Summary
Hier präsentieren wir eine Fluorophor basierte Bildgebungstechnik die Lebensfähigkeit der Zellen auf einem nicht transparenten Titangerüst zu erkennen sowie Einblicke in die Gerüst Verunreinigungen erkennen. Dieses Protokoll behebt den Nachteil des Abbildens Zell-Zell oder Zell-Metall-Wechselwirkungen auf nichttransparenten Gerüste.
Introduction
Chronische Rückenschmerzen ist eine multifaktorielle Erkrankung. Das Interesse an einer minimal-invasive Behandlungsoption für die degenerative Bandscheibenerkrankung hat sich seit den 1950er Jahren gewachsen. Bis heute ist multi-segmentale Fusion der Wirbelsäule die am weitesten verbreitete Behandlung. Da häufig diese Methode in der Beweglichkeit des betroffenen Segmentes zu Einschränkungen führt 1,2, Erforschung der Endoprothetik Ära wurde ein breites Interesse. Signifikante Fortschritte in der gesamten Scheibenersatz und Kernersatz hat eine gute Alternative werden zu chronischen Rückenschmerzen 1 zu behandeln. Trotz der großen Fortschritte, keine der Methoden klinisch evaluiert wurde. Die weniger starren Kern Implantate stellen eine vielversprechende Alternative zu Scheibenprothesen, vorausgesetzt , dass der Faserring intakt ist 3,4. Allerdings sind die derzeit vorliegenden Kern Implantate auf dem Markt sind oft mit Komplikationen wie Veränderungen im Wirbelkörper, Luxation, vertikale Höhenverlust der Scheibe und t assoziierter Mangel an notwendigen zugehörigen mechanischen Steifigkeit 5. Um die aktuellen Nachteile, ein neues Kern Implantat aus Titan gestrickten Drähte zu überwinden wurde 6 erfolgreich entwickelt. Aufgrund der einzigartigen Struktur gestrickt, hat dieses neu entwickelte Gerüst aufstrebenden biomechanischen Eigenschaften gezeigt, zum Beispiel Dämpfungsmerkmal, Porengröße, Belastbarkeit und Zuverlässigkeit 7. Ziel der Biokompatibilität dieses neuartigen Kern Implantats zu prüfen, dargestellt schwerwiegende Einschränkungen in den (optisch) Analysetechniken zurückzuführen auf die nicht transparente Natur des Implantats.
Um die Biokompatibilität, Zell-Metall - Wechselwirkung zu testen spielt eine herausragende Rolle 8-10. Eine Wechselwirkung zwischen den Zellen und dem Gerüst ist zur Stabilisierung notwendig und damit für die bessere Implantatintegration innerhalb des Host-Systems. Allerdings könnte eine zunehmende Tiefe Einwachsen der mechanischen Eigenschaften des Gerüsts zu verändern. Dem Ziel, investigate, ob das Gerüst Oberfläche eine Basis für die Zellbindung bietet, Proliferation und Differenzierung, oder ob die Metall die Lebensfähigkeit der Zellen betroffen sind, ist es wichtig, die gemeinsame bekannte Problem der Bildgebung Zellen auf / in nicht transparenten und opaken Gerüsten zu beheben. Um diese Einschränkung mehrere fluoreszierende basierte Techniken zu überwinden, wurden untersucht. Die Unternehmen bieten eine große Auswahl an Fluorophore 11 lebenden Zellen, zellulären Kompartimenten, oder sogar spezifische zelluläre Zustände zu visualisieren. Fluorophore für dieses Experiment wurden mit Hilfe des Online-Tools spektralen Betrachter, um unsere Fluoreszenzmikroskop optimal passen gewählt.
Die entwickelte Strategie für die Analyse der adhärenten Zellen Verhalten auf / in der nichttransparenten gewirkten Titangerüst beinhaltet die folgenden: 1) fluoreszierend (grün fluoreszierendes Protein / GFP) Markierung der osteochondro-Progenitorzellen Nachführung der Zellen auf der zu ermöglichen Gerüst, 2) die Lebensfähigkeit Messung (Mitochondriale Aktivität) der Zellen, und 3) die Visualisierung der Zell-Zell und Zell-Material Wechselwirkungen innerhalb des Gerüsts. Das Verfahren hat den Vorteil, dass sie leicht auf andere adhärente Zellen und anderen nicht-transparenten oder opaken Gerüst übertragen werden. Weiterhin kann die Lebensfähigkeit und das Einwachsen Muster über mehrere Tage überwacht werden, so kann es mit begrenzten Mengen an Gerüstmaterial oder Zellen verwendet werden.
Die vorliegende Studie zeigt die erfolgreiche Nutzung unserer aktuellen Protokoll, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu messen und in Wachstumsmuster von osteochondro-Vorläuferzellen an / in der nichttransparenten gestrickt Titan Gerüst sichtbar zu machen. Darüber hinaus könnten die entwickelten Protokolle verwendet werden, um die Gerüst Verunreinigungen zu bestimmen und Reinigungsprotokolle zu prüfen.
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Protocol
HINWEIS: immortalisierten humanen mesenchymalen Stromazellen Vorläuferzellen (SCP-1-Zellen) wurden für die Experimente verwendet. SCP-1 - Zellen wurden von Prof. Matthias Schieker 12 zur Verfügung gestellt.
1. Erweiterung der SCP-1-Zellen
- Bevor Sie mit dem SCP-1-Zellen zu arbeiten, reinigen richtig den Arbeitsbereich (mit der Bezeichnung Biosicherheitsschrank I) mit 70% Ethanol (v / v) mit Handschuhen.
- Im gereinigten Biosicherheitsschrank ein entsprechendes Volumen an Zellkulturmedium herzustellen , indem man die erforderlichen Komponenten Mischen , wie in Tabelle 1 angegeben. Um die Sterilität des Grundmediums zu erhalten, fügen Sie ergänzt , indem sie mit einer Porengröße von 0,22 um durch Sterilfilter durchströmt.
- Zur Vermeidung von Kontaminationen, Medium mindestens 24 Stunden vor dem Gebrauch vorzubereiten. Um seine Sterilität zu testen, inkubieren 1 ml Medium in einer Zellkulturplatte ohne Zellen in der Standard - Zellkulturbrutschrank: 37 ° C, 5% CO 2, 20% O 2 und 90% Luftfeuchtigkeit. Nach24 Stunden, überprüfen Medium mikroskopisch eine Vergrößerung von mindestens 200X verwendet wird.
- Pflegen SCP-1 - Zellen in einem Standard - Zellkultur - Inkubator mit unterstützenden Zustand: 37 ° C, 5% CO 2, 20% O 2 und 90% Luftfeuchtigkeit.
- Für die Wartung und Erweiterung, wachsen die SCP-1-Zellen, bis sie 80-90% Konfluenz erreichen. Während dieser Zeit Kulturzeit, Medium alle 2-3 Tage ändern. Bei Erreichen von 80-90% Konfluenz aufgeteilt SCP-1-Zellen (im Allgemeinen ein Verhältnis 1: 2) zum nächsten Durchgang für die Expansion oder die Platte für die Versuche (wie angegeben).
- Für die SCP-1-Zellen spalten, warm das Kulturmedium bei 37 ° C und Auftauen Trypsin / EDTA ein Wasserbad bei 37 ° C verwendet wird.
- aspirieren vollständig den Kulturmedium aus den 80-90% konfluenten Zellen und entsorgen Sie sie in einen Abfallbehälter.
- Waschen Sie die Zellen mindestens zweimal mit DPBS (Dulbecco Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung ohne Magnesium und Calcium, pH 7,2).
- Pipette ein geeignetes Volumen vonDPBS auf die Zellen (5 ml DPBS für eine T75 Kulturflasche und 12 ml für einen T175 Kulturkolben).
- Absaugen DPBS sorgfältig und entsorgen Sie sie in einen Abfallbehälter.
- Pipette ein geeignetes Volumen von 0,25% Trypsin / EDTA auf die Zellen (1 ml DPBS für einen T75-Kulturkolben und 2 ml für einen T175 Kulturkolben) und Inkubation für 5-10 min bei 37 ° C in der Standardzellkultur-Inkubator mit 5 % CO 2, 20% O 2 und 90% Luftfeuchtigkeit.
- Verdrängen die Zellen durch das Gefäß Klopfen und sicherzustellen, dass alle Zellen von der Kulturkunststoff (Trypsinbehandlung) abgelöst werden durch die schwimmenden Zellen unter dem Mikroskop beobachtet wird.
- Inactivate die Trypsin Reaktion von 10 ml Kulturmedium hinzugefügt wird. Mischen Sie die Trypsin und Zellen mit dem Medium sorgfältig durch wiederholtes Pipettieren.
- Übertragen die Zellsuspension in ein Reaktionsrohr und Zentrifuge bei 600 × g für 10 min bei Raumtemperatur.
- Den Überstand aspirieren und Zellpellet in 10 ml KulturMittel.
- Zählen Sie die Zellen durch Trypanblau-Ausschluss-Verfahren, wie in 2 beschriebenen Protokoll.
- Seed die Zellen in Abhängigkeit von der experimentellen Design.
2. Zählen von SCP-1-Zellen
- Durchführen einer Lebendzellzahl (Trypan Blau Ausschlussmethode) der resuspendierten Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers.
- Vor der Zellzahl, reinigen Sie den Hemocytometer Leitungswasser verwenden. Trocknen Sie die Hemocytometer Komponenten ein fusselfreies Gewebe verwenden. Montieren Sie es durch das Deckglas Befeuchten und es umgekehrt auf die beiden Glas Läufer auf jeder Seite des Zählfläche drücken. Stellen Sie sicher , dass die Newtonsche Ringe an den Glas Läufer zu sehen sind (Abbildung 1).
- Nehmen 10 & mgr; l der resuspendierten Zellen und mit 10 ul 0,1% Trypan Blau Lösung einen Verdünnungsfaktor von 2 zu erhalten.
- Last 10 ul der gesamten Probe auf dem vorgereinigten und Hemocytometer Kammer montiert.
- Zählen Sie die Anzahl der lebenden (weiß / transparent Zellen) und tot(blaue Kerne) Zellen auf den 4x4 Quadrate (siehe Abbildung 1B).
- Berechne die Gesamtzahl der Zellen nach der angegebenen Formel:
3. GFP Transfection von SCP-1-Zellen
HINWEIS: Um SCP-1-Zellwachstum auf und in das Gesttitangerüst über eine bestimmte Kulturperiode zu beobachten wir die Zellen mit grün fluoreszierende Protein (GFP) markiert. Überexpression von GFP wird durch eine Infektion mit Adenovirus-Partikel kodierend für GFP erreicht. Replikationsinkompetenten (-E1 / -E3) Adenoviruspartikel kodierend für grün fluoreszierendes Protein (GFP) wurden verwendet, SCP-1-Zellen zu infizieren. Die Viruspartikel wurden von Prof. Steven Dooley 13 , erhalten durch Kulturüberstand von rekombinanten Adenovirus (Ad5-GFP) transfizierten HEK293T - Zellen (Biosafety Labor II) zu sammeln. Drei Wiederholtes Einfrieren (-80 ° C) und Auftauen (37 ° C im Wasserbad) sichergestellt Zyklen dass keine HEK293T Zellen lebensfähig bleiben neue Viruspartikel zu erzeugen. Mit Hilfe dieses Adenovirus Lager Samen kann die SCP-1-Zellen effizient infizieren, ohne dass neue Viruspartikel zu erzeugen. Somit können die infizierten Zellen in einer biologischen Sicherheit Lab I. behandelt werden
- Resuspendieren der Zielzellen (SCP-1-Zellen) mit einer Aussaatdichte von 50.000 Zellen / ml in Kulturmedium. Pipette 2 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Gewebekulturplatte.
- in der Standard-Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C inkubieren; 5% CO 2, 20% O 2 und 90% Feuchtigkeit, bis SCP-1 - Zellen erreichen eine Konfluenz von 70-80%.
HINWEIS: Konfluenz hängt von der Aussaatdichte der Zellen. Aus den oben genannten Bedingungen erreichen SCP-1-Zellen eine Konfluenz von 70-80% in 1,5 bis 2 Tage. - Bei einer Konfluenz von 70-80%, ohne Absaugen das Kulturmedium pro 1 ml Kulturmedium 100 ul des Adenovirus Saatgut hinzuzufügen.
- Bestimmen die Konzentrationsbereich individuell abhängig von der Menge von Viruspartikeln in jedem Virus seed Stoffaufbereitung. Bei zu niedrig ist die Infektionseffizienz, zu reinigen und Viruspartikel mit verschiedenen im Handel erhältlichen Kits konzentrieren.
- Inkubieren für eine Stunde in der Standard - Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C (5% CO 2, 20% O 2 und 90% Luftfeuchtigkeit).
- Entfernen Sie das Kulturmedium, das Virus Saatgut enthält, und sammeln sie für die Entsorgung. In frischem Kulturmedium 2 ml pro Vertiefung einer 6-Well-Kulturplatte zu ergänzen.
- Stellen Sie sicher, dass vor der Entsorgung, Viruspartikel enthält, dem Medium autoklaviert wird.
- Bewerten Sie die intrazellulären GFP-Expression (Infektionseffizienz) 24 Stunden nach der Infektion ein Fluoreszenzmikroskop mit einem GFP-LED-Würfel / Filtersatz verwendet wird.
- Achten Sie auf die Zellmorphologie (Abbildung 2). Die Zellen aus der Kultur Kunststoff Ablösen können zu falsch positiven Ergebnissen führen.
4. Reinigung der Strick Titanium Scaffolds
- PSpitzen bis zu 5 Gerüste in einem 50 ml Reaktionsröhrchen.
- Waschen Sie das Gerüst (6-7 mm Dicke), dreimal mit 30 ml destilliertem entionisiertem Wasser für 20 min bei Raumtemperatur, rotor Bedingungen mit (8 xg).
- Ersetzen Sie die destilliertem entionisiertem Wasser mit 30 ml 1% (w / v) Triton-X-100-Lösung (gelöst in destilliertem entionisiertem Wasser) und dann waschen Sie die Gerüste einmal für 20 Minuten bei Raumtemperatur, Rotor Bedingungen mit (8 · g) .
- Entsorgen Sie das Triton-X-100-Lösung, gefolgt von Waschen mit 30 ml destilliertem entionisiertem Wasser zweimal (jeweils 5 Minuten bei Raumtemperatur) Aufrechterhaltung Rotor Bedingungen (8 × g).
- Ersetzen Sie die destilliertem entionisiertem Wasser. Spülen Sie die Gerüste nacheinander mit Reagenzqualität 99% Aceton, 99% Isopropanol und 99% Ethanol (jeweils 30 ml) für 2 x 5 min jeweils in einem Ultraschallbad (~ 50 Hz, 50 W, 220-240 V).
- Nachwaschen dreimal mit 30 ml destilliertem entionisiertem Wasser für 5 min, Ultraschallbad Behandlung konstant gehalten wird.
- Legen Sie die scaffolds auf einem fusselfreien Tuch, um trockene Nacht bei Raumtemperatur an der Luft.
- Autoklaviert das Gerüst für 15 min bei 121 ° C mit 15 psi.
- Bestätigen Sie das Reinigungsprotokoll durch indirekte Fluoreszenz wie in Protokoll 5 beschrieben.
5. Imaging Gerüstbauten durch indirekte Fluoreszenz
Hinweis: Das vorliegende Protokoll beschreibt die Abbildung von Gerüststrukturen, die durch indirekte Fluoreszenz des Fluorophors SulforhodaminB verwendet, die bei einer ex / em Wellenlänge von 565/586 nm eine leuchtend rote Fluoreszenz gibt. Jedoch kann das Fluorophor an besseren Sitz für vorgegebene Einstellungen des Mikroskops oder möglichen Autofluoreszenz des Gerüsts verändert werden.
- Bereiten Sie die SulforhodaminB Färbelösung (0,04%) in 1% Essigsäure und bei Raumtemperatur lagern mit Lichtschutz.
- Nehmen Sie eine 24-Well-Gewebekulturplatte und tauchen Sie das gereinigte Gerüst in 500 ul der SulforhodaminB Färbelösung, indem sie inside die gut mit einer Pinzette.
- Erfassen Sie die negativen Bilder des Gerüsts unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskop.
- Nehmen Sie Bilder mit einem RFP LED Würfel / Filter-Set mit einer Anregungswellenlänge von 531/40 nm und einer Emissionswellenlänge von 593/40 nm. Alternativ wählen , die eine ausreichende Anregungs- und Emissionswellenlänge mit Hilfe des Fluoreszenz - spektralen Betrachter 20. Sulforhodamin B hat seine Spitzen Anregung bei 578 nm und seine Spitzenemission bei 593 nm.
- Um die Gerüststruktur, um Bilder mit niedriger Vergrößerung, zB 4X oder 10X (Abbildung 3) zu visualisieren. Unter Verwendung dieser Bilder, bestimmen Eigenschaften, beispielsweise die Porengröße und Form mit Hilfe des ImageJ.
- Um Gerüst Verunreinigungen zu erfassen, nehmen Sie Bilder mit einer höheren Vergrößerung, zB 20X oder 40X, wenn man bedenkt , dass dies die Analyse Tiefe begrenzen. Stellen Sie sicher , dass Schmutzpartikel / Stoffe , die nicht zu sehen sind (siehe repräsentative Ergebnisse sind ;ure 3).
6. In - vitro - Biokompatibilität Assay
- Pre-warm das Kulturmedium bei 37 ° C in einem Wasserbad.
- Nehmen Sie eine 24-Well-Gewebekulturplatte und mit einer Pinzette, legen Sie die gereinigt und sterilisiert Gerüste in jedem Test gut aseptisch. Die Arbeiten im Rahmen der vorgereinigte Biosicherheitsschrank I!
- Tränken / brüten die Gerüste mit einem Kulturmedium für etwa 15 min (500 & mgr; l pro Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte), um Luft zu entfernen, aus dem Inneren des Gerüsts.
- Inzwischen resuspendieren 500.000 Ad-GFP-infizierten SCP1 Zellen in 1 ml Kulturmedium.
- Nach 15 min Gerüst Einweichen, aspirieren das Medium vollständig aus dem Gerüst.
- Für die Zellen auf dem Gerüst Aussäen werden 100 & mgr; l der Zellsuspension vorsichtig auf die Gerüstoberfläche (die in 24-Well-Platte gelegt wird). Halten Sie einen Mindestvolumen der Zellsuspension, während die Zellen der Aussaat, so dass kein Medium, um sicherzustellen, fließt out des Gerüsts.
- Inkubieren der Zellen für 30 min bei 37 ° C in der Standardzellkultur - Inkubator (5% CO 2, 20% O 2 und 90% Luftfeuchtigkeit).
- Hinzufügen 500 ul mehr Kulturmedium und Inkubation für 24 Stunden in Standard - Zellkulturbrutschrank (37 ° C, 5% CO 2, 20% O 2 und 90% Luftfeuchtigkeit).
- Bewerten Sie die Zelladhäsion Muster und Zelle auf der Gerüstoberfläche Ausbreiten eines Fluoreszenzmikroskop.
- Nehmen Sie Bilder mit einem GFP-LED-Würfel / Filter-Set mit einer Anregungswellenlänge von 470/22 nm und einer Emissionswellenlänge von 510/42 nm. Alternativ wählen, die eine ausreichende Anregungs- und Emissionswellenlänge mit Hilfe des Fluoreszenz-spektralen Betrachter. GFP hat seine Spitzen Anregung bei 488 nm und die Spitzenemission bei 507 nm.
- Um die Zellhaftung Muster erfassen Bilder bei niedrigen Vergrößerungen, zB 4X oder 10X (Abbildung 4) zu visualisieren. Um zu beobachten Zelle eine höhere mag Verbreitunggrößerung (mindestens 100 x) ist erforderlich - die Fokustiefe zu begrenzen.
- Für weitere Zelle Auswertung auf der Gerüstoberfläche ausbreitet, fixieren die Zellen mit 4% Formalin und gehen mit herkömmlichen Fluoreszenzfärbung von Zellstrukturen, zB Aktinfilamente (Phalloidin). Jedoch passen Inkubationszeiten und fluoreszierende Markierung der Antikörper , um 14 die einzelnen Gerüsteigenschaften, beispielsweise Diffusionszeiten oder Autofluoreszenz zu passen.
- Am nächsten Tag, ändern Sie das Kulturmedium nicht haftende Zellen zu entfernen.
- Der prozentuale Anteil von anhaftenden Zellen auf dem Gerüst durch Resazurin Umwandlung Messung wie in Protokoll 7 beschrieben.
Abbildung 5: Timeline von in - vitro - Test (A) Versuchsaufbau für Zellen Plattierung.. (B Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
7. Resazurin Conversion Messung
HINWEIS: Resazurin Konversionstest die mitochondriale Aktivität zu messen und damit indirekt die Zellproliferation verwendet wird. Resazurin zu Resorufin Verringerung erzeugt ein fluoreszierendes Signal, das auf der mitochondrialen Aktivität basiert , die mit lebensfähigen Zellzahlen (7A).
- aspirieren vollständig den Kulturmedium aus den SCP-1-Zellen und entsorgen Sie sie in einen Abfallbehälter.
- Waschen Sie die SCP-1-Zellen einmal mit DPBS abgelösten Zellen zu entfernen. In 500 ul DPBS pro Well der 24-Well-Gewebekulturplatte enthält SCP-1-Zellen auf dem Gerüst.
- Decken Sie die Zellen mit einer erforderlichen Uhrount steriler Resazurin - Arbeitslösung (0,25% Resazurin in Kulturmedium) und bei 37 ° C in der Standardzellkultur - Inkubator (5% CO 2, 20% O 2 und 90% Luftfeuchtigkeit) für 30 min inkubieren.
- Notieren Sie, dass; Inkubationszeit hängt vom Zelltyp und der Zelldichte. Sie kann zwischen 10 min und 6 Stunden variieren. Optimierte Inkubationszeit für SCP-1-Zellen 30 min.
- Als Hintergrundkontrolle, mindestens eine gut mit der Resazurin - Arbeitslösung , aber ohne Zellen, das bei 37 ° C in der Standardzellkultur - Inkubator (5% CO 2, 20% O 2 und 90% Luftfeuchtigkeit) für die gleiche inkubiert Zeitraum.
- Transfer 100 ul konditionierten Überstand aus jeder Vertiefung der 24-Well-Gewebekulturplatte in eine 96-Mikrotiterplatte.
- Waschen der verbleibenden Zellen dreimal mit 1 ml DPBS für 5 min bei Raumtemperatur, um Rest Resazurin Arbeitslösung zu entfernen. Nach dem dritten Waschen Kulturmedium t hinzufügeno die Implantate mit SCP-1 - Zellen (500 & mgr; l pro Well der 24-Well - Gewebekulturplatte) angeschlossen und Inkubation bei 37 ° C in der Standardzellkultur - Inkubator (5% CO 2, 20% O 2 und 90% Luftfeuchtigkeit) zur weiteren Zeitverlauf Messungen.
- Stellen Sie sicher, Replikate bei diesem Schritt zur Einrichtung (2-4), um Pipettierfehler zu minimieren.
- In der Zwischenzeit setzen die 96-Mikrotiterplatte in den Mikroplatten-Reader und messen die Fluoreszenz des gebildeten Resorufin.
- Um Hintergrundsignal, zu messen Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 545 nm und einer Emissionswellenlänge von 585 nm zu reduzieren.
- Alternativ wählen, die eine ausreichende Anregungs- und Emissionswellenlänge mit Hilfe des Fluoreszenz-spektralen Betrachter. Resorufin hat seine Spitzen Anregung bei 572 nm und die Spitzenemission bei 585 nm. Die gegebene Signalstärke ist ein Mittelwert von 25 Einzelmessungen (25 Blitze pro Vertiefung).
- Messen Sie die fluorescence gebildet Resorufin in konditioniertem Medium, eine untere Optik verwendet wird.
- Notieren Sie, dass die Verstärkung auf der durchschnittlichen Menge von Resazurin hängt umgewandelt und zwischen 10 und 4.000 variieren kann. Stellen Sie die Verstärkung auf den einzelnen Mikrotiterplatten-Lesegerät durch Pipettieren einer Resorufin-Standardkurve verwendet wird, so dass das Fluoreszenzsignal unter 80% der maximalen Signalintensität nachweisbar ist (in diesem Fall 20000). Die optimierte Verstärkung für SCP-1-Zellen ist 800.
- Ziehen Sie das Hintergrundsignal (Resazurin Arbeitslösung ohne Zellen) aus dem Signal der Testproben.
- Je nach Versuchsaufbau / Zweck, gehen Sie mit weiteren Schritten:
- Berechne den Prozentsatz der Lebensfähigkeit der Zellen auf dem Gerüst eine Standardkurve verwendet wird. Machen Sie eine individuelle Standardkurve separat für jede Zelllinie verwendet.
- Analyse des Zellwachstums / Proliferation durch die relative Zunahme in Resazurin Umwandlung im gesamten Kultivierungszeit abzuschätzen. Für diese Berechnung eingestelltdie Resazurin Umwandlung am Tag 1 als Referenz. Frisch Vorbereitung für diese Art von Analyse der Resazurin Arbeitslösung. Darüber hinaus müssen die Inkubationszeiten zwischen den einzelnen Messungen gleich sein.
- Wiederholen Sie das gesamte Protokoll von Resazurin Umwandlung Messung mindestens dreimal konsistente Ergebnisse zu erhalten.
8. Live-toten Anfärben
- Platte, die die SCP1 Zellen auf dem Gerüst mit einer Aussaatdichte von 50.000 Zellen / Gerüst und lassen Sie es auf dem Gerüst halten die Standard-Zellkulturbedingungen (siehe Protokoll 1 und 2) zu wachsen.
- Nach 24-48 Stunden vollständig das Kulturmedium aus den SCP-1-Zellen anzusaugen und sie in einen Abfallbehälter verwerfen.
- Waschen Sie die SCP-1-Zellen einmal mit DPBS abgelösten Zellen zu entfernen. In 500 ul DPBS pro Well der 24-Well-Gewebekulturplatte und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur.
- Stain SCP-1 unter Verwendung von Fluorophoren (alle drei Flecken in der gleichen Zeit):
- Von jetzt anhalten die Gerüste in der Dunkelheit, um die Fluorophore Bleichen von Tageslicht zu schützen!
- Stellen Sie eine Inkubationszeit auf 30 Minuten, um eine gleichmäßige Verteilung im gesamten Gerüst zu ermöglichen. Wenn auf andere Gerüste übertragen, stellen Sie sicher , dass die Inkubationszeiten zu optimieren , um fit die einzelnen Gerüsteigenschaften (Porengröße, Gerüsttiefe, etc.).
- Um lebensfähigen Zellen auf dem Gerüst zu erfassen, die Zellen mit Calcein-AM in einer Endkonzentration von 2 uM Farbstoff (in Kulturmedium).
- Um alle Zellen auf dem Gerüst zu erfassen, beflecken die Zellen mit Hoechst 33342 in einer Endkonzentration von 0,002 & mgr; g / & mgr; l (in Kulturmedium).
- Um abgestorbene Zellen zu erkennen, bebrüten das Gerüst mit Ethidiumhomodimer bei einer Endkonzentration von 4 & mgr; M (in Kulturmedium).
- Nach der Inkubationszeit, waschen Sie die Zellen 3 mal mit DPBS (1 ml pro Vertiefung) für jede 5 Minuten bei Raumtemperatur.
- Nehmen Sie sofort Bilds durch ein Fluoreszenzmikroskop.
- Machen Sie Fotos von der Calcein (lebende Zellen) mit einem GFP-LED-Würfel / Filtersatz (Anregungs- und Emissionswellenlänge von 470/22 nm und 510/42 nm, beziehungsweise). eine ausreichende Anregungs- und Emissionswellenlänge mit Hilfe des Fluoreszenz-spektralen viewer alternativ auswählen. Calcein hat seine Spitzen Anregung bei 488 nm und die Spitzenemission bei 507 nm. Hinweis: Sicherstellen, dass nicht GFP transfizierten Zellen für die Fluoreszenzfärbung mit Calcein oder andere grün fluoreszierenden Flecken zu verwenden.
- Machen Sie Fotos von der Hoechst 33342 mit einem DAPI LED Würfel / Filter-Set mit einer Anregungswellenlänge von 357/44 nm und einer Emissionswellenlänge von 447/60 nm. Alternativ wählen, die eine ausreichende Anregungs- und Emissionswellenlänge mit Hilfe des Fluoreszenz-spektralen Betrachter. Hoechst 33342 hat seine Spitzen Anregung bei 347 nm und seine Spitzenemission bei 483 nm.
- Machen Sie Fotos von der Ethidiumhomodimer mit einem RFP LED Würfel / Filtersatz (Anregungs- und Emissionswellenlänge of 531/40 nm und 593/40 nm, respectively). Alternativ wählen, die eine ausreichende Anregungs- und Emissionswellenlänge mit Hilfe des Fluoreszenz-spektralen Betrachter. Ethidium Homodimer hat seine Spitzen Anregung bei 530 nm und die Spitzenemission bei 618 nm.
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Representative Results
Vorläufige Ergebnisse zeigten, dass die beschriebenen neuen Kern Implantat nicht nur gute Dämpfungseigenschaften besitzt, sondern auch biokompatibel ist mit SCP-1-Zellen. Während des Herstellungsprozesses des Implantats, kommt es in Kontakt mit starken korrosiven und toxischen Stoffen (Schmiermittel, Beizmittel, Elektropolierlösung). Mit Hilfe der indirekten Fluoreszenzfärbungstechniken konnten wir restlichen Verunreinigungen sichtbar zu machen und damit ein Reinigungsprotokoll zeigt signifikante Reduktion in Substanz Last auf dem Gerüst zu optimieren. 3 zeigt die Effizienz des etablierten Reinigungsprotokoll.
Der Erfolg von Implantaten für die Endoprothetik Behandlung verwendet wird , durch Ereignisse bestimmt, die an der Zell-Material - Schnittstelle nimmt. Abbildung 4 zeigt die auf dem Gerüst befestigt Zellen nach 24 Stunden der Beschichtung, wie im Protokoll Abschnitt 6 eine signifikante beschrieben transfektion Effizienz der SCP-1 - Zellen wurde beobachtet , wie wir konnten Bild , um das Wachstumsmuster von mesenchymalen Stromazellen Vorläuferzellen auf dem Gerüst (siehe Abbildung 2). Direkte Visualisierung bestätigt die Biokompatibilität des Gerüsts und stellt auch die Einhaltung Muster auf der Gerüstoberfläche (Abbildung 4). Fluoreszenzfärbung kann weiter durchgeführt werden mit Zell-Wechselwirkung zu untersuchen und die Verbreitung auf dem Gerüst Oberfläche.
Fluorophore wurden zu untersuchen, um den Zelltod und Proliferation über einen bestimmten Zeitraum auf dem Gerüst erfolgreich angewendet. Live-dead-Anfärbung Bilder veranschaulichen, wie Färbung kann erfolgreich auf dem Gerüst durchgeführt werden , um die prozentuale Lebensfähigkeit der Zellen über einen bestimmten Zeitraum , um zu bestätigen, Fig . 6 zeigt blaue nukleäre Färbung (Hoechst 3342) in allen Zellen, rot fluoreszierend markierten (Ethidium Homodimer) abgestorbenen Zellen und grün Kennzeichnung für den Einbau von Calcein-AM als Lebensfähigkeit marker. Calcein AM wird an Calcein umgewandelt, welches in Gegenwart von Calciumionen im Cytoplasma der Zellen, die eine helle grüne Fluoreszenz zeigt. Hoechst 33342 ist die Zellwand permeabel und interkaliert in die zelluläre DNA. Auf diese Weise werden alle Zellen zeigen blaue Kerne (siehe Abbildung 6). Ethidium Homodimer ist keine Zellwand permeabel, so wird es nur interkalieren in die DNA der toten Zellen. Auf diese Weise werden tote Zellen rot Kerne zeigen. Weiterhin Lebensfähigkeit Zelle und fache Zunahme der Zellzahl am Gerüst über eine Woche wurde von Resazurin Umwandlungsassay quantifiziert und graphisch (7) dargestellt.
Abbildung 1: Zelle mit einem Hämocytometer gezählt (A) Aufbau einer Kammeranordnung.. (B) Abbildung der Zählkammern; 4 x 4 Zählkammer wird für eine Zelle cou verwendetnt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb . 2: GFP Transfektionseffizienz SCP1 Zellen zeigen eine starke grüne Fluoreszenz , die positive Ad-GFP- Transfektionseffizienz. Maßstabsbalken = 1000 & mgr; m, 4 - fache Vergrößerung. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Sulforhodamin B - Färbung negative Bilder erfassen (A) Scaffold vor der Reinigung.. Der Pfeil zeigt das Vorhandensein von giftigen / ätzenden Substanzen auf Schafott. (B) Scaffold nach dem Reinigungsprotokoll. Maßstabsbalken = 1000 & mgr; m, 4 - fache Vergrößerung. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb . 4: Adherence Muster SCP1 Zellen auf Gerüst GFP - Signal anzeigt , auf der Oberfläche des Gesttitangerüst Zellhaftung und Wachstumsmuster. Maßstabsbalken = 1000 & mgr; m, 4 - fache Vergrößerung. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Co-Fluoreszenzfärbung von Zellen auf Gerüst (.
Abbildung 7: Resazurin Umwandlungsassay (A) Biochemical Reduktionsreaktion von Redox - Farbstoffes (Resazurin) zu einem Endprodukt (Resorufin) , die Fluoreszenz emittiert und durchläuft kolorimetrische Veränderungen.. (B) mitochondriale Aktivität wurde gemessen , wenn Zellen auf 0,75 mg / cm³ Dichte Gerüst ausplattiert. Die Daten wurden gesammelt fl mituorescence basierte Messgerät. Fluoreszenzintensität bei 590 nm (y-Achse) zu definierten Zeitpunkten (x-Achse) wird als Ergebnis der quantitativen Messung der Lebensfähigkeit der Zellen (Ex = 540 nm, Em = 590 nm) dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mit Zwei-Wege-ANOVA und Standardfehler des Mittelwertes (SEM) bestimmt wird als Fehlerbalken gezeigt. Unter Berücksichtigung der Gerüst physikalischen Eigenschaften, zB Porengröße und die mechanischen Eigenschaften zusammen (zB Dämpfungsmerkmal), 0,75 mg / cm³ Dichte Gerüst für die Biokompatibilität Charakterisierung verwendet wurde. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Media - Komponenten | Konzentration |
| Basal & agr; MEM-Medien (%) | 90 |
| Serum (%) | 10 |
| Pen / Strep (%) | 1 |
Tabelle 1: Zellkultur (& agr; MEM) Medien Zusammensetzung.
| Problem | Ursache | Lösung |
| Die Lebensfähigkeit der Zellen Bildgebung auf Undurchsichtige Gerüst | Scaffold verhindert, dass Licht durchdringen, ohne Verzerrung | Verwenden Sie Fluorophor basierte Bildgebungstechnik für die Zell Beurteilung. |
| Störungen der Fluoreszenzintensität | Auto-Fluoreszenz, Hintergrundsignal | Achten Sie auf die Fluorophore und Anwendung einer geeigneten basierend auf bestimmten Gerüst Eigenschaften. |
| Die Lebensfähigkeit der Zellen Beurteilung auf Gerüst über eine Kulturperiode | Repeated Messungen über eine lange Zeit | Transfektion von Zellen mit Ad-GFP-Viruspartikel. |
| Zell Funktionalität Beurteilung auf nicht transparente Gerüst | Fluoreszenz-Imaging-Technik ermöglicht nur die Zellausbreitung Musteranalyse. | Führen Resazurin Umwandlungsassay (quantitative Messung der Lebensfähigkeit der Zellen) in Kombination mit bildgebenden Verfahren. |
Tabelle 2: Übersichtstabelle: Fehlerbehebung der Lebensfähigkeit der Zellen Bildgebung auf nicht-transparenten Gerüst.
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Discussion
Die Gerüstoberfläche spielt eine wichtige Rolle in ihrer Wechselwirkung mit dem Gewebe in vivo umgibt , wodurch Implantate funktionelle Haltbarkeit zu bestimmen. Somit wird die Bioverträglichkeit des Gerüsts durch in vitro - Assays untersucht unter Verwendung von Zellen (SCP1 - Zelllinie), wenn sie auf die Gerüste überzogen.
Mikroskopie-Techniken, die gut funktionieren, mit dünnen und optisch transparenten Gerüste sind schlecht geeignet für nicht transparente Gerüste die Biokompatibilität zu studieren. Dies ist vor allem , weil die nicht-transparenten Gerüste 15 Licht eindringt , ohne signifikante Verzerrung zu verhindern. Teilweise diese Probleme zu überwinden, haben wir eine Methode zur Zell Beurteilung auf / in gestrickter Titan Gerüste unter Verwendung verschiedener Fluorophore hiermit herzustellen.
Um Stricken zu ermöglichen, der Titandrähte, gefolgt von Falten, kommt das Material in Kontakt mit starken korrosiven und toxischen Substanzen (Schmiermittel, Beizmittel, elektro-Polierscheiben Lösung), die die Biokompatibilität des Gerüsts verändern könnten, wenn die Spuren auf dem Gerüst in / bleiben. Mit Hilfe eines entwickelten indirekten Fluoreszenz-Protokoll (Protokoll 5) konnten wir die Gerüststruktur zu visualisieren. Weiterhin Gerüsteigenschaften, beispielsweise die Materialdicke, die einzelnen Porengröße und -form oder Binde- Dichte wurden unter Verwendung ImageJ analysiert. Eine höhere vergrößertes epifluoreszenzmikroskopischen Bild Verunreinigungen im Gerüst sowie auf dem Gerüst Oberfläche erlaubt die Visualisierung. 3b Abbildung stellt somit das bestätigende Ergebnis der erfolgreich entwickelten Reinigungsprotokoll. Das Prinzip dieser indirekten Färbeprotokoll kann leicht auf andere nicht transparente Gerüste reproduziert werden, unter Berücksichtigung der einzelnen Gerüsteigenschaften, beispielsweise die Porengröße und entsprechende Diffusions die die Inkubationszeit auswirkt. Auch Autofluoreszenz des Gerüsts und mikroskopischen Einstellungen wirkt sich auf die Wahl des fluorophores verwendet. Das Online-Tool Fluoreszenz spektrale Betrachter kann helfen, die ausreichend Fluorophore zu wählen.
Zell-Metall-Wechselwirkung wurde durch die Analyse der Adhärenz Muster von Zellen auf dem Gerüst indirekt untersucht. 6 Protokoll beschreibt die Methodik, wie Zellen in vitro überwacht werden , wenn plattiert auf nichttransparenten Gerüste in Kultursystemen durch eine GFP Transfektion Strategie. Basierend auf vorläufigen Ergebnisse von in vitro - Tests hat es vorausgesagt worden , dass die Oberflächeneigenschaften , wie beispielsweise Zusammensetzung, Mikro-Topographie und Rauheit 16 könnte eine wichtige Rolle spielen bei der Festlegung Anhaftung und Ausbreitung von Zielzellen. Titan ist ein Biomaterial könnte somit als Substrat Vorlage handeln Basis zu schaffen für die Zellbindung (siehe Abbildung 4).
Implantatoberflächentopographie wurde berichtet , 16 Zellverhalten zu beeinflussen. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die Zellwachstum /Verbreitung und die Lebensfähigkeit unter Verwendung von Fluoreszenzfärbungstechniken in Kombination mit quantitativen Viabilitätsmessungen. Die Analyse ergab, subtile Variation in Prozent Lebensfähigkeit Zelle und Ausbreitung in Abhängigkeit von dem Gerüstmaterial. Allerdings beurteilt Zellfunktionalität quantitativ durch Resazurin Konversionstest (mitochondriale Aktivität), war nicht signifikant von dem Gerüstmaterial beeinflusst. Die Messung der mitochondrialen Aktivität durch Umwandlung Resazurin hat den Vorteil, dass es nicht toxisch ist und die Zelle kann so wiederholt über eine lange Kulturdauer durchgeführt werden. Besondere Vorsicht ist geboten, wenn aus Rest Resazurin Arbeitslösung waschen, wenn man so nicht das Hintergrundsignal (falsch-positive Ergebnisse) akkumulieren. Trotz dieser Vorteile wird der Resazurin Konversionstest geben keine Informationen über die Zelle auf dem Gerüst zu verbreiten. Die GFP-infizierten Zellen daher über eine lange Kulturdauer verfolgt werden (GFP-Signal konstant blieb für mehr als 14 Tage), wodurch s zu visualisierenpecific Wachstumsmuster auf dem Gerüst Oberfläche. Visualisierung von Zellen tiefer in das Gerüst wird noch durch das Gerüstmaterial begrenzt und somit wird Dissektion des Implantats erforderlich. Die Kombination dieser beiden Techniken hat den großen Vorteil, dass sie leicht auf andere Zelltypen übertragen werden können, wenn man bedenkt, dass die Inkubationszeit für den Zelltyp von Interesse angepasst werden könnte haben. Doch darauf zu achten hat , wenn diese Methode , um andere nicht-transparenten Gerüste übertragen, beispielsweise auf Kollagenbasis , Gerüste , die im Allgemeinen eine starke grüne Autofluoreszenz 17 aufweisen. In diesem Fall andere Fluoreszenzmarkierungen verwendet werden könnten. Die Kombination der oben genannten zwei Verfahren hat daher verschiedene Vorteile (siehe Tabelle 2).
Scaffold Eigenschaften, zum Beispiel die Porengröße Macht Falle Zellen im Inneren des Schafott. Wenn nicht genügend Nährstoffe zugeführt werden, könnten diese Zellen sterben und absondern Proteasen, die die Lebensfähigkeit der Zellen des Surround beeinflussening Zellen / Gewebe. Wir konnten eine fluoreszierende Basis Färbeprotokolls anzupassen, die lebenden und toten Zellen in und auf dem gestrickten Titangerüst sichtbar zu machen vermag. Ähnlich wie bei der indirekten Fluoreszenzfärbung kann das Prinzip dieser Färbeprotokolls leicht auf andere nicht-transparenten Gerüste übertragen werden. Während dabei die einzelnen Gerüsteigenschaften, beispielsweise Porengröße und entsprechende Diffusions sowie mögliche Autofluoreszenz weisen mikroskopische Einstellung berücksichtigt werden , da sie die Inkubationszeit und die Auswahl von Fluorophoren verwendet beeinträchtigen könnten. Auch hier das Online-Tool Fluoreszenz spektrale Betrachter kann helfen, die ausreichend Fluorophore zu wählen.
Zusammenfassend zeigen in vitro Ergebnisse , dass das Gest vorgeschlagen Titan Kern Implantatmodell ein biologisches Profil hat. Erste Befestigung von mesenchymalen Stromazellen Vorläuferzellen (SCP-1-Zellen) zu diesem Material lässt vermuten, dass diese Titanlegierung Implantat material ist biokompatibel. Obwohl wir Assoziation von verschiedenen topographischen Parameter nicht analysiert haben, können Gerüstoberflächenmodifikation Zelladhäsion Proliferation verbessern sowie Differenzierung 18. Optimale Kompatibilität zwischen Gerüst und Zellen erhöhen die Wahrscheinlichkeit für eine bessere Implantatintegration in das umgebende Gewebe und so in vivo Langlebigkeit verbessert nach der Behandlung 19. die oben genannten Testaufbau Mit eröffnet die Möglichkeit zur Verbesserung der biologischen Leistung des Gerüsts durch Oberflächenmodifikationen induziert zu messen und zu visualisieren. Die Bevorzugung von Gerüsten mit bioaktiven Oberfläche über unmodifizierten Implantatdesigns schlägt vor , die eine bessere Leistung 20 in Bezug auf die Osteo-chondrogenes Integration. Diese Studie wird durch andere Berichte über die Gesttitanimplantat , wo seine mechanischen Eigenschaften und Bioaktivität weiter verbessert wurden 6,7 berichtet.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben. Kein Teil der Arbeit wurde oder wird derzeit geprüft zur Veröffentlichung oder wurde an anderer Stelle veröffentlicht.
Acknowledgments
Das Projekt wird teilweise finanziert durch Zentralen Innovationsprogramms Mittelstand (ZIM) des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie -KF3010902AJ4. Die Veröffentlichungsgebühr wurde von der BG Unfallkrankenhaus Tübingen, Deutschland abgedeckt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/24/48 well plates, T25/ T75 culture flask | Greiner Bio-One GmbH | * | |
| * 24 well plates | Greiner Bio-One GmbH | CELLSTAR 662 160 | |
| * 48 well plates | Corning Incorporated USA | 3548 | |
| * 6 well plates | Falcon | 353046 | |
| * T25 | Greiner Bio-One GmbH | 690 175 | |
| * T75 | Greiner Bio-One GmbH | 658 175 | |
| Acetic acid, purum ≥ 99.0% | Carl Roth | 3738.4 | |
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 | |
| Axioplan-2 | Carl Zeiss, Germany | ||
| Biological safety cabinets | Thermo Scientific | safe 2020 | |
| Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) | Sigma | 17783 | |
| Cell Culture Incubtator | Binder, Tuttlingen, Germany | 9040-0078 | |
| Filter unit (0.22 µm) | Millipore, IRL | SLGP033RS | |
| Centrifuges 5810 R And 5417 R | Thermo Fisher Scientific, NY | Megafuge 40R | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Carl Roth | 4720.2 | |
| Dulbecco’s PBS without Ca & Mg | Sigma | H15-002 | |
| Ethanol 99% | SAV liquid prod. GmBH | 475956 | |
| Ethidium homodimer | Sigma | 46043 | |
| EVOS Fluorescence imaging system | Life technologies | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, PA, USA | ||
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533-100MG | |
| Knitted titanium nucleus implant | Buck co & KG,Germany | ||
| MEM Alpha Modification with Glutamine w/o nucleoside | Sigma | E15-832 | |
| Omega microplate Reader | BMG Labtech,Germany | FLUOstar Omega | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P11-010 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma | 199303-1G | |
| Sulforhodamine B sodium salt | Sigma | S1402-1G | |
| Test tube rotator | Labinco B.V.,The Netherlands | Model LD-76 | |
| TRIS (hydroxymethyl) aminomethan | Carl Roth | AE15.1 | |
| Triton | Carl Roth | 3051.2 | |
| Trypan Blue 0.5% | Carl Roth | CN76.1 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma | L11-004 |
References
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