Summary
Här presenterar vi en fluorofor baserad avbildningsteknik för att upptäcka cellviabilitet på en icke-transparent titan byggnadsställning samt att upptäcka glimtar av ställnings föroreningar. Detta protokoll felsöker nackdelen av avbildning cell-cell eller cell-metallinteraktioner på icke-transparenta ställningar.
Introduction
Kronisk ryggsmärta är en multifaktoriell sjukdom. Intresset för en minimalinvasiv behandlingsalternativ för degenerativ disksjukdom har ökat sedan 1950-talet. Fram till idag, är multi-segment fusion av ryggraden den mest använda behandlingen. Sedan leder denna metod ofta begränsningar i rörlighet drabbade segmentet 1,2, utforskning av protes eran blev ett stort intresse. Betydande framsteg i total diskersättning och kärnan ersättare har blivit ett bra alternativ till behandling av kronisk ryggsmärta en. Trots den enorma framsteg, har ingen av de metoder som utvärderats kliniskt. Mindre stela nucleus implantat utgör ett lovande alternativ till total diskersättning, under förutsättning att ringen fibrosus är intakt 3,4. Men de som för närvarande finns nucleus implantat på marknaden ofta förknippas med komplikationer som förändringar i kotkroppen, förskjutning, vertikal höjd förlust av skivan och than brist på nödvändig tillhörande mekanisk styvhet 5. För att övervinna de nuvarande nackdelarna, har en ny kärna implantat tillverkade av stickade titantrådar har framgångsrikt utvecklat sex. Tack vare den unika stickad struktur har detta nyligen utvecklade byggnadsställning som visas stående biomekaniska egenskaper, t ex dämpning funktion, porstorlek, lastning kapacitet och tillförlitlighet 7. Som syftar till att testa biokompatibilitet av denna nya kärna implantat, avbildad allvarliga begränsningar i (optiska) analystekniker tillskrivs den icke-transparenta karaktär av implantatet.
För att testa biokompatibiliteten, spelar växelverkan cell metall en framträdande roll 10/8. En interaktion mellan celler och ställningen är nödvändig för stabilisering och därmed för bättre implantat integration i värdsystemet. Dock kan en ökande inväxt djup förändra de mekaniska egenskaperna hos byggnadsställningen. Syftar till att undersöktigate om ställningen ytan ger en bas för cellbindning, proliferation och differentiering eller om metallen påverkar cellviabilitet, är det viktigt att felsöka vanliga välkända problemet med avbildning celler på / i icke-transparenta och ogenomskinliga ställningar. För att övervinna denna begränsning flera fluorescerande baserade tekniker utforskades. Företag ger ett stort utbud av fluoroforer för att visualisera levande celler, cellulära avdelningar, eller till och med specifika cellulära stater 11. Fluoroforer för detta experiment valdes med hjälp av online-verktyg spektrala tittaren för att bäst passa vår fluorescerande mikroskop.
Den utvecklade strategin för analysen av det vidhäftande celler beteende på / i den icke-transparenta stickad titan byggnadsställning innebär följande: 1) fluorescerande (grönt fluorescerande protein / GFP) märkning av osteochondro-progenitorceller för att möjliggöra spårning av cellerna på byggnadsställning, 2) mätning av lönsamheten (mitochondrial aktivitet) av cellerna, och 3) att visualisera cell-cell- och cell-material interaktioner inom ställningen. Försöket har den fördelen att den lätt kan överföras till andra vidhäftande celler och andra icke-transparent eller opak byggnadsställning. Vidare kan viabilitet och inväxt mönster att övervakas under flera dagar, varför det kan användas med begränsade mängder av byggnadsställningsmaterial eller celler.
Den aktuella studien visar den framgångsrika användningen av vår nuvarande protokoll för att mäta cellviabiliteten och visualisera inväxt mönster osteochondro-progenitorceller på / i den icke-transparenta stickad titan byggnadsställning. Dessutom kan de utvecklade protokoll användas för att bestämma de ställnings föroreningar och för att kontrollera rengöringsprotokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Förevigats humana mesenkymala stromal prekursorceller (SCP-1-celler) användes för experimenten. SCP-1-celler tillhandahölls av Prof. Matthias Schieker 12.
1. Utbyggnad av SCP-1-celler
- Innan arbeta med SCP-1-celler, ordentligt rengöra arbetsområdet (betecknad biosäkerhet skåp I) med 70% etanol (v / v) handskar.
- I den renade biosäkerhet skåp förbereda en lämplig volym av cellodlingsmedium genom att blanda de nödvändiga komponenterna som anges i tabell 1. I syfte att upprätthålla steriliteten av basalmediet, tillsätt tillskott genom passage genom sterila filter med en porstorlek av 0,22 | j, m.
- För att förhindra kontamination, beredning av medium åtminstone 24 h före användning. I syfte att testa dess sterilitet, inkubera 1 ml medium i en cellodlingsplatta utan celler i standardcellodlingsinkubator: 37 ° C, 5% CO2, 20% O2 och 90% luftfuktighet. Efter24 timmar, kontrollera medel mikroskopiskt med en förstoring på minst 200X.
- Upprätthålla SCP-1-celler i ett standardcellkulturinkubator med understödjande Förhållande: 37 ° C, 5% CO2, 20% O2 och 90% luftfuktighet.
- För underhåll och expansion, odla SCP-1 celler tills de når 80-90% konfluens. Under denna tidsperiod kultur, ändra medium var 2-3 dagar. Vid uppnående av 80 till 90% konfluens, delas SCP-1-celler (i allmänhet en 1: 2-förhållande) till nästa passage för expansion eller platta för experimenten (såsom anges).
- För att dela upp de SCP-1-celler, värma odlingsmediet vid 37 ° C och tina trypsin / EDTA med användning av ett vattenbad vid 37 ° C.
- Helt aspirera odlingsmedium från 80-90% sammanflytande celler och kasta den i en avfallsbehållare.
- Tvätta cellerna åtminstone två gånger med DPBS (Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning utan magnesium och kalcium, pH 7,2).
- Pipett en lämplig volym avDPBS på cellerna (5 ml DPBS för en T75 odlingskolv och 12 ml för en T175 odlingskolv).
- Aspirera DPBS försiktigt och kassera den i en avfallsbehållare.
- Pipett en lämplig volym av 0,25% trypsin / EDTA på cellerna (1 ml DPBS för en T75 odlingskolv och 2 ml för en T175 odlingskolv) och inkubera under 5-10 minuter vid 37 ° C i standardcellodlingsinkubator med 5 % CO2, 20% O2 och 90% luftfuktighet.
- Rubba cellerna genom att knacka på kärlet och säkerställa alla celler lösgörs från odlings plast (trypsinering) genom att observera de flytande cellerna under mikroskop.
- Inaktivera trypsin reaktionen genom tillsats av 10 ml av odlingsmedium. Blanda trypsin och celler med mediet noggrant genom upprepad pipettering.
- Överför cellsuspensionen in i ett reaktionsrör och centrifugera vid 600 xg under 10 min vid rumstemperatur.
- Aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 10 ml odlingsmedium.
- Räkna cellerna genom trypanblått uteslutningsmetoden såsom beskrivs i protokoll 2.
- Seed cellerna beroende på experimentell design.
2. Räkna av SCP-1-celler
- Utföra en viabel cellräkning (trypanblått uteslutningsmetoden) av de återsuspenderade cellerna med användning av en hemocytometer.
- Före celltal, rengör hemocytometer med användning av kranvatten. Torka hemocytometern komponenter med en luddfri vävnad. Montera den genom att fukta täckglaset och trycka den omvänt på de två glas löpare på varje sida av räkningsområdet. Se till att Newtons ringar syns på glas löpare (Figur 1).
- Ta 10 | il av de återsuspenderade cellerna och blanda med 10 pl av 0,1% Trypan Blue-lösning för erhållande av en utspädningsfaktor på två.
- Belastning 10 pl av det totala urvalet på förren och monteras hemocytometer kammaren.
- Räkna antalet levande (vit / transparenta celler) och död(blå kärnor) celler på de 4x4 rutor (se figur 1B).
- Beräkna det totala antalet celler efter den givna formeln:
3. GFP Transfektion av SCP-1-celler
OBS: För att observera SCP-1 celltillväxt på och i den stickade titan ställningen under en viss odlingsperiod vi märkt cellerna med grönt fluorescerande protein (GFP). Överexpression av GFP uppnås genom infektion med adenoviruspartiklar som kodar för GFP. Replikationsinkompetent (-E1 / -E3) adenoviruspartiklar som kodar för grönt fluorescerande protein (GFP) användes för att infektera SCP-1-celler. Viruspartiklarna erhölls från professor Steven Dooley 13 genom att samla odlingssupernatanten av rekombinant adenovirus (Ad5-GFP) transfekterade HEK293T celler (biosäkerhet lab II). Tre upprepad frysning (-80 ° C) och tina (37 ° C i vattenbad) cykler säkerställt att ingen HEK293T cellerna förblir lönsamt att producera nya viruspartiklar. Med hjälp av denna adenovirus fröunderlag kan effektivt infektera SCP-1 celler utan att producera nya viruspartiklar. Sålunda kan de infekterade cellerna hanteras på ett biosäkerhet Lab I.
- Resuspendera målceller (SCP-1-celler) med en såddtäthet av 50.000 celler / ml i odlingsmedium. Pipette 2 ml per brunn i en 6-brunnars vävnadsodlingsplatta.
- Inkubera vid 37 ° C i standardcellodlingsinkubator; 5% CO2, 20% O2 och 90% fuktighet, tills SCP-1-celler når en konfluens av 70-80%.
OBS: konfluens beror på såddtäthet av cellerna. För ovan angivna villkor, SCP-1 cellerna når en confluency på 70-80% i 1,5-2 dagar. - Vid en konfluens av 70-80%, utan att aspirera odlingsmediet tillsätt 100 pl av adenovirus fröunderlag per 1 ml odlingsmedium.
- Bestämma koncentrationsområdet individuellt beroende på mängden av viruspartiklar i varje virus seed mäldberedningen. Om infektionen effektivitet är för låg, rena och koncentrera viruspartiklar med användning av olika kommersiellt tillgängliga kit.
- Inkubera i en timme i standardcellodlingsinkubator vid 37 ° C (5% CO2, 20% O2 och 90% fuktighet).
- Ta bort odlingsmedium som innehåller viruset fröunderlag och samla det för omhändertagande. Lägg till färskt odlingsmedium 2 ml per brunn i en 6-väl-kulturplatta att fylla.
- Se till att före omhändertagande är viruspartikel innehållande medium autoklaveras.
- Utvärdera den intracellulära GFP-uttryck (infektionseffektivitet) 24 h efter infektionen med användning av ett fluorescensmikroskop med en GFP LED kub / filteruppsättning.
- Observera cellmorfologin (Figur 2). Celler lossnar från odlingsplast kan ge falska positiva resultat.
4. Rengöring av stickade Titanium Ställningar
- Psnöra upp till 5 ställningar i en 50 ml reaktionsrör.
- Tvätta scaffold (6-7 mm tjocklek) tre gånger med 30 ml destillerat-avjoniserat vatten under 20 min vid rumstemperatur, med användning av rotorförhållanden (8 xg).
- Ersätta den destillerade-avjoniserat vatten med 30 ml 1% (vikt / volym) Triton-X-100-lösning (löst i destillerat-avjonat vatten) och sedan tvätta de ställningar gång under 20 min vid rumstemperatur, med användning av rotorförhållanden (8 xg) .
- Kassera Triton-X-100-lösning följt av tvättning med 30 ml destillerat-avjoniserat vatten två gånger (5 min vardera vid rumstemperatur) som upprätthåller rotorförhållanden (8 xg).
- Byt ut destillerat-avjoniserat vatten. Skölj ställningar i följd med reagenskvalitet 99% aceton, 99% isopropanol och 99% etanol (30 ml vardera) för 2 x 5 min vardera i ett ultraljudsbad (~ 50 Hz, 50 W, 220-240 V).
- Tvätta igen tre gånger med 30 ml destillerat-avjoniserat vatten under 5 min, varvid ultraljudsbad behandling konstant.
- Placera scaffoLDS på en luddfri trasa för att lufttorka över natten vid rumstemperatur.
- Autoklavera byggställning för 15 min vid 121 ° C med 15 psi.
- Kontrollera rengöringsprotokollet genom indirekt fluorescens som beskrivs i protokoll 5.
5. Imaging Scaffold strukturer genom indirekt fluorescens
OBS: Det nuvarande protokollet beskriver avbildning av ställningsstrukturer genom indirekt fluorescens med hjälp av fluoroforen sulforodamin B som ger en ljus röd fluorescens vid en ex / em våglängden 565/586 nm. Emellertid kan fluoroforen ändras till bättre passform för givna mikroskop inställningar eller möjlig auto fluorescens av byggnadsställningen.
- Förbered sulforodamin B färgningslösning (0,04%) i 1% ättiksyra och förvara vid rumstemperatur med skydd från ljus.
- Ta en 24-brunnars vävnadsodlingsplatta och sänk den rengjorda ställningen i 500 pl sulforodamin B färgnings lösningen genom att placera den insIDE väl med hjälp av pincett.
- Fånga en negativ bild av ställningen med hjälp av fluorescensmikroskop.
- Ta bilder med en RFP LED kub / filtersats med en excitationsvåglängd av 531/40 nm och en emissionsvåglängd av 593/40 nm. Alternativt välja lämplig excitation och emissionsvåglängd med hjälp av fluorescensspektrala betraktaren 20. Sulforodamin B har sin topp excitation vid 578 nm och dess toppemission vid 593 nm.
- För att åskådliggöra ställningen struktur, ta bilder vid lägre förstoringar, t.ex. 4X eller 10X (Figur 3). Med hjälp av dessa bilder, bestämma egenskaper, t.ex. porstorlek och form med hjälp av ImageJ.
- För att upptäcka ställnings föroreningar, ta bilder vid högre förstoringar, t.ex. 20X eller 40X, med tanke på att detta kommer att begränsa analysen djup. Se till att smutspartiklar / ämnen inte sett (se representativa resultat, Figure 3).
6. In vitro biokompatibilitet analys
- Pre-värma odlingsmediet vid 37 ° C i ett vattenbad.
- Ta en 24-brunnars vävnadsodlingsplatta och med hjälp av pincett, placera de rengjorda och steriliserade ställningar i varje testbrunn aseptiskt. Arbeta under förren biosäkerhet skåp jag!
- Blöt / inkubera de ställningar med ett odlingsmedium under omkring 15 minuter (500 | j, l per brunn av en 24-brunnars vävnadsodlingsplatta), i syfte att avlägsna luft från insidan av byggnadsställningen.
- Samtidigt resuspendera 500.000 Ad-GFP-infekterade SCP1 celler i 1 ml odlingsmedium.
- Efter 15 minuter av byggnadsställning blötläggning, aspirera mediet helt från ställningen.
- För ympning av cellerna på ställningen, dispensera 100 pl av cellsuspensionen försiktigt på ställningen (som är placerad i 24-brunnar) yta. Upprätthålla en minimivolym av cellsuspensionen medan sådd cellerna, så att säkerställa att ingen mediet strömmar oUT av ställningen.
- Inkubera cellerna i 30 min vid 37 ° C i standardcellodlingsinkubator (5% CO2, 20% O2 och 90% fuktighet).
- Tillsätt 500 | il mer odlingsmedium och inkubera i 24 h i standardcellodlingsinkubator (37 ° C, 5% CO2, 20% O2 och 90% fuktighet).
- Utvärdera cellvidhäftning mönster och cellspridning på ställningen ytan med användning av ett fluorescensmikroskop.
- Ta bilder med en GFP LED kub / filtersats med en excitationsvåglängd av 470/22 nm och en emissionsvåglängd av 510/42 nm. Alternativt välja lämplig excitation och emissionsvåglängd med hjälp av fluorescens spektrala tittaren. GFP har sin topp excitation vid 488 nm och dess toppemission vid 507 nm.
- För att visualisera cell följsamhet mönster fånga bilder vid lägre förstoringar, t.ex. 4X eller 10X (Figur 4). För att observera cellspridning en högre magDet behövs storings (minst 100X) - begränsa fokusdjupet.
- För ytterligare utvärdering av cellspridning på ställningen ytan, fixera cellerna med 4% formalin och fortsätt med konventionell fluorescens färgning av cellulära strukturer, t.ex. aktinfilament (Phalloidin). Men anpassa inkubationstider och fluorescerande märkning av antikropparna för att passa de individuella ställnings egenskaper, t.ex. diffusion gånger eller auto-fluorescens 14.
- Nästa dag, ändra odlingsmediet för att avlägsna icke-adherenta celler.
- Beräkna procentandelen vidhäftande celler på ställningen genom resazurin konvertering mätning som beskrivs i protokoll 7.
Figur 5: Tidslinje för in vitro-analys (A) Experimentuppställning för plätering celler.. (B Klicka här för att se en större version av denna siffra.
7. Resazurin Conversion mätning
OBS: Resazurin konvertering analys används för att mäta den mitokondriella aktiviteten och därmed indirekt cellproliferation. Resazurin reduktion till resorufin genererar en fluorescerande signal, som är baserad på den mitokondriella aktiviteten i samband med viabla cellantal (figur 7A).
- Helt aspirera odlingsmedium från SCP-1-celler och kasta den i en avfallsbehållare.
- Tvätta SCP-1-celler en gång med DPBS för att avlägsna lösgjorda celler. Tillsätt 500 ^ il DPBS per brunn i 24-brunnars vävnadsodlingsplatta innehållande SCP-1-celler på ställningen.
- Täck celler med en krävs amount steril resazurin arbetslösning (0,25% resazurin i odlingsmedium) och inkubera vid 37 ° C i standardcellodlingsinkubator (5% CO2, 20% O2 och 90% fuktighet) under 30 min.
- Gör en notering som; Inkubationstiden beror på celltyp och celltäthet. Den kan variera mellan 10 min och 6 h. Optimerad inkubationstid för SCP-1-celler är 30 minuter.
- Som bakgrundskontroll, innefatta åtminstone en väl med resazurin arbetslösning, men utan celler, som inkuberades vid 37 ° C i standardcellodlingsinkubator (5% CO2, 20% O2 och 90% fuktighet) för samma tid.
- Överför 100 | j, l rade supernatanten från varje brunn i 24-brunnars vävnadsodlingsplatta i en 96-mikrobrunnsplatta.
- Tvätta de kvarvarande cellerna tre gånger med 1 ml DPBS för 5 minuter vid rumstemperatur för att avlägsna kvarvarande resazurin arbetslösning. Efter den tredje tvättningen lägga odlingsmedium to implantaten med SCP-1-celler (500 mikroliter per brunn i 24-brunnars vävnadsodlingsplatta) och fortsätta inkubation vid 37 ° C i standardcellodlingsinkubator (5% CO2, 20% O2 och 90% luftfuktighet) för ytterligare mätningar tidsförloppet.
- Se till att ställa upp replikat i detta steg (2-4) för att minimera pipetteringsfel.
- Under tiden, placera 96-mikrobrunnsplattan in i mikroplattläsare och mäta fluorescensen av den bildade resorufin.
- I syfte att minska bakgrundssignalen, mäta fluorescens vid en excitationsvåglängd av 545 nm och en emissionsvåglängd av 585 nm.
- Alternativt välja lämplig excitation och emissionsvåglängd med hjälp av fluorescens spektrala tittaren. Resorufin har sin topp excitation vid 572 nm och dess toppemission vid 585 nm. Den givna signalintensiteten är ett genomsnitt av 25 enskilda mätvärden (25 blixtar per brunn).
- Mäta fluorescensföreningenescence av bildade resorufin i konditionerat medium, med hjälp av en botten optik.
- Gör en notering att förstärkningen beror på den genomsnittliga mängden resazurin konverteras och kan variera mellan 10 och 4000. Justera förstärkningen till den individuella mikroplattläsare som används genom att pipettera en resorufin standardkurva, så att den fluorescerande signalen är under 80% av den högsta signalintensiteten detekterbar (i detta fall 20000). Den optimerade vinst för SCP-1-celler är 800.
- Subtrahera bakgrundssignalen (resazurin arbetslösning utan celler) från signal av testproverna.
- Beroende på försöksuppställningen / ändamål, fortsätta med ytterligare åtgärder:
- Beräkna den procentuella livskraften hos cellerna på ställningen med användning av en standardkurva. Göra en individuell standardkurva separat för varje cellinje användes.
- Analysera celltillväxt / spridning genom att uppskatta den relativa ökningen av resazurin omvandling hela odlingstiden. För denna beräkning, ställden resazurin konvertering på dag 1 som referens. Färskt förbereda resazurin arbetslösning för denna typ av analys. Vidare inkubationstider måste vara lika mellan de olika mätningarna.
- Upprepa hela protokollet av resazurin mätning konvertering åtminstone tre gånger för att få konsekventa resultat.
8. Levande döda färgning
- Platta SCP1 cellerna på ställningen med en såddtäthet av 50.000 celler / byggnadsställning och låta det växa på schavotten hålla standardcellodlingsbetingelser (se protokoll 1 och 2).
- Efter 24-48 timmar helt aspirera odlingsmedium från SCP-1-celler och kasta den i en avfallsbehållare.
- Tvätta SCP-1-celler en gång med DPBS för att avlägsna lösgjorda celler. Tillsätt 500 ^ il DPBS per brunn i 24-brunnars vävnadsodlingsplatta och inkubera under 5 min vid rumstemperatur.
- Stain SCP-1 vid användningen fluoroforer (alla tre fläckar på samma gång):
- Från och med nuhålla ställningar i mörkret för att skydda fluoroforer blekning från dagsljus!
- Ställa en inkubationstid till 30 min för att medge jämn fördelning genom hela ställningen. Om överföring till andra ställningar, se till att optimera inkubationstiderna för att passa individuella ställnings egenskaper (porstorlek, byggnadsställning djup, etc.).
- För att detektera viabla celler på ställningen, fläcka cellerna med kalcein AM vid en slutkoncentration av 2 ^ M (i odlingsmedium).
- För att detektera alla celler på ställningen, fläcka cellerna med Hoechst 33342 vid en slutlig koncentration av 0,002 ug / ul (i odlingsmedium).
- För att upptäcka döda celler, inkubera ställningen med etidium homodimer vid en slutlig koncentration av 4 iM (i odlingsmedium).
- Efter inkubationstiden, tvätta cellerna 3 gånger med DPBS (1 ml per brunn) för varje 5 min vid rumstemperatur.
- Omedelbart ta bilds genom användning av ett fluorescensmikroskop.
- Ta bilder av kalcein (levande celler) med en GFP LED kub / filteruppsättning (excitation och emissionsvåglängd av 470/22 nm och 510/42 nm, respektive). Alternativt välja en lämplig excitation och emissionsvåglängd med hjälp av fluorescens spektrala tittaren. Calcein har sin topp excitation vid 488 nm och dess toppemission vid 507 nm. Obs: Se till att inte använda GFP transfekterade celler för fluorescens färgning med kalcein eller andra gröna fluorescerande fläckar.
- Ta bilder av Hoechst 33.342 med en DAPI LED kub / filtersats med en excitationsvåglängd av 357/44 nm och en emissionsvåglängd av 447/60 nm. Alternativt välja lämplig excitation och emissionsvåglängd med hjälp av fluorescens spektrala tittaren. Hoechst 33342 har sin topp excitation vid 347 nm och dess toppemission vid 483 nm.
- Ta bilder av etidium homodimer med en RFP LED kub / filteruppsättning (excitation och emissionsvåglängd of 531/40 nm och 593/40 nm, respektive). Alternativt välja lämplig excitation och emissionsvåglängd med hjälp av fluorescens spektrala tittaren. Ethidium homodimer har sin topp excitation vid 530 nm och dess toppemission vid 618 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Preliminära resultat visade att den beskrivna nucleus implantatet inte bara roman har bra dämpningsfunktioner men också är biokompatibel med SCP-1-celler. Under tillverkningen av implantatet, kommer det i kontakt med starka frätande och giftiga ämnen (smörjmedel, betnings, elektro-polering lösning). Med hjälp av indirekta fluorescerande färgningstekniker kunde vi visualisera kvarvarande orenheter och följaktligen optimera en rengöringsprotokoll som visar signifikant minskning av substans belastning på ställningen. Figur 3 visar effektiviteten hos etablerad rengöringsprotokoll.
Framgången för implantat som används för artroplasti behandling bestäms av händelser som äger rum vid cellmaterialet gränssnitt. Figur 4 visar de celler fästa på ställningen efter 24 h av plätering, såsom beskrivs i protokollet avsnitt 6. En betydande transfection effektivitet SCP-1-celler observerades som vi kunde bild tillväxtmönstret av mesenkymala stromaceller prekursorceller på schavotten (se Figur 2). Direkt visualisering bekräftar biokompatibilitet ställningen och skildrar också vidhäftningen mönster på ställningen ytan (Figur 4). Fluorescens färgning kan göras ytterligare för att undersöka cell interaktion med och spridning på ställningen ytan.
Fluoroforer ades framgångsrikt tillämpats i syfte att undersöka celldöd och proliferation under en tidsperiod på ställningen. Live-död-färgning bilder exemplifiera hur färgning framgångsrikt kan göras på ställningen för att bekräfta procent livskraft celler under en tidsperiod. Figur 6 visar blå nukleär färgning (Hoechst 3342) i alla celler, röd fluorescerande (etidium homodimer) döda celler och grön märkning för inkorporering av kalcein-AM som lönsamhet maRKER. Calcein AM omvandlas till kalcein som uppvisar en ljus grön fluorescens i närvaro av kalciumjoner i cytoplasman i cellerna. Hoechst 33342 är cellväggen genomsläpplig och interkalerar i cellulärt DNA. Detta sätt alla celler kommer att visa blå kärnor (se Figur 6). Ethidium homodimer inte är cellväggen permeabel, vilket således kommer det bara interkalerar i DNA av döda celler. På så sätt kommer döda celler visar röda kärnor. Vidare cellviabiliteten och faldig ökning i cellantal på byggnadsställning över en vecka kvantifieras genom resazurin omvandlingsanalys och återges grafiskt (figur 7).
Figur 1: cellräkning med en hemocytometer (A) Inställning av en kammarenhet.. (B) Illustration av räkningskammare; 4 x 4 räknekammare användes för en cell count. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. GFP transfektion effektivitet SCP1 celler uppvisar en stark grön fluorescens indikerar positiv ad-GFP- transfektionseffektivitet. Skala bar = 1000 um, 4X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Sulforhodamine B färgning negativa bilder fånga (A) Scaffold före rengöring.. Pilen indikerar närvaron av giftiga / frätande ämnen på schavotten. (B) Scaffold efter rengöringsprotokollet. Skala bar = 1000 um, 4X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Vidhäftning mönster av SCP1 celler på scaffold GFP-signal indikerar cellvidhäftning och tillväxt mönster på ytan av den stickade titan ställningen. Skala bar = 1000 um, 4X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Co-fluorescens färgning av celler på byggnadsställning (.
Figur 7: Resazurin omvandlingsanalysen (A) Biochemical reduktionsreaktion av redox-färgämne (resazurin) till en slutprodukt (resorufin) som emitterar fluorescens och undergår kolorimetriska förändringar.. (B) Mitochondrial aktivitet mättes när celler ströks ut på 0,75 mg / cm ^ densitet scaffold. Data samlades in med hjälp av fluorescence baserade mätinstrument. Fluorescensintensiteten vid 590 nm (y-axel) vid definierade tidpunkter (x-axel) är avbildad som ett resultat av kvantitativ cellviabilitet mätning (Ex = 540 nm, Em = 590 nm). Den statistiska signifikansen bestämdes med användning Tvåvägs ANOVA och standardfelet för medelvärdet (SEM) visas som en felstaplar. Med tanke på byggnadsställningar fysikaliska egenskaper, t.ex. porstorlek och mekaniska egenskaper (t.ex. dämpning funktion) tillsammans, var 0,75 mg / cm densitet byggnadsställning som används för biokompatibilitet karakterisering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| medie~~POS=TRUNC komponenter~~POS=HEADCOMP | Koncentration |
| Basal aMEM media (%) | 90 |
| Serum (%) | 10 |
| Pen / strep (%) | 1 |
Tabell 1: Cellodling (aMEM) Media komposition.
| Problem | Orsak | Lösning |
| Cellviabilitet avbildning på icke-transparent byggnadsställning | Scaffold hindrar ljuset från att tränga in utan distorsion | Använd fluoroforen baserad avbildningsteknik för bedömning cell. |
| Interferens av fluorescensintensitet | Auto-fluorescens, bakgrundssignalen | Var uppmärksam på fluoroforer och använda lämpliga utifrån särskilda ställnings egenskaper. |
| Cellviabiliteten bedömning byggnadsställning under en odlingsperiod | Repeated mätningar under lång tid | Transfektera cellerna med Ad-GFP-viruspartiklar. |
| Cell funktionalitet bedömning av icke-transparent byggnadsställning | Fluorescens bildteknik tillåter endast cellspridning mönsteranalys. | Utför resazurin omvandlingsanalys (kvantitativ mätning cellviabiliteten) i en kombination med avbildningsteknik. |
Tabell 2: Sammanfattande tabell: felsökning cellviabiliteten imaging på icke-transparent byggnadsställning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ställningen yta spelar en viktig roll i dess interaktion med omgivande vävnad in vivo därigenom bestämma implantat funktionell hållbarhet. Sålunda är biokompatibilitet av byggnadsställningen studerades med in vitro-analyser med användning av celler (SCP1 cellinje), när utstryk på byggnadsställningar.
Mikroskopi tekniker som fungerar bra med tunna och optiskt transparenta byggnadsställningar är dåligt lämpade för icke-transparenta ställningar för att studera biokompatibiliteten. Detta beror främst på att de icke-transparenta ställningar förhindra ljus från att tränga in utan betydande snedvridning 15. För att delvis övervinna dessa problem vi härmed etablera en metod för cellbedömning på / i stickade titan gjort ställningar med olika fluoroforer.
För att möjliggöra stickning följt av vikning av de titantrådar, kommer materialet i kontakt med starkt korrosiva och toxiska ämnen (smörjmedel, mordant, electroPoler lösning), vilket skulle kunna förändra biokompatibilitet ställningen om spår kvar i / på schavotten. Med hjälp av en utvecklad indirekt-fluorescens-protokollet (Protokoll 5) kunde vi visualisera ställningen struktur. Vidare ställnings egenskaper, t.ex., materialtjockleken, den enskilda por storlek och form, eller bind densitet, analyserades med ImageJ. En högre förstorad epifluorescence mikroskopisk bild tillåts visualisera föroreningar i ställningen såväl som på ställningen ytan. Figur 3b representerar sålunda den bekräftande resultat av den framgångsrikt utvecklat rengöringsprotokoll. Principen för denna indirekta färgningsprotokollet kan lätt reproduceras till andra icke-transparenta ställningar, med beaktande av de enskilda ställningsegenskaperna, t.ex., porstorlek och motsvarande diffusion vilket påverkar inkubationstiden. Även automatisk fluorescens av ställnings och mikroskopiska inställningar påverkar valet av fluorophores användas. Onlineverktyget fluorescens spektrala tittaren kan hjälpa till att välja lämpliga fluoroforer.
interaktionen cell-metall har undersökts indirekt genom analys av vidhäftning mönster av celler på ställningen. Protokoll 6 beskriver metoden för hur celler kan övervakas in vitro om pläterade på icke-transparenta ställningar i odlingssystem med hjälp av en GFP transfektion strategi. Baserat på preliminära resultaten av in vitro-analyser, har det förutsagts att ytegenskaperna såsom sammansättning, mikro topografi och råhet 16 kan spela en viktig roll för att skapa vidhäftning och spridning av målceller. Titan är ett biomaterial alltså kan agera som ett substrat mall för att ge bas för cellbindning (se Figur 4).
Implantatytan topografi har rapporterats påverka cellens beteende 16. I föreliggande studie analyserade vi celltillväxt /spridning och lönsamhet med hjälp av fluorescens färgningsteknik i kombination med kvantitativa mätningar lönsamhets. Analys visade subtila variationer i cell procent livskraft och spridning beroende på ställningen material. Men cell funktionalitet utvärderas kvantitativt genom resazurin omvandlingsanalys (mitokondriell aktivitet), påverkades inte nämnvärt av ställningen material. Mätningen av mitokondrieaktiviteten genom resazurin omvandling har den fördelen att det inte är cell giftigt och därmed kan utföras upprepade gånger under en lång odlingsperiod. Särskild försiktighet måste iakttas vid tvätt av resterande resazurin arbetslösning, så att inte ackumulera bakgrundssignal (falskt positiva resultat). Trots dessa fördelar, kommer resazurin omvandlingsanalysen inte ge någon information om cellspridning på ställningen. GFP infekterade celler därmed kan spåras under en lång odlingsperiod (GFP signal förblev konstant under mer än 14 dagar), varigenom att visualisera sÄRSKILD tillväxtmönster på ställningen ytan. Visualisering av celler djupare i byggnadsställningen är fortfarande begränsad av byggnadsställningsmaterial och kommer således att kräva dissektion av implantatet. Kombinationen av dessa två tekniker har den stora fördelen att den lätt kan överföras till andra celltyper, med tanke på att inkubationstiden kan behöva anpassas till den celltypen av intresse. Dock måste man vara försiktig när överföra denna metod till andra icke-transparenta ställningar, t.ex. kollagen baserade byggnadsställningar som i allmänhet uppvisar en stark grön auto-fluorescens 17. I detta fall andra fluorescerande taggar skulle kunna användas. Kombinationen av ovan angivna två metoder har därför flera fördelar (se tabell 2).
Scaffold egenskaper, t.ex. porstorlek kanske fälla celler inuti ställningen. Om inte tillräckligt med näringsämnen levereras, kan dessa celler dör och utsöndrar proteaser som påverkar cellernas livsduglighet av surrounding celler / vävnad. Vi skulle kunna anpassa en fluorescerande baserad färgningsprotokollet som är i stånd att visualisera levande och döda celler i och på den stickade titan ställningen. I likhet med den indirekta fluorescensfärgningsprotokollet, kan principen om denna färgningsprotokollet lätt överföras till andra icke-transparenta ställningar. Därvid kan de enskilda ställnings egenskaper, t.ex. porstorlek och motsvarande diffusion så bra som möjligt auto-fluorescens mikroskopisk inställning måste beaktas eftersom de kan påverka inkubationstiden och valet av fluoroforer används. Här återigen onlineverktyget fluorescens spektrala tittaren kan hjälpa till att välja lämpliga fluoroforer.
Sammanfattningsvis in vitro resultat tyder på att den föreslagna stickade titan kärna implantatmodellen har en biologisk profil. Initial fastsättning av mesenkymala stromala prekursorceller (SCP-1-celler) på detta material antyder att denna titanlegering implantat material är biokompatibla. Även om vi inte har analyserat sammanslutning av olika topografiska parametrar kan ställnings ytbearbetning förbättra cellvidhäftning proliferation samt differentiering 18. Optimal kompatibilitet mellan byggnadsställning och celler höja sannolikheten för en bättre integration implantat i den omgivande vävnaden och så att förbättra in vivo livslängd efter behandlingen 19. Användning av den ovan angivna testuppställning öppnar för möjligheten att mäta och visualisera förbättringar i den biologiska prestandan hos byggnadsställningen inducerad av ytmodifieringar. Preferensen av byggnadsställningar med bioaktiva yta över omodifierade implantat mönster föreslår bättre prestanda 20 i termer av osteo-kondrogen integration. Denna studie förstärks ytterligare av andra rapporter om stickade titanimplantat där dess mekaniska egenskaper och bioaktivitet har rapporterats 6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen. Ingen del av arbetet har varit eller är under övervägande för publicering eller har publicerats på annat håll.
Acknowledgments
Projektet är delvis finansierat av Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand (ZIM) des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie -KF3010902AJ4. Avgiften för offentliggörande har täckts av BG trauma sjukhuset Tübingen, Tyskland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/24/48 well plates, T25/ T75 culture flask | Greiner Bio-One GmbH | * | |
| * 24 well plates | Greiner Bio-One GmbH | CELLSTAR 662 160 | |
| * 48 well plates | Corning Incorporated USA | 3548 | |
| * 6 well plates | Falcon | 353046 | |
| * T25 | Greiner Bio-One GmbH | 690 175 | |
| * T75 | Greiner Bio-One GmbH | 658 175 | |
| Acetic acid, purum ≥ 99.0% | Carl Roth | 3738.4 | |
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 | |
| Axioplan-2 | Carl Zeiss, Germany | ||
| Biological safety cabinets | Thermo Scientific | safe 2020 | |
| Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) | Sigma | 17783 | |
| Cell Culture Incubtator | Binder, Tuttlingen, Germany | 9040-0078 | |
| Filter unit (0.22 µm) | Millipore, IRL | SLGP033RS | |
| Centrifuges 5810 R And 5417 R | Thermo Fisher Scientific, NY | Megafuge 40R | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Carl Roth | 4720.2 | |
| Dulbecco’s PBS without Ca & Mg | Sigma | H15-002 | |
| Ethanol 99% | SAV liquid prod. GmBH | 475956 | |
| Ethidium homodimer | Sigma | 46043 | |
| EVOS Fluorescence imaging system | Life technologies | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, PA, USA | ||
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533-100MG | |
| Knitted titanium nucleus implant | Buck co & KG,Germany | ||
| MEM Alpha Modification with Glutamine w/o nucleoside | Sigma | E15-832 | |
| Omega microplate Reader | BMG Labtech,Germany | FLUOstar Omega | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P11-010 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma | 199303-1G | |
| Sulforhodamine B sodium salt | Sigma | S1402-1G | |
| Test tube rotator | Labinco B.V.,The Netherlands | Model LD-76 | |
| TRIS (hydroxymethyl) aminomethan | Carl Roth | AE15.1 | |
| Triton | Carl Roth | 3051.2 | |
| Trypan Blue 0.5% | Carl Roth | CN76.1 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma | L11-004 |
References
- Bridwell, K. H., Anderson, P. A., Boden, S. D., Vaccaro, A. R., Wang, J. C. What's new in spine surgery. J Bone Joint Surg Am. 95, 1144-1150 (2013).
- Adams, M. A., Dolan, P. Intervertebral disc degeneration: evidence for two distinct phenotypes. J Anat. 221, 497-506 (2012).
- Schizas, C., Kulik, G., Kosmopoulos, V. Disc degeneration: current surgical options. Eur Cell Mater. 20, 306-315 (2010).
- Lewis, G. Nucleus pulposus replacement and regeneration/repair technologies: present status and future prospects. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 1702-1720 (2012).
- Cunningham, B. W. Basic scientific considerations in total disc arthroplasty. Spine J. 4, 219-230 (2004).
- Implant for surgical use in humans or vertebrates. US8728164 B2. Google Patents. Buck, A. E., Kaps, H. -P. , (2014).
- Kettler, A., Kaps, H. P., Haegele, B., Wilke, H. J. Biomechanical behavior of a new nucleus prosthesis made of knitted titanium filaments. SAS J. 1, 125-130 (2007).
- Nerurkar, N. L., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria for intervertebral disc tissue engineering. J Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
- Elias, C. N., Lima, J. H. C., Valiev, R., Meyers, M. A. Biomedical applications of titanium and its alloys. JOM. 60, 46-49 (2008).
- Hallab, N., Link, H. D., McAfee, P. C. Biomaterial optimization in total disc arthroplasty. Spine (Phila Pa 1976). 28, 139-152 (2003).
- Gustafsdottir, S. M. Multiplex cytological profiling assay to measure diverse cellular states. PLoS One. 8, e80999 (2013).
- Bocker, W., et al. Introducing a single-cell-derived human mesenchymal stem cell line expressing hTERT after lentiviral gene transfer. J Cell Mol Med. 12, 1347-1359 (2008).
- Ehnert, S., et al. Transforming growth factor beta1 inhibits bone morphogenic protein (BMP)-2 and BMP-7 signaling via upregulation of Ski-related novel protein N (SnoN): possible mechanism for the failure of BMP therapy. BMC Med. 10, 101 (2012).
- Morgan, S. P., Rose, F. R., Matcher, S. J. Optical Techniques in Regenerative Medicine. , CRC Press. (2013).
- Vielreicher, M., et al. Taking a deep look: modern microscopy technologies to optimize the design and functionality of biocompatible scaffolds for tissue engineering in regenerative medicine. J R Soc Interface. 10, 20130263 (2013).
- Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18, 1573-1583 (1997).
- Niu, G., et al. Fluorescent imaging of endothelial cells in bioengineered blood vessels: the impact of crosslinking of the scaffold. J Tissue Eng Regen Med. , (2014).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur Spine J. 17, Suppl 4 467-479 (2008).
- Navarro, M., Michiardi, A., Castano, O., Planell, J. A. Biomaterials in orthopaedics. J R Soc Interface. 5, 1137-1158 (2008).
- Priyadarshani, P., Li, Y., Yao, L. Advances in biological therapy for nucleus pulposus regeneration. Osteoarthritis Cartilage. , (2015).
- Thermofisher Fluorescence Spectraviewer. , Source: https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html (2016).
