Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Sheathless केशिका वैद्युतकणसंचलन मास जैविक नमूने मेटाबोलिक रूपरेखा के लिए स्पेक्ट्रोमेट्री

doi: 10.3791/54535 Published: October 1, 2016

Summary

एक sheathless झरझरा टिप इंटरफेस डिजाइन का उपयोग कर केशिका वैद्युतकणसंचलन-मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा जैविक नमूने के चयापचय की रूपरेखा के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है।

Abstract

metabolomics में, विश्लेषणात्मक तकनीकों की एक विस्तृत रेंज (अंतर्जात) जटिल नमूनों में चयापचयों के वैश्विक रूपरेखा के लिए प्रयोग किया जाता है। इस पत्र में, एक प्रोटोकॉल केशिका वैद्युतकणसंचलन-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (सीई एमएस) द्वारा जैविक नमूनों में ऋणात्मक और cationic चयापचयों के विश्लेषण के लिए प्रस्तुत किया है। सीई अत्यधिक ध्रुवीय और आरोप लगाया चयापचयों के विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल के रूप में यौगिकों अपने आरोप-टु-आकार के अनुपात के आधार पर अलग हो रहे हैं। हाल ही में विकसित sheathless interfacing डिजाइन, यानी, एक झरझरा टिप इंटरफेस, सीई युग्मन electrospray को आयनीकरण (ईएसआई) एमएस के लिए प्रयोग किया जाता है। इस interfacing दृष्टिकोण ध्रुवीय मेटाबोलाइट वर्गों की एक व्यापक श्रेणी के लिए nanomolar का पता लगाने सीमा में जिसके परिणामस्वरूप, प्रभावी एमएस के साथ संयोजन में सीई की आंतरिक रूप से कम प्रवाह संपत्ति के उपयोग की अनुमति देता है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक के विश्लेषण के लिए कम पीएच जुदाई की स्थिति पर एक झरझरा टिप emitter के साथ एक नंगे जुड़े हुए सिलिका केशिका रोजगार पर आधारित हैजैविक नमूने में मेटाबोलाइट वर्गों के व्यापक सरणी। यह दिखा दिया है कि एक ही sheathless सीई एमएस विधि केवल एमएस का पता लगाने और स्विचन द्वारा अमीनो एसिड, न्यूक्लियोसाइड और छोटे पेप्टाइड, या ऋणात्मक चयापचयों, चीनी फॉस्फेट, न्यूक्लियोटाइड और कार्बनिक अम्ल सहित cationic चयापचयों, की रूपरेखा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता जुदाई वोल्टेज polarity। इस तरह के मूत्र, मस्तिष्कमेरु द्रव और ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइन के अर्क के रूप में विभिन्न जैविक नमूनों में अत्यधिक जानकारी युक्त चयापचय प्रोफाइल,, सीई-एमएस विश्लेषण के कम से कम 1 घंटे में इस प्रोटोकॉल के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।

Introduction

समकालीन metabolomics में, उच्च अंत विश्लेषणात्मक जुदाई तकनीक के क्रम में एक प्रतिनिधि प्राप्त करने के मेटाबोलाइट वर्गों की एक विस्तृत श्रृंखला का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं पढ़ने के लिए बाहर एक जीव 1 की शारीरिक स्थिति की। एक metabolomics अध्ययन के अंतिम उद्देश्य एक दिया जैविक / नैदानिक ​​प्रश्न का उत्तर प्राप्त करने के लिए है। वर्तमान में, मानव Metabolome डाटाबेस 40,000 से अधिक मेटाबोलाइट दोनों अंतर्जात और exogenous यौगिकों (पोषक तत्वों, माइक्रोबायोटा, दवाओं और अन्य स्रोतों से बाद के उद्भव) का प्रतिनिधित्व प्रविष्टियों के शामिल है 2। भौतिक-रासायनिक गुणों और इन चयापचयों की एकाग्रता रेंज में विशाल विविधता को देखते हुए, विभिन्न जुदाई तंत्र के साथ कई विश्लेषणात्मक तकनीकों के क्रम में एक दिया जैविक नमूने में संभव के रूप में कई चयापचयों प्रोफ़ाइल में संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, Psychogios एट अल। चयापचय मुनाफे के लिए पांच विश्लेषणात्मक जुदाई तकनीक के संयोजन का इस्तेमाल कियामानव सीरम 4,000 से अधिक रासायनिक विविध चयापचयों 3 का पता लगाने में जिसके परिणामस्वरूप के iling।

इस पत्र में, ध्यान जैविक नमूने 4,5 के चयापचय की रूपरेखा के लिए हाल ही में विकसित सीई एमएस रणनीतियों के लिए भुगतान किया जाएगा। सीई में, और विशेष रूप से केशिका क्षेत्र वैद्युतकणसंचलन (CZE, सामान्य रूप से सीई के रूप में कहा गया है), यौगिकों अपने आरोप-टु-आकार के अनुपात के आधार पर अलग हो रहे हैं और इसलिए, इस विश्लेषणात्मक तकनीक अत्यधिक ध्रुवीय और आरोप लगाया चयापचयों के विश्लेषण के लिए अनुकूल है। सीई की जुदाई तंत्र जिससे जैविक नमूने 6-8 की चयापचय रचना पर एक पूरक दृश्य प्रदान, chromatographic आधारित तकनीक से मौलिक रूप से अलग है। सोगा और सह कार्यकर्ताओं पहला जैविक नमूने 9,10 में चयापचयों के वैश्विक रूपरेखा के लिए सीई-एमएस की उपयोगिता दिखाने के लिए थे। अब तक, metabolomics के लिए व्यवहार्यता और सीई-एमएस की उपयोगिता को व्यापक रूप से 11-15 प्रदर्शित किया गया है।सीई आम तौर पर एक म्यान तरल तकनीक 16,17 interfacing के माध्यम से एमएस के लिए युग्मित है; हालांकि, म्यान तरल द्वारा केशिका प्रवाह के कमजोर पड़ने के कारण का पता लगाने संवेदनशीलता आंतरिक रूप से समझौता किया है।

हाल ही में, यह प्रदर्शन किया गया है कि एक sheathless इंटरफ़ेस का उपयोग काफी विभिन्न जैविक नमूने में मौजूद चयापचयों का पता लगाने के कवरेज में सुधार एक शास्त्रीय म्यान तरल इंटरफ़ेस 5,18,19 उपयोग सीई-एमएस की तुलना में। उदाहरण के लिए, 900 के लगभग आणविक सुविधाओं sheathless सीई-एमएस द्वारा मानव मूत्र में पाया जबकि 300 के बारे में आणविक सुविधाओं म्यान तरल सीई एमएस 5 के साथ मनाया गया गया था। इस्तेमाल किया sheathless इंटरफेस एक झरझरा टिप emitter, जो Moini 20 द्वारा आविष्कार किया गया था, प्रभावी नैनो ईएसआई-एमएस के साथ संयोजन में सीई की आंतरिक रूप से कम प्रवाह संपत्ति के उपयोग की अनुमति के आधार पर किया गया था।

आदेश metabolomics के क्षेत्र में sheathless सीई-एमएस के उपयोग को प्रोत्साहित करने के लिए,एक प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे इस दृष्टिकोण, के रूप में ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइन से अर्क के विश्लेषण के लिए एक उदाहरण प्रस्तुत किया जैविक नमूनों में अत्यधिक ध्रुवीय चयापचयों के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रस्तुत किया है। यह दिखाया है कि cationic चयापचयों की रूपरेखा के लिए sheathless सीई एमएस विधि भी बिल्कुल वैसा ही केशिका और जुदाई शर्तों का उपयोग, जिससे विश्लेषण समय को कम करने और वैश्विक रूपरेखा के लिए एक एकल विश्लेषणात्मक मंच प्रदान ऋणात्मक चयापचयों की रूपरेखा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता आरोप लगाया चयापचयों। प्रोटोकॉल भी एमएस यंत्र के साथ sheathless झरझरा टिप emitter के प्रभावी संरेखण के लिए एक रणनीति का वर्णन है।

Protocol

नोट: प्रोटोकॉल यहाँ चयापचय प्रोफाइलिंग की पढ़ाई के लिए sheathless सीई-एमएस के उपयोग के लिए वर्णित प्रयोगशाला के उपयोग के लिए ही है। नीचे उल्लिखित प्रक्रियाओं हाल ही में प्रकाशित काम 4,5 पर आधारित हैं। आगे प्रयोगात्मक जानकारी के इन पत्रों में पाया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने से पहले, सभी प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (MSDS) से परामर्श करें। जब प्रयोगों इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित का आयोजन सभी उचित प्रयोगशाला सुरक्षा प्रक्रियाओं का उपयोग, सुरक्षा चश्मा, प्रयोगशाला कोट और दस्ताने सहित कृपया।

1. अभिकर्मकों और समाधान नमूनों की तैयारी

  1. बैकग्राउंड इलेक्ट्रोलाइट की तैयारी (BGE)
    1. एक नए BGE समाधान (10% (v / v) एसिटिक एसिड, पीएच 2.2) हर दिन के लिए तैयार करें।
    2. एक 10 मिलीलीटर कांच की शीशी में पानी की 9.0 मिलीलीटर जोड़ें और एक धूआं हुड में पानी के लिए एसिटिक एसिड के 1.0 मिलीलीटर जोड़ें। समाधान अच्छी तरह से एक भंवर का उपयोग मिक्स।
  2. मेटाबोलाइट standar की तैयारीडी मिश्रण
    1. एक 50 माइक्रोन के केशन मानक मिश्रण पानी की 50 μl में 60 cationic चयापचयों युक्त के 50 μl भंग और अच्छी तरह से समाधान का मिश्रण। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर नहीं जब उपयोग में।
    2. एक 50 माइक्रोन के आयनों मानक मिश्रण पानी की 50 μl में 30 ऋणात्मक चयापचयों युक्त के 50 μl भंग और अच्छी तरह से समाधान का मिश्रण। जब उपयोग में नहीं, एक ही मानक मिश्रण का / फ्रीज पिघलना चक्र को रोकने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर इस समाधान स्टोर, aliquots में।
      नोट: मेटाबोलाइट जब -80 डिग्री सेल्सियस पर ठीक से जमा मानक मिश्रण 3 महीने के लिए स्थिर रहे हैं।
  3. ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइन से अर्क की तैयारी
    1. पक्षपाती मानव U-87 एमजी glioblastoma कोशिकाओं 1 मिलीलीटर ठंडा 0.9% सोडियम क्लोराइड समाधान 21 के साथ तीन बार धोएं।
    2. 2 मिलीलीटर ठंडा मेथनॉल / पानी के घोल (8/2, वी / वी) पक्षपाती कोशिकाओं को जोड़ने और का उपयोग कर एक रबर सेल खुरचनी 21 इत्तला दे दी परिमार्जन। 2 मिनट के लिए एक ट्यूब में मेथनॉल / पानी के घोल और ultrasonicate लीजिए।
    3. क्लोरोफॉर्म मेथनॉल / पानी के अंश (अंतिम अनुपात 8/8/2, वी / वी / वी) और सेंट्रीफ्यूज के लिए 16,100 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूना जोड़ें।
    4. मेथनॉल / पानी की परत लीजिए और एक निर्वात concentrator का उपयोग इस अंश लुप्त हो जाना। sheathless सीई-एमएस द्वारा विश्लेषण के लिए 50 μl पानी में सूखे सामग्री Reconstitute। जब उपयोग में नहीं है -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूना संग्रहीत करते हैं।

2. Sheathless सीई एमएस प्रणाली की स्थापना

  1. झरझरा टिप emitter के साथ नंगे जुड़े हुए सिलिका कारतूस की स्थापना
    1. सीई साधन में एक झरझरा टिप emitter (30 माइक्रोन भीतरी व्यास x 90 सेमी कुल लंबाई) के साथ एक नया नंगे जुड़े हुए सिलिका कारतूस रखें।
    2. 100% मेथनॉल का उपयोग कर सीई साधन को नियंत्रित करने के लिए सॉफ्टवेयर के साथ 15 मिनट के लिए 50 साई पर एक आगे कुल्ला लागू करें और नेत्रहीन जाँच तरल capil से बाहर बह रहा है कि क्याइस चरण के दौरान rinsing Lary आउटलेट। इसके अलावा BGE समाधान का उपयोग करने के लिए नेत्रहीन जांच तरल प्रवाहकीय केशिका से बाहर बह रहा है कि क्या 5 मिनट के लिए 50 साई पर विपरीत दिशा में एक कुल्ला प्रदर्शन करते हैं।
    3. 100 साई के दबाव के मामले में कोई तरल बूंद गठन केशिका दुकान पर देखा गया है पर कदम दोहराएँ 2.1.2। एक नया नंगे जुड़े हुए सिलिका कारतूस स्थापित करता है, तो कोई तरल बूंद गठन के इस कदम के दौरान मनाया गया।
    4. 10 मिनट के लिए 50 साई पर पानी के साथ जुदाई केशिका, 0.1 एम NaOH के द्वारा पीछा 10 मिनट के लिए 50 साई पर पानी से 10 मिनट के लिए 50 साई पर कुल्ला, तो और 10 मिनट के लिए अंत में BGE के साथ 50 पर साई।
      नोट: कदम 2.1.1 2.1.4 जब तक केवल एक नया केशिका कारतूस की स्थापना के लिए आवश्यक हैं।
  2. ईएसआई एमएस करने के लिए केशिका झरझरा टिप emitter के युग्मन
    नोट: एमएस करने के लिए सीई केशिका युग्मन के लिए, यह सुनिश्चित करें कि एमएस साधन calibrated किया गया है और सीई प्रणाली से जुड़े पहले। ईएसआई वोल्टेज सेट0. एक nanospray स्रोत के साथ एमएस साधन फिट बैठते हैं। गैस 1, गैस 2 और इंटरफेस हीटर तापमान सिर्फ आयन स्प्रे वोल्टेज 5 साई में 1500 वी सेट पर्दे पर सेट को लागू करने से होता है बहुत कम प्रवाह दरों पर ईएसआई के रूप में लागू नहीं किया गया।
    1. पानी ट्यूब से जुड़े हुए सिलिका कारतूस के स्प्रेयर टिप निकालें और एमएस साधन के लिए युग्मन के लिए nanospray स्रोत एडाप्टर में इसे स्थापित करें। सुनिश्चित करें कि सीई साधन में BGE शीशियों की ऊंचाई स्प्रेयर टिप की ऊंचाई मैच।
    2. 5 मिनट के लिए 50 साई BGE के साथ rinsing द्वारा प्रवाहकीय केशिका के माध्यम से तरल के प्रवाह के लिए जाँच करें। इस दौरान rinsing कदम ईएसआई स्प्रेयर सुई के आधार पर एक बूंद गठन मनाया जाना चाहिए।
    3. आगे की दिशा में 10 मिनट के लिए 50 साई BGE साथ जुदाई केशिका फ्लश। बूंद गठन के इस कदम के दौरान झरझरा टिप emitter (स्प्रेयर टिप) की नोक पर मनाया जाना चाहिए।
    4. ग की दूरी पर एमएस प्रवेश के द्वार पर झरझरा टिप emitter स्थितिआईआरसीए 2 से 3 मिमी।
    5. 1 मिनट के एक रैंप समय का उपयोग कर 30 केवी के एक वोल्टेज लागू करते हैं और 65 से 0 के पहले एक ईएसआई वोल्टेज का उपयोग चयापचय की रूपरेखा अध्ययन के लिए 1,000 मी / z के लिए मी / z श्रेणी में एमएस डेटा प्राप्त शुरू करते हैं।
      नोट: जन स्पेक्ट्रम संकेत के शून्य के रूप में कोई electrospray होना चाहिए होना चाहिए।
    6. 1,000 वी करने के लिए ईएसआई वोल्टेज सेट करते हुए डेटा को मापने पर ले जाने के लिए। एक निरंतर पृष्ठभूमि संकेत तक 200 वी की वेतन वृद्धि के साथ ईएसआई वोल्टेज बढ़ाने के लिए कम से कम 15 मिनट के लिए मनाया जाता है।
    7. आदेश देखने के लिए जो स्थिति अधिक से अधिक और सबसे स्थिर एमएस संकेत (कुल आयन electropherogram) प्रदान करता है में एक्स, वाई, या जेड दिशा में ले जाकर एमएस प्रवेश के केंद्र के लिए सम्मान के साथ झरझरा टिप emitter स्थिति का अनुकूलन।
    8. झरझरा टिप emitter की स्थिति के अनुकूलन और इष्टतम ईएसआई वोल्टेज निर्धारण करने के बाद, 0 वी करने के लिए ईएसआई वोल्टेज सेट और 5 मिनट की एक रैंप समय का उपयोग करने के लिए 1 केवी 30 केवी से सीई वोल्टेज कम।
    9. एक एमएस विधि usin बनाएंजी इष्टतम ईएसआई वोल्टेज और मेटाबोलाइट मानकों और जैविक नमूने के विश्लेषण के लिए सीई साधन पर एक सीई विधि।

3. Metabolite मानक और जैविक नमूनों के विश्लेषण

  1. Sheathless सीई-एमएस प्रणाली के निष्पादन मूल्यांकन
    1. स्थानांतरण एक खाली 100 μl microvial (पीसीआर शीशी), जो एक सीई शीशी में फिट बैठता है और इनलेट नमूना ट्रे में इस शीशी डाल में ऋणात्मक मेटाबोलाइट मानक मिश्रण के 20 μl।
      नोट: न्यूनतम मात्रा एक विश्वसनीय इंजेक्शन के लिए microvial में अपेक्षित 2 μl है।
      1. एमएस अधिग्रहण नकारात्मक आयन मोड कदम 2.2.9 के दौरान बनाया विधि प्रारंभ करें और बाद में सीई अनुक्रम सॉफ्टवेयर सीई साधन को नियंत्रित करने का उपयोग शुरू।
      2. BGE साथ जुदाई केशिका 10 के लिए 1.0 साई BGE इंजेक्शन से 3 मिनट 60 सेकंड के लिए 2.0 साई में इंजेक्शन द्वारा पीछा के लिए 50 साई पर कुल्ला (20 nl केशिका मात्रा के 3% करने के लिए इसी) और फिरसेकंड।
        नोट: बाद में, एमएस डाटा अधिग्रहण शुरू हो रहा है।
      3. प्रवेश पर 30 मिनट के लिए 0.5 साई के दबाव के साथ 1.0 मिनट की एक रैंप समय के साथ -30 केवी के एक वोल्टेज लागू करें। एक 30 मिनट electrophoretic जुदाई के बाद, एमएस डाटा अधिग्रहण रोकने के लिए और 5 मिनट के एक रैंप समय का उपयोग (सीई वोल्टेज की एक क्रमिक कमी के बाद electrophoretic जुदाई झरझरा टिप केशिका emitter के स्थायित्व में सुधार) -1 केवी सीई वोल्टेज कम।
    2. नमूना इंजेक्शन के बीच, 3 मिनट के लिए 30 साई पर पानी के साथ केशिका, 0.1 एम सोडियम हाइड्रोक्साइड, पानी और BGE प्रत्येक कुल्ला।
    3. पलायन बार और विश्लेषण किया ऋणात्मक मेटाबोलाइट मिश्रण के संकेत तीव्रता का निर्धारण करने के द्वारा दर्ज डेटा का विश्लेषण।
    4. आकलन ऋणात्मक मेटाबोलाइट मानकों में 10 और 28 मिनट के बीच इस क्षेत्र में दिखाई देते है।
    5. चेक तीन संरचनात्मक रूप से संबंधित isomers, यानी, डी ग्लूकोज-1-फॉस्फेट, डी ग्लूकोज-6-फॉस्फेट और डी-फ्रुक्टोज-6-फॉस्फेट रहे हैं कि क्याआंशिक रूप से अलग कर दिया, यानी, पहले दो चोटियों के बीच संकल्प 0.75 के लगभग है और पिछले दो चोटियों में से (चित्रा 1 देखें) 0.50 के लगभग है।
      ध्यान दें: 1.5 का एक संकल्प दो आसन्न चोटियों में से एक आधारभूत जुदाई इंगित करता है।
    6. दोहराएँ 3.1.1 और cationic मेटाबोलाइट मिश्रण के लिए 3.1.2 कदम। सुनिश्चित करें कि एमएस का पता लगाने सकारात्मक आयन मोड में है और सीई वोल्टेज +30 केवी है।
    7. पलायन बार और विश्लेषण किया cationic मेटाबोलाइट मिश्रण के संकेत तीव्रता का निर्धारण करने के द्वारा दर्ज डेटा का विश्लेषण।
    8. आकलन cationic मेटाबोलाइट मानकों 8 और 22 मिनट के बीच इस क्षेत्र में दिखाई देते है। जाँच करें कि क्या isoleucine और leucine 15 और 15.5 के बीच मिनट पलायन कर रहे हैं और निर्धारित संकल्प 0.5 के लगभग है अगर।
  2. जैविक नमूने का विश्लेषण
    1. दोहराएँ 3.1.1 और ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइन के निकालने की ऋणात्मक चयापचय की रूपरेखा के लिए 3.1.2 कदम।
      नोट: चयापचय चोरनमूना pretreatment के बाद प्राप्त तम्बू के लगभग 20 कोशिकाओं / nl के एक सेल घनत्व से मेल खाती है, इसलिए, एक 20 nl इंजेक्शन विश्लेषण प्रति 400 कोशिकाओं के बराबर है। ।
    2. मेटाबोलाइट लैक्टिक एसिड (मी / z 89.0243) 5 एमडीए जन सटीकता प्रयोग करने के लिए एक निकाले आयन electropherogram बनाएँ और जाँच करें कि क्या संकेत तीव्रता 100,000 मायने रखता है ऊपर है।
    3. दोहराएँ 3.1.1 और ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइन के निकालने की cationic चयापचय की रूपरेखा के लिए 3.1.2 कदम।
      नोट: एक अत्यधिक जानकारी युक्त कुल आयन electropherogram इस विधा में एक 20 nl इंजेक्शन के लिए मनाया जाना चाहिए।
    4. विश्लेषण या जब उपयोग में नहीं होने के बाद 15 मिनट के लिए 50 साई पर पानी के साथ केशिका कुल्ला और एक शीशी युक्त पानी और झरझरा खंड (आउटलेट हिस्सा) एक ट्यूब में भी पानी युक्त केशिका के इनलेट हिस्सा दुकान।

Representative Results

प्रस्तावित sheathless सीई एमएस विधि अत्यधिक कुशल उपलब्ध कराने में सक्षम है यानी, प्लेट 60,000 से 400,000 से लेकर नंबर, पता लगाने nanomolar BGE के रूप में 10% एसिटिक एसिड (पीएच 2.2) का उपयोग कर सीमा पर ऋणात्मक और cationic चयापचयों के लिए प्रोफाइल। अत्यधिक ध्रुवीय ऋणात्मक चयापचयों के विश्लेषण के लिए विधि की जुदाई प्रदर्शन तीन संरचनात्मक रूप से संबंधित चीनी फॉस्फेट isomers (चित्रा 1) के लिए प्रदर्शन किया है। हालांकि एक आधारभूत जुदाई इन तीन analytes के लिए प्राप्त नहीं कर रहा था, एक आंशिक जुदाई के रूप में इन analytes ही सटीक जन एमएस द्वारा उनकी चयनात्मक पता लगाने की अनुमति देने के लिए पर्याप्त है। कोशिकाओं की सीमित संख्या के चयापचय की रूपरेखा के लिए sheathless सीई एमएस विधि की क्षमता यानी, एक 20 nl इंजेक्शन 400 कोशिकाओं से मेल खाती है (सेल घनत्व लगभग 20 कोशिकाओं / nl है), एक उद्धरण में cationic चयापचयों के विश्लेषण के लिए प्रदर्शन किया है ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइन की (चित्रा 2), जिसमें 300 से अधिक आणविक सुविधाओं को एक एस / एन अनुपात ≥ 5 से ऊपर पाया गया।

आकृति 1
Sheathless सीई एमएस। निकाली आयन तीन चीनी फॉस्फेट isomers (25 माइक्रोन) के नकारात्मक आयन मोड में sheathless सीई-एमएस के साथ प्राप्त करने के लिए electropherogram द्वारा चित्रा 1. चीनी फॉस्फेट isomers का विश्लेषण। प्रायोगिक स्थिति: BGE, 10% एसिटिक एसिड (2.2 पीएच); जुदाई वोल्टेज, -30 केवी (0.5 साई सीई केशिका के प्रवेश पर लागू होता है); नमूना इंजेक्शन, 60 सेकंड के लिए 2.0 साई। अनुमति के साथ Reproduced 4। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. isoleucine और एल के विश्लेषणsheathless सीई एमएस। निकाली आयन दो एमिनो एसिड isomers (25 माइक्रोन) के सकारात्मक आयन मोड में sheathless सीई-एमएस के साथ प्राप्त की electropherogram द्वारा eucine। प्रायोगिक स्थिति: BGE, 10% एसिटिक एसिड (2.2 पीएच); जुदाई वोल्टेज, +30 केवी; नमूना इंजेक्शन, 60 सेकंड के लिए 2.0 साई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. एक सेल लाइन निकालने में cationic चयापचयों की रूपरेखा के लिए sheathless सीई-एमएस की क्षमता। चयापचय प्रोफ़ाइल (कुल आयन electropherogram) सकारात्मक आयन मोड में sheathless सीई-एमएस के साथ एक ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइन का एक उद्धरण में मनाया। प्रायोगिक स्थिति: BGE, 10% एसिटिक एसिड (2.2 पीएच); जुदाई वोल्टेज, +30 केवी; नमूना इंजेक्शन, 60 सेकंड के लिए 2.0 साई। अनुमति के साथ Reproduced 4 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

एक sheathless सीई एमएस विधि एक झरझरा टिप emitter रोजगार अत्यधिक ध्रुवीय और आरोप लगाया चयापचयों के विश्लेषण के लिए प्रस्तुत किया गया है। इस दृष्टिकोण की एक अनूठी विशेषता यह है कि ऋणात्मक या cationic चयापचयों केवल एमएस का पता लगाने और सीई वोल्टेज polarity स्विचन द्वारा profiled किया जा सकता है। जैविक नमूने में अत्यधिक ध्रुवीय और आरोप लगाया चयापचयों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक उच्च जुदाई दक्षता, जो संरचनात्मक रूप से समान चयापचयों के लिए महत्वपूर्ण है, और (कम) nanomolar रेंज में पता लगाने की सीमा के साथ साथ विश्लेषण किया जा सकता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल के क्रम में एक जैविक नमूने के चयापचय की रूपरेखा के लिए विधि की उपयोगिता उदाहरण देना करने के लिए सेल के अर्क के चयापचय की रूपरेखा के लिए sheathless सीई-एमएस के उपयोग पर ध्यान केंद्रित किया। यहाँ वर्णित दृष्टिकोण भी इस तरह के मानव मूत्र 5 के रूप में जैविक नमूने, के अन्य प्रकार के चयापचय की रूपरेखा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है यह देखते हुए कि एक उचित नमूना pretreatment प्रक्रिया का इस्तेमाल किया जाता है।

sheathless सीई एमएस methoडी एक झरझरा टिप emitter जो सीई की आंतरिक रूप से कम प्रवाह संपत्ति के उपयोग की अनुमति देता है पर आधारित है। इस संदर्भ में, एक स्थिर ईएसआई संकेत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चयापचय की रूपरेखा अध्ययन के लिए एक पूर्व अपेक्षित है। इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है कि स्प्रेयर टिप ठीक से एमएस प्रवेश के सामने तैनात है। इस सेट अप में, ईएसआई प्रक्रिया मुख्य रूप से BGE की प्रकृति पर निर्भर है और इसलिए, BGE अनुकूलन महत्वपूर्ण है। sheathless विन्यास म्यान तरल सीई-एमएस सिस्टम जहां म्यान तरल रचनाओं के सभी प्रकार के आयनीकरण दक्षता में सुधार करने के लिए जोड़ा जा सकता है की तुलना में कम बहुमुखी है। Sheathless ईएसआई स्प्रेयर सुई पूरी तरह से प्रवाहकीय तरल (यानी, BGE समाधान) के साथ भरा जाना चाहिए। एक अस्थिर ईएसआई संकेत एक आंशिक या पूरी तरह से खामियों को दूर केशिका से हो सकता है। BGE के साथ उच्च दबाव पर Rinsing इस मुद्दे को हल कर सकते हैं। वरना जुदाई केशिका जगह की जरूरत है। विश्लेषणात्मक प्रदर्शन के आकलन, एक स्थिर ईएसआई पृष्ठभूमि संकेत करने से पहलेपहले उत्पन्न किया जाना चाहिए जो एक दिन से दूसरे करने के लिए संगत है।

चयापचय की रूपरेखा अध्ययन के लिए sheathless सीई एमएस विधि के विश्लेषणात्मक प्रदर्शन मेटाबोलाइट मानक मिश्रण का उपयोग दैनिक जाँच की जरूरत है। एक ही प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, लगातार पलायन बार, यानी, के लिए 3% नीचे भिन्नता के भीतर दिन (एन = 10) और बीच-दिन (एन = 5) एक मेटाबोलाइट मानक मिश्रण (12.5 माइक्रोन) के एक 20 nl इंजेक्शन का उपयोग, शिखर ऊंचाइयों / क्षेत्रों (15% से नीचे परिवर्तन) और प्लेट संख्या (60,000 और 400,000 के बीच लेकर) प्राप्त किया जाना चाहिए। पता लगाने की सीमा सबसे मेटाबोलाइट मानकों के लिए nanomolar सीमा में होना चाहिए। केवल जब इन मानदंडों से मुलाकात कर रहे विधि जैविक नमूने के चयापचय की रूपरेखा के लिए तैयार है। से calibrated फिर से या झरझरा टिप केशिका emitter बदलने की जरूरत है यदि नहीं, एमएस साधन देखते और जाने की जरूरत है।

सीई-एमएस के बीच एक प्रभावी कदम rinsing विश्लेषण न केवल करने के लिए, उच्च महत्व का हैसंभावित भार को रोकने लेकिन यह भी जुदाई प्रदर्शन को बनाए रखने के लिए। संभावित भार नमूने के साथ दूषित है और इसलिए नई BGE शीशियों के साथ प्रतिस्थापन द्वारा हल BGE शीशियों की वजह से हो सकता है। जब sheathless सीई एमएस विधि उपयोग में नहीं है, यह जुदाई केशिका डिस्कनेक्ट करने के लिए और पानी में केशिका और बाहर एक ट्यूब युक्त पानी केशिका जीवनकाल लम्बा करने के लिए सुरक्षात्मक आस्तीन के साथ जलमग्न के प्रवेश पक्ष स्टोर करने के लिए महत्वपूर्ण है।

सारांश में, प्रस्तावित sheathless सीई एमएस विधि जब प्रक्रियाओं इस प्रोटोकॉल में सूचना के अनुसार इस्तेमाल जैविक नमूने के चयापचय की रूपरेखा के लिए एक मजबूत क्षमता का पता चलता। इस स्तर पर, अंतर-प्रयोगशाला तुलना डेटा निश्चित रूप से आदेश (दीर्घावधि) reproducibility और metabolomics के लिए इस दृष्टिकोण की मजबूती का आकलन करने में sheathless सीई-एमएस के लिए आवश्यक हैं। इस प्रोटोकॉल में इस तरह के एक अध्ययन को प्रोत्साहित कर सकते हैं। विभिन्न विश्लेषणात्मक चुनौतियों अभी भी विचार किया जाना चाहिए। इष्टतम perf के लिएormance, सीई वर्तमान अधिमानतः 5 μA नीचे और इस स्तर केशिका झरझरा टिप उत्सर्जक केवल 91 सेमी की लंबाई जो उच्च throughput assays के विकास में बाधा हो सकती है पर प्रदान की जाती हैं पर रखा जाना चाहिए। इसके अलावा, एक कम पीएच जुदाई बफर ऋणात्मक चयापचय की रूपरेखा जो संरचनात्मक रूप से संबंधित चीनी फॉस्फेट का एक आधारभूत जुदाई को प्राप्त करने के लिए सबसे इष्टतम नहीं हो सकता है के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह भी महत्वपूर्ण है केवल ऋणात्मक चयापचयों विश्लेषण किया जा सकता है कि (आंशिक रूप से) नकारात्मक खेतों में जुदाई की शर्तों के तहत चार्ज किया जाता है जो है। अगले कदम के रूप में वर्तमान में नैदानिक ​​चयापचय प्रोफाइलिंग की पढ़ाई के लिए sheathless सीई एमएस विधि की उपयोगिता का आकलन करने के लिए है, एक भी झरझरा टिप केशिका emitter केवल अप करने के लिए 100 जैविक नमूने के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

कुल मिलाकर, sheathless सीई एमएस दृष्टिकोण में आगे के विकास के metabolomics, यानी के क्षेत्र में एक नई दिशा खुल जाएगा, एस में जैविक कार्यों की एक गहरी समझ की दिशा मेंपर्याप्त प्रतिबंधित मामले हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CESI 8000 instrument Sciex A98089 OptiMS adapter required to couple CESI to MS
OptiMS Fused-Silica Cartridge, 30 μm ID x 90 cm total length Sciex B07367
OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source Sciex B07363
CESI vials Sciex B11648
Micro vials Sciex 144709
Glacial acetic acid Sigma A6283 Use in fume hood
Cationic metabolite mixture Human Metabolome Technologies H3304-3034
Anionic metabolite mixture Human Metabolome Technologies H3304-1031
Methanol (LC-MS Ultra Chromasolv) Sigma 14262 Use in fume hood
Sodium hydroxide solution Sigma 72079 0.1 M
U-87 MG Glioblastoma cell line Sigma 89081402
Chloroform Sigma 650498 Toxic; use in fume hood

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramautar, R., Berger, R., van der Greef, J., Hankemeier, T. Human metabolomics: strategies to understand biology. Curr Opin Chem Biol. 17, 841-846 (2013).
  2. Wishart, D. S., et al. HMDB 3.0--The Human Metabolome Database in 2013. Nucleic Acids Res. 41, D801-D807 (2013).
  3. Psychogios, N., et al. The human serum metabolome. PLoS One. 6, e16957 (2011).
  4. Gulersonmez, M. C., Lock, S., Hankemeier, T., Ramautar, R. Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry for anionic metabolic profiling. Electrophoresis. 37, 1007-1014 (2016).
  5. Ramautar, R., Busnel, J. M., Deelder, A. M., Mayboroda, O. A. Enhancing the coverage of the urinary metabolome by sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry. Anal Chem. 84, 885-892 (2012).
  6. Ramautar, R., et al. Metabolic profiling of human urine by CE-MS using a positively charged capillary coating and comparison with UPLC-MS. Mol Biosyst. 7, 194-199 (2011).
  7. Naz, S., Garcia, A., Barbas, C. Multiplatform analytical methodology for metabolic fingerprinting of lung tissue. Anal Chem. 85, 10941-10948 (2013).
  8. Ibanez, C., et al. CE/LC-MS multiplatform for broad metabolomic analysis of dietary polyphenols effect on colon cancer cells proliferation. Electrophoresis. 33, 2328-2336 (2012).
  9. Soga, T., et al. Simultaneous determination of anionic intermediates for Bacillus subtilis metabolic pathways by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem. 74, 2233-2239 (2002).
  10. Soga, T., et al. Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry. J Proteome Res. 2, 488-494 (2003).
  11. Britz-McKibbin, P. Capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry (CE-ESI-MS)-based metabolomics. Methods Mol Biol. 708, 229-246 (2011).
  12. Ibanez, C., et al. A new metabolomic workflow for early detection of Alzheimer's disease. J Chromatogr A. 1302, 65-71 (2013).
  13. Kuehnbaum, N. L., Britz-McKibbin, P. New advances in separation science for metabolomics: resolving chemical diversity in a post-genomic era. Chem Rev. 113, 2437-2468 (2013).
  14. Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nat Protoc. 8, 783-799 (2013).
  15. Hirayama, A., Wakayama, M., Soga, T. Metabolome analysis based on capillary electrophoresis-mass spectrometry. Trac-Trend Anal Chem. 61, 215-222 (2014).
  16. Maxwell, E. J., Chen, D. D. Twenty years of interface development for capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry. Anal Chim Acta. 627, 25-33 (2008).
  17. Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. Capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry interfaces: fundamental concepts and technical developments. J Chromatogr A. 1267, 17-31 (2012).
  18. Hirayama, A., Tomita, M., Soga, T. Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry with a high-sensitivity porous sprayer for cationic metabolome analysis. Analyst. 137, 5026-5033 (2012).
  19. Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. Non-aqueous capillary electrophoresis for the analysis of acidic compounds using negative electrospray ionization mass spectrometry. J Chromatogr A. 1323, 163-173 (2014).
  20. Moini, M. Simplifying CE-MS operation. 2. Interfacing low-flow separation techniques to mass spectrometry using a porous tip. Anal Chem. 79, 4241-4246 (2007).
  21. Dettmer, K., et al. Metabolite extraction from adherently growing mammalian cells for metabolomics studies: optimization of harvesting and extraction protocols. Anal Bioanal Chem. 399, 1127-1139 (2011).
Sheathless केशिका वैद्युतकणसंचलन मास जैविक नमूने मेटाबोलिक रूपरेखा के लिए स्पेक्ट्रोमेट्री
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, W., Gulersonmez, M. C., Hankemeier, T., Ramautar, R. Sheathless Capillary Electrophoresis–Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples. J. Vis. Exp. (116), e54535, doi:10.3791/54535 (2016).More

Zhang, W., Gulersonmez, M. C., Hankemeier, T., Ramautar, R. Sheathless Capillary Electrophoresis–Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples. J. Vis. Exp. (116), e54535, doi:10.3791/54535 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter