Summary
Her presenterer vi en fluorofor basert avbildningsteknikk for å detektere cellenes levedyktighet på en ikke-transparent titan stillaset, så vel som å detektere glimt av stillasurenheter. Denne protokollen feilsøker den ulempe avbildning celle-celle eller celle-interaksjoner metall på ikke-transparente stillasene.
Introduction
Kroniske ryggsmerter er en multifaktoriell sykdom. Interessen for en minimal invasiv behandling for degenerative plate sykdom har vokst siden 1950. Frem til i dag, multisegment fusjon av ryggsøylen er den mest brukte behandling. Siden denne metoden ofte fører til begrensninger i mobiliteten av det berørte segmentet 1,2, utforskning av protesetiden ble en bred interesse. Betydelige fremskritt i total plate erstatning og kjernen erstatning har blitt et godt alternativ til å behandle kroniske ryggsmerter en. Til tross for store fremskritt, har ingen av metodene er klinisk evaluert. De mindre stive nucleus implantater representerer et lovende alternativ til total plate erstatning, forutsatt at ringrommet fibrosus er intakt 3,4. Imidlertid er de for tiden foreliggende nukleus implantater på markedet ofte forbundet med komplikasjoner som forandringer i vertebrale legeme, forvridning, vertikal høyde tap av skiven og than mangel på nødvendige tilhørende mekanisk stivhet 5. For å overvinne de gjeldende ulempene, har en ny kjerne implantat fremstilt av titan strikkede tråder blitt utviklet 6. På grunn av den unike strikket struktur, har denne nyutviklede stillas vist særpregede biomekaniske egenskaper, for eksempel demping funksjon, pore størrelse, lastekapasitet og pålitelighet 7. Tar sikte på å teste biokompatibilitet av denne nye kjernen implantat, avbildet store begrensninger i (optisk) analyseteknikker tilskrives den ikke-transparente natur av implantatet.
For å teste den biokompatibilitet, spiller celle-metall interaksjon en fremtredende rolle 8-10. En interaksjon mellom cellene og stillaset er nødvendig for stabilisering og dermed til bedre implantatet integrering i vertssystemet. Imidlertid kan en økende innvekst dybde forandre de mekaniske egenskaper for stillaset. Sikte på å investigate om stillas overflaten gir et utgangspunkt for celleadhesjon, proliferasjon og differensiering, eller hvorvidt metallet påvirker cellenes levedyktighet, er det viktig å feilsøke den vanlige velkjente problemet med å avbilde celler på / i ikke-transparente og opake stillaser. For å overvinne denne begrensningen flere fluorescerende baserte teknikker ble utforsket. Selskaper tilbyr et stort utvalg av fluorophores å visualisere levende celler, cellular avdelinger, eller til spesifikke cellulære tilstander 11. Fluoroforer for dette eksperimentet ble valgt ved hjelp av den elektroniske verktøyet spektral viewer for å best passe vår fluorescerende mikroskop.
Den utviklede strategi for analyse av adherente celler oppførsel på / i det ikke-gjennomsiktige strikket titan stillaset omfatter følgende: 1) fluoriserende (green fluorescent protein / GFP) merking av de osteochondro-forløperceller til å tillate sporing av cellene på stillas, 2) måle levedyktighet (mitochondrial aktivitet) av cellene, og 3) å visualisere celle-celle og celle-materiale interaksjoner i stillaset. Fremgangsmåten har den fordel at det lett kan overføres til andre adherente celler og andre ikke-transparent eller ugjennomsiktig stillaset. Videre kan levedyktighet og innvekst mønster overvåkes i løpet av flere dager, slik at det kan anvendes med begrensede mengder av stillasmateriale eller celler.
Den foreliggende studien viser vellykket bruk av vår nåværende protokoll for å måle cellenes levedyktighet og visualisere i-vekstmønster av osteochondro-progenitorceller på / i det ikke-gjennomsiktige strikket titan stillaset. Videre kan de industrialiserte protokoller brukes for å bestemme de stillasurenheter og for å kontrollere renseprotokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Udødeliggjort human mesenchymale stromal forløperceller (SCP-1 celler) ble anvendt for eksperimentene. SCP-1 celler ble gitt av professor Matthias Schieker 12.
1. Utvidelse av SCP-1 celler
- Før arbeid med SCP-1 celler, riktig rengjøre arbeidsområdet (betegnet biosikkerhet kabinett jeg) med 70% etanol (v / v) hansker.
- I renset biosikkerhet skapet fremstille et passende volum av cellekulturmediet ved å blande de nødvendige komponenter som angitt i tabell 1. For å opprettholde sterilitet av det basale medium, tilsett tilskudd ved å passere gjennom sterilfilter med en porestørrelse på 0,22 um.
- For å hindre forurensning, forberede medium i minst 24 timer før bruk. For å teste dens sterilitet, inkuber 1 ml medium i en cellekulturplate uten celler i standard cellekulturinkubator: 37 ° C, 5% CO2, 20% O2 og 90% fuktighet. Etter24 timer, sjekk medium mikroskopisk bruke en forstørrelse på minst 200X.
- Opprettholde SCP-1-celler i en standard cellekulturinkubator med støttende tilstand: 37 ° C, 5% CO2, 20% O2 og 90% fuktighet.
- For vedlikehold og utvidelse, dyrke SCP-1 celler før de når 80-90% konfluens. I løpet av denne tidsperioden kultur, endre medium hver 2-3 dager. Ved å nå 80-90% konfluens, delt SCP-1-celler (generelt et 1: 2 forhold) til den neste passasje for utvidelse eller plate for forsøkene (som angitt).
- For å splitte SCP-1-celler, oppvarmes kulturmediet ved 37 ° C og tine trypsin / EDTA ved hjelp av et vannbad ved 37 ° C.
- Aspirer dyrkingsmediet fra 80-90% konfluente celler og kast den inn i en avfallsbeholder.
- Vask cellene i det minste to ganger med DPBS (Dulbeccos Fosfatbufret saltløsning uten magnesium og kalsium, pH 7,2).
- Pipetter en passende volum avDPBS på cellene (5 ml dPBS for en T75 kultur kolbe og 12 ml for en T175 kultur kolbe).
- Aspirer DPBS nøye og kast den i en avfallsbeholder.
- Pipetter en passende volum av 0,25% trypsin / EDTA på cellene (1 ml DPBS til en T75 kulturflaske og 2 ml av en kultur T175-kolbe) og inkuberes i 5-10 minutter ved 37 ° C i standard cellekulturinkubator med 5 % CO2, 20% O2 og 90% fuktighet.
- Løsne cellene ved å trykke på beholderen og sikre at alle cellene er løsrevet fra kulturen plast (trypsinering) ved å observere de flytende cellene under mikroskopet.
- Inaktivere trypsin reaksjonen ved tilsetning av 10 ml av kulturmediet. Bland trypsin, og cellene med mediet omhyggelig ved gjentatt pipettering.
- Overfør cellesuspensjonen til en reaksjonsrøret og sentrifuger ved 600 xg i 10 min ved romtemperatur.
- Aspirer supernatanten og cellepelleten suspenderes i 10 ml kulturmedium.
- Tell cellene ved trypanblått eksklusjon fremgangsmåte som beskrevet i protokoll 2.
- Seed cellene avhengig av eksperimentell design.
2. Opptelling av SCP-1 celler
- Utfør en levedyktig celletall (trypanblått eksklusjon metode) av de resuspenderte celler ved hjelp av en hemocytometer.
- Før celletall, rengjør hemocytometer bruke vann fra springen. Tørk hemocytometer komponenter med en lofri vev. Montere den ved å fukte dekkglass og trykke den omvendt på de to glass løpere på hver side av telleområdet. Sørg for at Newtons ringer blir sett på glass løpere (figur 1).
- Ta 10 ul av de resuspenderte celler og bland med 10 ul av 0,1% trypanblått-løsning for å oppnå en fortynning faktor på to.
- Load 10 mL av det totale utvalget på pre-renset og montert hemocytometer kammeret.
- Tell antall levende (hvit / gjennomsiktige celler) og døde(blå kjerner) cellene på 4x4 rutene (se figur 1B).
- Beregn det totale antall celler etter den gitte formel:
3. GFP Transfeksjon av SCP-1 celler
NB: For å kunne observere SCP-en cellevekst på og inn i det strikkede titan stillas over en viss dyrkningsperiode vi merket cellene med grønt fluorescerende protein (GFP). Overekspresjon av GFP oppnås ved infeksjon med adenovirus partikler som koder for GFP. Replication inhabil (-E1 / -E3) adenovirus partikler som koder for grønt fluorescerende protein (GFP) ble brukt til å infisere SCP-1 celler. Viruspartiklene ble oppnådd fra Prof. Steven Dooley 13 ved å samle kultursupernatant av rekombinant adenovirus (Ad5-GFP) transfekterte celler (HEK293T biosikkerhet lab II). Tre gjentatte fryse (-80 ° C) og opptining (37 ° C i vannbad) sykluser sikres at ingen HEK293T celler forblir levedyktig å produsere nye viruspartikler. Ved hjelp av denne adenovirus frø lager effektivt kan infisere SCP-1 celler uten å produsere nye viruspartikler. Således kan de infiserte celler behandles i et biologisk Lab I.
- Suspender målceller (SCP-1-celler) med et såing tetthet på 50.000 celler / ml i kulturmedium. Pipettes 2 ml per brønn i en 6-brønners vevskulturplate.
- Inkuber ved 37 ° C i standard cellekulturinkubator; 5% CO2, 20% O2 og 90% fuktighet, til SCP-1 cellene når en sammenflytning på 70-80%.
MERK: konfluens avhenger seeding tettheten av cellene. For ovennevnte forhold, SCP-1 celler nå et confluency på 70-80% i 1,5-2 dager. - Ved en sammenflytning på 70-80%, uten å aspirere kulturmediet tilsett 100 ul av adenovirus frø lager per 1 ml kulturmedium.
- Bestemme konsentrasjonsområdet individuelt avhengig av mengden av viruspartikler i hvert virus for seged lager forberedelse. Dersom infeksjonen effektivitet er for lav, rense og konsentrere viruspartikler ved hjelp av forskjellige kommersielt tilgjengelige sett.
- Inkuberes i en time i standard cellekulturinkubator ved 37 ° C (5% CO2, 20% O2 og 90% fuktighet).
- Fjern kultur medium som inneholder viruset frø lager og samle det til disposisjon. Legg ferskt kulturmedium 2 ml per brønn av en 6-godt-kultur-plate for å etterfylle.
- Pass på at før avhending, er viruspartikkel inneholder medium autoklavert.
- Vurdere intracellulære GFP uttrykk (infeksjon effektivitet) 24 timer etter infeksjonen ved hjelp av en fluorescens mikroskop med en GFP LED kube / filtersett.
- Observer celle morfologi (figur 2). Celler løsne fra kultur plast kan gi falske positive resultater.
4. Rengjøring av strikkede Titanium Stillas
- Psnøre opp til 5 stillasene inn i en 50 ml reaksjonsrøret.
- Vask stillaset (6-7 mm tykkelse) tre ganger med 30 ml destillert-avionisert vann i 20 minutter ved romtemperatur, ved bruk av rotor betingelser (8 xg).
- Erstatte det destillerte-deionisert vann med 30 ml 1% (w / v) Triton-X-100 oppløsning (oppløst i destillert-avionisert vann), og deretter vaske stillasene én gang i 20 minutter ved romtemperatur, ved bruk av rotor betingelser (8 xg) .
- Kast Triton-X-100, etterfulgt av vasking med 30 ml destillert avionisert vann-to ganger (5 min hver ved værelsestemperatur) og opprettholdt rotor forholdene (8 xg).
- Sett på destillert-ionisert vann. Skyll stillasene i rekkefølge med reagenskvalitet 99% aceton, 99% isopropanol og 99% etanol (30 ml hver) i 2 x 5 minutter hver i et ultrasonisk bad (~ 50 Hz, 50 W, 220-240 V).
- Vask igjen tre ganger med 30 ml destillert-avionisert vann i 5 minutter, holde ultralydbadet behandling konstant.
- Plasser scaffolds på en klut som ikke loer for å lufttørke over natten ved romtemperatur.
- Autoklavere stillaset i 15 minutter ved 121 ° C med 15 psi.
- Bekreft rengjøringsprotokoll ved indirekte fluorescens som beskrevet i protokollen fem.
5. Imaging Stillas Structures ved indirekte Fluorescence
MERK: Den nåværende protokollen beskriver avbildning av stillaskonstruksjoner ved indirekte fluorescens bruke fluorophore sulforhodamin B som gir en lys rød fluorescens ved en ex / em bølgelengde på 565/586 nm. Imidlertid kan fluorophore endres til bedre passform for gitte mikroskopinnstillinger eller mulig auto-fluorescens av stillaset.
- Klargjør sulforhodamin B fargeløsning (0,04%) i 1% eddiksyre og oppbevares ved romtemperatur med beskyttelse mot lys.
- Ta en 24-brønns vevskultur plate og senk renset stillaset i 500 mL av sulforhodamin B flekker løsning ved å plassere den insIde godt ved hjelp av tang.
- Fang de negative bilder av stillaset med fluorescens mikroskop.
- Ta bilder med et RFP LED kube / filtersett med en eksitasjonsbølgelengde på 531/40 nm og en emisjonsbølgelengde på 593/40 nm. Alternativt kan velge det tilstrekkelig eksitasjon og emisjonsbølgelengden ved hjelp av fluorescens spektral betrakteren 20. Sulforhodamine B har sitt høydepunkt eksitasjon ved 578 nm og sin topp utslipp på 593 nm.
- For å visualisere stillaset struktur, ta bilder ved lavere forstørrelser, f.eks 4X eller 10X (figur 3). Ved hjelp av disse bildene, bestemme egenskaper, f.eks pore størrelse og form ved hjelp av ImageJ.
- For å oppdage stillasurenheter, ta bilder ved høyere forstørrelse, f.eks 20X eller 40X, med tanke på at dette vil begrense analysen dybde. Sørg for at smuss partikler / stoffer er ikke sett (se representative resultater; Figure 3).
6. I Vitro Biokompatibilitet analyse
- Forvarme dyrkningsmediet ved 37 ° C i et vannbad.
- Ta en 24-brønns vevskultur plate og bruke tang, plasserer de rengjorte og steriliserte stillasene i hver testbrønn aseptisk. Arbeid under pre-renset biosikkerhet kabinett jeg!
- Sug / inkuberes stillasene med et dyrkningsmedium for omtrent 15 min (500 ul per brønn av en 24-brønners vevskulturplate), for å fjerne luft fra innsiden av stillaset.
- I mellomtiden, resuspender 500000 Ad-GFP-infiserte SCP1 celler i 1 ml kulturmedium.
- Etter 15 minutter av stillas soaking, aspirer mediet helt av stillaset.
- For utsåing av cellene i stillaset, dispensere 100 ul av cellesuspensjonen forsiktig på stillaset (som er plassert i 24-brønners plate) overflate. Opprettholde et minimum volum av cellesuspensjonen under såing av cellene, slik at for å sikre at ingen mediet strømmer out av stillaset.
- Cellene inkuberes i 30 min ved 37 ° C i standard cellekulturinkubator (5% CO2, 20% O2 og 90% fuktighet).
- Legg 500 mL mer kulturmedium og inkuberes i 24 timer i standard cellekulturinkubator (37 ° C, 5% CO2, 20% O2 og 90% fuktighet).
- Evaluere celle tilslutning mønster og celle spredning på stillaset overflaten ved hjelp av et fluorescens mikroskop.
- Ta bilder med et GFP LED kube / filtersett med en eksitasjonsbølgelengde på 470/22 nm og en emisjonsbølgelengde på 510/42 nm. Alternativt kan velge det tilstrekkelig eksitasjon og emisjonsbølgelengden ved hjelp av fluorescens spektral betrakteren. GFP har sitt høydepunkt eksitasjon ved 488 nm og sin topp utslipp på 507 nm.
- For å visualisere celle etterlevelse mønster ta bilder ved lavere forstørrelser, f.eks 4X eller 10X (figur 4). For å kunne observere celle spre en høyere magnification (minst 100X) er nødvendig - å begrense fokusdybde.
- For ytterligere å vurdere celle spredning på stillaset overflaten, fikse cellene med 4% formalin og fortsette med vanlig fluorescens farging av cellulære strukturer, f.eks aktin filamenter (Phalloidin). Men tilpasse inkubasjonstider og fluorescerende merking av antistoffer for å passe de individuelle stillas egenskaper, for eksempel diffusjon ganger eller auto-fluorescens 14.
- Den neste dag, endrer kulturmediet for å fjerne ikke-adherente celler.
- Beregn prosentandelen av heftende celler på stillaset ved Resazurin konvertering måling som beskrevet i protokollen 7.
Figur 5: Timeline av in vitro-analysen (A) Eksperimentell oppsett for plating celler.. (B Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
7. Resazurin Conversion måling
MERK: Resazurin omdannelse analysen anvendes for å måle den mitokondrielle aktivitet, og således indirekte celleproliferasjon. Resazurin reduksjon til resorufin genererer et fluorescerende signal, som er basert på den mitokondrielle aktivitet forbundet med levedyktige celler (figur 7A).
- Aspirer dyrkingsmediet fra SCP-1-celler og kaste den inn i en avfallsbeholder.
- Vask SCP-1 celler gang med DPBS å fjerne frittliggende celler. Legg 500 ul DPBS pr brønn på 24-brønners vevkulturplate inneholdende SCP-1-celler på stillaset.
- Dekk cellene med en nødvendig amount steril resazurin arbeidsløsning (0,25% resazurin i kulturmedium) og inkuberes ved 37 ° C i standard cellekulturinkubator (5% CO2, 20% O2 og 90% fuktighet) i 30 minutter.
- Lag et notat som; Inkubasjonstiden er avhengig av celletype og celletetthet. Det kan variere mellom 10 minutter og 6 timer. Optimalisert inkubasjonstid for SCP-1-celler er 30 min.
- Som en bakgrunnskontroll, inkluderer minst en brønn med resazurin arbeidsoppløsningen, men uten celler, som blir inkubert ved 37 ° C i standard cellekulturinkubator (5% CO2, 20% O2 og 90% fuktighet) for den samme mengde tid.
- Overfør 100 ul avkjølte supernatant fra hver brønn av 24-brønners vevskulturplate inn i en 96-mikrobrønnplate.
- Vask de gjenværende cellene tre ganger med 1 ml DPBS i 5 min ved romtemperatur for å fjerne gjenværende resazurin arbeidsløsning. Etter den tredje vaske legge kulturmedium to implantater med SCP-1-celler (500 ul per brønn av 24-brønners vevkulturplate) og fortsette inkubering ved 37 ° C i standard cellekulturinkubator (5% CO2, 20% O2 og 90% fuktighet) for ytterligere tidskurs målinger.
- Sørg for å sette opp gjentak på dette trinnet (2-4) for å minimere pipettering feil.
- I mellomtiden plasseres 96-mikrobrønnplate inn i mikroplateavleser og måle fluorescensen av det dannede resorufin.
- For å redusere bakgrunnssignalet, måle fluorescens ved en eksitasjonsbølgelengde på 545 nm og en emisjonsbølgelengde på 585 nm.
- Alternativt kan velge det tilstrekkelig eksitasjon og emisjonsbølgelengden ved hjelp av fluorescens spektral betrakteren. Resorufin har sitt høydepunkt eksitasjon ved 572 nm og sin topp utslipp på 585 nm. Den gitt signal intensitet er et gjennomsnitt av 25 individuelle målinger (25 blinker per brønn).
- Mål fluorescence av dannet resorufin i kondisjonert medium, ved hjelp av en bunn optikk.
- Lag et notat at gevinsten avhenger av den gjennomsnittlige mengden av resazurin konvertert og kan variere mellom 10 og 4000. Justere forsterkningen til de enkelte mikroplateleser som brukes ved å pipettere en resorufin standardkurve, slik at det fluorescente signalet er under 80% av den maksimale signalintensitet påvises (i dette tilfelle 20 000). Den optimaliserte gevinst for SCP-1 celler er 800.
- Trekke fra bakgrunnssignalet (resazurin arbeidsløsning uten celler) fra signalet for testprøvene.
- Avhengig av eksperimentelle oppsettet / formål, fortsette med ytterligere skritt:
- Beregn prosentandelen av levedyktigheten av cellene på stillaset ved hjelp av en standardkurve. Gjør et individ standardkurve separat for hver cellelinje som brukes.
- Analyser cellevekst / proliferasjon ved å estimere den relative økningen i resazurin omdannelse i løpet av kultiveringen tid. For denne beregningen, settResazurin konvertering på dag 1 som referanse. Ferskt fremstille resazurin arbeidsoppløsningen for denne type analyse. Videre inkubasjonstider må være lik mellom de ulike målingene.
- Gjenta hele protokollkonvertering av resazurin måling minst tre ganger for å få konsistente resultater.
8. Levende-dead Farging
- Plate SCP1 cellene på stillaset med en seeding tetthet på 50.000 celler / stillas og la den vokse på stillaset holde celledyrkningsforholdene standard (se protokoll 1 og 2).
- Etter 24-48 timers fullstendig Aspirer dyrkningsmediet fra SCP-1-celler og kaste den inn i en avfallsbeholder.
- Vask SCP-1 celler gang med DPBS å fjerne frittliggende celler. Tilsett 500 ul DPBS per brønn av 24-brønners vevkulturplate og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
- Stain SCP-1 bruker fluorophores (alle tre flekker på samme tid):
- Fra nå avholde stillasene i mørke for å beskytte den fluoroforer bleke fra dagslys!
- Angi en inkubasjonstid på 30 min for å tillate jevn fordeling i hele stillaset. Dersom overføring til andre stillaser, sørg for å optimalisere inkubasjonstider å passe den enkelte stillas egenskaper (pore størrelse, stillas dybde, etc.).
- For å påvise levedyktige celler på stillaset, flekke cellene med calcein AM ved en endelig konsentrasjon på 2 uM (i kulturmedium).
- For å påvise alle celler på stillaset, flekke cellene med Hoechst 33342 til en sluttkonsentrasjon på 0,002 ug / ul (i kulturmedium).
- For å oppdage døde celler, inkuber stillaset med etidium homodimer ved en sluttkonsentrasjon på 4 pM (i dyrkningsmediet).
- Etter inkubasjonstiden, vaskes cellene 3 ganger med DPBS (1 ml pr brønn) til hver 5 min ved romtemperatur.
- Umiddelbart ta bildes ved hjelp av et fluorescens mikroskop.
- Ta bilder av calcein (levende celler) med en GFP LED kube / filtersett (eksitasjon og emisjon bølgelengde på 470/22 nm og 510/42 nm, henholdsvis). Alternativt kan velge en tilstrekkelig eksitasjon og emisjonsbølgelengden ved hjelp av fluorescens spektral betrakteren. Calcein har sitt høydepunkt eksitasjon ved 488 nm og sin topp utslipp på 507 nm. MERK: Pass på å ikke bruke GFP transfekterte celler for fluorescens farging med Calcein eller andre grønne fluorescerende flekker.
- Ta bilder av Hoechst 33342 med en DAPI LED kube / filtersett med en eksitasjon bølgelengde på 357/44 nm og en emisjon bølgelengde på 447/60 nm. Alternativt kan velge det tilstrekkelig eksitasjon og emisjonsbølgelengden ved hjelp av fluorescens spektral betrakteren. Hoechst 33342 har sitt høydepunkt eksitasjon ved 347 nm og sin topp utslipp på 483 nm.
- Ta bilder av ethidium homodimer med en RFP LED kube / filtersett (eksitasjon og emisjon bølgelengde of 531/40 nm og 593/40 nm, henholdsvis). Alternativt kan velge det tilstrekkelig eksitasjon og emisjonsbølgelengden ved hjelp av fluorescens spektral betrakteren. Ethidium homodimer har sitt høydepunkt eksitasjon ved 530 nm og sin topp utslipp på 618 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Foreløpige resultater viste at den beskrevne nye kjernen implantatet ikke bare har gode dempe funksjoner, men også er biokompatibelt med SCP-1-celler. Under produksjonsprosessen av implantatet, den kommer i kontakt med sterke etsende og giftige stoffer (smøremiddel, mordant, elektro-polering løsning). Med hjelp av indirekte fluorescerende fargeteknikker var vi i stand til å visualisere de resterende urenheter og dermed optimalisere en renseprotokoll som viser signifikant reduksjon i substans belastning på stillaset. Figur 3 viser effektiviteten av etablerte renseprotokoll.
Suksessen av implantater som brukes til protese behandling bestemmes av hendelser som finner sted i basismaterialet grensesnitt. Figur 4 viser at cellene festet på stillaset etter 24 timer med platekledning, som er beskrevet i protokollen seksjonen 6. En vesentlig transsjon effektivitet av SCP-1-celler ble observert som vi kunne bilde vekstmønster av mesenchymale stromal forløperceller i stillaset (se figur 2). Direkte visualisering bekrefter biokompatibilitet av stillaset, og viser også vedheftningen mønster på stillaset overflate (figur 4). Fluorescens-farging kan gjøres for ytterligere å undersøke celleinteraksjon med og sprer seg på stillaset overflaten.
Fluoroforer ble med hell anvendt for å undersøke celledød og proliferasjon i løpet av en periode på stillaset. Lever-dead-farvebilder eksempler på hvordan flekker kan med hell utføres i stillaset, for å bekrefte den prosent levedyktigheten av celler i løpet av en tidsperiode. Figur 6 viser blå nukleær farging (Hoechst 3342) i alle celler, red fluorescensmerket (etidium homodimer) døde celler, og grønn merking for inkorporering av calcein-AM som levedyktighet marker. Calcein AM omdannes til calcein som utviser en lys grønn fluorescens i nærvær av kalsiumioner i cytoplasma av cellene. Hoechst 33342 er celleveggen permeabel og skytes inn i det cellulære DNA. På denne måten kan alle cellene viser blå kjerner (se figur 6). Etidium homodimer er ikke celleveggen permeabel, slik at det vil bare intercalate i DNA av døde celler. På denne måten vil døde celler viser røde kjerner. Videre ble cellenes levedyktighet og fold økning i celleantall på stillaset i løpet av en uke kvantifisert ved Resazurin omdannelse analyse og representert grafisk (figur 7).
Figur 1: Celle telle med en hemocytometer (A) Oppsett av et kammer montering.. (B) Illustrasjon av tellekamre; 4 x 4 tellekammer brukes for en celle count. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. GFP transfeksjon effektivitet SCP1 celler viser en sterk grønn fluorescens indikerer positiv ad-GFP- transfeksjon effektivitet. Scale bar = 1000 mikrometer, 4X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Sulforhodamine B flekker negative bilder fangst (A) Stillas før rengjøring.. Arrow indikerer tilstedeværelse av giftige / etsende stoffer på stillaset. (B) Stillas etter rengjøring protokollen. Scale bar = 1000 mikrometer, 4X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 4: Ved å følge mønsteret av SCP1 celler på stillaset GFP signal indikerer cellene skulle vedhefte og vekstmønster på overflaten av den strikkede titan stillaset. Scale bar = 1000 mikrometer, 4X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Co-fluorescens farging av celler på stillas (.
Figur 7: Resazurin omdannelse assay (A) Biokjemisk reduksjonsreaksjon av redoks-fargestoff (resazurin) inn i et sluttprodukt (resorufin) som emitterer fluorescens, og gjennomgår kolorimetriske endringer.. (B) Mitokondriell aktivitet ble målt når cellene ble sådd ut på 0,75 mg / cm³ tetthet stillaset. Data ble samlet inn ved hjelp fluorescence basert måleinstrument. Fluorescensintensiteten ved 590 nm (y-akse) ved definerte tidspunkter (x-akse) er avbildet som et resultat av kvantitativ måling av cellelevedyktighet (Ex = 540 nm, Em = 590 nm). Den statistiske signifikans ble bestemt ved bruk Toveis ANOVA og standard feil av gjennomsnittet (SEM) vises som en feilfelt. Vurderer stillas fysiske egenskaper, for eksempel, pore størrelse og mekaniske egenskaper (f.eks dempefunksjon) sammen, ble 0,75 mg / cm³ tetthet stillas brukes for biokompatibilitet karakterisering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| medie~~POS=TRUNC komponenter | Konsentrasjon |
| Basal aMEM media (%) | 90 |
| Serum (%) | 10 |
| Pen / Strep (%) | 1 |
Tabell 1: Cellekultur (aMEM) Media sammensetning.
| Problem | Årsaken | Løsning |
| Celleviabilitet bildebehandling på ikke-transparent stillas | Stillas hindrer lys i å trenge inn uten forvrengning | Bruk fluorophore basert avbildningsteknikk for celle vurdering. |
| Forstyrrelse av fluorescens intensitet | Auto fluorescens, bakgrunnssignal | Vær oppmerksom på fluorophores og bruke egnet basert på bestemte stillas egenskaper. |
| Celleviabilitet vurdering på stillaset over en kultur periode | Repeated målinger over lang tid | Transfektere cellene med ad-GFP-viruspartikler. |
| Cell funksjonalitet vurdering på ikke-transparent stillas | Fluorescens avbildningsteknikk tillater bare celle spredning mønster analyse. | Utføre resazurin omdannelse assay (kvantitativt celleviabilitet måling) i en kombinasjon med avbildningsteknikk. |
Tabell 2: Oppsummering tabell: feilsøking cellen levedyktighet bildebehandling på ikke-transparent stillaset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stillaset flate spiller en viktig rolle i dets interaksjon med omkringliggende vev in vivo for derved å bestemme implantater funksjonell holdbarhet. Således er bio-forenlighet av stillaset studert ved in vitro-analyser ved anvendelse av celler (SCP1 cellelinje), når belagt på stillasene.
Mikroskopi teknikker som fungerer godt med tynne og optisk transparente stillaser er dårlig egnet for ikke-gjennomsiktige stillasene for å studere biokompatibilitet. Dette er hovedsakelig fordi de ikke-gjennomsiktige stillaser hindre lys i å trenge uten betydelig forvrengning 15. For delvis å overvinne disse problemene vi herved etablere en metode for celle vurdering på / i strikket titan gjort stillasene ved hjelp av ulike fluorophores.
For å muliggjøre strikking, etterfulgt av folding av titantråder, kommer materialet i kontakt med sterke korrosive og giftige stoffer (smøremiddel, mordant, elektro-polishing løsning), som kan forandre den biokompatibilitet av stillaset hvis spor igjen i / på stillaset. Med hjelp av et utviklet indirekte fluorescens-protokoll (Protokoll 5) kunne visualisere Stillaskonstruksjon. Videre stillas egenskaper, f.eks materialtykkelsen, den enkelte pore størrelse og form, eller binde tetthet, ble analysert ved hjelp av ImageJ. En høyere forstørret epifluorescens mikroskopisk bilde tillates å visualisere urenheter i stillaset, samt på stillaset overflaten. Figur 3b representerer således den bekreftende resultat av vellykket utviklet renseprotokoll. Prinsippet for denne indirekte farging protokollen kan lett kopieres til andre ikke-transparent stillas, tatt i betraktning de enkelte stillas egenskaper, for eksempel, pore størrelse og tilsvarende diffusjon som påvirker inkubasjonstid. Også, auto-fluorescens av stillaset og mikroskopiske innstillinger påvirker valg av fluorophores brukt. Den elektroniske verktøy fluorescens spektral betrakteren kan bidra til å velge de adekvate fluorophores.
Celle-metall-interaksjonen har blitt undersøkt indirekte ved å analysere tilslutning mønster av celler på stillaset. Protokoll 6 beskriver metoder for hvordan celler kan måles in vitro hvis belagt på ikke-transparente stillas i kultursystemer ved hjelp av en GFP transfeksjon strategi. Basert på foreløpige resultater fra in vitro analyser, er det blitt forutsagt at overflateegenskaper slik som blanding, mikro-ruhet topografi og 16 kan spille en viktig rolle i å etablere tilslutning og spredning av målceller. Titan som et biomateriale således kan virke som et substrat mal for å gi basen for cellebinding (se figur 4).
Implantatet overflatetopografi er blitt rapportert å påvirke celle-adferd 16. I den foreliggende undersøkelse, analyserte vi cellevekst /spredning og levedyktighet ved hjelp av fluorescens fargeteknikker i kombinasjon med kvantitative målinger levedyktighet. Analyse viste subtile variasjoner i celle prosent levedyktigheten og sprer seg, avhengig av stillasmaterialet. Imidlertid cellefunksjonalitet måles kvantitativt ved Resazurin omdannelse assay (mitokondriell aktivitet), var ikke signifikant påvirket av stillaset materiale. Målingen av mitokondriell aktivitet ved omdannelse resazurin har den fordel at det ikke er giftig cellen og således kan utføres gjentatte ganger over en lang periode kultur. Spesielle hensyn må tas når du vasker av rest resazurin arbeidsløsning, så å ikke akkumulere bakgrunn signal (falske positive resultater). Til tross for disse fordelene, vil resazurin konverteringen analysen ikke gi noen informasjon om celle spredning på stillaset. GFP-infiserte celler dermed kan spores over en lang periode kultur (GFP signal var konstant i mer enn 14 dager), og dermed muliggjør å visualisere specific vekst mønster på stillaset overflaten. Visualisering av celler dypere i stillaset er fortsatt begrenset av stillaset materiale og således vil kreve disseksjon av implantatet. Kombinasjonen av disse to teknikkene har den store fordel at det lett kan overføres til andre celletyper, med tanke på at inkubasjonstiden kanskje må være tilpasset den celletype av interesse. Imidlertid har omsorg for å bli tatt når du overfører denne metoden til andre ikke-gjennomsiktige stillaser, f.eks kollagen basert stillaser som generelt utviser en sterk grønn auto-fluorescens 17. I dette tilfelle andre fluorescerende koder kan brukes. Kombinasjonen av ovennevnte to fremgangsmåter har derfor flere fordeler (se tabell 2).
Stillas egenskaper, for eksempel porestørrelse kanskje felle celler inne i stillaset. Hvis ikke nok næringsstoffer er levert, kan disse cellene dør og skiller proteaser som påvirker cellelevedyktigheten til surrounding celler / vev. Vi var i stand til å tilpasse seg et fluorescerende basert flekker protokoll som er i stand til å visualisere levende og døde celler i og på strikket titan stillaset. I likhet med den indirekte fluorescens farging protokollen, kan prinsippet for denne fargingen protokollen være lett overføres til andre ikke-transparente stillasene. Mens de gjør det, er de enkelte stillas egenskaper, for eksempel, porestørrelse og tilsvarende diffusjon så godt som mulig auto-fluorescens, mikroskopisk innstilling må tas i betraktning som de kan påvirke inkubasjonstiden og valg av fluoroforer anvendt. Her, igjen elektroniske verktøyet fluorescens spektral betrakteren kan bidra til å velge de adekvate fluorophores.
I sammendrag, in vitro-resultater indikerer at den foreslåtte strikket titankjernen implantat modellen har en biologisk profil. Initial feste av mesenchymale stromal forloperceller (SCP-1 celler) på dette materialet tyder på at dette titan implantat material er biokompatible. Selv om vi ikke har analysert sammenslutning av ulike topografiske parametere, kan stillaset overflate modifikasjon forbedre celle tilslutning spredning samt differensiering 18. Optimal kompatibilitet mellom stillaset og celler øke sannsynligheten for bedre implantat integrering i det omkringliggende vev og så forbedrer in vivo levetid etter behandlingen 19. Ved hjelp av ovenstående testoppsettet åpner opp muligheten for å måle og visual forbedringer i de biologiske resultatene av stillaset indusert av overflaten modifikasjoner. Preferansen av stillas med bioaktive overflate over umodifiserte implantat design antyder bedre ytelse 20 i form av osteo-chondrogenic integrasjon. Denne studien er ytterligere forsterket av andre rapporter om strikket titan implantat der dens mekaniske eiendom og bioaktivitet er rapportert 6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende interesser. Ingen del av arbeidet har vært eller er for tiden under vurdering for publikasjon eller har blitt publisert andre steder.
Acknowledgments
Prosjektet er delvis finansiert av Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand (ZIM) des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie -KF3010902AJ4. Publikasjonen avgiften er omfattet av BG traumer sykehuset Tübingen, Tyskland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/24/48 well plates, T25/ T75 culture flask | Greiner Bio-One GmbH | * | |
| * 24 well plates | Greiner Bio-One GmbH | CELLSTAR 662 160 | |
| * 48 well plates | Corning Incorporated USA | 3548 | |
| * 6 well plates | Falcon | 353046 | |
| * T25 | Greiner Bio-One GmbH | 690 175 | |
| * T75 | Greiner Bio-One GmbH | 658 175 | |
| Acetic acid, purum ≥ 99.0% | Carl Roth | 3738.4 | |
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 | |
| Axioplan-2 | Carl Zeiss, Germany | ||
| Biological safety cabinets | Thermo Scientific | safe 2020 | |
| Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) | Sigma | 17783 | |
| Cell Culture Incubtator | Binder, Tuttlingen, Germany | 9040-0078 | |
| Filter unit (0.22 µm) | Millipore, IRL | SLGP033RS | |
| Centrifuges 5810 R And 5417 R | Thermo Fisher Scientific, NY | Megafuge 40R | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Carl Roth | 4720.2 | |
| Dulbecco’s PBS without Ca & Mg | Sigma | H15-002 | |
| Ethanol 99% | SAV liquid prod. GmBH | 475956 | |
| Ethidium homodimer | Sigma | 46043 | |
| EVOS Fluorescence imaging system | Life technologies | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, PA, USA | ||
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533-100MG | |
| Knitted titanium nucleus implant | Buck co & KG,Germany | ||
| MEM Alpha Modification with Glutamine w/o nucleoside | Sigma | E15-832 | |
| Omega microplate Reader | BMG Labtech,Germany | FLUOstar Omega | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P11-010 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma | 199303-1G | |
| Sulforhodamine B sodium salt | Sigma | S1402-1G | |
| Test tube rotator | Labinco B.V.,The Netherlands | Model LD-76 | |
| TRIS (hydroxymethyl) aminomethan | Carl Roth | AE15.1 | |
| Triton | Carl Roth | 3051.2 | |
| Trypan Blue 0.5% | Carl Roth | CN76.1 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma | L11-004 |
References
- Bridwell, K. H., Anderson, P. A., Boden, S. D., Vaccaro, A. R., Wang, J. C. What's new in spine surgery. J Bone Joint Surg Am. 95, 1144-1150 (2013).
- Adams, M. A., Dolan, P. Intervertebral disc degeneration: evidence for two distinct phenotypes. J Anat. 221, 497-506 (2012).
- Schizas, C., Kulik, G., Kosmopoulos, V. Disc degeneration: current surgical options. Eur Cell Mater. 20, 306-315 (2010).
- Lewis, G. Nucleus pulposus replacement and regeneration/repair technologies: present status and future prospects. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 1702-1720 (2012).
- Cunningham, B. W. Basic scientific considerations in total disc arthroplasty. Spine J. 4, 219-230 (2004).
- Implant for surgical use in humans or vertebrates. US8728164 B2. Google Patents. Buck, A. E., Kaps, H. -P. , (2014).
- Kettler, A., Kaps, H. P., Haegele, B., Wilke, H. J. Biomechanical behavior of a new nucleus prosthesis made of knitted titanium filaments. SAS J. 1, 125-130 (2007).
- Nerurkar, N. L., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria for intervertebral disc tissue engineering. J Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
- Elias, C. N., Lima, J. H. C., Valiev, R., Meyers, M. A. Biomedical applications of titanium and its alloys. JOM. 60, 46-49 (2008).
- Hallab, N., Link, H. D., McAfee, P. C. Biomaterial optimization in total disc arthroplasty. Spine (Phila Pa 1976). 28, 139-152 (2003).
- Gustafsdottir, S. M. Multiplex cytological profiling assay to measure diverse cellular states. PLoS One. 8, e80999 (2013).
- Bocker, W., et al. Introducing a single-cell-derived human mesenchymal stem cell line expressing hTERT after lentiviral gene transfer. J Cell Mol Med. 12, 1347-1359 (2008).
- Ehnert, S., et al. Transforming growth factor beta1 inhibits bone morphogenic protein (BMP)-2 and BMP-7 signaling via upregulation of Ski-related novel protein N (SnoN): possible mechanism for the failure of BMP therapy. BMC Med. 10, 101 (2012).
- Morgan, S. P., Rose, F. R., Matcher, S. J. Optical Techniques in Regenerative Medicine. , CRC Press. (2013).
- Vielreicher, M., et al. Taking a deep look: modern microscopy technologies to optimize the design and functionality of biocompatible scaffolds for tissue engineering in regenerative medicine. J R Soc Interface. 10, 20130263 (2013).
- Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18, 1573-1583 (1997).
- Niu, G., et al. Fluorescent imaging of endothelial cells in bioengineered blood vessels: the impact of crosslinking of the scaffold. J Tissue Eng Regen Med. , (2014).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur Spine J. 17, Suppl 4 467-479 (2008).
- Navarro, M., Michiardi, A., Castano, O., Planell, J. A. Biomaterials in orthopaedics. J R Soc Interface. 5, 1137-1158 (2008).
- Priyadarshani, P., Li, Y., Yao, L. Advances in biological therapy for nucleus pulposus regeneration. Osteoarthritis Cartilage. , (2015).
- Thermofisher Fluorescence Spectraviewer. , Source: https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html (2016).
