Summary
Burada bir şeffaf olmayan titanyum iskele üzerinde hücre canlılığını tespit etmek yanı sıra iskele yabancı maddelerin Glimpses tespit etmek için bir fluorofor tabanlı görüntüleme tekniği sunuyoruz. Bu protokol, saydam olmayan iskeleler üzerine hücre-hücre ya da hücre-metal etkileşimleri görüntüleme dezavantajına giderir.
Introduction
Kronik sırt ağrısı çok faktörlü bir hastalıktır. dejeneratif disk hastalığı için minimal invaziv bir tedavi seçeneği olarak ilgi 1950'lerden beri büyüdü. Bugün, omurganın çoklu segmental füzyon en yaygın kullanılan tedavi kadar. Bu yana, bu yöntem genellikle etkilenen segmentin 1,2 hareketliliği sınırlamalar yol açar, artroplasti dönemin keşif geniş bir ilgi oldu. Toplam disk değiştirme ve çekirdek yerine önemli gelişmeler kronik bel ağrısı 1 tedavi etmek için iyi bir alternatif haline gelmiştir. Büyük gelişmelere rağmen, yöntemlerin hiçbiri klinik değerlendirilmiştir. Daha az sert çekirdek implantlar, toplam disk değiştirme için umut verici bir alternatifi temsil anulus fibrosus 3,4 bozulmamış olması koşuluyla. Ancak, şu anda piyasada mevcut çekirdek implantlar genellikle vertebral cismin, çıkık, disk ve t dikey yüksekliği kaybına değişiklikleri gibi komplikasyonlar ile ilişkiliGerekli ilişkili mekanik sertliği 5 o eksikliği. Mevcut dezavantajların üstesinden gelmek için, örgü titanyum tellerden oluşan yeni bir çekirdeği implant başarıyla 6 geliştirilmiştir. Nedeniyle eşsiz örme yapısı, bu yeni geliştirilen iskele gibi seçkin biyomekanik özellikleri, sönümleme özelliği, gözenek boyutu, yükleme kapasitesi ve güvenilirlik 7 göstermiştir. Bu yeni çekirdek implantın biyouyumluluk test etmek hedefleyen, implantın şeffaf olmayan doğaya atfedilen (optik) analiz teknikleri ciddi sınırlamalar tasvir.
Biyouyumluluk test etmek için, hücre metali etkileşimi önemli bir rol 8-10 oynar. hücreleri ve iskele arasında bir etkileşim konak sistemi içinde daha iyi implant entegrasyonu için istikrar ve dolayısıyla için gereklidir. Ancak, artan büyümesi derinlik iskele mekanik özelliklerini değiştirebilir. inves hedefleyeniskele yüzey hücre eki, çoğalması ve farklılaşması veya bir temel sağlar olmadığını araştırılmazsa metal hücre canlılığı etkileyip etkilemediğini, bu şeffaf olmayan ve opak iskeleleri / 'üzerinde görüntüleme hücreleri ortak tanınmış sorunu gidermek için önemlidir. Bu sınırlama birkaç floresan üstesinden gelmek için dayalı teknikler incelenmiştir. Şirketler canlı hücreler, hücre bölmeleri, hatta spesifik hücresel devletler 11 görselleştirmek için fluorophores geniş bir ürün yelpazesi sunuyoruz. Bu deney için fluorophores en iyi şekilde floresan mikroskop sığdırmak için online araç spektral izleyici yardımıyla seçildi.
üzerinde hücrelerin izleme sağlamak için osteochondro-projenitör hücrelerin 1) flüoresan (yeşil floresan protein / GFP) etiketleme: şeffaf olmayan örme titanyum iskele üzerine / içine yapışan hücreler davranış analizi için geliştirilmiş stratejisi aşağıdaki kapsar iskele, 2) canlılığını ölçen (mitochondrial aktivite) hücreleri, ve 3) görselleştirme hücre-hücre ve iskele içinde hücre materyal etkileşimleri. Prosedür kolayca diğer yapışık hücreler ve diğer non-saydam veya opak iskele aktarılabilir avantajına sahiptir. Ayrıca, canlılık ve içe büyüme paterni birkaç gün içinde izlenebilir, bu nedenle iskele malzemesi veya hücrelerin sınırlı bir miktarda kullanılabilir.
Bu çalışmada hücre canlılığı ölçmek ve şeffaf olmayan örme titanyum iskele / 'üzerinde osteochondro-progenitör hücrelerin in-büyüme modeli görselleştirmek için mevcut protokol başarılı kullanımını gösterir. Ayrıca, geliştirilen protokoller iskele kirleri belirlemek ve temizlik protokolleri kontrol etmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: ölümsüzleştirilmiş insan mezenkimal stromal ön-madde hücreleri (SCP-1 hücreleri) deneyleri için kullanılmıştır. SCP-1 hücreleri, Dr. Matthias Schieker 12 tarafından temin edilmiştir.
SCP-1 hücrelerinin 1. Genişleme
- Önceki SCP-1 hücreleri ile çalışan, düzgün% 70 etanol (v / v), eldiven ile çalışma alanını (belirlenen biyogüvenlik kabini I) temizleyin.
- Temizlenmiş biyo-güvenlik kabini, Tablo 1 'de gösterildiği gibi gerekli bileşenlerin karıştırılması ile hücre kültür ortamında uygun bir hacmi hazırlar. Bazal ortamın sterilliğinin muhafaza etmek için, 0.22 um bir gözenek boyutuna sahip steril filtrelerden geçirilerek takviyesi ekleyin.
- , Bulaşmayı önlemek kullanımdan önce orta en az 24 saat hazırlamak. 37 ° C,% 5 CO2,% 20 O2 ve% 90 nem: kendi sterilite test etmek için, standart hücre kültürü inkübatöründe hücreleri olmadan bir hücre kültürü plakasında 1 mi ortam inkübe edilir. Sonra24 saat, orta mikroskobik en az 200X büyütme kullanarak kontrol edin.
- 37 ° C,% 5 CO2,% 20 O2 ve% 90 nem oranı: Destekleyici koşulu ile, standart hücre kültürü kuluçka makinesi içinde SCP-1 hücreleri korumak.
- onlar% 80-90 confluency ulaşana kadar bakım ve genişletme için SCP-1 hücreleri büyür. Bu süre kültürü sırasında, her 2-3 günde bir orta değiştirin. (Gösterildiği gibi) deneyler için genişleme veya plaka için bir sonraki geçit: (2 oranı genel olarak 1)% 80-90 confluency ulaştıktan sonra, SCP-1 hücreleri bölme.
- SCP-1 hücreleri bölme için, 37 ° C 'de kültür ortamı ısınmaya bırakılmış ve 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu kullanılarak tripsin / EDTA çözülme.
- Tamamen% 80-90 konfluent hücrelerin kültür ortamı aspire ve bir atık kabı içine atın.
- (Dulbecco fosfat, magnezyum ve kalsiyum olmayan pH 7.2 tamponlu tuz), DPBS ile en az iki kez hücreleri yıkayın.
- uygun bir hacimde Pipethücreler üzerine DPBS (T75 kültür şişelerinde 5 ml DPBS ve T175 kültür şişelerinde 12 ml) eklenmiştir.
- Aspire DPBS dikkatli ve bir atık kabı içine atın.
- hücreler üzerine% 0.25 tripsin / EDTA, uygun bir hacim (bir T175 kültür şişesi için T75 kültür şişelerinde 1 mi DPBS ve 2 ml) pipetle ve 5 standart hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de 5-10 dakika süreyle inkübe % CO2,% 20 O2 ve% 90 nem.
- gemi dokunarak hücreleri çıkarmak ve tüm hücreler mikroskop altında yüzen hücreleri gözlemleyerek kültür plastikten (trypsinization) ayrılmış olduğundan emin olun.
- kültür ortamında 10 ml eklenerek tripsin reaksiyon etkisiz hale getirirler. tekrarlanan pipetleme dikkatlice orta tripsin ve hücreleri karıştırın.
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 600 x g'de bir reaksiyon tüpü ve santrifüj içine hücre süspansiyonu aktarın.
- Süpernatantı aspire ve 10 ml kültür hücre peletorta.
- protokol 2'de tarif edildiği gibi Tripan Mavisi dışlama yöntemi ile hücre sayımı.
- Deneysel tasarımına bağlı olarak hücrelerin Tohum.
SCP-1 hücreleri, 2. Sayım
- Hemasitometre kullanılarak yeniden süspansiyon haline getirildi bir hücre canlı hücre sayısı (tripan mavisiyle çıkarma metodu) uygulayın.
- hücre sayımı öncesinde, musluk suyu kullanarak hemasitometre temizleyin. Havsız doku kullanılarak hemositometre bileşenlerini kurutun. cam kapak nemlendirilmesi ve sayım alanının her iki tarafında iki cam koşucular üzerine ters olarak basarak birleştirin. Newton halkaları cam koşucular (Şekil 1) görülen olduğundan emin olun.
- yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler 10 ul ve en fazla 2 arasında bir seyreltme faktörü elde etmek için,% 0.1 tripan mavi çözelti 10 ul ile karıştırın.
- Yük önceden temizlenmiş ve monte hemositometre odasının toplam numune 10 ul.
- Canlı (beyaz / şeffaf hücreler) ve ölü sayısını(mavi çekirdekleri) 4x4 meydanlarda hücreleri (Şekil 1B bakınız).
- verilen formüle, aşağıdaki hücrelerin toplam sayısı hesaplanır:
SCP-1 hücreleri, 3. GFP transfeksiyonu
Not: ve yeşil flüoresan proteini (GFP) ve hücreleri işaretlenmiş belli bir kültür dönemi boyunca örme titanyum yapı iskelesi SCP-1 hücre gelişimini gözlemek amacıyla. GFP aşırı ekspresyonu GFP kodlayan adenovirüs partikülleri ile enfeksiyon ile elde edilmektedir. Yeşil floresan proteini (GFP) kodlayan çoğaltma yetersiz (-E1 / -E3) adenovirüs partikülleri SCP-1 hücrelerini enfekte etmek için kullanıldı. Virüs parçacıkları rekombinant adenovirüs (Ad5-GFP) transfekte HEK293T hücreleri (Biyolojik Güvenlik Laboratuarı II) kültürü üst katmanını toplama ile Dr. Steven Dooley 13 elde edildi. Üç tekrarlanan donma (-80 ° C) ve erime (su banyosu 37 ° C) döngüleri Resim HE sağlamıştırK293T hücreleri yeni virüs parçacıkları üretmek için canlı kalır. etkili bir şekilde yeni virüs partikülleri üretmeden SCP-1 hücreleri enfekte edebilir bu adenovirüs tohum stok kullanma. Bu nedenle, enfekte olmuş hücreler, bir Biogüvenlik Lab l'de işlenebilir
- Kültür ortamı içinde 50,000 hücre / ml bir çekirdek yoğunluğu olan hedef hücreleri (SCP-1 hücreleri) yeniden süspanse edin. 6-çukurlu doku kültürü plakasına oyuk başına Pipet 2 mi.
- standart hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edilir; SCP-1 hücreleri kadar% 5 CO2,% 20 O2 ve% 90 nem,% 70-80'lik bir birleşik duruma ulaştılar.
NOT: confluency hücre tohumlama yoğunluğuna bağlıdır. Yukarıda belirtilen koşullar için SCP-1 hücreleri 1.5-2 gün içinde% 70-80'lik bir confluency ulaşır. - Kültür ortamı kültür ortamının 1 ml'si başına adenovirüs tohum stokundan 100 ul aspire olmayan% 70-80 konfluansa, en.
- her bir virüs se virüs partiküllerinin miktarına bağlı olarak konsantrasyon aralığı belirlemeked hamur hazırlama. Enfeksiyon verimi çok düşük olduğu durumda, saflaştırmak ve çeşitli ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak virüs partikülleri konsantre edilir.
- 37 ° C'de (% 5 CO2,% 20 O2 ve% 90 nem) standart hücre kültürü inkübatöründe bir saat süreyle inkübe edin.
- Virüs tohum stoğu içeren kültür ortamı çıkarın ve bertarafı için toplamak. doldurmak için bir 6-yuvalı kültür-plakası kaynağı başına taze kültür ortamı 2 ml ilave edilir.
- atmadan önce, orta içeren virüs parçacık otoklava olduğundan emin olun.
- hücre içi GFP (enfeksiyon verimliliği) bir GFP LED küp / filtre seti ile bir floresan mikroskop kullanılarak enfeksiyondan 24 saat sonra değerlendirin.
- Hücre morfolojisi (Şekil 2) dikkat edin. kültür plastik ayırma Hücreler yanlış pozitif sonuçlar verebilir.
Örme Titanyum iskelelerinin 4. Temizlik
- P50 ml'lik bir reaksiyon tüpüne 5 iskeleleri kadar katmaktadır.
- Rotor koşulları (8 xg) kullanılarak, oda sıcaklığında, 20 dakika süre ile 30 ml saf-iyonu giderilmiş su ile iskelesi (6-7 mm kalınlıkta) ile üç kez yıkanır.
- 30 mi% 1 damıtık iyonu giderilmiş su yerine-Triton X-100 çözeltisi (ağ / hac) (damıtılmış-iyonu giderilmiş su içinde çözülmüş) ve daha sonra, rotor koşulları kullanılarak, oda sıcaklığında, 20 dakika için bir kere iskeleleri yıkama (8 x g) .
- İki kez damıtılmış-deiyonize su, 30 ml ile yıkanır, Triton-X-100 çözeltisi (oda sıcaklığında her biri 5 dakika) muhafaza rotor koşullarında (8 x g) atın.
- damıtılmış-iyonu giderilmiş su yerine. ultrasonik bir banyoda reaktif dereceli% 99 aseton,% 99 izopropanol ve 2 x 5 dakika süreyle% 99 etanol (30 mL) ekstrakte edildi her biri iskeleleri sekans durulayın (~ 50 Hz, 50 W, 220-240 V).
- ultrasonik banyoda sabit tutarak, 5 dakika boyunca 30 ml saf-iyonu giderilmiş su ile tekrar üç kez yıkayın.
- scaffo yerleştirinsırayla tüy bırakmayan bir doku üzerinde lds oda sıcaklığında kuru bir gecede havalandırmak için.
- 15 psi, 121 ° C'de 15 dakika boyunca iskele otoklava.
- protokolünde 5 açıklandığı gibi dolaylı floresan temizleme protokolünü onaylayın.
Dolaylı Floresan 5. Görüntüleme İskele Yapıları
NOT: Bu protokol 565/586 nm eski / em dalga boyunda parlak kırmızı floresan veren fluorofor sülforhodamin B kullanılarak dolaylı floresan iskele yapılarının görüntüleme açıklar. Ancak, fluorofor verilen mikroskop ayarları veya iskele olası otomatik floresan için daha iyi oturması için değiştirilebilir.
- ışıktan korunarak oda sıcaklığında% 1 asetik asit ve mağaza sülforhodamin B boyama çözeltisi (% 0.04) hazırlayın.
- 24 oyuklu doku kültürü plakası almak ve ins yerleştirerek sülforhodamin B boyama çözeltisi 500 ul temizliği iskele daldırıniyi kullanarak forseps ide.
- floresan mikroskop kullanılarak iskele olumsuz görüntüler yakalayın.
- 531/40 nm bir eksitasyon dalga boyu ve 593/40 nm'lik bir emisyon dalga boyunda ayarlanmış bir RFP LED küp / filtre ile resim al. Alternatif floresan spektral görüntüleyici 20 yardımıyla yeterli uyarma ve emisyon dalga boyu seçin. Sülforhodamin B 578 nm dalga boyunda zirveye uyarma ve 593 nm'de zirve emisyon vardır.
- Iskele yapısının görselleştirmek için, düşük büyütmede, örneğin, 4X veya 10X (Şekil 3) fotoğraf çekmek. Bu resimlerde kullanan, örneğin özellikleri, gözenek boyutunu belirlemek ve ImageJ yardımıyla şekil.
- Iskele kirleri tespit etmek amacıyla, bu analiz derinliği sınırlar dikkate alınarak, örneğin, yüksek büyütme oranlarında 20x veya 40x fotoğraf çekmek. Partiküller / maddeler görmedim ki kir emin olun (temsilci sonuçları görmek; ŞekŞekil 3).
6. İn Vitro Biouyumluluk Tahlili
- Bir su banyosu içinde 37 ° C 'de kültür ortamı önceden ısıtın.
- 24 oyuklu doku kültürü plakası almak ve forseps kullanılarak, iyi aseptik her test temizlenmiş ve sterilize iskeleleri yerleştirin. Önceden temizlenmiş Biyogüvenlik kabini I altında çalışmak!
- Skafoldun içindeki havayı yok etmek için, yaklaşık 15 dakika boyunca (24 oyuklu doku kültürü plakası, oyuk başına 500 ul) için bir kültür ortamı ile iskeleleri inkübe / bekletin.
- Bu arada, kültür ortamı, 1 ml 500.000 Ad-GFP ile enfekte edilmiş SCP1 tekrar süspansiyon hücreleri.
- iskele Islatma 15 dakika sonra, iskele kapalı tamamen orta aspire.
- iskele üzerinde hücrelerin ekim için dikkatlice yüzeye (24 plaka yerleştirilir) iskele üzerinde hücre süspansiyonu 100 ul dağıtmak. hücrelerin ekim sırasında, bu yüzden hiçbir ortam o akar sağlamak için hücre süspansiyonu minimum hacmi korumakiskele ut.
- Standart bir hücre kültürü inkübatöründe (% 5 CO2,% 20 O2 ve% 90 nem) 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca inkübe hücreleri.
- 500 ul daha fazla kültür ortamı ilave edin ve standart hücre kültürü inkübatöründe 24 saat (37 ° C,% 5 CO2,% 20 O2 ve% 90 nem) inkübe edilir.
- Bir floresan mikroskop kullanılarak iskele yüzeyinde yayılan hücre yapışma desen ve hücre değerlendirin.
- 470/22 nm bir eksitasyon dalga boyu ve 510/42 nm'lik bir emisyon dalga boyunda ayarlanmış bir GFP LED küp / filtre ile resim al. Alternatif floresan spektral izleyici yardımıyla yeterli uyarma ve emisyon dalga boyu seçin. GFP 488 nm'de zirveye uyarma ve 507 nm'de zirve emisyon vardır.
- Düşük büyütmede, örneğin, 4X ya da 10X (Şekil 4) hücre yapışma model resimleri yakalama görselleştirmek için. Daha yüksek mag yayılan hücre gözlemlemek amacıylanification (en azından 100X) gereklidir - Odak derinliği sınırlayan.
- Ayrıca iskele yüzeyinde yayılan hücreyi değerlendirmek için,% 4 formalin ile hücreleri düzeltmek ve geleneksel hücresel yapıların floresan boyanması, örneğin, aktin filamentler (Phalloidin) devam edin. Bununla birlikte, tek tek iskele özelliklerini, örneğin yayılma süreleri veya otomatik floresans 14 uyması için inkübasyon sürelerini ve antikor flüoresan etiketleme uyum sağlar.
- Bir sonraki gün, yapışmayan hücreler çıkarıldı kültür ortamı olarak değiştirin.
- Protokol 7 de tarif edildiği gibi, dönüşüm ölçümü resazurin göre iskele yapışık hücre yüzdesini hesaplayın.
Şekil 5: in vitro deney Zaman (A) hücreleri kaplama için deneysel kurulum.. (B bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
7. Resazurin Dönüşüm ölçümü
NOT: Resazurin dönüşüm deneyi mitokondriyal aktiviteyi ölçmek için kullanılan ve bu nedenle dolaylı olarak hücre çoğalmasıdır. Resorufine Resazurin redüksiyon canlı hücre sayısı (Şekil 7A) ile ilişkili mitokondriyal aktivite dayanan bir flüoresan sinyal üretir.
- Tamamen SCP-1 hücrelerinden kültür ortamı aspire ve bir atık kabı içine atın.
- müstakil hücreleri çıkarmak için DPBS ile bir kez SCP-1 hücreleri yıkayın. iskele SCP-1 hücreleri ihtiva eden 24 oyuklu doku kültür plakasının her bir oyuğuna 500 ul DPBS ekleyin.
- Gerekli am hücreleri KapakSteril resazurin hazır çözelti (kültür ortamı içinde% 0.25 resazurin) ve Miktarı, 30 dakika boyunca standart hücre kültürü inkübatöründe (% 5 CO2,% 20 O2 ve% 90 nem) 37 ° C de inkübe edilir.
- Bu not edin; Kuluçka süresi, hücre tipi, hücre yoğunluğuna bağlıdır. Bu, 10 dakika ile 6 saat arasında değişebilir. SCP-1 hücreleri için optimize edilmiş inkübasyon süresi 30 dakikadır.
- Bir arka plan kontrolü olarak, aynı (% 5 CO2,% 20 O2 ve% 90 nem) standart hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edilir, en azından bir tane de resazurin çözelti ile ancak hücrelerin olmaksızın zaman miktarı.
- Aktarım 100 ul 96 mikro plakasına 24 oyuklu doku kültür plakasının her bir oyuktan süpernatan durumunu.
- Kalıntı resazurin çalışma çözeltisi fazlasının alınması amacıyla, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1 ml DPBS kalan hücreler üç kez yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra kültür ortamı, t eklemeO SCP-1 hücreleri ile implant (24 oyuklu doku kültürü plakası, oyuk başına 500 ul) ve standart hücre kültür inkübatörü (% 5 CO2,% 20 O2 ve% 90 nem) 37 ° C 'de inkübasyon devam daha fazla zaman ders ölçümleri için.
- pipetleme hataları en aza indirmek için bu aşama (2-4) de çoğaltır kurmak için emin olun.
- Bu arada, mikroplaka okuyucu içine 96-mikro plaka koyun ve oluşan resorufine floresan ölçmek.
- Arka plan sinyali azaltmak için, 545 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu ve 585 nm'lik bir emisyon dalga boyunda floresan ölçer.
- Alternatif floresan spektral izleyici yardımıyla yeterli uyarma ve emisyon dalga boyu seçin. Resorufm 572 nm dalga boyunda zirveye uyarma ve 585 nm'de zirve emisyon vardır. Verilen sinyal yoğunluğu 25 ayrı okumaları (kuyu başına 25 yanıp söner) bir ortalamasıdır.
- flor ölçünkıvamlandırılmış ortam içinde oluşturulan resorufine arasında Escence, bir alt optik kullanarak.
- kazanç dönüştürülür ve 10 ile 4000 arasında değişebilir resazurin ortalama miktarına bağlıdır, bir yere not edin. flüoresan sinyal (bu durumda 20,000) tespit maksimum sinyal yoğunluğu% 80 altında olduğu şekilde, bir Resorufin standart eğri pipetleme kullanılan tek tek mikroplaka okuyucuya kazanç ayarlama. SCP-1 hücreleri için optimize edilmiş kazanç 800.
- test numunelerinin sinyalinden (hücreler olmadan çalışma çözümü resazurin) arka plan sinyali çıkarın.
- deney düzeneği / amacına bağlı olarak, daha ileri adımlar ile devam edin:
- bir standart eğri kullanılarak iskele üzerinde hücrelerin canlılığı yüzdesini hesaplayın. kullanılan her bir hücre hattı için ayrı ayrı bağımsız bir standart eğri sağlayın.
- yetiştirme süresi boyunca resazurin dönüşüm nispi bir artış tahmin edilerek hücre büyümesi / çoğalmasını analiz edin. Bu hesaplama için, setreferans olarak günde 1 resazurin dönüşüm. Taze bu tür bir analiz için resazurin çalışma solüsyon hazırlanır. Ayrıca, kuluçka süreleri farklı ölçümler arasındaki eşit olmak zorunda.
- tutarlı sonuçlar elde etmek için en az üç kez resazurin dönüşüm ölçümü tüm protokol tekrarlayın.
8. Canlı ölü Boyama
- 50,000 hücre / iskele bir çekirdek yoğunluğuna sahip bir platform üzerinde SCP1 hücreler plaka ve standart hücre kültür koşulları tutarak bir platform üzerinde büyümesine izin (protokol 1'e bakınız ve 2).
- 24-48 sonra saat tamamen SCP-1 hücrelerinden kültür ortamı aspire ve bir atık kabı içine atın.
- müstakil hücreleri çıkarmak için DPBS ile bir kez SCP-1 hücreleri yıkayın. 24 oyuklu doku kültür plakasının her bir oyuğuna 500 ul DPBS ilave edilir ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir.
- Leke SCP-1 kullanarak fluorophores (aynı anda üç lekeler):
- Şu andan itibarengün ışığından fluorophores ağartma korumak için karanlıkta iskeleleri tutmak!
- iskele boyunca eşit bir dağılım sağlamak için 30 dakika için bir kuluçka süresi ayarlayın. Diğer iskeleleri transfer olursa, bireysel iskele özellikleri (gözenek boyutu, iskele derinliği, vb) sığdırmak için kuluçka süreleri optimize etmek için emin olun.
- , Bir platform üzerinde canlı hücreler tespit (kültür ortamında) 2 uM nihai konsantrasyonda kalsein AM hücreleri boyamak için.
- iskele tüm hücrelerin tespit etmek için, (kültür ortamı içinde) 0.002 mg / ml bir son konsantrasyonda Hoechst 33342 hücreleri leke.
- Ölü hücrelerin tespit etmek için, (kültür ortamında) 4 uM'lik bir son konsantrasyonda etidyum homodimer olan iskele inkübe edin.
- İnkübasyon süresinden sonra, oda sıcaklığında her biri 5 dakika için hücreler DPBS ile 3 kez (her 1 mi) yıkayın.
- Hemen fotoğraf çekmekBir floresan mikroskop kullanarak s.
- (Sırasıyla, 470/22 nm ve 510/42 nm eksitasyon ve emisyon dalga boyu) bir GFP LED küp / filtre seti ile kalsein resimlerini (canlı hücreler) alın. Alternatif floresan spektral izleyici yardımıyla yeterli bir uyarım ve emisyon dalga boyu seçin. Calcein 488 nm'de zirveye uyarma ve 507 nm dalga boyunda zirveye emisyon vardır. Not: Calcein veya diğer yeşil floresan lekeleri ile floresan boyama GFP transfekte hücreler kullanmamayı emin olun.
- 357/44 nm bir eksitasyon dalga boyu ve 447/60 nm'lik bir emisyon dalga boyunda ayarlanmış bir DAPI LED küp / filtre ile Hoechst 33342 fotoğraflarını al. Alternatif floresan spektral izleyici yardımıyla yeterli uyarma ve emisyon dalga boyu seçin. Hoechst 33342 347 nm dalga boyunda zirveye uyarma ve 483 nm'de zirve emisyon vardır.
- Bir RFP LED küp / filtre seti (uyarma ve emisyon dalga boyu ile o etidiyum homodimerin resimlerini çekinf 531/40 nm ile 593/40 nm, sırasıyla). Alternatif floresan spektral izleyici yardımıyla yeterli uyarma ve emisyon dalga boyu seçin. Etidyum homodimer 530 nm'de zirveye uyarma ve 618 nm'de zirve emisyon vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ön sonuçlar anlatılan yeni çekirdeği implant, sadece iyi bir sönümleme özelliklerine sahip, ancak, aynı zamanda SCP-1 hücreleri ile biyolojik olarak uyumlu olduğunu göstermiştir. İmplantın üretim işlemi sırasında, güçlü bir aşındırıcı ve zehirli maddeler (yağlama maddesi, mordan, elektro-cilalama çözelti) ile temas eder. Dolaylı floresan boyama teknikleri yardımıyla biz kalan kirleri görselleştirmek ve dolayısıyla iskele üzerinde madde yükü önemli bir azalma gösteren bir temizlik protokolü optimize başardık. 3 kurulan temizlik protokolünün etkinliğini göstermektedir.
Protokol bölümünde 6. trans önemli bir tarif edildiği gibi hücre malzeme arayüzünde yer alan olaylar tarafından belirlenir artroplasti tedavisinde kullanılan implantların başarısı. Şekil 4, kaplama 24 saat sonra iskele üzerinde takılı hücreleri gösterirSCP-1 hücrelerinin Fection VERİMLİLİK iskele (Şekil 2'ye bakınız) görüntü mezenkimal stromal öncü hücrelerin büyüme paterni olabilir gözlemlenmiştir. Doğrudan görselleştirme iskele biyouyumluluk teyit ve ayrıca iskele yüzeyinde yapışma desen (Şekil 4) göstermektedir. Floresan boyama iskele yüzeye yayılması ve hücre etkileşimini incelemek için daha yapılabilir.
Fluorophores başarılı bir platform üzerinde bir süre içinde hücre ölümü ve çoğalması incelemek üzere uygulanmıştır. Canlı-cansız boyama görüntüleri boyama başarıyla bir süre boyunca hücrelerinin yüzde canlılığını onaylamak için iskele yapılabilir nasıl örnek. Tüm hücrelerde 6 mavi nükleer boyanma gösterir (3342 Hoechst) Şekil kırmızı floresan etiketli (etidyum homodimer) ölü hücreler ve canlılığı ma olarak Calcein-AM birleştirmek için yeşil etiketlemerker. Calcein AM hücrelerin sitoplazmasında kalsiyum iyonlarının mevcudiyetinde parlak yeşil flüoresan sergileyen kalsein dönüştürülür. Hoechst 33342 hücresel DNA'ya hücre duvarı geçirgenliği ve intercalates olup. Bu şekilde tüm hücreleri mavi çekirdekleri (Şekil 6 bakınız) gösterecektir. Etidyum homodimer geçirgen hücre duvarı olmayan bu nedenle sadece olacak birleşip ölü hücrelerin DNA'sına. Bu şekilde, ölü hücreler, kırmızı çekirdekleri gösterecektir. Bundan başka, hücre canlılığı ve bir hafta boyunca iskele hücre sayısındaki artış katı dönüşüm deneyi resazurin ile nicelendirildi ve grafik (Şekil 7) ile temsil edilen.
Şekil 1: Hücre bir hemasitometre ile sayma bir oda montaj (A) Kur.. (B) sayma odaları İllüstrasyon; 4 x 4 sayım odasında, bir hücre cou için kullanılannt. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. GFP transfeksiyon verimi SCP1 hücreleri pozitif bir reklam-GFP- transfeksiyon etkinliği gösteren güçlü bir yeşil floresan gösterirler. Ölçek çubuğu = 1,000 mikron, 4X büyütme. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: sülforhodamin B boyama negatif görüntüler yakalama temizlemeden önce (A) İskele.. Ok iskele üzerinde toksik / aşındırıcı maddelerin varlığını gösterir. (Temizlik protokolünden sonra B) İskele. Ölçek çubuğu = 1,000 mikron, 4X büyütme. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. Iskele GFP sinyali SCP1 hücre yapışma modeli örme titanyum iskele yüzeyinde hücre uyumunu ve gelişimini gösterir. Ölçek çubuğu = 1,000 mikron, 4X büyütme. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6: iskele hücrelerinin ko-floresan boyama (.
Şekil 7: Resazurin dönüşüm deneyi fluoresans neşreden ve kolorimetrik değişiklikler yapılmadığı bir son ürün (Resorufin) içine redoks boya (resazurin) (A) Biyokimyasal indirgeme reaksiyonu.. (B) hücreler 0.75 mg / cm yoğunluğu iskele ekildi zaman Mitokondrial aktivitesi ölçülmüştür. Veri fl kullanılarak toplanmıştırtabanlı ölçüm cihazını uorescence. belirli zaman (x-ekseni) 590 nm'de (y-ekseni) fluoresans yoğunluğu niceliksel hücre canlılığı ölçümü (ex = 540 nm, Em = 590 nm) bir sonucu olarak tasvir edilir. İstatistiksel anlamlılık bir hata çubukları olarak gösterilmiştir iki yönlü ANOVA ve ortalamanın standart hatası (SEM) kullanılarak tespit edilmiştir. Iskele fiziksel özellikleri göz önüne alındığında, örneğin, bir arada, 0.75 mg / cm³ yoğunluklu iskele biyouyumluluk karakterizasyonu için kullanılan gözenek boyutu ve mekanik özellikleri (örneğin, sönümleme özelliği). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Medya bileşenleri | konsantrasyon |
| Bazal αMEM ortamı (%) | 90 |
| Serum (%) | 10 |
| Pen / Strep (%) | 1 |
Tablo 1: Hücre kültürü (αMEM) Ortam terkip.
| Sorun | Sebeb olmak | Çözüm |
| Şeffaf olmayan iskele üzerinde hücre canlılığı görüntüleme | İskele bozulma olmadan nüfuz ışık engeller | Hücre değerlendirmesi için fluorofor tabanlı görüntüleme tekniği kullanın. |
| floresan Girişim | Otomatik floresan, arka plan sinyali | fluorophores dikkat edin ve özellikle iskele özelliklerine göre uygun kullanın. |
| bir kültür dönemi boyunca iskele Hücre canlılığı değerlendirmesi | RUzun bir zaman içinde epeated ölçümler | reklam GFP-virüs parçacıkları ile hücreleri transfekte. |
| Saydam olmayan iskele üzerinde hücre işlevselliği değerlendirmesi | Floresan görüntüleme tekniği model analizi yayılan tek hücreyi tanır. | görüntüleme tekniği ile birlikte dönüşüm deneyi (niceliksel hücre canlılığı ölçümü) resazurin gerçekleştirin. |
Tablo 2: Özet tablosu: şeffaf olmayan iskele üzerinde hücre canlılığı görüntüleme giderme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Iskele yüzeyi bu şekilde implantlar, fonksiyonel dayanıklılığı belirlemek in vivo çevreleyen doku ile etkileşimlerinde önemli bir rol oynar. Böylece, yapı iskeletinin biyo-uyumluluk iskeleler üzerine kaplanır hücreler kullanılarak in vitro deneylerde (SCP1 hücre hattı) ile incelenmiştir.
ince ve optik olarak transparan iskeleleri ile iyi işlev mikroskopi teknikleri kötü biyouyumluluk incelemek için şeffaf olmayan iskeleleri için uygundur. Bu saydam olmayan iskeleleri önemli bir bozulma 15 olmadan nüfuz ışık engel başlıca nedeni olduğunu. kısmen bu sorunların üstesinden gelmek için biz bu vesile ile çeşitli fluorophores kullanarak örme titanyum yapılan iskeleleri / 'hücre değerlendirilmesi için bir yöntem oluşturulması.
Titanyum tellerin katlanır ve ardından örgü sağlamak üzere, malzeme güçlü bir aşındırıcı ve zehirli maddeler (yağlama maddesi, mordan, elektrik temasizleri iskele üzerinde / içinde kalırsa iskelenin biyouyumluluk değiştirebilecek çözümü), -polishing. gelişmiş dolaylı-floresan protokolü yardımıyla (Protokol 5) ile biz iskele yapısı görselleştirmek olabilir. Bundan başka, örneğin, iskele özellikleri, malzeme kalınlığı, tek tek delik boyutu ve şekli, veya bağ yoğunluğu, ImageJ kullanılarak analiz edildi. Mikroskobik görüntü iskelesi yanı sıra iskele yüzeyinde kirleri görselleştirme izin Daha yüksek büyütülmüş Epifloresans. Şekil 3b böylece başarıyla geliştirilmiş temizleme protokolü doğrulayıcı sonucunu temsil etmektedir. Bu dolaylı boyama protokolü ilkesi kolayca örneğin, kuluçka süresini etkiler boyutu ve karşılık gelen difüzyon gözenek dikkate bireysel iskele özelliklerini alarak, diğer şeffaf olmayan iskeleleri için çoğaltılabilir. Ayrıca, iskele ve mikroskobik ayarları otomatik floresan fl seçimi etkileruorophores kullanılır. Online araç floresan spektral görüntüleyici yeterli fluorophores seçmek için yardımcı olabilir.
Hücre metal etkileşimi iskele üzerinde hücrelerin bağlılık modelini analiz ederek dolaylı olarak incelenmiştir. Protokol 6 GFP transfeksiyon stratejisi kullanılarak kültür sistemlerinde şeffaf olmayan iskeleler üzerine kaplanmış halinde hücreler, in vitro olarak izlenebilir nasıl bir metodoloji tarif eder. In vitro deneylerinin sonuçlarına dayanarak, ön, tür bileşim, mikro topografya ve pürüzlülüğü 16 gibi yüzey özellikleri yapışmayı oluşturulması ve hedef hücrelerin yayılmasını önemli bir rol oynayabileceğini tahmin edilmiştir. Titanyum bir biomalzemedir böylece hücre eki (Şekil 4 bakınız) için bir temel sağlamak için bir alt tabaka şablon olarak hareket olabilir ediliyor.
İmplant yüzey topografisi hücre davranışını 16 etkilemek için rapor edilmiştir. Bu çalışmada, biz / hücre büyümesini analizyayma ve canlılık kantitatif canlılığı ölçümleri ile birlikte floresan boyama teknikleri kullanılarak. Analiz ince hücre yüzde canlılığı varyasyonu ve iskele materyale bağlı olarak yayılan saptandı. Bununla birlikte, dönüşüm deneyi (mitokondriyal aktivite) resazurin ile kantitatif olarak değerlendirildi hücre fonksiyonu önemli ölçüde iskele malzemesi tarafından etkilenmemiştir. dönüşüm resazurin ile mitokondriyal aktivite ölçümü toksik baz istasyonu gibi bir avantaja sahiptir ve bu nedenle, uzun kültür dönemi boyunca art arda gerçekleştirilebilir. Özel bakım arka plan sinyali (yalancı pozitif sonuç) birikir değil, bu yüzden artık resazurin çalışma solüsyonu kapalı yıkarken alınmalıdır. Bu avantajlara rağmen, resazurin dönüşüm tahlil iskele üzerinde yayılan hücreye herhangi bir bilgi vermez. GFP enfekte hücreler dolayısıyla böylece s görselleştirmek sağlayan, (GFP sinyali 14 gün boyunca sabit kalmıştır) uzun kültür dönemi boyunca izlenebiliriskele yüzeyinde pecific büyüme paterni. derin iskele hücrelerin Görselleştirme hala implantın diseksiyon gerektirir böylece iskele malzemesi ile sınırlıdır ve. Bu iki yöntemin bir kombinasyonu kolayca inkübasyon süresi ilgi hücre tipine adapte edilmesi gerekebilir göz önüne alındığında, diğer hücre tipleri aktarılabilir önemli bir avantaja sahiptir. Ancak, bakım gibi diğer non-saydam iskeleleri, bu yöntemi aktarırken alınmalıdır, kollajen genellikle güçlü bir yeşil oto-floresan 17 sergileyen iskeleleri tabanlı. Bu durumda diğer floresan etiketler kullanılabilir. Yukarıda belirtilen iki yöntem kombinasyonu bu yüzden çeşitli avantajlar (bakınız Tablo 2) sahiptir.
İskele özellikleri, örneğin, iskele içinde boyut kudreti tuzak hücreleri gözenek. yeterli besin sağlanır ise, bu hücreler ölür ve surround hücre canlılığını etkileyen proteazları salgılarlar olabilirhücre / doku ing. Biz ve örme titanyum iskele canlı ve ölü hücreleri görselleştirmek için güçlü bir floresan bazlı boyama protokolü adapte başardık. indirekt floresan boyama protokolüne benzer, bu boyama protokolü ilkesi kolayca diğer şeffaf olmayan iskeleleri transfer edilebilir. Bunu yaparken, bireysel iskele özellikleri, örneğin, gözenek boyutu ve karşılık gelen difüzyon yanı sıra olası oto-floresan, mikroskobik ayar, inkübasyon süresi ve kullanılan fluorophores seçimini etkileyebilir olarak dikkate alınması gerekir. Burada, yine çevrimiçi araç floresan spektral görüntüleyici yeterli fluorophores seçmek için yardımcı olabilir.
Özetle, in vitro sonuçlar Önerilen örgülü titanyum çekirdeği implant modeli, biyolojik bir profile sahip olduğunu göstermektedir. Bu malzeme üzerinde mezenkimal stromal öncü hücrelerin (SCP-1 hücreleri) Başlangıç eki önerir bu titanyum alaşımı implant material biyolojik olarak uyumlu olan. Farklı topografik parametrelerin ilişkisini analiz olmasına rağmen, iskele yüzey modifikasyonu farklılaşma 18 yanı sıra hücre yapışma çoğalmasını artırmak olabilir. Iskele ve hücreler arasındaki optimum uyumluluk çevreleyen dokuya daha iyi implant entegrasyonu olasılığını yükseltmek ve böylece tedavi 19 sonra in vivo uzun ömürlü iyileştirilmesi. Yukarıda belirtilen test kurulumu kullanarak ölçmek ve yüzey modifikasyonları tarafından uyarılan iskele biyolojik performans iyileştirmeleri görselleştirmek imkanı yaratır. Değiştirilmemiş implant tasarımları üzerinde biyoaktif yüzeyi ile iskelelerinin tercih osteo-kondrojenik entegrasyon açısından daha iyi bir performans 20 göstermektedir. Bu çalışma daha da mekanik özellik ve biyo-6,7 bildirilmiştir örme titanyum implant diğer raporlar ile geliştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olduğunu beyan ederim. işin hiçbir bölümü olmuş ya da yayınlanmak üzere göz altında şu anda veya başka bir yerde yayımlandı gelmiştir.
Acknowledgments
Proje kısmen Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand (ZIM) des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie -KF3010902AJ4 tarafından finanse edilmektedir. yayın ücreti BG travma hastane Tübingen, Almanya tarafından kapatılmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/24/48 well plates, T25/ T75 culture flask | Greiner Bio-One GmbH | * | |
| * 24 well plates | Greiner Bio-One GmbH | CELLSTAR 662 160 | |
| * 48 well plates | Corning Incorporated USA | 3548 | |
| * 6 well plates | Falcon | 353046 | |
| * T25 | Greiner Bio-One GmbH | 690 175 | |
| * T75 | Greiner Bio-One GmbH | 658 175 | |
| Acetic acid, purum ≥ 99.0% | Carl Roth | 3738.4 | |
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 | |
| Axioplan-2 | Carl Zeiss, Germany | ||
| Biological safety cabinets | Thermo Scientific | safe 2020 | |
| Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) | Sigma | 17783 | |
| Cell Culture Incubtator | Binder, Tuttlingen, Germany | 9040-0078 | |
| Filter unit (0.22 µm) | Millipore, IRL | SLGP033RS | |
| Centrifuges 5810 R And 5417 R | Thermo Fisher Scientific, NY | Megafuge 40R | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Carl Roth | 4720.2 | |
| Dulbecco’s PBS without Ca & Mg | Sigma | H15-002 | |
| Ethanol 99% | SAV liquid prod. GmBH | 475956 | |
| Ethidium homodimer | Sigma | 46043 | |
| EVOS Fluorescence imaging system | Life technologies | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, PA, USA | ||
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533-100MG | |
| Knitted titanium nucleus implant | Buck co & KG,Germany | ||
| MEM Alpha Modification with Glutamine w/o nucleoside | Sigma | E15-832 | |
| Omega microplate Reader | BMG Labtech,Germany | FLUOstar Omega | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P11-010 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma | 199303-1G | |
| Sulforhodamine B sodium salt | Sigma | S1402-1G | |
| Test tube rotator | Labinco B.V.,The Netherlands | Model LD-76 | |
| TRIS (hydroxymethyl) aminomethan | Carl Roth | AE15.1 | |
| Triton | Carl Roth | 3051.2 | |
| Trypan Blue 0.5% | Carl Roth | CN76.1 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma | L11-004 |
References
- Bridwell, K. H., Anderson, P. A., Boden, S. D., Vaccaro, A. R., Wang, J. C. What's new in spine surgery. J Bone Joint Surg Am. 95, 1144-1150 (2013).
- Adams, M. A., Dolan, P. Intervertebral disc degeneration: evidence for two distinct phenotypes. J Anat. 221, 497-506 (2012).
- Schizas, C., Kulik, G., Kosmopoulos, V. Disc degeneration: current surgical options. Eur Cell Mater. 20, 306-315 (2010).
- Lewis, G. Nucleus pulposus replacement and regeneration/repair technologies: present status and future prospects. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 1702-1720 (2012).
- Cunningham, B. W. Basic scientific considerations in total disc arthroplasty. Spine J. 4, 219-230 (2004).
- Implant for surgical use in humans or vertebrates. US8728164 B2. Google Patents. Buck, A. E., Kaps, H. -P. , (2014).
- Kettler, A., Kaps, H. P., Haegele, B., Wilke, H. J. Biomechanical behavior of a new nucleus prosthesis made of knitted titanium filaments. SAS J. 1, 125-130 (2007).
- Nerurkar, N. L., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria for intervertebral disc tissue engineering. J Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
- Elias, C. N., Lima, J. H. C., Valiev, R., Meyers, M. A. Biomedical applications of titanium and its alloys. JOM. 60, 46-49 (2008).
- Hallab, N., Link, H. D., McAfee, P. C. Biomaterial optimization in total disc arthroplasty. Spine (Phila Pa 1976). 28, 139-152 (2003).
- Gustafsdottir, S. M. Multiplex cytological profiling assay to measure diverse cellular states. PLoS One. 8, e80999 (2013).
- Bocker, W., et al. Introducing a single-cell-derived human mesenchymal stem cell line expressing hTERT after lentiviral gene transfer. J Cell Mol Med. 12, 1347-1359 (2008).
- Ehnert, S., et al. Transforming growth factor beta1 inhibits bone morphogenic protein (BMP)-2 and BMP-7 signaling via upregulation of Ski-related novel protein N (SnoN): possible mechanism for the failure of BMP therapy. BMC Med. 10, 101 (2012).
- Morgan, S. P., Rose, F. R., Matcher, S. J. Optical Techniques in Regenerative Medicine. , CRC Press. (2013).
- Vielreicher, M., et al. Taking a deep look: modern microscopy technologies to optimize the design and functionality of biocompatible scaffolds for tissue engineering in regenerative medicine. J R Soc Interface. 10, 20130263 (2013).
- Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18, 1573-1583 (1997).
- Niu, G., et al. Fluorescent imaging of endothelial cells in bioengineered blood vessels: the impact of crosslinking of the scaffold. J Tissue Eng Regen Med. , (2014).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur Spine J. 17, Suppl 4 467-479 (2008).
- Navarro, M., Michiardi, A., Castano, O., Planell, J. A. Biomaterials in orthopaedics. J R Soc Interface. 5, 1137-1158 (2008).
- Priyadarshani, P., Li, Y., Yao, L. Advances in biological therapy for nucleus pulposus regeneration. Osteoarthritis Cartilage. , (2015).
- Thermofisher Fluorescence Spectraviewer. , Source: https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html (2016).
