Summary
כאן אנו מציגים טכניקת הדמיה המבוססת fluorophore לזהות כדאיויות תא על גבי פיגום טיטניום שאינו שקוף כמו גם לזהות הבזקים של זיהומי הפיגום. פרוטוקול זה troubleshoots החיסרון של הדמיה תאים תאים או תאים אינטראקציות-מתכת על פיגומים שאינם שקופים.
Introduction
כאבי גב כרוניים הוא מחלה מולטיפקטוריאלית. ההתעניינות אפשרות טיפול זעיר-פולשני עבור מחלת דיסק ניוונית גדלה מאז 1950. עד היום, היתוך רב-סגמנטלי של עמוד השדרה הוא הטיפול הנפוץ ביותר. מאז, שיטה זו מובילה לעיתים קרובות מגבלות בניידות של המגזר מושפע 1,2, חקר של עידן המפרק הפך עניין רחב. התקדמות משמעותית החלפת גרעין החלפת דיסק כוללת הפכה אלטרנטיבה טובה לטיפול בכאב 1 גב כרוני. למרות ההתקדמות הענקית, אף אחת מהשיטות נבדקו קליני. פחות שתלי הגרעין הנוקשים לייצג חלופה מבטיחה החלפת דיסק כוללת, ובלבד fibrosus annulus הוא תם 3,4. עם זאת, שתלי הגרעין הנוכחיים כיום בשוק הקשורים לעתים קרובות עם סיבוכים כמו שינויים בגוף בחוליות, פריק, אובדן גובה אנכי של הדיסק tהוא חוסר נוקשות 5 המכנים קשורות צורך. על מנת להתגבר על החסרונות הנוכחיים, שתל גרעין רומן עשויים חוטי טיטניום סרוגים פותח 6 בהצלחה. בשל המבנה הסרוג הייחודי, פיגום חדש שפותח זה הוכיח מאפיינים ביומכנית מכובדים, למשל, תכונת דעיכה, גודל נקבובי, קיבולת טעינה ואמינה 7. במטרה לבחון את biocompatibility של שתל גרעין הרומן הזה, מתואר מגבלות חמורות בטכניקות הניתוח (האופטיות) מיוחס האופי הלא-השקוף של השתל.
על מנת לבדוק את ההתאמה הביולוגית, אינטראקצית תא-מתכת ממלאת תפקיד בולט 8-10. אינטראקציה בין תאי הפיגום הכרחית לייצוב ומכאן לשילוב השתל הטוב יותר בתוך המערכת המארחת. עם זאת, עומק ingrowth הגדלה עשוי לשנות את התכונות המכאניות של הפיגום. במטרה investigate אם פני שטח הפיגום מספקים בסיס מצורף תא, התפשטות והבחנה או אם המתכת משפיעה על כדאיויות תא, חשוב לפתור את הבעיה הנפוצה הידועה של תאי הדמיה על / פיגומים שאינם שקופים ואטומים. על מנת להתגבר על ניאון כמה מגבלה זו טכניקות המבוססות נחקרו. חברות לספק מגוון רחב של fluorophores לדמיין תאי חיים, תאים סלולריים, או אפילו מדינות הסלולר ספציפיות 11. Fluorophores לניסוי זה נבחר בעזרת צופה ספקטרלי הכלי המקוון כדי טוב ביותר כדי להתאים מיקרוסקופ פלואורסצנטי שלנו.
האסטרטגיה שפותחה עבור הניתוח של התנהגות תאים החסידה על / בתוך פיגום טיטניום סרוג הלא שקוף כרוך הבא: פלורסנט 1) (חלבון פלואורסצנטי ירוק / GFP) התיוג של תאי osteochondro-האב לאפשר מעקב אחר התאים על פיגום, 2) מדידת כדאיות (Mitoפעילות chondrial) של התאים, ו -3) תאי תאי הדמית אינטראקציות חומר תאים בתוך הפיגום. ההליך יש את היתרון שהוא יכול בקלות להיות מועבר תאים חסידים אחרים פיגום שאינו שקוף או אטום אחר. יתר על כן, הכדאיות דפוס ingrowth ניתן לנטר על פני כמה ימים, ולכן ניתן להשתמש בו עם כמויות מוגבלות של פיגום חומר או תאים.
המחקר הנוכחי מדגים את השימוש המוצלח של הפרוטוקול הנוכחי, כדי לאמוד את כדאיות התא ולדמיין צמיחה דפוס של תאים osteochondro-אב על / בתוך הפיגום טיטניום סרוגים שאינם שקופים. יתר על כן, פרוטוקולים שפותחו עשויים לשמש על מנת לקבוע את זיהומי הפיגום לבדוק פרוטוקולי ניקוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: הונצח מבשר סטרומה האדם mesenchymal תאים (תאים SCP-1) שימשו הניסויים. SCP-1 תאים נמסרו על ידי פרופ 'מתיאס Schieker 12.
1. הרחבת SCP-1 תאים
- לפני העבודה עם תאי SCP-1, כמו שצריך לנקות את משטח העבודה (אני קבינט בטיחות הביולוגי מיועד) עם 70% אתנול (v / v) לובשות כפפות.
- בארון הבטיחות הביולוגי לנקות להכין נפח מתאים של מדיום תרבית תאים על ידי ערבוב הרכיבים הנדרשים כמצוינים בטבלה 1. על מנת לשמור על סטריליות של מדיום הבסיס, להוסיף תוספים ידי עובר דרך מסננים סטרילי עם גודל נקבובי של 0.22 מיקרומטר.
- כדי למנוע זיהום, להכין בינוני לפחות 24 שעות לפני השימוש. על מנת לבחון העקרות שלה, דגירת 1 מיליליטר בינוני בצלחת תרבית תאים ללא תאים בחממת תרבית תאים הסטנדרטית: 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 20% O 2 ולחות 90%. לאחרhr 24, לבדוק מיקרוסקופית בינוני באמצעות הגדלה של לפחות 200X.
- לשמור SCP-1 תאי חממת תרבית תאים סטנדרטית עם מצב תומך: 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 20% O 2 ולחות 90%.
- עבור תחזוקה והרחבה, לגדל את תאי SCP-1 עד שהם מגיעים 80-90% confluency. במהלך התרבות פרק זמן זה, לשנות בינוני כל 2-3 ימים. בהגיעם 80-90% confluency, לפצל תאים SCP-1 (בכלל יחס של 1: 2) למעבר הבא להתרחבות או צלחת עבור הניסויים (כפי שצוין).
- עבור פיצול התאים SCP-1, לחמם את המדיום תרבות ב 37 ° C ו להפשיר טריפסין / EDTA באמצעות אמבט מים ב 37 ° C.
- לחלוטין לשאוב את מדיום התרבות מתאי ומחוברות 80-90% וזורקים אותו לתוך מיכל פסולת.
- שוטפים את התאים לפחות פעמיים עם DPBS (שנאגרו מלוחים של פוספט Dulbecco ללא מגנזיום וסידן, pH 7.2).
- פיפטה נפח מתאים שלDPBS על גבי תאים (5 מ"ל DPBS עבור בקבוק תרבות T75 ו -12 מ"ל עבור בקבוק תרבות T175).
- לשאוב DPBS בזהירות וזורק אותו לתוך מיכל פסולת.
- פיפטה נפח מתאים של 0.25% טריפסין / EDTA על תאים (1 מ"ל DPBS עבור בקבוק תרבות T75 ו -2 מ"ל עבור בקבוק תרבות T175) דגירה למשך 5-10 דקות ב 37 ° C בחממה תרבית תאים סטנדרטיים עם 5 CO 2%, 20% O 2 ולחות 90%.
- לסלק את התאים על ידי קשה על הכלי ולהבטיח את כל התאים מנותקים מן פלסטיק התרבות (trypsinization) על ידי התבוננות התאים הצפים תחת מיקרוסקופ.
- להשבית את התגובה טריפסין על ידי הוספת 10 מ"ל של מדיום תרבות. מערבבים את טריפסין ותאים עם המדיום בקפידה על ידי pipetting חזר.
- מעבירים את ההשעיה התא לתוך צינור התגובה ו צנטריפוגות ב 600 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל התרבותבינוני.
- ספירת התאים על ידי שיטת הרחקה הכחולה Trypan כמתואר בפרוטוקול 2.
- זרעי התאים בהתאם לעיצוב ניסיוני.
ספירת 2. של SCP-1 תאים
- בצע ספירת תאי קיימא (שיטת הרחקה הכחולה Trypan) של תאי resuspended באמצעות hemocytometer.
- לפני הספירה התא, לנקות את hemocytometer שימוש במי ברז. ייבש את מרכיבי hemocytometer באמצעות רקמות חינם מוך. להרכיב אותו על ידי הרטבת הזכוכית המכסה ומצמידה אותו הפוך על גבי שני הרצים זכוכית בכל צד של האזור והיד עוד נטויה. ודא טבעות הניוטונית נראות על רצי הזכוכית (איור 1).
- קח 10 μl של תאים resuspended ומערבבים עם 10 μl של פתרון 0.1% Trypan כחול להשיג גורם לדילול של 2.
- טען 10 μl של המדגם על החדר hemocytometer מראש לנקות ולהרכיב.
- הספירה חי (לבן / תאים שקופים) ומת(גרעינים כחולים) תאים על ריבועי 4x4 (ראה האיור 1B).
- חשב את המספר הכולל של תאים בעקבות הנוסחה:
3. Transfection GFP של SCP-1 תאים
הערה: כדי לצפות SCP-1 תאי צמיחה על ולתוך פיגום טיטניום סרוג פני תקופת תרבות מסוימת סמנו את התאים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). התבטאות יתר של GFP מושגת על ידי זיהום עם חלקיקי אדינו מקודדי GFP. שכפול פסול (-E1 / -E3) חלקיקים אדנו המקודדים יצירת חלבונים פלואורסצנטי ירוק (GFP) שימשו להדביק תאים SCP-1. את חלקיקי הנגיף התקבלו פרופ 'סטיבן דולי 13 על ידי איסוף supernatant התרבות של אדנו רקומביננטי (Ad5-GFP) תאי HEK293T טרנספקציה (מעבדת בטיחות ביולוגית השנייה). שלוש הקפאה חזרה (-80 ° C) הפשרה (37 מעלות צלזיוס באמבט המים) מחזורים הבטיחו כי אין לותאי K293T להישאר קיימא לייצר חלקיקי נגיף חדשים. באמצעות מניות זרע אדנו זה יכול ביעילות להדביק את התאים SCP-1 מבלי לייצר חלקיקי נגיף חדשים. לפיכך, את התאים הנגועים יכולים להיות מטופלים I. Lab בטיחות ביולוגית
- Resuspend תאי היעד (תאי SCP-1) עם צפיפות זריעה של ml / 50,000 תאים במדיום התרבות. פיפטה 2 מ"ל לכל גם לתוך צלחת בתרבית רקמה 6 באר.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממת תרבית תאים הסטנדרטית; 5% CO 2, 20% O 2 ו -90% לחות, עד תאים SCP-1 להגיע confluency של 70-80%.
הערה: confluency תלוי צפיפות זריעה של התאים. לקבלת התנאים האמורים לעיל, תאים SCP-1 להגיע confluency של 70-80% ב 1.5-2 ימים. - בדיון שנערך confluency של 70-80%, ללא aspirating בינוני התרבות להוסיף 100 μl של המניה זרע אדנו לכל 1 מ"ל של מדיום תרבות.
- קבע את טווח הריכוז בנפרד בהתאם לכמות של חלקיקי נגיף בכל וירוס seלהכנה מלאה ed. במקרה יעילות הזיהום נמוכה מדי, לטהר ולרכז חלקיקי נגיף באמצעות ערכות שונות זמינות מסחרי.
- דגירה במשך שעה בחממת תרבית תאים הסטנדרטית על 37 מעלות צלזיוס (5% CO 2, 20% O 2 ולחות 90%).
- הסר בינוני תרבות המכיל את המניה זרע וירוס ולאסוף אותו לסילוק. הוסף בינוני תרבות טרי 2 מ"ל לכל טוב של צלחת 6-היטב בתרבות-לחדש.
- ודא כי לפני סילוק, חלקיק וירוס המכיל בינוני הוא autoclaved.
- חישוב ביטוי GFP התאי (יעילות זיהום) 24 שעות לאחר ההדבקה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם סט GFP LED הקובייה / פילטר.
- שים את מורפולוגיה התא (איור 2). תאי ניתוק מן פלסטיק התרבות יכולים לתת תוצאות חיוביות כוזבות.
4. ניקוי של פיגומים טיטניום סרוגים
- Pתחרה עד 5 פיגומים לתוך צינור התגובה 50 מ"ל.
- שטפו את הפיגום (עובי 6-7 מ"מ) שלוש פעמים עם 30 מ"ל מים מזוקקים-deionized במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, באמצעות תנאים הרוטור (8 XG).
- החזר את מים מזוקקים-deionized עם 30 מ"ל 1% (w / v) טריטון X-100 פתרון (מומס במים מזוקקים-יונים) ולאחר מכן לשטוף את הפיגומים פעם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, באמצעות תנאים הרוטור (8 XG) .
- מחק את הפתרון Triton-X-100 ואחריו כביסה עם 30 מ"ל מזוקקים-deionized מים פעמיים (5 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר) תנאים הרוטור שמירה (8 XG).
- החזר את המים מזוקקים-יונים. שוטפים את ברצף פיגומים עם אצטון 99% כיתה מגיב, 99% isopropanol ואתנול 99% (30 מ"ל כל אחד) עבור 2 x 5 דקות כל אחד באמבטיה קולי (~ 50 הרץ, 50 W, 220-240 V).
- לשטוף שוב שלוש פעמים עם 30 מ"ל מזוקקים-deionized מים במשך 5 דקות, תוך שמירה על קבועים לטיפול באמבטיה קולי.
- מניחים את scaffoLDS על רקמה נטולת מוך כדי לאוורר לילה יבש בטמפרטורת החדר.
- חיטוי הפיגום במשך 15 דקות ב 121 מעלות צלזיוס עם 15 psi.
- אשר את פרוטוקול הניקוי על ידי קרינה עקיפה כמתואר בפרוטוקול 5.
5. מבני הדמית פיגום על ידי קרינה עקיפה
הערה: הפרוטוקול הנוכחי מתאר את ההדמיה של מבני פיגום על ידי קרינה עקיפה באמצעות fluorophore sulforhodamine B אשר נותן קרינה אדומה בוהקת באורך גל לשעבר / em של 565/586 ננומטר. עם זאת, fluorophore ניתן לשנות כדי להתאים טוב יותר עבור הגדרות מיקרוסקופ נתונות או אוטומט קרינה אפשרית של הפיגום.
- הכן את הפתרון מכתים sulforhodamine B (0.04%) חומצה אצטית 1% ולאחסן בטמפרטורת החדר עם הגנה מפני אור.
- קח צלחת בתרבית רקמה 24 גם לטבול הפיגום לנקות 500 μl של הפתרון מכתים sulforhodamine B ידי הצבתו insIDE מלקחיים באמצעות היטב.
- ללכוד את הדימויים השליליים של הפיגום באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- צלמו תמונות עם להגדיר קוביה / מסנן LED RFP עם גל עירור של ננומטר 531/40 ו אורך גל הפליטה של ננומטר 593/40. לחלופין לבחור את אורך גל העירור ופליטה הנאות בעזרת הצופה רפאי הקרינה 20. Sulforhodamine B יש עירור לשיאו 578 ננומטר ופליטה לשיאו 593 ננומטר.
- על מנת להמחיש את מבנה הפיגום, לצלם בהגדלה נמוכה, למשל, 4X או 10X (איור 3). שימוש בתמונות אלה, לקבוע מאפיינים, למשל, את הגודל הנקבובי ולעצב בעזרת של ImageJ.
- כדי לזהות זיהומים פיגום, לצלם בהגדלות גדולות, למשל, 20X או 40X, בהתחשב בכך זה יגביל את ניתוח מעמיק. ודא עפר חלקיקים / חומרים אינם נראים (ראה תוצאות נציג; איוריור 3).
6. Assay במבחנה Biocompatibility
- טרום לחמם את מדיום התרבות על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
- קח צלחת בתרבית רקמה 24 גם באמצעות מלקחיים, מניחים את הפיגומים לנקות ולחטא היטב בכל מבחן היטב בסביבה נקייה מחיידקים. לעבוד מתחת לארון biosafety מראש לנקות לי!
- משרים / דגירת הפיגומים עם מדיום תרבות במשך כ 15 דקות (500 μl לכל גם צלחת בתרבית רקמה 24 גם), כדי להסיר אוויר מבפנים של הפיגום.
- בינתיים, resuspend 500,000 Ad-GFP נגועים בתאי SCP1 ב 1 מ"ל של מדיום תרבות.
- לאחר 15 דקות של השריה פיגום, לשאוב את המדיום לחלוטין את הפיגום.
- עבור זריעת התאים על הפיגום, לוותר 100 μl של ההשעיה תא בקפידה על הפיגום (אשר ממוקם 24 גם צלחת) משטח. יש לשמור על היקף מינימלי של ההשעיה תא תוך זריעת התאים, כך כדי להבטיח ששום מדיום זורם out של הפיגום.
- דגירת התאים למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחממת תרבית תאים הסטנדרטית (5% CO 2, 20% O 2 ולחות 90%).
- הוסף 500 μl יותר מדיום תרבות דגירה במשך 24 שעות בחממת תרבית תאים הסטנדרטית (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 20% O 2 ו -90% לחות).
- להעריך את דפוס ההיענות תא ותא מתפשט על פני הפיגום באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- צלמו תמונות עם להגדיר קוביה / מסנן LED GFP עם גל עירור של ננומטר 470/22 ו אורך גל הפליטה של ננומטר 510/42. לחלופין לבחור עירור הנאות אורך גל פליטה בעזרת הצופה רפאי הקרינה. GFP יש עירור לשיאה ב 488 ננומטר ופליטה לשיאה ב 507 ננומטר.
- על מנת להמחיש תמונות ללכוד דפוס דבק תא בהגדלות נמוכות, למשל, 4X או 10X (איור 4). על מנת לצפות תא הפצת mag גבוהnification (לפחות 100X) יש צורך - הגבלת עומק המיקוד.
- להערכת תא נוסף מתפשט על פני הפיגום, לתקן את התאים עם 4% פורמלין והמשך עם מכתים הקרינה המקובלת של מבנים הסלולר, למשל, סיבי אקטין (Phalloidin). עם זאת, להסתגל פעמי דגירה וסימון הניאון של הנוגדנים על מנת להתאים את מאפייני פיגום פרט, למשל, פעמים דיפוזיה או פלואורסצנציה אוטומטי 14.
- למחרת, לשנות את מדיום התרבות להסיר תאים שאינם חסידים.
- חישוב אחוזי התאים חסידים על הפיגום על ידי resazurin מדידת המרה כמתואר בפרוטוקול 7.
איור 5: ציר זמן של assay במבחנה (א) התקנה ניסיונית עבור תאי ציפוי.. (B אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
7. מדידת מרת Resazurin
הערה: assay המרה Resazurin משמש למדידת פעילות המיטוכונדריה ובכך התפשטות תאים בעקיפין. Resazurin ירידה ל resorufin מייצרת אות ניאון, אשר מבוססת על פעילות המיטוכונדריה הקשורים למספרי תא קיימא (איור 7 א).
- לחלוטין לשאוב את מדיום תרבות מתאי SCP-1 וזורק אותו לתוך מיכל פסולת.
- שוטף את תאי SCP-1 פעם עם DPBS כדי להסיר תאים מנותקים. הוסף 500 μl DPBS לכל טוב של צלחת בתרבית רקמה 24 גם המכיל תאים SCP-1 על הפיגום.
- לכסות את התאים עם בבוקר נדרשount של פתרון עובד resazurin סטרילי (resazurin 0.25% בטווח בינוני תרבות) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממת תרבית תאים הסטנדרטית (5% CO 2, 20% O 2 ו -90% לחות) למשך 30 דקות.
- רשום לעצמך כי; זמן הדגירה תלוי בסוג התא צפיפות התאים. זה יכול להשתנות בין 10 דקות ו -6 שעות. זמן דגירה אופטימלי עבור תאי SCP-1 הוא 30 דקות.
- כביקורת רקע, לכלול לפחות אחד גם עם הפתרון עובד resazurin אבל ללא תאים, כלומר וטופח על 37 מעלות צלזיוס בחממת תרבית תאים הסטנדרטיות (5% CO 2, 20% O 2 ו -90% לחות) עבור אותו כמות הזמן.
- העברת 100 μl מותנה supernatant מבאר כל צלחת בתרבית רקמה 24 גם לתוך צלחת 96-microwell.
- שוטפים את התאים הנותרים שלוש פעמים עם 1 DPBS מ"ל במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר הפתרון עובד resazurin שיורית. לאחר לשטוף third להוסיף t בינוני תרבותo השתלים עם תאים SCP-1 (500 μl לכל גם צלחת בתרבית רקמה 24 גם) ולהמשיך הדגירה על 37 מעלות צלזיוס בחממה תרבית תאים סטנדרטיים (5% CO 2, 20% O 2 ו -90% לחות) למדידות כמובן זמן נוסף.
- הקפד להגדיר משכפל בשלב זה (2-4) כדי למזער שגיאות pipetting.
- בינתיים, מניחים את צלחת 96-microwell לתוך קורא microplate ולמדוד את הקרינה של resorufin נוצר.
- על מנת להקטין אות רקע, למדוד קרינה באורך גל עירור של 545 ננומטר ו אורך גל פליטה של 585 ננומטר.
- לחלופין לבחור עירור הנאות אורך גל פליטה בעזרת הצופה רפאי הקרינה. Resorufin יש עירור לשיאו 572 ננומטר ופליטה לשיאו 585 ננומטר. עוצמת האות הנתונה היא ממוצעת של 25 קריאות בודדות (25 הבזקים לכל טוב).
- מדוד את פלואורידescence של resorufin נוצר במדיום מותנה, באמצעות ראייה תחתונה.
- רשום לעצמך כי, הרווח תלוי בכמות הממוצעת של resazurin המרה ויכול להשתנות בין 10 ל -4,000. התאם את הרווח לקורא microplate הפרט שמוצג pipetting עקום סטנדרט resorufin, כך אות הניאון היא מתחת ל -80% של עוצמת האות המרבית לזיהוי (במקרה זה 20,000). הרווח המותאם במיוחד תאי SCP-1 הוא 800.
- הפחת את אות הרקע (resazurin פתרון עובד ללא תאים) מן האות של דגימות הבדיקה.
- בהתאם להגדרה / המטרה ניסיון, להמשיך עם צעדים נוספים:
- חישוב אחוזי הכדאיות של תאים על הפיגום באמצעות עקומת סטנדרט. תן עקום סטנדרט בודד בנפרד עבור כל קו תא בשימוש.
- לנתח צמיחת תאים / התפשטות ידי אומדן גידול יחסי ההמרה resazurin ברחבי זמן הטיפוח. בחישוב זה, להגדירהמרת resazurin ביום 1 כנקודת התייחסות. טרי להכין הפתרון עובד resazurin עבור סוג זה של ניתוח. יתר על כן, פעמי דגירה צריכות להיות שווה בין המידות השונות.
- חזור על הפרוטוקול כולו מדידת המרת resazurin לפחות שלוש פעמים כדי לקבל תוצאות עקביות.
8. Live-מת מכתים
- פלייט תאי SCP1 על הפיגום עם צפיפות זריעה של 50,000 תאים / פיגום ולאפשר לו לגדול על פיגום שמירה על תנאי תרבית תאים הסטנדרטיים (עיין בפרוטוקול 1 ו -2).
- לאחר 24-48 שעות לחלוטין לשאוב את המדיום תרבות מתאי SCP-1 וזורקים אותו לתוך מיכל פסולת.
- שוטף את תאי SCP-1 פעם עם DPBS כדי להסיר תאים מנותקים. הוסף 500 μl DPBS לכל טוב של צלחת בתרבית רקמה 24 היטב דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הכתם SCP-1 fluorophores אלקטרוני (כל שלושה כתמים בעת ובעונה אחת):
- מעכשיולשמור על הפיגומים בחושך כדי להגן על הלבנת fluorophores מאור היום!
- גדר זמן דגירה 30 דקות על מנת לאפשר חלוקה שווה לאורך הפיגום. אם העברת לפיגומים אחרים, לוודא כדי לייעל את זמני דגירה כדי להתאים את מאפייני פיגום פרט (גודל נקבובי, עומק פיגום, וכו ').
- כדי לזהות תאים קיימא על הפיגום, להכתים את התאים עם AM calcein בריכוז סופי של 2 מיקרומטר (במדיום תרבות).
- על מנת לזהות את כל התאים על הפיגום, להכתים את התאים עם Hoechst 33342 בריכוז סופי של 0.002 מיקרוגרם / μl (במדיום תרבות).
- כדי לזהות תאים מתים, דגירה הפיגום עם homodimer ethidium בריכוז סופי של 4 מיקרומטר (במדיום תרבות).
- לאחר זמן הדגירה, לשטוף את התאים 3 פעמים עם DPBS (1 מ"ל לכל טוב) עבור כל 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- מיד לצלםים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- צלמו תמונות של calcein (תאים חיים) עם GFP LED קוביה / מערכת סינון (עירור ופליטה באורך גל של 470/22 ננומטר 510/42 ננומטר, בהתאמה). לחלופין לבחור עירור נאות אורך גל פליטה בעזרת הצופה רפאי הקרינה. Calcein יש עירור לשיאה ב 488 ננומטר ופליטה לשיאה ב 507 ננומטר. הערה: ודא שלא להשתמש בתאי transfected GFP מכתים קרינה עם Calcein או כתמי ניאון ירוקים אחרים.
- צלמו תמונות של Hoechst 33342 עם מסנן / קוביית LED DAPI להגדיר עם גל עירור של ננומטר 357/44 ו אורך גל הפליטה של ננומטר 447/60. לחלופין לבחור עירור הנאות אורך גל פליטה בעזרת הצופה רפאי הקרינה. Hoechst 33342 יש עירור לשיאו 347 ננומטר ופליטה לשיאו 483 ננומטר.
- צלמו תמונות של homodimer ethidium עם סט קוביית LED RFP / מסנן (עירור o אורך גל הפליטהf 531/40 ננומטר 593/40 ננומטר, בהתאמה). לחלופין לבחור עירור הנאות אורך גל פליטה בעזרת הצופה רפאי הקרינה. יש Ethidium homodimer עירור לשיאה ב 530 ננומטר ופליטה שלה לשיא 618 ננומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאות ראשוניות הראו כי שתל גרעין הרומן תאר לא רק יש תכונות דעיכה טובות אבל גם הוא ביולוגי עם תאי SCP-1. במהלך תהליך הייצור של השתל, הוא בא במגע עם חומרים קורוזיביים ורעילים חזקים (סיכה, עוקצני, פתרון ליטוש אלקטרו). בעזרת טכניקות מכתימות פלורסנט עקיפים הצלחנו לדמיין זיהומים נותרים וכתוצאה מכך לייעל פרוטוקול ניקוי מראה ירידה משמעותית עומס חומר על הפיגום. איור 3 מראה את היעילות של פרוטוקול ניקוי הוקם.
ההצלחה של שתלים משמשים לטיפול מפרק נקבע על ידי אירועים המתרחשים בבית ממשק התא-חומר. איור 4 מראה התאים המצורפת על הפיגום לאחר 24 שעות של ציפוי, כמתואר בסעיף בפרוטוקול 6. משמעותי טרנסיעילות fection של תאי SCP-1 נצפתה ככל שיכולנו תמונת דפוס הצמיחה של תאים מבשרים סטרומה mesenchymal על הפיגום (עיין באיור 2). להדמיה ישירה מאשרת את biocompatibility של הפיגום וגם מתאר את דפוס ההיענות על משטח הפיגום (איור 4). מכתים קרינה ניתן לעשות עוד לבחון אינטראקצית תא עם והפצה על משטח הפיגום.
Fluorophores יושמו בהצלחה על מנת לבחון מוות של תאים ושגשוגם על פני תקופה של זמן על הפיגום. תמונות חיות-מת-מכתים מדגימים כיצד מכתים יכול להתבצע בהצלחה על הפיגום כדי לאשר את הכדאיות אחוזים של תאים על פני תקופה של זמן. איור 6 מראה מכתים גרעיני כחול (Hoechst 3342) בכל התאים, אדום שכותרתו fluorescently (homodimer ethidium) תאים מתים, וסימון ירוק עבור התאגדות של-AM calcein כמו ma הכדאיתrker. Calcein AM מומר calcein אשר מציג פלואורסצנטי ירוק בהיר בנוכחות יוני סידן בציטופלסמה של התאים. Hoechst 33342 הוא דופן תא חדירה intercalates לתוך ה- DNA התאי. התאים כל דרך זה ייראה גרעינים כחולים (ראה איור 6). Ethidium homodimer אינו דופן התא חדיר, ולכן יהיה רק intercalate לתוך ה- DNA של תאים מתים. בדרך זו, תאים מתים נראים גרעינים אדומים. יתר על כן, כדאיות התא ומקפלים הגידול במספר תאים על הפיגום יותר משבוע היה לכמת ידי resazurin assay המרה מיוצג (איור 7).
איור 1: תא לספור עם hemocytometer (א) התקנה של הרכבה קאמרית.. (ב) איור של תאי הספירה; 4 x 4 תא ספירה משמש עבור cou תאNT. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. יעילות transfection GFP תאים SCP1 מפגינים פלואורסצנטי ירוק חזק המעיד על יעילות transfection חיובית-GFP- המודעה. סרגל קנה מידה = 1,000 מיקרומטר, גדלת 4X. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: Sulforhodamine B מכתים ללכוד דימויים שליליים (א) פיגום לפני הניקוי.. החץ מצביע על נוכחות של חומרים רעילים / מאכל על הפיגום. (פיגום B) לאחר פרוטוקול הניקוי. סרגל קנה מידה = 1,000 מיקרומטר, גדלת 4X. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:. דפוס דבקות של תאי SCP1 על פיגום אות ה- GFP מציין דבקות תא דפוס צמיחה על פני השטח של פיגום טיטניום הסרוג. סרגל קנה מידה = 1,000 מיקרומטר, גדלת 4X. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: Co-קרינת צביעת תאים על פיגום (.
איור 7: assay מרת Resazurin (א) צמצום תגובה ביוכימיים של צבע חיזור (resazurin) לתוך מוצר סופי (resorufin) אשר פולט קרינה עובר שינויי colorimetric.. (ב) פעילות מיטוכונדריאלי נמדדה כאשר תאים היו מצופות על פיגום צפיפות 0.75 מ"ג / cm³. הנתונים נאספו באמצעות fluorescence מכשיר המדידה מבוסס. עוצמת הקרינה ב 590 ננומטר (ציר y) בנקודות זמן מוגדרים (ציר x) מתוארת כתוצאת מדידת כדאי תא כמותית (אקס = 540 ננומטר, Em = 590 ננומטר). המובהקות הסטטיסטיות נקבעו באמצעות שתי way ANOVA ואת סטיית התקן של הממוצע (SEM) מוצג בתור סרגל שגיאות. בהתחשב בתכונות הפיזיות הפיגום, למשל, גודל נקבובי תכונות מכאניות (למשל, תכונת דעיכה) יחד, 0.75 מ"ג / פיגום צפיפות cm³ שמש לאפיון biocompatibility. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| רכיבי מדיה | ריכוז |
| התקשורת בסל αMEM (%) | 90 |
| סרום (%) | 10 |
| פן / סטרפטוקוקוס (%) | 1 |
טבלה 1: תא התרבות (αMEM) הרכב מדיה.
| בְּעָיָה | גורם | פִּתָרוֹן |
| הדמית כדאי תא על פיגום שאינו שקוף | הפיגום מונע חדירת אור השמש לתוך ללא עיוות | השתמש בטכניקת הדמיה המבוססת fluorophore להערכת תא. |
| התערבות של עוצמת הקרינה | קרינה אוטומטית, אות רקע | שימו לב fluorophores ולהשתמש המתאים בהתבסס על מאפייני פיגום בפרט. |
| הערכת כדאיות התא על פיגום על פני תקופה תרבות | Rמדידות epeated על פני תקופה ארוכה | Transfect התאים עם חלקיקי וירוס ad-GFP. |
| הערכה פונקציונלית נייד על פיגום שאינו שקוף | טכניקת דימות פלואורסצנטי מאפשרת תא רק מתפשט ניתוח דפוס. | בצע resazurin assay המרה (מדידת כדאיות התא כמותי) בצירוף עם טכניקת הדמיה. |
טבלה 2: טבלת סיכום: פתרון בעיות הדמית כדאי תא על פיגום שאינו שקוף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
משטח הפיגום ממלא תפקיד חשוב באינטראקציה שלו עם רקמה סובבת in vivo ובכך לקבוע שתלים עמידים פונקציונלי. לפיכך, התאימות ביו של הפיגום היא למדה על ידי מבחנים במבחנה באמצעות תאים (קו תא SCP1), כאשר מצופים על הפיגומים.
שיטות מיקרוסקופיה המתפקדות היטב עם פיגומים דקים ושקופים אופטי מתאימות גרוע עבור פיגומים שאינם שקופים ללמוד את biocompatibility. הסיבה העיקרית לכך היא הפיגומים הלא שקוף למנוע חדירת אור השמש לתוך ללא עיוות משמעותי 15. כדי בחלקו להתגבר על בעיות אלה אנו בזאת להקים שיטה להערכת תא על / פיגומי טיטניום עשה סרוגים באמצעות fluorophores השונה.
על מנת לאפשר סריגה ואחריו מתקפלים של חוטי טיטניום, החומר בא במגע עם חומרים קורוזיביים ורעילים חזקים (סיכה, עוקצני, אלקטרו-polishing פתרון), אשר עשוי לשנות את biocompatibility של הפיגום אם עקבות להישאר / על הפיגום. בעזרת פרוטוקול עקיף קרינה מפותחת (הפרוטוקול 5) נוכל לדמיין את מבנה הפיגום. יתר על כן, מאפייני פיגום, למשל, עובי החומר, את הגודל הנקבובי פרט וצורה, או צפיפות החיבור, נותחו באמצעות ImageJ. תמונת מוגדלות גבוהה epifluorescence מיקרוסקופי מותר לדמיין זיהומי הפיגום כמו גם על פני שטח הפיגום. איור 3B ובכך מייצג את התוצאה המאשרת של פרוטוקול הניקוי פתח בהצלחה. העיקרון של פרוטוקול מכתים עקיף זה ניתן לשחזר בקלות פיגומים שאינם שקופים אחרים, תוך התחשבות במאפייני פיגום הפרט, למשל, גודל נקבובי ודיפוזיה מקבילה אשר משפיע על זמן הדגירה. כמו כן, פלואורסצנציה אוטומטית של גדרות הפיגום מיקרוסקופי המשפיעה על בחירת fluorophores בשימוש. הצופה רפאי קרינת כלי המקוון יכול לעזור לבחור את fluorophores הנאותה.
אינטראקצית תא-מתכת נבדקת בעקיפין על ידי ניתוח דפוס ההיענות של תאים על הפיגום. פרוטוקול 6 מתאר את המתודולוגיה של איך ניתן לנטר תאים במבחנה אם מצופה על פיגומים שאינם שקופים במערכות התרבות באמצעות אסטרטגיה transfection GFP. בהתבסס על תוצאות ראשוניות של מבחני חוץ גופייה, זה כבר חזה כי מאפייני המשטח כמו רכב, מייקרו-טופוגרפיה וחספוס 16 עשויים לשחק תפקיד חשוב בביסוס דבקות והפצת תאי יעד. טיטניום להיות ביולוגי ולכן עשוי להיות פועל כתבנית מצע לספק בסיס עבור התקשרות תא (ראה איור 4).
טופוגרפית משטח שתל דווחה להשפיע תא התנהגות 16. במחקר הנוכחי, ניתחנו את צמיחת תאים /הפץ ואת כדאיות שימוש בטכניקות מכתימות קרינה בשילוב עם מדידות כדאיות כמותית. ניתוח חשף וריאציה עדינה כדאי תא אחוז והפצה תלוי בחומר הפיגום. עם זאת, הפונקציונליות תא להעריך כמותית על ידי assay המרה resazurin (פעילות המיטוכונדריה), לא הושפעו באופן משמעותי את חומר הפיגום. מדידת פעילות המיטוכונדריה ידי המרה resazurin יש יתרון כי הוא אינו לתא רעילים ובכך ניתן לבצע שוב ושוב על פני תקופה ארוכה התרבות. יש טיפול מיוחד שיש לנקוט בעת שטיפה את הפתרון עובד שיורית resazurin, אם אפשר לא לצבור אות רקע (תוצאות חיוביות כוזבות). למרות יתרונות אלה, assay מרת resazurin לא נותן שום מידע על התא מתפשט על הפיגום. התאים הנגועים GFP ומכאן ניתן לעקוב על פני תקופה ארוכה תרבות (אות ה- GFP נשאר קבוע במשך 14 ימים), ובכך שהיא מאפשרת לדמיין יםדפוס הצמיחה pecific על משטח הפיגום. ויזואליזציה של תאים עמוקים בתוך הפיגום עדיין מוגבלת על ידי חומר הפיגום וכך תדרוש דיסקציה של השתל. השילוב של שתי הטכניקות הללו יש את היתרון העיקרי שהוא יכול בקלות להיות מועבר סוגי תאים אחרים, בהתחשב בכך זמן דגירה עלול צריך להיות מותאם לסוג תא העניין. עם זאת, טיפול צריך להילקח בעת ההעברה בשיטה זו כדי פיגומים שאינם שקופים אחרים, למשל, קולגן מבוסס פיגומים אשר בדרך כלל מפגין 17 אוטומטי פלואורסצנטי ירוק חזק. במקרה זה תגי פלורסנט אחרים עשויים לשמש. השילוב של שתי השיטות הנ"ל כאמור ולכן יש מספר יתרונות (ראו טבלה 2).
מאפייני פיגום, למשל, נקבוביים תאי מלכודת העצמה גודל בתוך הפיגום. אם לא מזין מספיק מסופקים, תאים אלה עלולים למות ומפרישי פרוטאזות המשפיעים כדאי תא של סראונדing / רקמות תאים. הצלחנו להסתגל פרוטוקול מכתים מבוסס ניאון כי הוא מסוגל לדמיין תאי חיים ומתים פנימה על פיגום טיטניום הסרוג. בדומה פרוטוקול מכתים קרינה העקיף, עיקרון פרוטוקול מכתים זה יכול בקלות להיות מועבר פיגומים שאינם שקופים אחרים. תוך כדי כך, את מאפייני פיגום הפרט, למשל, גודל נקבובי דיפוזיה המקבילה וכן אוטומטית-קרינה אפשרית, הגדרה מיקרוסקופית צריכות להילקח בחשבון גם הם עשויים להשפיע על זמן הדגירה והבחירה של fluorophores בשימוש. הנה, שוב לצופת רפאי קרינת כלי המקוונת יכול לעזור לבחור את fluorophores הנאותה.
לסיכום, במבחנת תוצאות מחקר מראים כי מודל שתל גרעין טיטניום סרוגים המוצע יש פרופיל ביולוגי. מצורף ראשונית של תאים מבשר סטרומה mesenchymal (SCP-1 תאים) על חומר זה מצביע על כך מאטריה שתל טיטניום סגסוגת זוl היא ביולוגית. למרות שאנו לא נתחנו עמותת פרמטרים טופוגרפיים שונים, שינוי פני שטח פיגום עשוי להגביר התפשטות הדבקות תאים, כמו גם בידול 18. התאמה מיטבית בין הפיגום ותאי להעלות את ההסתברות של שילוב השתל טוב יותר אל הרקמות המקיפות אותם ולכן שיפור בתוחלת החיים vivo לאחר הטיפול 19. באמצעות הגדרת הבדיקה כאמור לעיל פותחת את האפשרות למדוד ולדמיין שיפורים בביצועים הביולוגי של הפיגום המושרה על ידי שינויים משטח. ההעדפה של פיגומים עם משטח ביו על עיצובים השתל ללא שינוי מצביע על ביצועים טובים יותר 20 במונחים של אינטגרציה osteo-chondrogenic. מחקר זה הוא עוד יותר משופר על ידי דיווחים אחרים על שתל טיטניום הסרוג שבו רכוש הפעילות הביולוגי המכאניים שלה דווחו 6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים. אף חלק של העבודה כבר או בטיפולה לפרסום או פורסם במקומות אחרים.
Acknowledgments
הפרויקט ממומן בחלקו על ידי Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand (צים) des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie -KF3010902AJ4. דמי הפרסום כבר מכוסה על ידי בית החולים טראומה BG טובינגן, גרמניה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/24/48 well plates, T25/ T75 culture flask | Greiner Bio-One GmbH | * | |
| * 24 well plates | Greiner Bio-One GmbH | CELLSTAR 662 160 | |
| * 48 well plates | Corning Incorporated USA | 3548 | |
| * 6 well plates | Falcon | 353046 | |
| * T25 | Greiner Bio-One GmbH | 690 175 | |
| * T75 | Greiner Bio-One GmbH | 658 175 | |
| Acetic acid, purum ≥ 99.0% | Carl Roth | 3738.4 | |
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 | |
| Axioplan-2 | Carl Zeiss, Germany | ||
| Biological safety cabinets | Thermo Scientific | safe 2020 | |
| Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) | Sigma | 17783 | |
| Cell Culture Incubtator | Binder, Tuttlingen, Germany | 9040-0078 | |
| Filter unit (0.22 µm) | Millipore, IRL | SLGP033RS | |
| Centrifuges 5810 R And 5417 R | Thermo Fisher Scientific, NY | Megafuge 40R | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Carl Roth | 4720.2 | |
| Dulbecco’s PBS without Ca & Mg | Sigma | H15-002 | |
| Ethanol 99% | SAV liquid prod. GmBH | 475956 | |
| Ethidium homodimer | Sigma | 46043 | |
| EVOS Fluorescence imaging system | Life technologies | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, PA, USA | ||
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533-100MG | |
| Knitted titanium nucleus implant | Buck co & KG,Germany | ||
| MEM Alpha Modification with Glutamine w/o nucleoside | Sigma | E15-832 | |
| Omega microplate Reader | BMG Labtech,Germany | FLUOstar Omega | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P11-010 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma | 199303-1G | |
| Sulforhodamine B sodium salt | Sigma | S1402-1G | |
| Test tube rotator | Labinco B.V.,The Netherlands | Model LD-76 | |
| TRIS (hydroxymethyl) aminomethan | Carl Roth | AE15.1 | |
| Triton | Carl Roth | 3051.2 | |
| Trypan Blue 0.5% | Carl Roth | CN76.1 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma | L11-004 |
References
- Bridwell, K. H., Anderson, P. A., Boden, S. D., Vaccaro, A. R., Wang, J. C. What's new in spine surgery. J Bone Joint Surg Am. 95, 1144-1150 (2013).
- Adams, M. A., Dolan, P. Intervertebral disc degeneration: evidence for two distinct phenotypes. J Anat. 221, 497-506 (2012).
- Schizas, C., Kulik, G., Kosmopoulos, V. Disc degeneration: current surgical options. Eur Cell Mater. 20, 306-315 (2010).
- Lewis, G. Nucleus pulposus replacement and regeneration/repair technologies: present status and future prospects. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 1702-1720 (2012).
- Cunningham, B. W. Basic scientific considerations in total disc arthroplasty. Spine J. 4, 219-230 (2004).
- Implant for surgical use in humans or vertebrates. US8728164 B2. Google Patents. Buck, A. E., Kaps, H. -P. , (2014).
- Kettler, A., Kaps, H. P., Haegele, B., Wilke, H. J. Biomechanical behavior of a new nucleus prosthesis made of knitted titanium filaments. SAS J. 1, 125-130 (2007).
- Nerurkar, N. L., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria for intervertebral disc tissue engineering. J Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
- Elias, C. N., Lima, J. H. C., Valiev, R., Meyers, M. A. Biomedical applications of titanium and its alloys. JOM. 60, 46-49 (2008).
- Hallab, N., Link, H. D., McAfee, P. C. Biomaterial optimization in total disc arthroplasty. Spine (Phila Pa 1976). 28, 139-152 (2003).
- Gustafsdottir, S. M. Multiplex cytological profiling assay to measure diverse cellular states. PLoS One. 8, e80999 (2013).
- Bocker, W., et al. Introducing a single-cell-derived human mesenchymal stem cell line expressing hTERT after lentiviral gene transfer. J Cell Mol Med. 12, 1347-1359 (2008).
- Ehnert, S., et al. Transforming growth factor beta1 inhibits bone morphogenic protein (BMP)-2 and BMP-7 signaling via upregulation of Ski-related novel protein N (SnoN): possible mechanism for the failure of BMP therapy. BMC Med. 10, 101 (2012).
- Morgan, S. P., Rose, F. R., Matcher, S. J. Optical Techniques in Regenerative Medicine. , CRC Press. (2013).
- Vielreicher, M., et al. Taking a deep look: modern microscopy technologies to optimize the design and functionality of biocompatible scaffolds for tissue engineering in regenerative medicine. J R Soc Interface. 10, 20130263 (2013).
- Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18, 1573-1583 (1997).
- Niu, G., et al. Fluorescent imaging of endothelial cells in bioengineered blood vessels: the impact of crosslinking of the scaffold. J Tissue Eng Regen Med. , (2014).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur Spine J. 17, Suppl 4 467-479 (2008).
- Navarro, M., Michiardi, A., Castano, O., Planell, J. A. Biomaterials in orthopaedics. J R Soc Interface. 5, 1137-1158 (2008).
- Priyadarshani, P., Li, Y., Yao, L. Advances in biological therapy for nucleus pulposus regeneration. Osteoarthritis Cartilage. , (2015).
- Thermofisher Fluorescence Spectraviewer. , Source: https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html (2016).
