 200 x g'de 5 dakika boyunca hücreler ve askıya tekrar 2 x 10 7 (SK-ES1) ya da soğuk PBS, ml başına 10 7 (TC71) hücre. enjeksiyonları yaparken buz üzerinde nihai bir hücre süspansiyonu tutun.
Gastrocnemius Muscle içine ES hücrelerinin 2. Ortotopik Enjeksiyon
- 4-6 haftalık dişi SCID / bej fareler kullanın.
- Embriyonik kök hücrelerin enjekte etmek, nazikçe alt hindlimb medial tarafını açığa fare tuşunu basılı tutun ve dördüncü ve beşinci parmakları arasında sol bacak stabilize.
- Bir 28 G ½ iğne kullanarak ya gastroknemıus kasına 2 x 10 6 (SK-ES1) ya da 10 6 (TC71) ES hücreleri (Şekil 2A) içeren, daha önce hazırlanan hücre süspansiyonu, 0.1 ml enjekte edilir.
NOT: Her ne kadar kas içi inj için maksimum sesections enjekte edilen, yüksek hücre sayısı, bu özel işlem için, tipik olarak 0.1 mL gerekli olduğu için hacim artışı 0.05 ml'dir. Bu prosedür Georgetown Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.- tibia tepe / tübero- yönünde 45 derecelik bir açı - gastroknemius kas içine öne yaklaşık 30 iğne takın.
- tibial tepe / tuberositas dokunduğunda hafifçe iğneyi çıkartın. Yavaşça basıncı kademeli serbest bırakmak için iğne çekilmesi, hücre süspansiyonu çözümü enjekte edilir.
- sıkıntı belirtileri önümüzdeki 24 saat boyunca enjekte fareler izleyin.
NOT: Hayvan işlemede daha az deneyime sahip Müfettişler tümör hücresi enjeksiyonları için fareler anestezi düşünmelisiniz. Bazı kurumlar güvenlik nedeniyle anestezi gerekebilir.
3. Birincil Tümör Büyüme İzleme
- d birincil tümörlerin büyümesini izlemekünlük tümör boyutu istenilen hacim ulaşıncaya kadar.
NOT: Bu çalışmada, 250 mm 3 buzağı hacmi deney (Şekil 2B) bir başlangıç noktası olarak kullanılmıştır. tümörler bu büyüklüğe ulaşması için 2 hafta - Tipik olarak, yaklaşık 1 sürer.- onun-medial lateral ve ön-arka uzunlukları yoluyla dijital kumpas ile günlük buzağı boyutunu ölçmek.
- D uzun çapı ve d tümör taşıyan düşük hindlimb kısa çapı 3.14 x, formül (D xD 2/6) ile dana hacmini belirler.
NOT: - 50 mm 3 normal erişkin fare buzağı boyutu yaklaşık 40 olduğunu. Hacim tümörün büyümesi ve baldır esas olarak tümör dokusu oluşacak sonraki aşamalarında artacaktır.
Tümör taşıyan hindlimb hipoksi Başlatmaya 4. Femoral Arter Ligasyonu (FAL)
- Bu işlem için gerekli cerrahi aletler hazırlayın: curved veya sivri ince forseps, forseps, cerrahi makas ve iğne tutucu çekti. Bir otoklav veya sıcak-boncuk sterilizatör kullanılarak cerrahi öncesi bu araçları sterilize edin. Ayrıca, bu ameliyat için hazır ince pamuklu çubuklarla var.
NOT: Bu araçlar işlem sırasında gerektiği gibi ucunda yeniden sterilize edilmesi tavsiye edilir. - Analjezik ajan (Carprofen 5 mg / kg) deri altından (SQ) enjekte edilir. algılamak ve hipoksi doğrulamak için, hypoxyprobe-1 (pimonidazol, 60 mg / kg) enjekte edilir.
NOT: Bu doz fare başına 1.5 mg eşittir ve intraperitonal PBS (IP) 'de 15 mg / ml hypoxyprobe çözeltisi 0.1 mL püskürtülmesiyle elde edilir. hypoxyprobe sonra immünohistokimyasal olarak hayvan dokularında saptanabilen postmortem olduğunu. - 1 L / dakikalık bir akış hızında% 100 oksijen içinde% 5 izofluran - 3 ihtiva eden bir anestezi indüksiyonu odasında fare yerleştirin.
- dış uyaranlara tepkisiz kadar indüksiyon odasında fare bırakın. Sonra i hayvan kaldırmaknduction odası. İşletim yüzeyinde bir ısınma pad üstüne yerleştirilen steril bir örtü üzerinde yatar pozisyonda hayvan yerleştirin. 0.8 L / dakikalık bir akış hızında% 100 oksijen içinde% 3 izofluran - 1, sürekli bir akış bağlamak için bir burun konisi kullanın.
- kornea kurumasını önlemek için her gözün steril olmayan ilaçlı oftalmik merhem sürün. iyice cerrahi alan atmaktadır için en fazla 10 saniye boyunca cilt üzerinde bırakarak, epilasyon kremi uygulayın. Sonra bir etanol hazırlık takımını kullanarak epilasyon kremi silin.
- Uzatın ve yaklaşık 45 derecelik fare orta hattan bant parçası ile hindlimb sabitleyin. hindlimb güvenli sonra iki kez daha her tekrarlayarak, etanol, ardından% 10 povidon / iyot çubukla / çözeltisi ile maruz cildinizi silin. cerrahi işlem geri kalanı için, arka bacak bölgesinin büyütülmüş bir görünümünü elde etmek için bir stereo mikroskop kullanımı.
- sivri forseps ve cerrahi makas kullanarak, sk bir kesi yapmakyaklaşık 1 cm uzunluğunda, içinde, kasık bölgesine doğru orta uyluk. tuzlu ıslatılmış ince pamuklu çubuklarla kullanarak, yavaşça uyluk kas çevreleyen deri altı yağ dokusu uzak fırça.
- Dikkatle cilt altı yağ dokusu ile künt diseksiyon ile yatan femoral arter ortaya koymaktadır. orta üst adduktor kas damarsal maruz yara ve cerrahi alan stabilize.
- yavaşça delip membranöz femoral kılıf sayesinde, ince forseps kullanarak nörovasküler demet ortaya çıkarmak. Ince forseps temiz bir set kullanarak incelemek ve inguinal ligament distal kasık yakın proksimal yerde femoral ven ve sinir femoral arter ayırın. femoral ven duvarını delici kaçınmak için dikkatli kullanın.
- diseksiyon ardından, lateral sirkumfleks femoral arter (LCFA) şubesine femoral arter ve distal altında 6-0 ipek sütür bir iplikçik geçmektedir. Çift düğüm (Şekil 3) kullanılarak femoral arter tıkamak. 6-0 polipropilen sütür ile kesi kapatın. kesi kapattıktan sonra, sıvı dengesi tedavisi için sıcak tuzlu su SQ, 0.5 ml enjekte edilir. kurtarma kafesine bir dökümlü sıcak ped üstüne hayvan koyun ve uyanık kadar sürekli izlemek.
- Analjezik ajan ameliyat sonrası ilk 6 saat boyunca hayvanlar izlemek ve enjekte (Carprofen 5 mg / kg, SQ) 3 gün süre ile her gün. Dikişler steril makas kullanarak 10 gün sonrası ameliyat çıkarın.
Bacak Amputasyon tarafından 5. Birincil Tümör eksizyonu
NOT: buzağı boyutu kontrol grubu için 250 mm 3 veya hipoksik grup için FAL sonra 3 gün ulaştığında tümör taşıyan alt hindlimb organını.
- nazikçe hayvanı tutarken saç kesme makineleri ile pelvik bölgeye distal tibia tümör taşıyan uzuv saç tıraş. İşlemden önce analjezik ajan (Carprofen 5 mg / kg, SQ) enjekte edilir.
- Bir anestezi indüksiyon ch içine fare yerleştirin1 L / dakikalık bir akış hızında% 100 oksijen içinde% 5 izofluran - sarı 3 ihtiva etmektedir. dış uyaranlara tepkisiz kadar indüksiyon odasında fare bırakın. Sonra indüksiyon odasından gelen hayvan çıkarın.
- İşletim yüzeyinde bir ısınma pad üzerinde yerleştirilen steril bir örtü üzerinde sağ lateral yatar pozisyonda hayvan yerleştirin. 0.8 L / dakikalık bir akış hızında% 100 oksijen içinde% 3 - izofluran 1 sürekli bir akış bağlamak için bir burun konisi kullanın. kornea kurumasını önlemek için her gözün steril olmayan ilaçlı oftalmik merhem sürün
- 3 kez tekrarlayarak etanol, ardından% 10 povidon / iyot bezi / solüsyonu kullanılarak cerrahi siteyi, hazırlayın. Steril cerrahi alanında elde etmek için fare üzerinde bir steril gazlı bez (örneğin, cerrahi drape) uygulayın.
- Künt diseksiyon ve proksimal cildin geri çekilmesi ardından orta femur çevresel cilt kesisi, emin olun. bacağın ortalama tarafında medial femoral nörovasküler pedikül Açığa ve ardından Arter4-0 kaplamalı (Polyglactin 910) emilebilir sütür materyali kullanarak inguinal ligament yakın.
- koksofemoral eklem yumuşak doku künt diseksiyon ardından makas ile kas gruplarının, bir orta-femoral kesiye gerçekleştirin. Bir kemik kesici kullanarak, orta femoral osteotomi gerçekleştirin. steril ince pamuklu bir bez veya bir emilebilir jelatin sünger kullanarak, yavaşça en aza indirmek ve kanamayı önlemek için osteotomi sitesini basın.
- cerrahi yara klipleri kullanarak örten cilt kapatın ve sıvı dengesi tedavisi için ılık tuzlu su SQ 0.5 ml enjekte edilir. kurtarma kafesine bir dökümlü sıcak ped üstüne hayvan koyun ve uyanık kadar sürekli izlemek.
- cerrahi üzerine, RNA, DNA veya protein izolasyonu için primer tümörlerden doku örnekleri toplamak -80 ° C'de sıvı nitrojen ve mağaza dondurma oturtun. Aşağıdaki bölümde 9'da tarif edildiği gibi, birincil hücre kültürü için, bu aşamada, doku örnekleri toplamak. histoloji ve immunochemis için% 10 nötr tamponlu formalin kalan uzuv doku Fixhypoxyprobe-1 tespiti de dahil olmak üzere, deneyin.
- 3 gün boyunca sonra her gün, ameliyat sonrası ilk 6 saat içinde hareket, ağrı ve gıda tüketimi için hayvan izleyin. 3 gün süreyle günlük olarak analjezik madde (Carprofen 5 mg / kg, SQ) enjekte edilir. Bir yara klip çıkarıcı kullanarak amputasyon sonrası yara klipleri 10 gün çıkartın.
Metastazlarının Varlığı 6. İzleme Fareler
- günlük fareler gözlemlemek ve haftada en az iki kez metastaz klinik belirtileri için onları değerlendirmek.
- çeşitli yerlerde, genellikle omuz, kontralateral bacak ve çene geliştirmek kitleler olarak ortaya makrometastazı varlığını hayvanları gözlemlemek. Bu amaçla, dikkatlice baş, boyun ve koltuk altı bölgeleri ve kontralateral hindlimb palpe. MR tarama ile birlikte karın şişliği yoluyla iç organ metastazları kontrol edin.
- inde ile xiphoid süreci (sternum alt ucu) tuşuna basarak akciğer metastazlarının varlığı için kontrol edinx parmak. 24
NOT: Bu basınç diyafram solunum kapasitesini azaltır. ileri evre akciğer metastazları ile Fareler zahmetli nefes alarak kendini solunum sıkıntısı belirtileri gösteriyor. - Böyle merkezi sinir sistemine metastaz düşündüren bacak felç ve ataksi gibi nörolojik semptomların, hayvanları gözlemlemek.
- Potansiyel hastalık ilerlemesinin bir göstergesi olarak, kilo kaybı için en az haftada bir kez fareler izleyin. işlem öncesi ağırlığının% 15 aşan vücut ağırlığı kaybı insancıl son nokta olarak kabul edilir.
7. Manyetik Rezonans Görüntüleme algılama Metastazına (MRG)
- İstenilen zaman noktalarında metastaz MRI gerçekleştirin. 18
NOT: Bu çalışmada, 7 Tesla yatay spektrometre kullanıldı. MR günlerde 15 gerçekleştirilen ve SK-ES1 hücreleri ve TC71 hücreleri için günde 15 35 sonrası amputasyon oldu. - Bir anestezi indüksiyon Chambe içine fare yerleştirin% 30 oksijen ve% 70 azot oksit bir gaz karışımı içinde% 3 izofluran - 1 içeren R.
- dış uyaranlara tepkisiz kadar indüksiyon odasında fare bırakın. Sonra indüksiyon odasından gelen hayvan çıkarın.
- % 1.5 izofluran sürekli yönetim ve% 30 nitröz oksit ile solunum ve sıcaklık monitörizasyonu ile bir stereotaksik tutucu üzerine anestezi fare aktarın. kornea kurumasını önlemek için her gözün steril olmayan ilaçlı oftalmik merhem sürün. Görüntü hayvan ya sırasıyla tüm vücut ya da beyin görüntüleme için 40 veya 23 mm Bruker fare hacmi bobin.
- TR = 3.000 msn, TE = 24 msn, matris = 256, FOV = 4.35 x 3,0 cm, dilim kalınlığı = 0.5 mm, NADİR faktörü = 4 ve ortalamalar = 4. 18: iki boyutlu, T2 ağırlıklı NADİR sırasını kullanmak
- Sıcak bir kurtarma kafeste hayvan koyun ve uyanık kadar sürekli izlemek.
NOT: anestezi sığ bir düzlem kullanıldığından dolayı fareler hızla iyileşir. anestezi hiçbir yan etkisi olmadığından emin olmak için görüntüleme sonraki ilk 6 saat boyunca hayvan izleyin.
8. Ötanazi ve Nekropsi
- MR ve / veya hastalığın ilerlemesi klinik semptomlarla saptanabilir metastaz mevcut hayvanların kez fareler Euthanize.
NOT: Bu çalışmada, fareler günde 50 kurban ve sırasıyla, SK-ES1 ve TC71 ksenograftları taşıyan hayvanlar için 25 sonrası amputasyon. Bazı durumlarda, daha önce ötanazi nedeniyle yüksek metastaz yükü için gerekliydi. - (- Ötenazi odası hacim / dk% 30 10'da CO 2) / dk 1.5 L CO 2 maruz fareler Euthanize. Hayvan ölümü sağlamak için, CO 2 maruz kaldıktan sonra servikal dislokasyon gerçekleştirin.
- % 70 etanol ile tüm fare Sprey ve laminer akış kaputu içine yerleştirin. Bir kan toplama tu için 1 ml şırınga ve transfer 25 G ½ iğne kullanılarak kalp delme yoluyla kan toplayınEDTA, 2 mg olması.
- humeri ve omurga yanı sıra başka yerlerde mevcut makroskobik metastaz hem dalak, böbreküstü bezleri, yumurtalıklar, böbrekler, karaciğer, akciğer, beyin, sağ bacak, kemik iliği: Aşağıdaki dokuları toplayın. 25,26
- hypoxyprobe-1 tespiti de dahil olmak üzere histoloji ve immünokimyanın için% 10 nötr tamponlu formalin her doku yarısını sabitleyin. Ek bileşen daha sonra RNA, DNA ya da protein izolasyonu için -80 ° C'de saklayın, sıvı nitrojen içinde, diğer yarısı dondurma. Aşağıdaki bölümde 9'da tarif edildiği gibi, birincil hücre kültürü için 25,26 doku örnekleri toplamak.
9. Primer Hücre Kültürü
- Primer hücre kültürü gerçekleştirmek için, bir laminer akış kaputu steril koşullar altında nekropsi (yukarıdaki bölüm 8) sırasında ampute ekstremitenin (yukarıdaki bölüm 5) veya dokuların teşrih.
- penisilin ortotopik enjeksiyon için kullanılan hücre hattı (200 birim / ml), hücre kültür ortamı uygun olan hazırlanması,streptomisin (200 ug / ml), fungizon (1 ug / ml) ve% 0.2 Mycoplasma profilaktik antibiyotik. 6 cm hücre kültür plakasına primer kültür ortamına 2.5 ml yerleştirin.
- Primer tümör veya metastaz gelen canlı tümör dokusu alanları seçin ve ardından steril makas kullanılarak her 2-3 mm iki üç segment izole.
NOT: Canlı tümör dokusu genellikle tümörün kenarlarında bulunan ve pembemsi veya kırmızımsı renkte, belirgin parlaklık ve genel ıslak görünüşü nekroz ayırt edilebilir. Buna karşılık, nekrotik doku yaygın tümör merkezinde görülür ve donuk, sevimsiz bir görünüme sahip bir beyazımsı / krem rengi kitle şeklinde ortaya çıkar. 27 - Adım 9.2'de tarif edilen primer kültür ortamı içeren bir 6-cm hücre kültürü plakasının izole segmentleri aktarın.
- standart koşullar altında kültür hücreleri gibi bölüm 1 (NOT) ve 9.2 tarif. 18,28 wh doku parçaları, kaynaklanan hücresel akıbet için kültür edinIch birkaç gün içinde gözlenmelidir. Hücreler izdiham ulaştıklarında, trypsinize ve standart hücre kültür tekniklerine göre bunları yaymak.
Not: Birincil hücre kültürü, daha sonra, daha önce tarif edildiği gibi, büyüme ve kontrolü ve hipoksik tümör, hem de moleküler özellikleri elde edilen hücrelerin metastaz özelliklerinin değerlendirilmesi için kullanılabilir. 18
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gastrokinemius kası içine ES hücrelerinin enjeksiyonundan sonra, primer tümörler 250 mm3 bir baldır boyutu büyümesine izin verilir (Şekil 1, 2). sırasıyla, SK-ES1 xenogreftler için TC71 20-25 gün 15 gün - tümörler için gerekli zaman bu hacim genellikle 10 arasında değişmektedir ulaşmak için. 250 mm3 sergi endojen hipoksi, nispeten düşük düzeyde bir buzağı hacminde tümörleri hypoxybrobe-1 (pimonidazole) göre, (tümör dokusu yaklaşık% 3) (Şekil 4A, C), boyama. Önemli olarak, bu kontrol tümörleri, hypoxyprobe-1 pozitif boyanması damar uzak olan ve hücre ölümüne (Şekil 4A) geçmesi başlangıç tümör hücrelerinde, sadece fizyolojik yani hipoksi, alanlarda gözlenmiştir. Sağlıklı tümör dokusunun toplu hypoxyprobe-1 için negatif kalırken böyle boyama, karakteristik "hava fırça" desen sergiler. <hypoxyprobe-1, 4 saat sonrası FAL (Şekil 4B), tümör hücrelerinin büyük bir çoğunluğunda görülen pozitif boyama ile kanıtlandığı gibi destek> 6 aksine, FAL, bu aşamada, derin hipoksi oluşturur. Özellikle, hypoxyprobe-1-pozitif tümör hücreleri, aynı zamanda, aralarında kan damarlarının yakınlığı ve fizyolojik hipoksi karakteristik model kaybolur gözlenmektedir. Bu FAL ile tedavi edilen tümörlerde, doku% 73 hipoksik tümör hücrelerinin (Şekil 4C) oluşur. Tümör dokusu da hücre büzülmesi ve gevşek bir yapı (Şekil 4B) de dahil olmak üzere hipoksi kaynaklı hasar ilk belirtileri sergiler.
FAL etkinliği daha da primer tümör büyümesinin tamamen önlenmesine ile desteklenmiştir. FAL ve amputasyon arasında 3 günlük süre boyunca, primer tümörlerin boyutu (Şekil 5A) artmamıştır. Bunun aksine, farelerden primer tümörler surger sham tabiY ve böylece cerrahi (Şekil 5A) tabi kontrol farelerinde tümörlerin büyüme oranının taklit yaklaşık 650 mm3 bir hacme ulaşan hızla büyümeye devam etmiştir. 18 Bu veriler doğrultusunda, histopatolojik analiz 3 gün ameliyat sonrası (Şekil 5B) hasat FAL-tedavi primer tümörlerde nekroz geniş alanlar saptandı. Bununla birlikte, damar (Şekil 5B) yakınında genellikle tümörün kenarlarında yer alan tümör dokusu içinde bulunan canlı tümör hücre grupları, vardı. Daha sonra kovalent bu, hücrelerin içinde proteinlerine bağlanma yeteneğini kazanmaktadır, canlı hipoksik hücrelerde aktif hale Biz hypoxyprobes kullanılan, bu hücrelerin, oksijenasyon durumunu incelemek. 29 de örneğin, bu problar, zaman içinde herhangi bir noktada hipoksi deneyimli hücrelerin sürekli bir belirteci olarak hizmet vermektedir. Bu nedenle, experim süresince tümör hücrelerinin oksijen seviyelerindeki değişiklikleri tespit etmek içinent, biz immünohistokimyasal olarak bağımsız tespit edilebilir iki farklı hypoxyprobes kullanılır. Problar, iki zaman noktasında uygulandı - FAL (hypoxyprobe-1) ve daha önceki amputasyon (hypoxyprobe-2, CCI-103F) hemen önce - ve lokalizasyon hasat tümörlerde 3 gün sonra FAL (Şekil 1) tespit edilmiştir. Doku (Şekil 5C) ciddi hipoksik oldu gibi Hypoxyprobe-1, FAL zamanında mevcut değildi, tümör hücrelerinin büyük bir çoğunluğu işaretlenmiştir. Bu hücreler FAL zamanında hayatta ve kalıcı hypoxyprobe-1 bağlanma yeteneğine sahiptirler çünkü Şekil 4B'de gösterildiği gibi etiket, aynı zamanda nekrozu / apoptoz alanda açıktır. Nekrotik alanlar hücreler çoktan ölmüş ve yönetim (Şekil 5D) sırasında prob etkinleştirmek için koyamadık olarak aksine, hypoxyprobe-2, post-FAL sadece canlı hücreleri lekeli 2 gün uyguladı. İlginç bir şekilde, daha da Obse(hypoxyprobe-1-pozitif) ilk hipoksik olarak damar bitişik canlı tümör dokusunun SVEd, ama yeterince sonraki bir zaman noktasında oksijenli (hypoxyprobe-2-negatif) (Şekil 5C, d). Bu bulgu kollateral damar bağımlı doku reperfüzyon hindlimb 3 gün sonrası FAL kan akışını geri belirten daha önceki raporlarda ile uyum içindedir. Tümör (Şekil 5E) ve vaskülarize kenarlarında onların büyük intravasation ile kanıtlandığı gibi 20 tümör dokusu 3 gün sonrası FAL kalan canlı tümör hücreleri, son derece invaziv idi. damar lümeni içinde hücrelerin bazıları FAL üzerine hipoksik hale geldiğini belirten hypoxyprobe-1 için pozitif, henüz canlı kalmıştır. Topluca, bu veriler primer tümörlerin hücreleri kaçmasını kolaylaştırabilir şiddetli hipoksi takip eden doku reperfüzyon düşündürmektedir.
Pilot deneye dayanan, yaygın metastazlar vardıTC71 hücreleri genellikle 15 gün içinde metastaz ise SK-ES1 xenogreftler için saptanabilir MRG ile yaklaşık 35 gün sonrası amputasyon. 15. günde tek bir görüntüleme TC71 tümörlü fareler için yeterli olurken, Sonuç olarak, metastaz gecikme süresi ve sıklığı analizi için, MR, 15. günde ve SK-ES1 tümörleri taşıyan hayvanlar için 35 sonrası amputasyon yapıldı. Ötenazi sırasıyla SK-ES1 ve TC71 ksenograftları olan hayvanlar için günde 50 ve 25. günde yapılmıştır. Daha önce belirtildiği gibi, metastaz en yaygın tipleri, yumuşak omuz bölgesinde doku kitleleri, hem de karşı taraftaki bacak, SK-ES1 hücreleri için üst çene alanı ve omurga ve akciğer ve TC71 pelvik tümörlere kemik metastazları dahil. Buna ek olarak 18, böbrek üstü bezleri, akciğerler ve karaciğer, hem de kemik iliği infiltrasyonu gibi iç organlar, sık sık metastaz, FAL ile tedavi edilen SK-ES1 ksenograftları olan farelerin (Şekil 6) gözlendi. Genel olarak, hipoksi önemli ölçüde artmıştırher iki hücre genel (SK-ES1) veya site-spesifik (TC71), frekans ve metastazların çokluğu. Daha önce büyük bir TC71 primer tümörler için tarif edildiği gibi, ancak, TC71 ksenogrefler, aynı zamanda, (FAL ile muamele edilmiş tümörler için kontrol% 25 ve% 40), amputasyon yerinde sık sık tekrarlanan kitleleri geliştirdi. 18
kontrol ve FAL-tedavi birincil tümörler ve metastaz gelen dokular da ES yayılmasına katılan hipoksi aktive yollarının belirlenmesi amacıyla kapsamlı moleküler analizler için malzeme kaynağı olabilir. Örneğin, bir kontrol ve hipoksik primer tümörlerin metabolomic profillerinde önemli farklılıklar gözlendi (veriler gösterilmemiştir). Biz de başarıyla yukarıdaki dokuların tüm çoklu hücre hatları izole başardık. Orijinal hücrelere kıyasla ve bu kontrol tu türetilmiş Birçok durumda, FAL ile tedavi edilen tümörlerden türetilmiş hücreler morfolojik açıdan fark değişiklikler sergilemiştirmors (Şekil 7A). Bu hücre kültürleri saflığı Ewing sarkomu işaretleyici, CD99 (Şekil 7B) için pozitif immüno-lekeleme ile de teyit edilmiştir. Ayrıca, hücre serileri hücrelerin% 100 genellikle artmış kromozom sayıları (Şekil 8A) ile kendini gösteren insan sentromerik problar ile in situ hibridizasyon (FISH) floresan pozitif bir sinyal vardı. Bu hücrelerin insan kaynaklı daha önce FAL ile muamele edilmiş tümörlerin (Şekil 8B) elde edilen orijinal hücre hattı ve hücreler hem de SK-ES1 hücreleri için tarif sitogenetik düzenlenmeleri sergilemiştir metafaz kromozomlarda (Şekil 8B) analizi ile teyit edilmiştir. 30
ES Hipoksi Modelinin 1. Anahat Şekil. ES hücreleri (1-2 x 10 6) gastrocn enjekte edilmiştirSCID / bej farelerinin emius kasları. Elde edilen primer tümörler 250 mm3'lük bir baldır hacmi ulaştıktan sonra, fareler iki deney grubuna ayrıldı. Kontrol grubundan gelen fareler hypoxyprobe-1 (HP-1) enjekte edildi ve primer tümörler uzuv kesme ile çıkarıldı. Hipoksik gruptan Fareler hypoxyprobe-1 enjekte edilmiş ve daha sonra femoral arter ligasyonu (FAL) tabi tutuldu. İki gün sonra fareler, hypoxyprobe-2 (HP-2) enjekte edildi ve daha sonra tümör taşıyan mafsalları, üç gün sonra FAL ampute bulundu. Her iki gruptan Hayvanlar periyodik manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ile izlendi. metastaz görüntüleme ve klinik bulgulara göre belirgin oldu sonra farelere ötenazi uygulandı ve metastaz varlığı nekropsi ve histopatolojik analizler ile teyit edilmiştir. tümör büyümesi, görüntüleme ve ötenazi zaman büyümesi ve metastazı, SK-ES1 hücre oranına dayanır. hypoxyprobe-2 gerektiğinde ise yöntem ve visu kurmak Notalize FAL ve uzuv kesme arasındaki dönemde hipoksi seviyelerinde değişiklikler, kullanımı, gerçek deney için gerekli değildir. Bu nedenle, bu protokolde dahil değildir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
2. Birincil Tümör Büyüme rakam. Sağlam bir hindlimb A. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG). kırmızı ok tümör hücre ortotopik enjeksiyon bölgesini ve yönünü gösterir. Yaklaşık 250 mm 3 gastroknemius kasının (kırmızı çizgi) büyüyen bir buzağı hacminde B. Primer tümör. Kırmızı ok uçları, kemik yıkım siteleri gösterir. T - tibia. Lütfen cBu rakamın büyük halini görmek için buraya yalamak.
Şekil 3. Femoral Arter Ligasyonu Site. Baryum sülfat ile perfüze bir 129S1 / SVJ fare temsili bir ölüm sonrası X-Ray arteriyogram hemen bağlanmasından sonra, önceden var olan kollateral damarların varlığını vurgulamak için gösterilmiştir. yakın, görüntü iki ligasyon (Xs), lateral sirkumfleks femoral arter (LCFA) (kırmızı X) ve genu arter (beyaz X) başka proksimale bir distalinden tasvir ederken, tümör hipoksi modeli sadece proksimal ligasyonu kullanılan unutmayın LCFA inguinal ligament ve uzak (kırmızı X). kollateral damar gelişimi bölgesi açıklanan (sönük damarları) olarak gösterilir ve onların dolambaçlı, mantar vida şekli ile tanımlanır. He tıklayınızBu rakamın büyük halini görmek için yeniden.
Şekil 4. Tümör hipoksi Femoral Arter Ligasyonu (FAL) Bağlı. A. Hematoksilen & eozin (H & E) ile boyandı ve hypoxyprobe-1 (kahverengi) için immunohistokimyasal 250 mm 3 olan buzağı hacminde bir kontrol tümörü. Hypoxyprobe-1 immün sadece damarsal uzak tümör hücreleri oksijensiz ve hücre ölümüne geçmesi başlar olan fizyolojik tümör hipoksi, alanlarında görülmektedir. B. Hasat benzer boyutta 4 saat sonrası ligasyon birincil tümör FAL ile muamele edilmiş ve H & E ile boyanmış ve hypoxyprobe-1 için boyanmış. Tümör hücrelerinin çoğunluğu damar yakın olanlar da dahil olmak üzere, hypoxyprobe-1 için oldukça olumludur. V - kan damarı. C hypoxyprobe-1 quantif olduğu pozitif boyama alanıImageJ yazılımı kullanılarak kontrolü ve FAL ile tedavi edilen tümörlerde ied. Hata çubukları SEM'i temsil etmektedir. *** - P <0.001 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Birincil Tümör Büyümesi Üzerine Femoral Arter Ligasyonu (FAL) Şekil 5. etkisi. Fal cerrahi ve amputasyon arasında 3 günlük süre içinde A Primer tümör büyümesi (n = 4) ve sham ile muamele edilmiş (n = 4) hayvanlar, tam kontrol tümörleri ile karşılaştırıldığında (n = 6). Hata çubukları SD temsil etmektedir. *** - P <0.001, hem kontrol hem de sham ile muamele edilmiş tümörler ile karşılaştırıldığında. Bir FAL-tedavi tümörün B. Hematoksilen ve eozin (H & E) boyama sonrası ligasyonu tümör içinde yaygın nekroz ortaya 3 gün hasat. Kırmızı anahat canlı tümör ce bir alanı gösteriryüksek ölçüde damarlanmış bölgesi yakınında LLS sonrası FAL 3 gün perfüze. C. FAL-tedavi tümör dokusu 3 days hypoxyprobe-1 için immunohistokimyasal sonrası ameliyat hasat. Hypoxyprobe-1 FAL önce enjekte edilmiştir. Bu nedenle, pozitif immun hemen yoğun doku hipoksisi varlığını ameliyat sonrası gösterir. D. Hypoxyprobe-2 amputasyon de, doku toplanan 24 saat sonra 2 gün sonrası FAL enjekte edildi ve. Pozitif hypoxyprobe-2 boyanma amputasyon anda doku hipoksisi tanımlar. Sarı ok hemen sonra hipoksik olarak damar bitişik bir alana işaret ederken kırmızı ok hipoksik her iki zaman noktasında doku gösteren FAL (hypoxyprobe-1-pozitif) çıkarımı zamanında hypoxyprobe-2 için değil, negatif, burada reperfüzyonun göstergesidir. nekrotik alanlarda hypoxyprobe-2 boyanma olmaması bu bölgedeki hücreler kendi yönetimi ve bu nedenle anında uygulanabilir olmadığını göstermektediraktif prob bağlamak mümkün. paneller BD sunulan boyama Seri doku kısımlarında gerçekleştirilmiştir. E. intravazasyonunda tümör 3 gün sonrası FAL FAL-tedavi. immün hypoxyprobe-1 damar lümeni (kırmızı ok) içinde pozitif canlı hücreleri tanımlar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
FAL ile tedavi edilen SK-ES1 tümörleri taşıyan farelerde metastaz Şekil 6. Örnek. metastaz manyetik rezonans görüntüleme (MRG) tarafından algılanır ve nekropsi ve histopatolojik analizler (hematoksilen ve eozin boyama, H & E) ile doğrulanmıştır. M - metastazı. Daha büyük bir vers görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın iyon.
FAL-tedavi İlköğretim Tümörler Kaynaklanan Hücreleri 7. Özellikleri Şekil. C. canlı hücre kültürleri kontrol ve hipoksik primer tümörlerden hasat dokularından oluşturulmuş ve morfolojileri, ilk ortotopik enjeksiyon için kullanılan orijinal hücre çizgileri ile karşılaştırılmıştır. FAL-tedavi primer tümörlerden türetilmiş hücrelerin boyutları ve morfolojisi dramatik değişiklikler gösterirler. Orijinal ve primer tümör kaynaklı SK-ES1 hücrelerin temsili görüntüleri gösterilmiştir. ES işaretleyici CD99 için immunohistokimyasal FAL ile tedavi edilen tümörlerden türetilmiş ve DNA-bağlama boya, DAPI ile karşıt hücreler B. Örnek ve görüntüler. Tüm hücreler genişlemiş çekirdek (beyaz ok) içeren hipertrofik hücreleri de dahil olmak üzere, CD99-pozitif. OAD / 54532 / 54532fig7large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
FAL ile tedavi edilen tümörlerden türetilmiş hücreler 8. kromozom analizi Şekil. In situ hibridizasyon C. Floresan insan sentromerik 4 prob sinyalleri iki çekirdekleri yok interfaz hücrelerinde (FISH) analizi. Dört sinyallerle büyük çekirdek bir tetraploid (4n) hücre (beyaz ok) gösterir. SK-ES1 orijinal hücre hattı için temsili metafaz ve FAL ile muamele edilmiş primer tümörden türetilen hücre B. FISH analizi. Kırmızı oklar inv (1) (p13.1q21), SK-ES1 hücrelerinin rastlantısal olmayan sitogenetik yeniden düzenleme özelliğini göstermektedir. Kırmızı sinyaller: İnsan sentromerine 4 sonda; Orijinal SK-ES1 hücrelerinde yeşil sinyaller: kromozom 4q32.2 üzerine NPY5R prob.e.com/files/ftp_upload/54532/54532fig8large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bizim modelimiz iki deney gruplarında metastaz karşılaştırılmasını içerir - tümörler 250 mm 3 bir buzağı hacmine ulaşmıştır üzerine amputasyon ardından hindlimb geliştirmek için izin verilen bir kontrol grubu, ve bir hipoksi maruz grubu, hangi tümöre içinde taşıyan arka bacak 3 gün sonra amputasyon, ardından aynı hacimde FAL tabi tutulur. Kontrol tümörlerine kıyasla bu deneylerde FAL-tedavi edilen tümörler, küçük bir gecikme ile ampute olsa da, onların büyüklük ligasyonu ve amputasyon arasında 3 günlük süre boyunca artmaz. Bu nedenle, bu yaklaşım benzer boyutlarda ancak hipoksi dramatik farklı düzeylerde tümörler arasında metastatik potansiyelin karşılaştırılmasına olanak sağlamaktadır. Bunun aksine, sham ile, tümör büyümesinin, 3 gün ve ardından, cerrahi müdahaleler için yaygın olarak kullanılan bir kontrol, sham-muamele ile Deney grupları arasında tümör boyutu önemli farklılıklar, sonuçlanırendojen hipoksi önemli düzeylerde sahip ed primer tümörler. Pilot deneyler dayanarak, sham önemli ölçüde tümör büyümesini ya da hipoksi seviyelerini etkilemez ve bu nedenle deneysel tasarım elimine edilebilir. Bunun yerine, benzer boyutlarda ve farklı hipoksi düzeylerinin tümörlerin karşılaştırma stratejisi hastalığın yayılması üzerine hipoksi etkilerini ortaya çıkması için son derece alakalı bir modeldir. Önemli bir şekilde, in vitro çalışmalar, önceki farklı olarak, bu yaklaşım, bir doğal tümör mikro hipoksi ön-metastatik işlemlerden kapsamlı değerlendirme sağlar. 4-6
Deneysel tasarım hedefi, oluşumu üzerinde hipoksinin neden olduğu uyarıcı etkisinin tespiti için izin metastaz bir düşük taban düzeyinde elde etmektir. Biz bir buzağı FAL 250 mm 3 boyutu ve amputasyon SK-ES1 primer tümörleri için en uygun olduğunu kurdu. Ancak, bu parametre ea için optimize edilmesi gerekecektir ch hücre hattı, onların metastatik potansiyeli ve lokal invazyon bağlı. yüksek metastatik potansiyele sahip tümörlerde, amputasyon primer tümör büyüklüğü azaltılabilir gerekebilir. Örneğin, TC71 tümörleri amputasyon yerinde tekrarlayan tümörlerin sık oluşumu ile kendini gösteren bir yüksek lokal invaziv gösterirler. Bu tür kitleler geliştirmek 18 kez hayvanlar sonraki uzak metastaz primer tümörlerden ya da sık sık hızla büyümeye ve endojen hipoksi yüksek düzeyde sergi tekrarlayan tümörlerin kaynaklanan eğer açık olmaz gibi, analizler dışında gerekir. Önceki deneyimlerinden, hücre hattının bağımsız 150 mm 3 minimal tümör taşıyan buzağı güvenilir bir şekilde ölçülebilmesi boyut ve normalleştirilmiş kullandı. FAL ve amputasyon tümör boyutu azalan tekrarlayan tümörlerin ortadan kaldırmak ya da yeteri kadar bazal metastaz oranını azaltmak değilse, söz konusu özel hücre çizgisi, bu deneyler için uygun olmayabilir.
ve_content "> Aynı şekilde, onun metastaz gecikme bağlı her hücre hattı için MR zaman çizelgesi ve ötenazi oluşturulması önemlidir. Özellikle, MR ile müdahale cerrahi yara klipleri 10 gün sonrası daha erken kaldırılabilir cerrahi, ve bu süre bazen nedeniyle iyileşmesi ile komplikasyonlar genişletmek gerekir. Böylece, ilk MR zaman olarak gün 15 kurulan bu çalışmada.Bu modelde bir diğer önemli husus tümör hücresi yayılımını önleyecek tam tümör nekroz, neden olmadan metastatik süreçleri indükleyebilen hipoksi düzeyi sürdürmektedir. Biz bu çalışmada bu sorunla karşılaştı olmasına rağmen gerekirse, hipoksi şiddeti gibi LCFA ve genu arter olarak femoral arter dalları ile ilişkili olarak kesin yerini ve ligasyonu sayısını değiştirerek düzenlenebilir. 20 Böylece, LCFA bir ligasyon yakın hi daha şiddetli iskemi yaratacakndlimb dolaşımı, dolayısıyla uzak bacak hipoksik koşullar arttırır. Buna karşılık, femoral arter sonraki dallarına distalinden bağlanarak alt hindlimb sonuçlanan hipoksi azalacaktır.
Önemlisi, kombine FAL ve amputasyon prosedürlerinin hiçbir ciddi yan etkisi ve daha önce ayrı ayrı yapılan bu teknikler için bildirilen, ameliyatlar ile ilgili herhangi bir ölüm vardı. 18-20 Dolayısıyla, çalışmadaki yöntemin başarısı primer yerinde Tümör alım oranı ve hücre hattı bağımlı her ikisi de tekrarlayan tümörlerin frekansının esas olarak sınırlıdır.
hipoksi birçok tümör tipinde yanlısı metastatik faktör olarak olduğu gibi, bu yaklaşım aynı zamanda doğrudan etkilerini test etmek ve bacaklarda geliştirmek diğer sarkomlarda eylemler mekanizmaları tanımlamak için uygun olabilir. 23. Ayrıca, benzer bir strateji W ortotopik ortamlarda büyüyen diğer malignitelerin uygulanabiliriyi tanımlanmış bir kan dolaşımı rota i. Böylece, uygun değişikliklerle, bu model ES biyoloji alanında ötesinde araştırmaları için kullanışlı bir araç olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 ml Insulin syringes with permanently attached 28 G ½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges - Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25 G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 ml syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3-EDTA Micro tube 1.3 ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
References
- Lessnick, S. L., Ladanyi, M. Molecular pathogenesis of Ewing sarcoma: new therapeutic and transcriptional targets. Annu Rev Pathol. 7, 145-159 (2012).
- Ladenstein, R. Primary disseminated multifocal Ewing sarcoma: results of the Euro-EWING 99 trial. J Clin Oncol. 28, 3284-3291 (2010).
- Dunst, J., Ahrens, S., Paulussen, M., Burdach, S., Jurgens, H. Prognostic impact of tumor perfusion in MR-imaging studies in Ewing tumors. Strahlenther Onkol. 177, 153-159 (2001).
- Aryee, D. N. Hypoxia modulates EWS-FLI1 transcriptional signature and enhances the malignant properties of Ewing's sarcoma cells in vitro. Cancer Research. 70, 4015-4023 (2010).
- Knowles, H. J., Schaefer, K. L., Dirksen, U., Athanasou, N. A. Hypoxia and hypoglycaemia in Ewing's sarcoma and osteosarcoma: regulation and phenotypic effects of Hypoxia-Inducible Factor. BMC cancer. 10, 372 (2010).
- Tilan, J. U. Hypoxia shifts activity of neuropeptide Y in Ewing sarcoma from growth-inhibitory to growth-promoting effects. Oncotarget. 4, 2487-2501 (2013).
- Franzius, C. Successful high-resolution animal positron emission tomography of human Ewing tumours and their metastases in a murine xenograft model. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 33, 1432-1441 (2006).
- Hauer, K. DKK2 mediates osteolysis, invasiveness, and metastatic spread in Ewing sarcoma. Cancer Research. 73, 967-977 (2012).
- Manara, M. C. Preclinical in vivo study of new insulin-like growth factor-I receptor--specific inhibitor in Ewing's sarcoma. Clin Cancer Res. 13, 1322-1330 (2007).
- Scotlandi, K. Murine model for skeletal metastases of Ewing's sarcoma. J Orthop Res. 18, 959-966 (2000).
- Vormoor, J. Establishment of an in vivo model for pediatric Ewing tumors by transplantation into NOD/scid mice. Pediatr Res. 49, 332-341 (2001).
- Picarda, G. Preclinical evidence that use of TRAIL in Ewing's sarcoma and osteosarcoma therapy inhibits tumor growth, prevents osteolysis, and increases animal survival. Clin Cancer Res. 16, 2363-2374 (2010).
- Vormoor, B. Development of a preclinical orthotopic xenograft model of ewing sarcoma and other human malignant bone disease using advanced in vivo imaging. PLoS One. 9, e85128 (2014).
- Wang, Y. Platelet-derived growth factor receptor beta inhibition increases tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) sensitivity: imatinib and TRAIL dual therapy. Cancer. 116, 3892-3902 (2010).
- Wang, Y. X. Inhibiting platelet-derived growth factor beta reduces Ewing's sarcoma growth and metastasis in a novel orthotopic human xenograft model. In Vivo. 23, 903-909 (2009).
- Odri, G. A. Zoledronic acid as a new adjuvant therapeutic strategy for Ewing's sarcoma patients. Cancer Research. 70, 7610-7619 (2010).
- Merchant, M. S. Interferon gamma enhances the effectiveness of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonists in a xenograft model of Ewing's sarcoma. Cancer Research. 64, 8349-8356 (2004).
- Hong, S. H. High neuropeptide Y release associates with Ewing sarcoma bone dissemination - in vivo model of site-specific metastases. Oncotarget. 6, 7151-7165 (2015).
- Lee, E. W. Neuropeptide Y induces ischemic angiogenesis and restores function of ischemic skeletal muscles. J Clin Invest. 111, 1853-1862 (2003).
- Tilan, J. U. Platelet neuropeptide Y is critical for ischemic revascularization in mice. FASEB J. , (2013).
- Toffoli, S., Michiels, C. Intermittent hypoxia is a key regulator of cancer cell and endothelial cell interplay in tumours. The FEBS journal. 275, 2991-3002 (2008).
- Das, B. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem cells (Dayton, Ohio). 26, 1818-1830 (2008).
- Arndt, C. A., Rose, P. S., Folpe, A. L., Laack, N. N. Common musculoskeletal tumors of childhood and adolescence. Mayo Clin Proc. 87, 475-487 (2012).
- Mendoza, A. A novel noninvasive method for evaluating experimental lung metastasis in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52, 584-589 (2013).
- Feldman, D. B., Seely, J. C. Necropsy Guide: Rodents and the Rabbit. , CRC Press. (1988).
- Parkinson, C. M. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J Vis Exp. , (2011).
- Raymond, A. K., Lazar, A. J. Bone Sarcoma. PP, L. in, S, P. atel , Springer. (2013).
- Dietel, M., Arps, H., Gerding, D., Trapp, M., Niendorf, A. Establishment of primary cell cultures: experiences with 155 cell strains. Klin Wochenschr. 65, 507-512 (1987).
- Varghese, A. J., Gulyas, S., Mohindra, J. K. Hypoxia-dependent reduction of 1-(2-nitro-1-imidazolyl)-3-methoxy-2-propanol by Chinese hamster ovary cells and KHT tumor cells in vitro and in vivo. Cancer Research. 36, 3761-3765 (1976).
- ATCC. , http://www.atcc.org/products/all/HTB-86.aspx#characteristics (2014).
