Summary
Un protocollo per profili metabolici di campioni biologici da elettroforesi capillare-spettrometria di massa con un design di interfaccia punta porosa guaina è presentato.
Abstract
In metabolomica, una vasta gamma di tecniche analitiche viene utilizzato per la profilatura globale (endogeni) metaboliti in campioni complessi. In questo documento, un protocollo è presentato per l'analisi dei metaboliti anionici e cationici in campioni biologici mediante elettroforesi capillare-spettrometria di massa (CE-MS). CE è ben adatto per l'analisi dei metaboliti altamente polari e cariche come composti vengono separati sulla base del loro rapporto carica-size. Una guaina interfacciamento progettazione sviluppata di recente, vale a dire, una interfaccia punta porosa, è usato per l'accoppiamento CE a ionizzazione electrospray (ESI) MS. Questo approccio interfacciamento consente l'uso efficace della struttura intrinsecamente bassa portata di CE in combinazione con MS, causando limiti di rilevazione nanomolari per una vasta gamma di classi di metaboliti polari. Il protocollo qui presentata si basa sull'impiego di un capillare in silice fusa nudo con un emettitore punta porosa in condizioni di separazione basso pH per l'analisi di unvasta gamma di classi di metaboliti in campioni biologici. Si dimostra che lo stesso metodo sheathless CE-MS può essere utilizzato per la profilatura dei metaboliti cationici, compresi aminoacidi, nucleosidi e piccoli peptidi, o metaboliti anionici, tra fosfati zucchero, nucleotidi e acidi organici, soltanto commutazione del rilevamento MS e tensione di polarità separazione. Altamente ricchi di informazioni profili metabolici in vari campioni biologici, come ad esempio urina, fluido e estratti della linea cellulare di glioblastoma cerebro-spinale, possono essere ottenuti da questo protocollo in meno di 1 ora di analisi CE-MS.
Introduction
In metabolomica contemporanei, di fascia alta tecniche di separazione analitica sono utilizzati per analizzare una vasta gamma di classi metaboliti per ottenere un rappresentante lettura fuori dello stato fisiologico di un organismo 1. L'obiettivo finale di uno studio metabolomica è quello di ottenere una risposta ad una determinata questione biologica / clinica. Allo stato attuale, il database metaboloma umano è composto di oltre 40.000 voci di metaboliti che rappresentano composti sia endogeni ed esogeni (quest'ultimo originari di sostanze nutritive, microbiota, droghe e altre fonti) 2. Data la grande diversità nelle proprietà fisico-chimiche e gamma di concentrazione di questi metaboliti, molteplici tecniche analitiche con diversi meccanismi di separazione dovrebbero essere usati in combinazione per profilo come molti metaboliti possibili in un dato campione biologico. Ad esempio, Psychogios et al. Ha utilizzato una combinazione di cinque tecniche di separazione analitiche per il prof metabolicailing di siero umano conseguente rilevazione di oltre 4.000 chimicamente diversi metaboliti 3.
In questo lavoro, l'attenzione sarà rivolta alle strategie di recente sviluppo CE-MS per profili metabolici di campioni biologici 4,5. In CE, elettroforesi più specificamente capillare zona (CZE, normalmente chiamato come CE), i composti sono separati sulla base del loro rapporto carica-dimensioni e, di conseguenza, questa tecnica analitica è particolarmente adatto per l'analisi dei metaboliti polari e cariche. Il meccanismo di separazione del CE è fondamentalmente differente da tecniche cromatografiche-based, fornendo così una vista complementare sulla composizione metabolico di campioni biologici 6-8. Soga e collaboratori sono stati i primi a dimostrare l'utilità del CE-MS per la profilazione globale di metaboliti in campioni biologici 9,10. Fino ad ora, la fattibilità e l'utilità di CE-MS per la metabolomica è stato ampiamente dimostrato 11-15.CE è generalmente accoppiato a MS mediante una guaina liquida tecnica 16,17 interfacciamento; tuttavia, a causa della diluizione dell'effluente capillare dalla guaina-liquido, la sensibilità di rilevazione è intrinsecamente compromessa.
Recentemente, è stato dimostrato che l'uso di un'interfaccia sheathless migliorato significativamente la copertura di rivelazione di metaboliti presenti nei vari campioni biologici rispetto a CE-MS utilizzando una classica interfaccia sheath-liquido 5,18,19. Ad esempio, circa 900 caratteristiche molecolari sono stati rilevati nelle urine umane da guaina CE-MS, mentre circa 300 caratteristiche molecolari sono stati osservati con guaina-liquido CE-MS 5. L'interfaccia di guaina utilizzata si basava su un emettitore punta porosa, che è stato inventato da Moini 20, permettendo l'uso efficace della proprietà intrinsecamente basso flusso di CE in combinazione con nano-ESI-MS.
Al fine di stimolare l'uso di guaina CE-MS nel campo della metabolomica,un protocollo è presentato descrive come questo approccio può essere utilizzato per l'analisi dei metaboliti altamente polari in campioni biologici, come esemplificato per l'analisi di estratti dalla linea cellulare glioblastoma. E 'dimostrato che il metodo sheathless CE-MS per la profilatura dei metaboliti cationici può essere utilizzato anche per la profilatura dei metaboliti anionici utilizzando esattamente le stesse condizioni capillari e separazione, riducendo così i tempi di analisi e fornendo una piattaforma analitica unico per la profilatura globale metaboliti cariche. Il protocollo descrive anche una strategia per l'allineamento efficace della guaina poroso emettitore punta con lo strumento MS.
Protocol
NOTA: Il protocollo qui descritto per l'utilizzo di guaina CE-MS per gli studi di profili metabolici è solo per uso in laboratorio. Le procedure descritte di seguito si basano su 4,5 lavoro di recente pubblicazione. Ulteriori dettagli sperimentali possono essere trovati in questi documenti. Prima di utilizzare questo protocollo, consultare tutte le schede di sicurezza materiale pertinente (MSDS). Si prega di utilizzare tutte le procedure di sicurezza di laboratorio appropriate, tra cui occhiali di sicurezza, camice da laboratorio e guanti, quando conduce gli esperimenti descritti in questo protocollo.
1. Preparazione dei reagenti Solutions e Campioni
- Preparazione del fondo elettrolita (DTF)
- Preparare una nuova soluzione BGE (10% (v / v) di acido acetico, pH 2.2) ogni giorno.
- Aggiungere 9,0 ml di acqua in una fiala di vetro da 10 ml e aggiungere 1,0 ml di acido acetico in acqua in una cappa aspirante. Miscelare la soluzione accuratamente con un vortice.
- Preparazione del metabolita standarmiscela d
- Sciogliere 50 ml di una miscela standard di 50 micron cazione contenente 60 metaboliti cationica in 50 ml di acqua e mescolare accuratamente la soluzione. Conservare a -80 ° C quando non in uso.
- Sciogliere 50 ml di un anione miscela standard 50 micron contenente 30 metaboliti anionici in 50 ml di acqua e mescolare accuratamente la soluzione. Conservare questa soluzione, in aliquote per evitare cicli di congelamento / scongelamento della stessa miscela standard, a -80 ° C quando non in uso.
NOTA: Il metabolita miscele standard sono stabili per 3 mesi se conservato correttamente a -80 ° C.
- Preparazione di estratti dalla linea cellulare di glioblastoma
- Lavare le cellule U-87 mg di glioblastoma aderenti umani tre volte con 1 ml ghiacciata 0,9% soluzione di cloruro di sodio 21.
- Aggiungere 2 ml di soluzione di metanolo / acqua ghiacciata (8/2, v / v) per le cellule aderenti e raschiare con una gomma con punta raschietto cella 21. Raccogliere la soluzione di metanolo / acqua in un tubo e ultrasonicate per 2 min.
- Aggiungere cloroformio per la frazione di metanolo / acqua (rapporto finale 8/8/2, v / v / v) e centrifugare il campione per 10 minuti a 16.100 xg e 4 ° C.
- Raccogliere lo strato metanolo / acqua e si evapora questa frazione usando un concentratore a vuoto. Ricostituire il materiale essiccato in 50 microlitri di acqua per l'analisi mediante guaina CE-MS. Quando non in uso conservare il campione a -80 ° C.
2. Impostazione del CE-MS Sistema senza guaina
- L'installazione della cartuccia silice fusa nudo con l'emettitore punta porosa
- Inserire una nuova cartuccia silice fusa nudo con un emettitore punta porosa (lunghezza 30 micron di diametro interno x 90 cm totale) nello strumento CE.
- Applicare un risciacquo in avanti a 50 psi per 15 minuti con il software di controllo dello strumento CE utilizzando il 100% di metanolo e controllare visivamente se il liquido fluisce fuori dal CAPILpresa lary durante questa fase di risciacquo. effettuare anche un risciacquo in direzione opposta a 50 psi per 5 minuti utilizzando la soluzione BGE esaminare visivamente che il liquido scorre fuori dal capillare conduttivo.
- Ripetere passaggio 2.1.2 ad una pressione di 100 psi in caso nessuna formazione goccia liquido è stato osservato in uscita capillare. Installare una nuova cartuccia di silice fusa nudo se non è stata osservata formazione di gocce di liquido durante questa fase.
- Risciacquare il capillare di separazione con acqua a 50 psi per 10 minuti, seguita da 0,1 M NaOH a 50 psi per 10 minuti, poi con acqua a 50 psi per 10 minuti e infine con BGE a 50 psi per 10 min.
NOTA: I passaggi 2.1.1 fino a 2.1.4 sono necessari solo per l'installazione di una nuova cartuccia capillare.
- Accoppiamento del capillare porosa punta emettitore di ESI-MS
NOTA: Prima di accoppiare il capillare CE a MS, assicurarsi che lo strumento è stato calibrato MS e collegato al sistema CE. Impostare la tensione ESI per0. Montare lo strumento MS con una fonte nanospray. Gas 1, gas 2 e la temperatura del riscaldatore dell'interfaccia non sono stati applicati come ESI a portate molto basse avviene semplicemente applicando la tensione di spruzzatura ione impostato a 1500 V. Impostare la tenda a 5 psi.- Rimuovere la punta spruzzatore della cartuccia silice fusa dal tubo dell'acqua e installarlo nella adattatore di origine nanospray per accoppiare allo strumento MS. Assicurarsi che l'altezza delle fiale BGE nello strumento CE corrisponde l'altezza della punta spruzzatore.
- Controllare il flusso di liquido attraverso il capillare conduttivo mediante risciacquo con BGE a 50 psi per 5 min. Durante questo passo risciacquo deve rilevare una formazione goccia alla base dell'ago spruzzatore ESI.
- Lavare il capillare di separazione con BGE a 50 psi per 10 minuti nella direzione in avanti. formazione di gocce deve essere osservata alla punta della punta emettitore poroso (punta spruzzatore) durante questa fase.
- Posizionare la punta emettitore poroso per l'ingresso della bocca MS ad una distanza di circa 2 a 3 mm.
- Applicare una tensione di 30 kV utilizzando un tempo di rampa di 1 min e cominciare ad acquisire i dati MS nel range m / z da 65 a 1.000 m / z per gli studi di profili metabolici utilizzando prima una tensione ESI di 0.
NOTA: Lo spettro di massa fosse nulla di segnale come non ci dovrebbero essere elettrospray. - Impostare la tensione ESI a 1.000 V, mentre portare avanti la misurazione dei dati. Aumentare la tensione ESI con incrementi di 200 V fino a quando un segnale di fondo costante si registra per almeno 15 minuti.
- Ottimizzare la punta posizione emettitore poroso rispetto al centro della bocca MS muovendolo in x, y, z direzione per vedere quale posizione fornisce il massimo ed il segnale MS più stabile (totale elettroferogramma ion).
- Dopo ottimizzare la posizione dell'emettitore punta porosa e determinare la tensione ottimale ESI, impostare la tensione ESI a 0 V e diminuire la tensione CE da 30 kV a 1 kV utilizzando un tempo di rampa di 5 min.
- Creare un metodo usin MSg la tensione ottimale ESI e un metodo CE sullo strumento CE per l'analisi degli standard metaboliti e campioni biologici.
3. Analisi del metabolita standard e dei campioni biologici
- La valutazione delle prestazioni del sistema-CE MS guaina
- Trasferimento 20 microlitri della miscela standard metabolita anionico in un vuoto 100 microfiala ml (PCR flaconcino) che si inserisce in una fiala CE e mettere questo vial nel vassoio campione di ingresso.
NOTA: Il volume minimo richiesto nella microprovetta per un'iniezione affidabile è di 2 ml.- Avviare il metodo modalità di ioni negativi di acquisizione MS creato durante la fase 2.2.9 e successivamente avviare la sequenza CE utilizzando il software che controlla lo strumento CE.
- Risciacquare il capillare di separazione con BGE a 50 psi per 3 min seguita da iniezione a 2.0 psi per 60 sec (20 nl corrispondente al 3% del volume capillare) e poi per iniezione BGE a 1,0 psi per 10sec.
NOTA: In seguito, l'acquisizione dei dati MS viene attivato. - Applicare una tensione di -30 kV con un tempo di rampa di 1,0 min con una pressione di 0,5 psi per 30 min in ingresso. Dopo 30 min separazione elettroforetica, interrompere acquisizione dati MS e diminuire la tensione CE a -1 kV utilizzando un tempo di rampa di 5 min (una graduale diminuzione della tensione CE dopo la separazione elettroforetica migliora la durata della punta porosa capillare emettitore).
- Tra le iniezioni del campione, sciacquare il capillare con acqua, 0,1 M di idrossido di sodio, acqua e BGE ciascuno a 30 psi per 3 min.
- Analizzare i dati registrati mediante la determinazione dei tempi di migrazione e l'intensità della miscela metabolita anionico analizzato segnale.
- Valutare se le norme metaboliti anionici appaiono nella regione tra 10 e 28 min.
- Controllare se tre isomeri strutturalmente affini, vale a dire, D-glucosio-1-fosfato, D-glucosio-6-fosfato e D-fruttosio-6-fosfato sonoparzialmente separata, cioè, la risoluzione tra i primi due picchi è circa 0,75 e degli ultimi due picchi è circa 0,50 (vedi Figura 1).
NOTA: Una risoluzione di 1.5 indica una separazione di base di due picchi adiacenti. - Ripetere i punti 3.1.1 e 3.1.2 per la miscela metabolita cationico. Assicurarsi che il rilevamento MS è ora in modalità ioni positivi e la tensione CE è +30 kV.
- Analizzare i dati registrati mediante la determinazione dei tempi di migrazione e l'intensità della miscela metabolita cationico analizzato segnale.
- Valutare se le norme metabolita cationici appaiono nella regione tra 8 e 22 min. Controllare se isoleucina e leucina stanno migrando tra il 15 e il 15,5 min e determinare se la risoluzione è di circa 0,5.
- Trasferimento 20 microlitri della miscela standard metabolita anionico in un vuoto 100 microfiala ml (PCR flaconcino) che si inserisce in una fiala CE e mettere questo vial nel vassoio campione di ingresso.
- Analisi di campioni biologici
- Ripetere i punti 3.1.1 e 3.1.2 per anionico profili metabolici dell'estratto della linea cellulare di glioblastoma.
NOTA: L'aria metabolicatenda ottenuto dopo pretrattamento campione corrisponde ad una densità cellulare di circa 20 cellule / nl, quindi, una iniezione nl 20 è l'equivalente di 400 cellule per analisi. . - Crea un elettroferogramma ioni estratti per l'acido lattico metabolita (m / z 89,0243) con 5 MDA accuratezza di massa e verificare se l'intensità del segnale è al di sopra di 100.000 conteggi.
- Ripetere i punti 3.1.1 e 3.1.2 per cationica profili metabolici dell'estratto della linea cellulare di glioblastoma.
NOTA: A altamente ricco di informazioni elettroferogramma totale di ioni deve essere osservato per 20 iniezione nl in questa modalità. - Dopo analisi o quando non in uso, risciacquare il capillare con acqua a 50 psi per 15 min e memorizzare la parte di ingresso del capillare in un'acqua flaconcino contenente e la sezione poroso (parte presa) in una provetta contenente anche acqua.
- Ripetere i punti 3.1.1 e 3.1.2 per anionico profili metabolici dell'estratto della linea cellulare di glioblastoma.
Representative Results
Il metodo guaina CE-MS proposto è in grado di fornire altamente efficiente, cioè, numeri di lastra che vanno da 60.000 a 400.000, profili per metaboliti anionici e cationici a limiti di rivelazione nanomolari con acido acetico al 10% (pH 2,2) come BGE. Il rendimento di separazione del metodo per l'analisi dei metaboliti anionici altamente polari è dimostrato per tre strutturalmente correlate isomeri zucchero fosfato (Figura 1). Sebbene una separazione di base non è stato ottenuto per questi tre analiti, una parziale separazione è sufficiente a permetterne la rivelazione selettiva da MS come questi analiti hanno la stessa massa esatta. Il potenziale del metodo CE-MS guaina, per profili metabolici del numero limitato di cellule, cioè, una iniezione nl 20 corrisponde a 400 cellule (densità delle cellule è di circa 20 cellule / nl), è dimostrata per l'analisi dei metaboliti cationici in un estratto della linea cellulare glioblastoma (Figura 2), in cui sono stati individuati oltre 300 caratteristiche molecolari sopra S / N-ratio ≥ 5.
Figura 1. Analisi di isomeri zucchero fosfato dalla guaina CE-MS. Elettroferogramma ioni estratti per tre isomeri di fosfato di zucchero (25 micron) ottenute con guaina CE-MS in modalità ioni negativi. Condizioni sperimentali: BGE, 10% di acido acetico (pH 2,2); tensione separazione, -30 kV (+0,5 psi applicata all'ingresso del capillare CE); iniezione del campione, 2,0 psi per 60 sec. Riprodotto con il permesso 4. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Analisi di isoleucina e leucine da guaina CE-MS. elettroferogramma ioni Estratto di due isomeri aminoacidi (25 micron) ottenute con guaina CE-MS in modalità ioni positivi. Condizioni sperimentali: BGE, 10% di acido acetico (pH 2,2); tensione separazione, +30 kV; iniezione del campione, 2,0 psi per 60 sec. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Potenziale di guaina CE-MS per profilatura metaboliti cationici in un estratto di linee cellulari. Profilo metabolico (totale elettroferogramma ion) osservata in un estratto di una linea cellulare di glioblastoma con guaina CE-MS in modalità ioni positivi. Condizioni sperimentali: BGE, 10% di acido acetico (pH 2,2); tensione separazione, +30 kV; iniezione del campione, 2,0 psi per 60 sec. Riprodotto con il permesso 4 Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Una guaina Metodo CE-MS utilizzando un emettitore punta porosa è stata presentata per l'analisi dei metaboliti altamente polari e cariche. Una caratteristica unica di questo approccio è che i metaboliti anionici o cationici possono essere profilate da un solo passaggio MS rilevamento e la tensione CE polarità. Una vasta gamma di metaboliti altamente polari e cariche in campioni biologici possono essere analizzati con una elevata efficienza di separazione, che è di fondamentale importanza per i metaboliti strutturalmente simili, e con limiti di rilevabilità nel (basso) gamma nanomolari. Il protocollo presentato focalizzato sull'uso di guaina CE-MS per profili metabolici degli estratti cellulari per esemplificare l'utilità del metodo di profili metabolici di un campione biologico. L'approccio qui descritto può essere utilizzato anche per profili metabolici di altri tipi di campioni biologici, quali urina umana 5, dato che una corretta procedura di pretrattamento del campione viene utilizzato.
La guaina CE-MS method è basato su un emettitore punta porosa che permette l'utilizzo della struttura intrinsecamente bassa portata di CE. In questo contesto, un segnale stabile ESI è un pre-requisito per gli studi di profili metabolici riproducibili. Pertanto, è importante che la punta spruzzatore sia correttamente posizionato davanti all'ingresso MS. In questa configurazione, il processo ESI dipende principalmente dalla natura del BGE e quindi, ottimizzazione BGE è critica. La configurazione senza guaina è meno versatile rispetto alla guaina-liquido sistemi CE-MS in cui possono essere aggiunti tutti i tipi di composizioni guaina-liquido per migliorare l'efficienza di ionizzazione. L'ago guaina spruzzatore ESI ha bisogno di essere completamente riempita di liquido conduttivo (ad esempio, la soluzione BGE). Un segnale ESI instabile può derivare da un capillare parzialmente o completamente collegato. Risciacquo ad alta pressione con BGE può risolvere questo problema. Altrimenti il capillare di separazione deve essere sostituito. Prima di valutazione delle prestazioni analitiche, un segnale di fondo ESI stabiledovrebbe essere generato prima che sia coerente da un giorno all'altro.
Le prestazioni analitiche della guaina metodo di CE-MS per gli studi di profili metabolici deve essere controllato quotidianamente utilizzando miscele standard metabolita. Nelle stesse condizioni sperimentali, tempi di migrazione coerenti, cioè, variazione di sotto del 3% per entro giorni (n = 10) e tra giorni (n = 5) utilizzando una iniezione da 20 nl di una miscela standard metabolita (12.5 mM), picco altezze / aree (variazione inferiore al 15%) e targhe (comprese tra 60.000 e 400.000) dovrebbero essere ottenuti. Limiti di rilevazione dovrebbero essere nella gamma nanomolari per la maggior parte standard metaboliti. Solo quando vengono soddisfatti questi criteri è il metodo pronto per profili metabolici di campioni biologici. In caso contrario, lo strumento MS ha bisogno di essere sintonizzati e ricalibrato o poroso punta capillare emettitore deve essere cambiato.
Una fase di risciacquo efficace tra CE-MS analisi è di grande importanza, non solo perprevenire potenziali riporto ma anche per mantenere le prestazioni di separazione. riporto potenziale può essere causato da fiale BGE contaminati con il campione e quindi risolti con la sostituzione con nuove fiale BGE. Quando il metodo CE-MS guaina non è in uso, è importante scollegare il capillare separazione e memorizzare il lato di ingresso del capillare in acqua e l'esterno sommerso con il manicotto protettivo in una provetta contenente acqua per prolungare la vita capillare.
In sintesi, la guaina metodo di CE-MS proposto mostra un forte potenziale di profili metabolici di campioni biologici se utilizzato secondo le modalità riportate nel presente protocollo. In questa fase, i dati di confronto inter-laboratorio sono sicuramente necessaria per guaina CE-MS al fine di valutare la (a lungo termine) la riproducibilità e la robustezza di questo approccio per la metabolomica. Questo protocollo può stimolare un tale studio. devono ancora varie sfide di analisi da considerare. Per perf ottimaleormance, l'attuale CE dovrebbe essere mantenuta preferibilmente al di sotto 5 μA e in questa fase i capillari porosi emettitori di punta vengono forniti solo a una lunghezza di 91 centimetri, che possono ostacolare lo sviluppo di test high-throughput. Inoltre, un buffer partire separazione pH è stato usato per anionico profili metabolici che non può essere il più ottimale per ottenere una separazione di base di fosfati zucchero strutturalmente correlati. Altrettanto importante è che solo metaboliti anionici possono essere analizzati che sono (parzialmente) caricato negativamente alle condizioni di separazione usati. Il passo successivo è quello di valutare l'utilità del metodo sheathless CE-MS per studi clinici profili metabolici come attualmente, un singolo porosa punta capillare emettitore può essere utilizzato solo per l'analisi di un massimo di 100 campioni biologici.
Nel complesso, l'ulteriore sviluppo nell'approccio guaina CE-MS si aprirà una nuova direzione nel campo della metabolomica, vale a dire, verso una comprensione più profonda delle funzioni biologiche in scasi ampie limitato.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CESI 8000 instrument | Sciex | A98089 | OptiMS adapter required to couple CESI to MS |
| OptiMS Fused-Silica Cartridge, 30 μm ID x 90 cm total length | Sciex | B07367 | |
| OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source | Sciex | B07363 | |
| CESI vials | Sciex | B11648 | |
| Micro vials | Sciex | 144709 | |
| Glacial acetic acid | Sigma | A6283 | Use in fume hood |
| Cationic metabolite mixture | Human Metabolome Technologies | H3304-3034 | |
| Anionic metabolite mixture | Human Metabolome Technologies | H3304-1031 | |
| Methanol (LC-MS Ultra Chromasolv) | Sigma | 14262 | Use in fume hood |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | 72079 | 0.1 M |
| U-87 MG Glioblastoma cell line | Sigma | 89081402 | |
| Chloroform | Sigma | 650498 | Toxic; use in fume hood |
References
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