Summary
Qui presentiamo una tecnica di imaging fluoroforo base per rilevare la vitalità cellulare su uno scaffold di titanio non trasparente nonché per rilevare intravedere le impurità dell'impalcatura. Questo protocollo risolve i l'inconveniente di immaginare interazioni cellula-cellula o cellula-metallo su impalcature non trasparenti.
Introduction
mal di schiena cronico è una malattia multifattoriale. L'interesse per una opzione di trattamento minimamente invasivo per la malattia degenerativa del disco è cresciuta dal 1950. Fino ad oggi, multi-segmentale fusione della colonna vertebrale è il trattamento più utilizzato. Poiché questo metodo porta spesso a limitazioni nella mobilità del segmento interessato 1,2, esplorazione del periodo artroplastica diventato un grande interesse. Avanzamenti significativi nella sostituzione totale sostituzione del disco e il nucleo è diventata una valida alternativa per il trattamento di mal di schiena cronico 1. Nonostante gli enormi progressi, nessuno dei metodi è stata valutata clinicamente. Gli impianti nucleo meno rigide rappresentano una promettente alternativa per la sostituzione totale del disco, a condizione che l'anello fibroso è intatto 3,4. Tuttavia, gli impianti attualmente presenti nucleo sul mercato sono spesso associati a complicanze come i cambiamenti nel corpo vertebrale, la dislocazione, la perdita di altezza verticale del disco e tegli mancanza della necessaria associato rigidità meccanica 5. Per superare gli inconvenienti attuali, un romanzo protesi nucleo di fili di titanio maglia è stato sviluppato con successo 6. A causa della struttura a maglia unico, questo scaffold recente sviluppato ha dimostrato caratteristiche distinte biomeccaniche, ad esempio, funzione di smorzamento, dimensione dei pori, la capacità di carico e affidabilità 7. Allo scopo di testare la biocompatibilità di questo romanzo dell'impianto nucleo, raffigurato severe limitazioni nelle (ottici) tecniche di analisi attribuite alla natura non trasparente dell'impianto.
Per testare la biocompatibilità, interazioni cellula-metallo svolge un ruolo importante 8-10. Una interazione tra le cellule e scaffold è necessario per la stabilizzazione e quindi per l'integrazione dell'impianto meglio nel sistema host. Tuttavia, una profondità ingrowth crescenti potrebbero alterare le proprietà meccaniche del ponteggio. Con l'obiettivo di investigate se la superficie scaffold fornisce una base per l'adesione cellulare, la proliferazione e la differenziazione o se il metallo colpisce vitalità cellulare, è importante per risolvere il comune problema ben noto di formazione immagine celle / in ponteggi non trasparenti e opachi. Per superare questa limitazione vari fluorescenti sono state esplorate tecniche basate. Le aziende offrono una vasta gamma di fluorofori di visualizzare le cellule viventi, compartimenti cellulari, o stati cellulari anche specifici 11. Fluorofori per questo esperimento sono stati scelti con l'aiuto dello strumento spettatore spettrale on-line, al fine di adattarsi al meglio il nostro microscopio a fluorescenza.
La strategia sviluppata per l'analisi del comportamento cellule aderenti sul / nel non trasparente scaffold di titanio maglia comporta quanto segue: 1) fluorescente (proteina fluorescente verde / GFP) etichettatura delle cellule osteochondro-progenitrici per consentire il monitoraggio delle cellule sulla impalcatura, 2) la misura della redditività (mitoattività mitocondriale) delle celle, e 3) la visualizzazione cellula-cellula e le interazioni cellula-materiale all'interno del ponteggio. La procedura ha il vantaggio di poter essere facilmente trasferito ad altre cellule aderenti e altre scaffold non trasparente o opaco. Inoltre, la vitalità ed il modello ricrescita possono essere monitorati per diversi giorni, quindi può essere utilizzato con quantità limitate di materiale scaffold o le celle.
Il presente studio dimostra l'uso di successo del nostro protocollo corrente per misurare la vitalità cellulare e visualizzare modello in-crescita di cellule progenitrici osteochondro-on / nel non trasparente impalcatura titanio maglia. Inoltre, i protocolli sviluppati potrebbero essere utilizzati per determinare le impurità scaffold e verificare protocolli di pulizia.
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Protocol
NOTA: Immortalata cellule stromali mesenchimali umane precursori (SCP-1 le cellule) sono stati utilizzati per gli esperimenti. SCP-1 le cellule sono stati forniti dal Prof. Matthias Schieker 12.
1. Ampliamento della SCP-1 le cellule
- Prima di lavorare con le cellule SCP-1, pulire adeguatamente la zona di lavoro (indicata biosicurezza cabinet I) con i guanti etanolo al 70% (v / v) indossa.
- Nella armadio biosicurezza pulita preparare un volume adeguato di terreno di coltura cellulare miscelando i componenti necessari come indicato nella Tabella 1. Al fine di mantenere la sterilità del terreno base, aggiungere supplementi passando attraverso filtri sterili con dimensione dei pori di 0,22 micron.
- Per prevenire la contaminazione, preparare medium almeno 24 ore prima dell'uso. Per testare la sterilità, incubare 1 ml di mezzo in una piastra di coltura cellulare senza cellule in incubatore standard di coltura cellulare: 37 ° C, 5% CO 2, 20% O 2 e 90% di umidità. Dopo24 h, verificare medio microscopio con un ingrandimento di almeno 200X.
- Mantenere SCP-1 le cellule in un incubatore di coltura cellulare standard condizione di supporto: 37 ° C, 5% CO 2, 20% O 2 e 90% di umidità.
- Per la manutenzione ed espansione, crescono le cellule SCP-1 fino a raggiungere 80-90% di confluenza. Durante questo periodo di tempo la cultura, cambiare media ogni 2-3 giorni. Giunti 80-90% di confluenza, le cellule raggruppati SCP-1 (in generale un rapporto 1: 2) al successivo passaggio per l'espansione o la piastra per gli esperimenti (come indicato).
- Per dividere le cellule SCP-1, riscaldare il mezzo di coltura a 37 ° C e scongelare tripsina / EDTA utilizzando un bagno d'acqua a 37 ° C.
- Completamente aspirare il terreno di coltura dalle cellule confluenti 80-90% e gettarlo in un contenitore per rifiuti.
- Lavare le cellule due volte con almeno DPBS (fosfato di Dulbecco tamponata salina senza magnesio e calcio, pH 7.2).
- Pipettare un volume adeguato diDPBS sulle celle (5 ml DPBS per un pallone di coltura T75 e 12 ml per un pallone di coltura T175).
- Aspirare DPBS con cura e scartare in un contenitore per rifiuti.
- Pipettare un volume adeguato di 0,25% tripsina / EDTA sulle celle (1 ml DPBS per un pallone di coltura T75 e 2 ml per un pallone di coltura T175) e incubare per 5-10 minuti a 37 ° C in incubatore di coltura cellulare standard 5 % CO 2, 20% O 2 e 90% di umidità.
- Dislodge le cellule toccando nave e garantire tutte le cellule vengono staccate dalla plastica coltura (tripsinizzazione) osservando le cellule galleggianti al microscopio.
- Inattivare la reazione tripsina aggiungendo 10 ml di mezzo di coltura. Mescolare la tripsina e le cellule con il mezzo accuratamente pipettando ripetutamente.
- Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di reazione e centrifugare a 600 xg per 10 min a temperatura ambiente.
- Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di culturamedie.
- Contare le cellule con il metodo di esclusione Trypan Blue come descritto nel protocollo 2.
- Seme le cellule a seconda del disegno sperimentale.
2. Conteggio delle SCP-1 le cellule
- Eseguire un conteggio delle cellule vitali (Trypan Blue metodo di esclusione) delle cellule risospese con un emocitometro.
- Prima della conta delle cellule, pulire l'emocitometro con acqua di rubinetto. Asciugare i componenti emocitometro utilizzando un panno che non lasci residui. Assemblare inumidendo il vetro di copertura e premendolo inversamente sulle due guide di vetro su ciascun lato della zona di conteggio. Assicurarsi che gli anelli di Newton si vedono sulle guide di vetro (Figura 1).
- Prelevare 10 ml di cellule risospese e mescolate con 10 ml di 0,1% soluzione Trypan Blue per ottenere un fattore di diluizione di 2.
- Carico 10 ml di campione totale sulla camera emocitometro pre-puliti e assemblati.
- Contare il numero di live (bianco / celle trasparenti) e morti(blu nuclei), le cellule nelle piazze 4x4 (vedi Figura 1B).
- Calcolare il numero totale di celle secondo la formula proposta:
3. GFP trasfezione di SCP-1 le cellule
NOTA: Per osservare SCP-1 crescita cellulare acceso e in patibolo titanio maglia nel corso di un certo periodo di cultura che ha segnato l'cellule con la proteina fluorescente verde (GFP). Sovraespressione di GFP si ottiene l'infezione con particelle di adenovirus codificanti per GFP. particelle adenovirus replica incompetente (E1 / -E3) che codifica per la proteina fluorescente verde (GFP) sono stati usati per infettare le cellule SCP-1. Le particelle virali sono stati ottenuti da Prof. Steven Dooley 13 attraverso la raccolta di cultura surnatante di adenovirus ricombinante (AD5-GFP), le cellule trasfettate HEK293T (biosicurezza laboratorio II). Tre ripetuti di congelamento (-80 ° C) e disgelo (37 ° C a bagnomaria) cicli assicurato che nessun HEcellule K293T rimangono vitali per produrre nuove particelle virali. L'utilizzo di questo ceppo di adenovirus possono efficacemente di infettare le cellule SCP-1 senza produrre nuove particelle virali. Così, le cellule infette possono essere gestiti in un I. biosicurezza Lab
- Risospendere le cellule bersaglio (SCP-1 celle) con una densità di semina di 50.000 cellule / ml nel terreno di coltura. Pipettare 2 ml per pozzetto in una piastra di coltura tissutale 6-bene.
- Incubare a 37 ° C in incubatore standard di coltura cellulare; 5% di CO 2, 20% O 2 e 90% di umidità, sino SCP-1 cellule raggiungere una confluenza del 70-80%.
NOTA: confluenza dipende dalla densità di semina delle cellule. Per le condizioni sopra indicate, le cellule SCP-1 raggiungono confluenza del 70-80% in 1,5-2 giorni. - Ad una confluenza del 70-80%, senza aspirare il mezzo di coltura aggiungere 100 ml di brodo seme adenovirus per 1 ml di mezzo di coltura.
- Determinare l'intervallo di concentrazione singolarmente a seconda della quantità di particelle virali in ciascun virus séEd magazzino preparazione. Nel caso l'efficienza dell'infezione è troppo bassa, purificare e concentrare particelle virali utilizzando vari kit disponibili in commercio.
- Incubare per un'ora nell'incubatore standard di coltura cellulare a 37 ° C (5% CO 2, 20% O 2 e 90% di umidità).
- Rimuovere il terreno di coltura contenente il ceppo di virus e raccoglierlo per lo smaltimento. Aggiungere mezzo di coltura fresco 2 ml per pozzetto di un 6-ben-cultura-plate per ricostituire.
- Assicurarsi che prima dello smaltimento, particella del virus contenente mezzo è autoclavato.
- Valutare l'espressione GFP intracellulare (efficienza infezione) 24 ore dopo l'infezione utilizzando un microscopio a fluorescenza con un set di cubo / filtro GFP LED.
- Osservare la morfologia cellulare (Figura 2). Le cellule si staccano dalla plastica cultura possono dare risultati falsi positivi.
4. La pulizia della maglia di titanio Ponteggi
- Ppizzo a 5 ponteggi in un tubo di reazione da 50 ml.
- Lavare il ponteggio (6-7 mm di spessore) tre volte con 30 ml di acqua distillata-deionizzata per 20 min a temperatura ambiente, utilizzando condizioni di rotore (8 XG).
- Sostituire l'acqua distillata-deionizzata con 30 ml 1% (w / v) Triton-X-100 soluzione (disciolto in acqua distillata-deionizzata) e poi lavare i ponteggi una volta per 20 min a temperatura ambiente, utilizzando condizioni di rotore (8 xg) .
- Scartare la soluzione Triton-X-100 seguita da lavaggio con 30 ml di acqua distillata deionizzata-due volte (5 min ciascuna a temperatura ambiente) condizioni di rotore mantenimento (8 XG).
- Sostituire l'acqua distillata-deionizzata. Sciacquare i ponteggi in sequenza con il reagente di grado 99% di acetone, il 99% di isopropanolo e 99% di etanolo (30 ml ciascuna) per 2 x 5 minuti ciascuno in un bagno a ultrasuoni (~ 50 Hz, 50 W, 220-240 V).
- Lavare nuovamente tre volte con 30 ml di acqua distillata-deionizzata per 5 minuti, mantenendo costante trattamento bagno ad ultrasuoni.
- Posizionare il ScaffoLDS su un tessuto privo di lanugine, al fine di ventilare asciugare per una notte a temperatura ambiente.
- Autoclavare l'impalcatura per 15 min a 121 ° C con 15 psi.
- Confermare il protocollo di pulizia per fluorescenza indiretta, come descritto nel protocollo 5.
5. Imaging impalcatura Strutture di fluorescenza indiretta
NOTA: Il presente protocollo descrive l'imaging strutture impalcature per fluorescenza indiretta utilizzando il fluoroforo solforodamina B che dà una fluorescenza rossa brillante a una lunghezza d'onda ex / em di 565/586 nm. Tuttavia, il fluoroforo può essere modificato per meglio adattarsi per determinati impostazioni microscopio o possibile auto-fluorescenza del ponteggio.
- Preparare la soluzione sulforodamina B colorazione (0,04%) in acido acetico 1% e conservare a temperatura ambiente con protezione dalla luce.
- Prendete una piastra di coltura tissutale 24 pozzetti e immergere il patibolo pulita in 500 ml di soluzione colorante solforodamina B ponendolo inside i bene con pinze.
- Catturare le immagini negative del patibolo utilizzando microscopio a fluorescenza.
- Scatta foto con una RFP LED cubo / set di filtri con una lunghezza d'onda di eccitazione di 531/40 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 593/40 nm. In alternativa scegliere l'adeguata lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione con l'aiuto dello spettrale visualizzatore di fluorescenza 20. Solforodamina B ha la sua eccitazione picco a 578 nm e il suo picco di emissione a 593 nm.
- Al fine di visualizzare la struttura patibolo, scattare foto ad ingrandimenti inferiori, ad esempio, 4X o 10X (Figura 3). Utilizzando queste immagini, determinare caratteristiche, ad esempio, la dimensione dei pori e forma con l'aiuto del ImageJ.
- Al fine di rilevare le impurità ponteggio, prendere le immagini con ingrandimenti maggiori, ad esempio, 20X o 40X, se si considera che questo limiterà la profondità di analisi. Assicurarsi che la sporcizia particelle / sostanze non si vedono (vedere i risultati rappresentativi; figure 3).
6. In Vitro Biocompatibilità Assay
- Pre-riscaldare il mezzo di coltura a 37 ° C in un bagno d'acqua.
- Prendete una piastra di coltura tissutale 24 pozzetti e usando pinze, posizionare i ponteggi puliti e sterilizzati in ciascuna prova ben asettico. Lavorare sotto l'armadio biosicurezza pre-puliti I!
- Impregnano / incubare i ponteggi con un terreno di coltura per circa 15 min (500 microlitri per pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti), al fine di rimuovere l'aria dall'interno del ponteggio.
- Nel frattempo, risospendere 500.000 cellule SCP1 Ad-GFP-infettati in 1 ml di terreno di coltura.
- Dopo 15 min di impalcatura ammollo, aspirare il terreno completamente fuori patibolo.
- Per semina le cellule sul patibolo, erogare 100 l di sospensione cellulare con cautela sul patibolo (che si trova a 24 pozzetti) di superficie. Mantenere un volume minimo di sospensione cellulare mentre semina delle cellule, in modo da garantire l'assenza di fluido scorre out del patibolo.
- Incubare le cellule per 30 min a 37 ° C in incubatore di coltura cellulare standard (5% CO 2, 20% O 2 e 90% di umidità).
- Aggiungere 500 microlitri più terreno di coltura e incubare per 24 ore in incubatore standard di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO 2, 20% O 2 e 90% di umidità).
- Valutare il pattern aderenza cellula e cellula diffusione sulla superficie scaffold usando un microscopio a fluorescenza.
- Scatta foto con un GFP LED cubo / set di filtri con una lunghezza d'onda di eccitazione di 470/22 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 510/42 nm. In alternativa scegliere l'eccitazione adeguato e lunghezza d'onda di emissione con l'aiuto dello spettatore spettro di fluorescenza. GFP ha la sua eccitazione picco a 488 nm e il suo picco di emissione a 507 nm.
- Per visualizzare aderenza delle cellule catturare immagini Pattern a ingrandimenti inferiori, ad esempio, 4X o 10X (Figura 4). Per osservare cellule diffusione di una rivista più altoè necessaria nification (almeno 100X) - limitando la profondità di messa a fuoco.
- Per valutare ulteriormente cellule diffusione sulla superficie patibolo, fissare le cellule con il 4% di formalina e procedere con tradizionale colorazione a fluorescenza di strutture cellulari, ad esempio, i filamenti di actina (falloidina). Tuttavia, adattare i tempi di incubazione e l'etichettatura fluorescenza degli anticorpi in modo da adattarsi alle caratteristiche individuali impalcatura, ad esempio, i tempi di diffusione o auto-fluorescenza 14.
- Il giorno successivo, cambiare il terreno di coltura per rimuovere le cellule non aderenti.
- Calcolare la percentuale di cellule aderenti sul ponteggio da resazurina misurazione conversione come descritto nel protocollo 7.
Figura 5: Timeline di test in vitro (A) messa a punto sperimentale per la placcatura cellule.. (B Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
misurazione 7. resazurina conversione
NOTA: saggio di conversione resazurina è utilizzato per misurare l'attività mitocondriale e quindi indirettamente la proliferazione cellulare. Riduzione resazurina ad resorufina genera un segnale fluorescente, che si basa sulla attività mitocondriale associata con numero di cellule vitali (Figura 7A).
- Completamente aspirare il terreno di coltura dalle cellule SCP-1 e scartare in un contenitore per rifiuti.
- Lavare le cellule SCP-1 una volta con DPBS per rimuovere le cellule staccate. Aggiungere 500 microlitri DPBS per pozzetto della piastra di coltura tissutale 24 pozzetti contenente cellule SCP-1 sul patibolo.
- Coprire le cellule con un am necessariaount di soluzione resazurina lavorare sterile (0,25% resazurin in terreno di coltura) e incubare a 37 ° C in incubatore di coltura cellulare standard (5% CO 2, 20% O 2 e 90% di umidità) per 30 min.
- Fare una nota che; tempo di incubazione dipende dal tipo di cellula e densità cellulare. Si può variare tra 10 minuti e 6 ore. tempo di incubazione Ottimizzato per SCP-1 le cellule è di 30 min.
- Come controllo sfondo, comprende almeno un pozzetto con la soluzione di lavoro resazurina ma senza cellule, che viene incubata a 37 ° C in incubatore di coltura cellulare standard (5% CO 2, 20% O 2 e 90% di umidità) per lo stesso quantità di tempo.
- Trasferire 100 ul condizionati surnatante da ogni pozzetto della piastra di coltura tissutale 24 pozzetti in una piastra da 96 micropozzetti.
- Lavare le cellule rimanenti tre volte con 1 ml DPBS per 5 min a temperatura ambiente per rimuovere la soluzione di lavoro residua resazurina. Dopo il terzo lavaggio aggiungere mezzo di coltura to impianti con SCP-1 cellule (500 microlitri per pozzetto della piastra da 24 pozzetti di coltura tissutale) e continuare incubazione a 37 ° C in incubatore di coltura cellulare standard (5% CO 2, 20% O 2 e 90% di umidità) per ulteriori misurazioni corso del tempo.
- Assicurarsi di impostare fino replicati in questa fase (2-4), al fine di minimizzare gli errori di pipettamento.
- Nel frattempo, posizionare la piastra 96 micropozzetti nel lettore di micropiastre e misurare la fluorescenza del resorufina formata.
- Al fine di ridurre segnale di fondo, misurare la fluorescenza ad una lunghezza d'onda di eccitazione di 545 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 585 nm.
- In alternativa scegliere l'eccitazione adeguato e lunghezza d'onda di emissione con l'aiuto dello spettatore spettro di fluorescenza. Resorufina ha la sua eccitazione picco a 572 nm e il suo picco di emissione a 585 nm. L'intensità del segnale dato è una media di 25 letture individuali (25 lampeggia per pozzetto).
- Misurare la Fluorescence di resorufina formata nel mezzo condizionato, utilizzando un'ottica bottom.
- Prendere nota che, il guadagno dipende dalla quantità media di resazurina convertita e può variare tra 10 e 4.000. Regolare il guadagno per il lettore di micropiastre individuale usato pipettando una curva standard resorufina, tale che il segnale fluorescente è inferiore all'80% della massima intensità di segnale rilevabile (in questo caso 20.000). Il guadagno ottimizzato per SCP-1 le cellule è di 800.
- Sottrarre il segnale di fondo (resazurin soluzione di lavoro senza cellule) dal segnale dei campioni di prova.
- A seconda della configurazione sperimentale / scopo, procedere con ulteriori passi:
- Calcolare la percentuale di vitalità delle cellule sul ponteggio utilizzando una curva standard. Effettuare una curva standard individuale separatamente per ciascuna linea cellulare utilizzato.
- Analizzare la crescita delle cellule / proliferazione attraverso la stima del relativo aumento di conversione resazurina per tutto il periodo di coltivazione. Per questo calcolo, impostarela conversione resazurina il giorno 1 come riferimento. Appena preparare la soluzione di lavoro resazurina per questo tipo di analisi. Inoltre, i tempi di incubazione devono essere uguali tra le diverse misurazioni.
- Ripetere l'intero protocollo di misura conversione resazurina almeno tre volte per ottenere risultati coerenti.
8. La colorazione Live-morti
- Piastra le cellule SCP1 sul patibolo con una densità di semina di 50.000 cellule / scaffold e farlo crescere sul patibolo mantenendo le condizioni standard di coltura cellulare (fare riferimento al protocollo 1 e 2).
- Dopo 24-48 ore aspirare completamente il terreno di coltura dalle cellule SCP-1 e scartare in un contenitore per rifiuti.
- Lavare le cellule SCP-1 una volta con DPBS per rimuovere le cellule staccate. Aggiungere 500 microlitri DPBS per pozzetto della piastra di coltura tissutale da 24 pozzetti e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
- Stain SCP-1 con fluorofori (tutte e tre le macchie allo stesso tempo):
- Da ora in poimantenere i ponteggi al buio, al fine di proteggere il sbiancamento fluorofori dalla luce del giorno!
- Impostare un tempo di incubazione di 30 min per permettere uguale distribuzione in tutto il ponteggio. Se il trasferimento ad altri ponteggi, assicurarsi di ottimizzare i tempi di incubazione per adattarsi alle caratteristiche individuali ponteggi (dimensione dei pori, profondità impalcatura, ecc).
- Per rilevare cellule vitali sul ponteggio, macchiare le cellule con calceina AM ad una concentrazione finale di 2 mM (in terreno di coltura).
- Al fine di rilevare tutte le celle sul ponteggio, macchiare le cellule con Hoechst 33342 ad una concentrazione finale di 0,002 mg / mL (in terreno di coltura).
- Al fine di rilevare le cellule morte, incubare il ponteggio con etidio omodimero ad una concentrazione finale di 4 mM (in mezzo di coltura).
- Dopo il tempo di incubazione, lavare le cellule 3 volte con DPBS (1 ml per pozzetto) per ogni 5 min a temperatura ambiente.
- prende immediatamente fotos utilizzando un microscopio a fluorescenza.
- Scattare foto della calceina (cellule viventi) con un GFP LED serie cubo / filtro (eccitazione ed emissione lunghezza d'onda di 470/22 nm e 510/42 nm, rispettivamente). In alternativa scegliere un'eccitazione adeguata e lunghezza d'onda di emissione con l'aiuto dello spettatore spettro di fluorescenza. Calceina ha la sua eccitazione picco a 488 nm e il suo picco di emissione a 507 nm. NOTA: assicuratevi di non usare cellule trasfettate GFP per fluorescenza colorazione con calceina o altre macchie fluorescenti verdi.
- Scattare foto della Hoechst 33342 con una DAPI LED cubo / set di filtri con una lunghezza d'onda di eccitazione di 357/44 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 447/60 nm. In alternativa scegliere l'eccitazione adeguato e lunghezza d'onda di emissione con l'aiuto dello spettatore spettro di fluorescenza. Hoechst 33342 ha la sua eccitazione picco a 347 nm e il suo picco di emissione a 483 nm.
- Scattare foto del omodimero etidio con un cubo insieme RFP LED / filtro (eccitazione e lunghezza d'onda di emissione of 531/40 nm e 593/40 nm, rispettivamente). In alternativa scegliere l'eccitazione adeguato e lunghezza d'onda di emissione con l'aiuto dello spettatore spettro di fluorescenza. Etidio omodimero ha la sua eccitazione picco a 530 nm e la sua picco di emissione a 618 nm.
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Representative Results
I risultati preliminari hanno mostrato che l'impianto nucleo romanzo descritto non solo ha buone caratteristiche di smorzamento, ma anche è biocompatibile con SCP-1 le cellule. Durante il processo di produzione dell'impianto, viene a contatto con sostanze fortemente corrosive e tossiche (lubrificante, mordente, soluzione elettro-lucidatura). Con l'aiuto di tecniche di colorazione fluorescente indirette siamo stati in grado di visualizzare le impurità residue e quindi ottimizzare un protocollo di pulizia che mostra significativa riduzione del carico sostanza sul ponteggio. La figura 3 mostra l'efficienza del protocollo di pulizia stabilita.
Il successo di impianti utilizzati per il trattamento artroplastica è determinata da eventi che si svolge all'interfaccia cellula-materiale. La Figura 4 mostra le cellule attaccate sull'impalcatura dopo 24 ore di placcatura, come descritto nella sezione del protocollo 6. Una significativa transefficienza perfezione di SCP-1 le cellule è stata osservata, come abbiamo potuto immagine il modello di crescita delle cellule stromali mesenchimali precursori sul patibolo (vedi figura 2). La visualizzazione diretta conferma la biocompatibilità del ponteggio e descrive anche il modello di aderenza sulla superficie scaffold (Figura 4). Fluorescenza colorazione può essere fatto ulteriormente per esaminare l'interazione con cellule e la diffusione sulla superficie ponteggio.
Fluorofori sono state applicate con successo per esaminare morte cellulare e la proliferazione in un periodo di tempo sul ponteggio. Immagini live-dead-colorazione esemplificano come colorazione può correttamente essere fatto sul ponteggio per confermare la vitalità percentuale di cellule in un periodo di tempo. Figura 6 mostra colorazione nucleare blu (Hoechst 3342) in tutte le cellule, rosso fluorescente (etidio omodimero) le cellule morte, e l'etichettatura verde per l'incorporazione di calceina-AM come la vitalità marker. Calceina AM viene convertito calceina che presenta una fluorescenza verde brillante in presenza di ioni calcio nel citoplasma delle cellule. Hoechst 33342 è parete cellulare permeabile e intercala nel DNA cellulare. In questo modo tutte le cellule mostrerà nuclei blu (vedi figura 6). Etidio omodimero non è parete cellulare permeabile, quindi sarà solo intercalare nel DNA delle cellule morte. In questo modo, le cellule morte mostrerà nuclei rossi. Inoltre, la vitalità cellulare e piega aumento del numero di cellule sull'impalcatura più di una settimana è stata quantificata resazurina saggio di conversione e rappresentati graficamente (Figura 7).
Figura 1: il conteggio delle cellule con un emocitometro (A) Configurazione di un gruppo da camera.. (B) Illustrazione di camere di conteggio; 4 x 4 camera di conteggio viene utilizzato per un cou cellulent. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. GFP efficienza di trasfezione le cellule SCP1 esibiscono una forte fluorescenza verde indica positivo efficienza di trasfezione ad-GFP. Barra di scala = 1,000 micron, 4X ingrandimento. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: solforodamina B colorazione immagini negative di cattura (A) Ponteggio prima della pulizia.. La freccia indica la presenza di sostanze tossiche / corrosivi sull'impalcatura. (B) Ponteggio dopo il protocollo di pulizia. Barra di scala = 1,000 micron, 4X ingrandimento. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. Reticolo adesione di cellule SCP1 sull'impalcatura segnale GFP indica adesione cellulare e modello di crescita sulla superficie dello scaffold di titanio maglia. Barra di scala = 1,000 micron, 4X ingrandimento. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Co-fluorescenza colorazione delle cellule sull'impalcatura (.
Figura 7: saggio di conversione resazurina (A) reazione di riduzione biochimica di redox colorante (resazurin) in un prodotto finale (resorufina) che emette fluorescenza e subisce variazioni colorimetriche.. (B) L'attività mitocondriale è stata misurata quando le cellule sono state piastrate su 0,75 mg / cm scaffold densità. I dati sono stati raccolti con fluorescence apparecchio di misurazione basato. intensità di fluorescenza a 590 nm (asse y) in momenti definiti (asse X) è raffigurato come un risultato di misurazione quantitativa vitalità cellulare (Ex = 540 nm, Em = 590 nm). La significatività statistica è stata determinata utilizzando due vie ANOVA e l'errore standard della media (SEM) è indicato come un barre di errore. Considerando le proprietà fisiche ponteggio, ad esempio, la dimensione dei pori e le proprietà meccaniche (per esempio, caratteristica di smorzamento) insieme, 0,75 mg / cm³ impalcatura densità è stato utilizzato per la caratterizzazione biocompatibilità. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| componenti media | Concentrazione |
| i media basale αMEM (%) | 90 |
| Serum (%) | 10 |
| Pen / Strep (%) | 1 |
Tabella 1: coltura delle cellule composizione (αMEM) Media.
| Problema | Causa | Soluzione |
| l'imaging vitalità cellulare sull'impalcatura Non trasparente | Impalcatura impedisce alla luce di penetrare senza distorsioni | Utilizzare tecnica di imaging basata fluoroforo per la valutazione delle cellule. |
| Interferenza di intensità di fluorescenza | fluorescenza Auto, segnale di fondo | Prestare attenzione ai fluorofori e utilizzare appropriato in base alle particolari proprietà patibolo. |
| valutazione vitalità cellulare sull'impalcatura per un periodo di coltura | Rmisure epeated nel corso di un lungo periodo di tempo | Trasfezione delle cellule con particelle ad-GFP-virus. |
| valutazione funzionalità delle cellule sull'impalcatura non trasparenti | tecnica di imaging di fluorescenza consente solo cellule diffusione analisi del modello. | Eseguire resazurina saggio di conversione (misurazione quantitativa vitalità cellulare) in una combinazione con la tecnica di imaging. |
Tabella 2: Tabella riassuntiva: la risoluzione dei problemi di imaging vitalità cellulare sull'impalcatura non trasparente.
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Discussion
La superficie scaffold svolge un ruolo importante nella sua interazione con il tessuto circostante in vivo determinando impianti durata funzionale. Così, la biocompatibilità del ponteggio viene studiato attraverso saggi in vitro utilizzando cellule (linea cellulare SCP1), quando plated sulla ponteggi.
tecniche di microscopia che funzionano bene con impalcature sottili e otticamente trasparenti sono scarsamente adatte per ponteggi non trasparenti per studiare la biocompatibilità. Questo è principalmente perché i ponteggi non trasparenti impedire alla luce di penetrare senza significative distorsioni 15. Per superare in parte questi problemi che la presente stabilire un metodo per la valutazione delle cellule sulla / nella ponteggi titanio fatto a maglia usando vari fluorofori.
Per consentire maglia seguito piegando dei fili di titanio, il materiale entra in contatto con sostanze fortemente corrosive e tossiche (lubrificante, mordente, elettromeccanicilucidare, soluzione), che potrebbe alterare la biocompatibilità del patibolo, se le tracce rimangono in / sul patibolo. Con l'aiuto di un protocollo indiretta-fluorescenza sviluppata (protocollo 5) potremmo visualizzare la struttura patibolo. Inoltre, le caratteristiche impalcatura, ad esempio, lo spessore del materiale, la dimensione individuale dei pori e la forma, o la densità connettivo, sono stati analizzati utilizzando ImageJ. Un epifluorescenza superiore ingrandita un'immagine microscopica permesso visualizzazione impurità nel scaffold nonché sulla superficie scaffold. Figura 3b rappresenta pertanto il risultato di conferma del protocollo di pulizia sviluppato con successo. Il principio di questo protocollo di colorazione indiretta può essere facilmente riprodotto ad altri scaffold non trasparenti, prendendo in considerazione le singole proprietà scaffold, per esempio, dimensione dei pori e corrispondenti diffusione che colpisce il tempo di incubazione. Inoltre, auto-fluorescenza delle impostazioni scaffold e microscopiche influenza la scelta di fluorophores utilizzati. Lo strumento di fluorescenza spettatore spettrale online può aiutare a scegliere i fluorofori adeguate.
interazione Cell-metallo è stata esaminata indirettamente analizzando il modello aderenza delle cellule sul ponteggio. Protocollo 6 descrive la metodologia di come le cellule possono essere monitorati in vitro se placcato su ponteggi non trasparenti in sistemi di coltura utilizzando una strategia di GFP trasfezione. Sulla base dei risultati preliminari di test in vitro, è stato previsto che le proprietà superficiali quali composizione, micro-topografia e rugosità 16 potrebbe svolgere un ruolo importante nello stabilire l'aderenza e la diffusione delle cellule bersaglio. Il titanio essendo un biomateriale quindi potrebbe essere che agisce come modello substrato per fornire base per l'adesione delle cellule (vedere Figura 4).
Implant topografia superficiale è stato segnalato per influenzare il comportamento delle cellule 16. Nel presente studio, abbiamo analizzato la crescita delle cellule /la diffusione e la vitalità con tecniche di fluorescenza di colorazione in combinazione con misure di vitalità quantitative. L'analisi ha rivelato sottile variazione percentuale vitalità cellulare e la diffusione a seconda del materiale scaffold. Tuttavia, la funzionalità delle cellule valutata quantitativamente resazurina saggio di conversione (attività mitocondriale), non è stata significativamente influenzata dal materiale patibolo. La misurazione dell'attività mitocondriale resazurina conversione ha il vantaggio che non è tossica cellula e quindi può essere eseguito ripetutamente per un lungo periodo di coltura. Particolare cura deve essere presa durante il lavaggio off soluzione di lavoro residua resazurina, in modo da non accumulare segnale di fondo (falsi positivi). Nonostante questi vantaggi, il saggio di conversione resazurina non dare alcuna informazione sulla cella diffusione sul ponteggio. Le cellule GFP infettate da cui possono essere monitorati nel corso di un lungo periodo di cultura (segnale GFP è rimasto costante per oltre 14 giorni), consentendo così di visualizzare smodello di crescita pecifici sulla superficie patibolo. Visualizzazione cellule profonde nella scaffold è ancora limitata dal materiale scaffold e quindi richiedono la dissezione dell'impianto. La combinazione di queste due tecniche ha il grande vantaggio di poter essere facilmente trasferito ad altri tipi di cellule, considerato che il tempo di incubazione potrebbe dover essere adattato al tipo cellulare di interesse. Tuttavia, la cura deve essere presa durante il trasferimento di questo metodo per altri ponteggi non trasparenti, ad esempio, il collagene impalcature che in genere presentano una forte auto-fluorescenza verde 17 based. In questo caso possono essere utilizzati altri tag fluorescenti. La combinazione delle sopra indicate due metodi quindi i vantaggi (vedi Tabella 2).
Caratteristiche impalcatura, ad esempio, poro cellule trappola potenza dimensioni all'interno del patibolo. Se non abbastanza nutrienti vengono forniti, queste cellule potrebbero morire e secernere proteasi che influenzano la vitalità delle cellule della corniceing cellule / tessuti. Siamo stati in grado di adattare un fluorescente basato protocollo di colorazione che è in grado di visualizzare le cellule vive e morte e sul patibolo in titanio maglia. Simile al protocollo indiretta colorazione in fluorescenza, il principio di questo protocollo di colorazione può essere facilmente trasferito ad altri scaffold non trasparenti. Mentre in questo modo, le proprietà individuali scaffold, per esempio, dimensione dei pori e diffusione corrispondente al meglio auto-fluorescenza, impostazione microscopica devono essere presi in considerazione come potrebbero influenzare il tempo di incubazione e la scelta di fluorofori utilizzati. Qui, ancora una volta lo strumento di fluorescenza spettatore spettrale online può aiutare a scegliere i fluorofori adeguate.
In sintesi, i risultati in vitro indicano che la proposta di titanio maglia modello di impianto nucleo ha un profilo biologico. attacco iniziale di cellule precursori mesenchimali stromali (SCP-1 celle) su questo materiale suggerisce che questo titanio materia di impianto in legal è biocompatibile. Anche se non abbiamo analizzato l'associazione di diversi parametri topografici, impalcatura modifica della superficie potrebbe migliorare l'aderenza proliferazione delle cellule così come la differenziazione 18. Compatibilità ottimale tra scaffold e le cellule aumentare la probabilità di una migliore integrazione dell'impianto nel tessuto circostante e quindi migliorando di longevità vivo dopo il trattamento 19. Utilizzando la configurazione di prova sopra indicato apre la possibilità di misurare e visualizzare miglioramenti nelle prestazioni biologica del ponteggio indotta da modificazioni superficiali. La preferenza di ponteggi con superficie bioattiva su disegni di impianto non modificati suggerisce il migliore prestazione 20 in termini di integrazione osteo-condrogenico. Questo studio è ulteriormente rafforzata da altre relazioni sul impianto in titanio a maglia in cui la sua proprietà meccaniche e bioattività sono stati riportati 6,7.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi in competizione. Nessuna parte del lavoro è stato o è attualmente in corso di pubblicazione o è stato pubblicato altrove.
Acknowledgments
Il progetto è parzialmente finanziato da Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand (ZIM) des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie -KF3010902AJ4. La tassa di pubblicazione è stato coperto da trauma dell'ospedale BG Tubinga, in Germania.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/24/48 well plates, T25/ T75 culture flask | Greiner Bio-One GmbH | * | |
| * 24 well plates | Greiner Bio-One GmbH | CELLSTAR 662 160 | |
| * 48 well plates | Corning Incorporated USA | 3548 | |
| * 6 well plates | Falcon | 353046 | |
| * T25 | Greiner Bio-One GmbH | 690 175 | |
| * T75 | Greiner Bio-One GmbH | 658 175 | |
| Acetic acid, purum ≥ 99.0% | Carl Roth | 3738.4 | |
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 | |
| Axioplan-2 | Carl Zeiss, Germany | ||
| Biological safety cabinets | Thermo Scientific | safe 2020 | |
| Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) | Sigma | 17783 | |
| Cell Culture Incubtator | Binder, Tuttlingen, Germany | 9040-0078 | |
| Filter unit (0.22 µm) | Millipore, IRL | SLGP033RS | |
| Centrifuges 5810 R And 5417 R | Thermo Fisher Scientific, NY | Megafuge 40R | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Carl Roth | 4720.2 | |
| Dulbecco’s PBS without Ca & Mg | Sigma | H15-002 | |
| Ethanol 99% | SAV liquid prod. GmBH | 475956 | |
| Ethidium homodimer | Sigma | 46043 | |
| EVOS Fluorescence imaging system | Life technologies | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, PA, USA | ||
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533-100MG | |
| Knitted titanium nucleus implant | Buck co & KG,Germany | ||
| MEM Alpha Modification with Glutamine w/o nucleoside | Sigma | E15-832 | |
| Omega microplate Reader | BMG Labtech,Germany | FLUOstar Omega | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P11-010 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma | 199303-1G | |
| Sulforhodamine B sodium salt | Sigma | S1402-1G | |
| Test tube rotator | Labinco B.V.,The Netherlands | Model LD-76 | |
| TRIS (hydroxymethyl) aminomethan | Carl Roth | AE15.1 | |
| Triton | Carl Roth | 3051.2 | |
| Trypan Blue 0.5% | Carl Roth | CN76.1 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma | L11-004 |
References
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