Protocol
Dierenverzorging en experimenten werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Zwitserse gemeenten (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Bern, Zwitserland).
1. Bereid Oplossingen voor Experimenten
- Bereid de extracellulaire matrix (ECM) coating-oplossing (zie tabel Materiaal, punt 6): Dooi ECM mix op ijs. Verdun de ECM mix 01:10 in basis kweekmedium (zonder neurotrofe factoren of foetaal runderserum (FBS)) en op te slaan op het ijs.
- Bereid het kweekmedium (zie Material Tabel, punt 1): Maak een voorraad van Neurobasal medium FBS of hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF) bevatten. Vullen Neurobasal medium met verse FBS (10%) en BDNF (5 ng / ml) net voor toevoeging aan de celkweek.
- Bereid de extracellulaire oplossing (zie tabel Materiaal, punt 2).
2. Wassen en Sterilisatie van MEA
(figuur 1E). Elke elektrode heeft een afmeting van 40 x 40 urn 2 met een tussenruimte van 200 micrometer van centrum tot centrum. De elektroden zijn gemaakt van platina. De elektroden zijn verbonden met de overeenkomstige contacten van een circuit van indiumtinoxide. Dit circuit is geïsoleerd door een 5 um laag van SU-8. Zie Materiaal tabel voor meer informatie over de aanbieder. MEA andere indelingen kunnen geschikt zijn voor deze experimenten.
- Voor nieuwe MMO's: Spoel ze door onderdompeling in 70% ethanol gedurende 30 seconden en wassen met gedestilleerd water gedurende 30 sec. Werk in een laminaire stroming kap.
- Laat de MEA drogen 30 min in een laminaire stroming kap.
- Zet elke MEA in een afzonderlijke steriele petrischaal (35 mm x 10 mm) en sluit af met folie. De MEA kan worden bewaard tot gebruik.
- Voor gebruikte MEA: Incubeer de MMO's in een petrischaal (35 mm x 10 mm) met 1 ml enzymatische solution (zie Materials tabel, punt 6) O / N op de orbitale schudder bij RT om biologisch materiaal te verwijderen. Ga dan verder zoals in stap 2.1.
LET OP: Behandel de MMO's met zorg behulp van een tang met rubberen uiteinden.
3. Bereiding van MEA voor kweekexperimenten
- Verwijder het afsluitfolie en laat de MEA in de petrischaal (35 mm x 10 mm) voor het gehele experiment.
- Coat het MEA met oplossing bereid in 1,1: Gebruik een koude 200 ul pipetpunt (bewaard bij -20 ° C) tot 50 gl bekledingsoplossing pipet elke MEA, die het gehele elektrodeoppervlak.
- Sta MEA te bekleden voor 30 minuten tot 1 uur bij KT.
- Verwijder de bekledingsoplossing met een pipet. Breng 100 pi kweekmedium aangevuld met 10% FBS en 5 ng / ml BDNF en verlaat deze bij kamertemperatuur tot uitplaten het weefsel.
- Plaats 2 platen met de gecoate MEA in een grote petrischaal (94 mm x 16 mm) en voeg een derde klein petrischaaltje met 1.5ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voor bevochtiging.
LET OP: Het toevoegen van een kleine petrischaal (stap 3.5) met PBS is cruciaal voor verdamping van kweekmedium aanzienlijk beperken.
4. Spiral Ganglion Dissection
LET OP: Bruto dissectie kan buiten de laminaire stroming kap gedaan worden (stap 4,1-4,4). Voor fijne dissectie steriele omstandigheden (laminaire stroming kap) zijn verplicht (uit stap 4.5).
- Euthanaseren dieren (5-7 dagen oude muizen) door onthoofding zonder voorafgaande verdoving.
- Steriliseer de kop door besproeien met 70% ethanol.
- Door vast te houden het hoofd, snijd de verbinding tussen de huid en de schedel met een scherpe / scherpe schaar langs de sagittale lijn.
- Snijd de schedel sagittally en verwijder de hersenen met behulp van scherpe / stompe schaar.
- Snijd de temporele beenderen van de schedel en plaats deze in een petrischaaltje met steriel ijskoud Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS).
- Met een dissectie microscoop, ontleden het trommelvlies bulla met behulp van fijne pincet en isoleren van het binnenoor.
- Verwijder het bot van de cochlea, met behulp van fijne pincet.
- Verwijder de spiraal ligament en stria vascularis (SV) samen door te oordelen met een tang de basale deel van de spiraal ganglion (SG) en de SV en langzaam tot rust te komen van de SV van de basis -to-top
- Isoleer het orgaan van Corti (OC), de SG en de modiolus (figuur 1A - C)
- Scheid de OC van de SG en modiolus door te oordelen met een tang de basale deel van de SG en de OC en langzaam tot rust te komen van de OC van base-to-top.
- Snijd laterale explantaten (200-500 urn in diameter) van de ganglion spirale nog aan de modiolus (figuur 1D) met een pincet en een micro scalpel.
5. Spiral Ganglion explantaatkweek op MMO's
- Plaats twee ganglion spirale explantaten naast de elektroden op de MEA vooraf bereide met 100 ul kweekmedium.
- Plaats het orgaan van Corti ongeveer 5 mm afstand van het elektrodeoppervlak.
- Tang om de explantaten en het orgaan van Corti pin op de MEA met vermijding van schade aan het weefsel.
- Plaats de MEA voorzichtig in de broedstoof en kweek bij 37 ° C en 5% CO2. De volgende dag visueel op de explantaten naar de MEA hebben gehecht.
LET OP: Als explantaten niet hebben gehecht O / N, zullen ze zelden doen in de komende dagen. De OC is geplaatst naast de cultuur trofische / neurotrofe support. - Voeg 100 ul kweekmedium 10% FBS en BDNF met dagelijkse gedurende 5 opeenvolgende dagen.
- Op dag 6 Voeg 2 ml kweekmedium dat 10% FBS en 5 ng / ml BDNF en kweek het weefsel gedurende nog 13 dagen.
6. elektrofysiologische registraties tot spontane en elektrode Stimulatie afhankelijke activiteit Onderzoek
- Was de MEA cultuur met extracellulaire zolutie bereid in stap 1,3, bij kamertemperatuur.
- Droog de contacten met een tissue en monteer de MEA op de MEA setup.
OPMERKING: Om de cultuur vochtig te houden tijdens de montage, voeg een kleine daling van de extracellulaire oplossing voor de cultuur. - Voeg 300 ul van extracellulaire oplossing en wacht 10 minuten voor het opnemen, om het systeem te stabiliseren.
- Record spontane activiteit gedurende 2 min van alle elektroden door op de plaat / verwerven toets van de software en identificeren registrerende elektroden.
- MEA elektrode stimulatie: Selecteer de amplitude / duur / vorm van de stimulus op de juiste software en gelden voor een aantal elektroden achter elkaar zoals beschreven 13. Selecteer de elektroden basis van degenen weergegeven spontane activiteit (zoals in stap 6,4). Opnemen van alle resterende elektrodes.
- Stimulatie artefact sluiten stimuleren van dezelfde elektrode 10 keer. Indien de kweek ten minste 8 van 10 keer reageert, kan worden aangenomen alspositieve reactie op elektrode geïnduceerde stimulatie.
- Voor achtergrondgeluiden vastgesteld, toegepast Tetrodotoxin (TTX) naar de cultureat een concentratie van 1 uM, to-voltage-gated natrium kanalen en record voor 2 minuten te blokkeren. Gebruik dit om spike detectie (7.1 en 7.2) uit te voeren.
7. Data-analyse
OPMERKING: Gegevensanalyse is eerder gedetailleerd beschreven in 6 en 5. Voor specifieke informatie over software die wordt gebruikt in dit onderzoek zie Materialen Table, punt 7.
- Met de juiste software detecteren spontane activiteit voor elke elektrode onder toepassing van een detector op basis van standaardafwijkingen en een daaropvolgende discriminator. Deze procedure wordt beschreven in 6. Activiteit verschijnt zo snel spanningspieken (<5 msec).
- Kies een drempel die resulteert in geen activiteit bij het analyseren van de TTX behandeld samples.Adapt de drempelwaarde voor elk experiment om onderscheid te maken tussen valse Positive en vals-negatieve detecties.
- Behulp van geschikte software observeert de gedetecteerde neuronale activiteit van elke elektrode als een raster plot volgens standaardprocedures (zie figuur 2A - C).
- Bepaal en het totale netwerk activiteit weer te geven door het optellen van alle gedetecteerde gebeurtenissen binnen een schuifraam van 10 msec, verschoven met 1 msec stappen.
- Detect-stimulatie geïnduceerde activiteit door het weergeven van de ruwe data met behulp van passende analyse software. Identificeer de interne spikes offline handmatig. Single spikes verschijnen zo snel spanningspieken, die na de stimulatie artefact (pijlpunt in figuur 2E). Een voorbeeld is getoond in figuur 2E.
- Afhankelijk van het experiment analyseert het aantal reagerende elektroden, de drempel nodig is om een respons, aantal actiepotentiaal per elektroden en andere parameters van belang 5.
8. Tissue Fixatie en Immunohistochemistry
NB: De kleuring proces zal de MEA vernietigen. Zie Materiaal Table (punt 4) voor reagentia.
- Direct na de opname was de culturen met 37 ° C warm PBS drie keer. Gooi de PBS en breng 4% paraformaldehyde (PFA) (in PBS) voorverwarmd tot 37 ° C gedurende 10 minuten.
LET OP: PFA is giftig. Werk in een chemische kap met een passende bescherming en gooi oplossing volgens richtlijnen. - Was de kweken driemaal met PBS en geblokkeerd met 2% runderserumalbumine (BSA) in PBS (0,01% Triton-X100) gedurende 2 uur.
- Voeg het eerste antilichaam (anti-tubuline βIII, tuj antilichaam) verdund in PBS (2% BSA en 0,01% Triton-X100) en verlaat O / N bij 4 ° C. Was de cultuur driemaal met PBS.
LET OP: Van nu af aan in het donker te houden het monster zo vaak mogelijk om het bleken van de secundaire-fluorescent gelabeld antilichaam te minimaliseren. - Voeg het tweede antilichaam, verdund in PBS (2% BSA eend 0,01% Triton-X100) en incubeer gedurende 1 tot 2 uur bij KT. Om vlekken kernen toe te voegen 1: 10.000 DAPI (1 mg / ml voorraad) gedurende 10 min.
- Spoel driemaal met PBS en de monsters terug te monteren om dunne dekglaasjes (24 x 50 mm 2) met behulp van montage medium (zie tabel Materials, punt 4). Afbeelding met behulp van een fluorescentiemicroscoop met 5X en 20X vergroting.
Representative Results
Figuur 1 geeft een overzicht van de procedure voor het weefsel isolatie, voorbereiding en cultuur op de MEA. We tonen de opeenvolgende stappen van weefseldissectie de ganglion spirale (SG) van het sensorische epithelium van het orgaan van Corti (OC) en stria vascularis (SV) isoleren gehecht spiraalvormige ligament (Figuur 1 A - C). Ganglion spirale explantaten (3-4 in aantal) worden gesneden met micro-schaar van het ganglion zoals schematisch geïllustreerd in figuur 1D en op MEA (Figuur 1E), via elektrode bezette gebied (2,2 mm2). De OC is geplaatst in de nabijheid, buiten het elektrodeoppervlak. De groei van de cultuur kan worden in de tijd gevolgd (figuur 1G). Een schematisch diagram van het protocol wordt getoond in figuur 1F. Elektrofysiologische activiteit kan worden gedetecteerd na 6 dagen kweken die toenemen bij langdurige kweekperiode. Wij zijnecommend beoordeling van 18 dagen oude kweken die aanzienlijk hoger aantal registrerende elektroden in vergelijking met eerdere tijdstippen 5 produceren.
Figuur 1. Celkweek voorbereiding. (A) Vers ontleed muis binnenoor. Wit gestippelde lijn geeft de locatie van het slakkenhuis, zwarte gestippelde lijn geeft het evenwichtsorgaan regio. (B) Mouse binnenoor na verwijdering van de cochleaire botachtige wand. Cochlear bochten worden aangeduid door witte stippellijnen. (C) De spiraal ganglion (SG) en modiolus, het orgaan van Corti (OC) en de stria vascularis (SV) en spiraalvormige ligament getoond na dissectie. (D) Schematische voorstelling van SG en OC dissectie en SG explantatie voorbereiding {figuur aangepast van 5 met toestemming van de uitgever}. (E) Illustratie van de meervoudige elektrode-reeks in deze studie. Hercoderenelektroden zijn georganiseerd in een rechthoekig rooster in het midden en bezetten een oppervlakte van 2,2 mm2. 4 Grond elektroden en side contacten worden geïllustreerd. (F) Schematische voorstelling van de cultuurprotocol. Opnames worden uitgevoerd op dag 18. (G) Representatieve foto's (heldere veld beelden) en schema's van SG explantaten op MEA gecontroleerd cultuur op dag 1, 6 en 18. Schaal bars = 400 pm. Klik hier om een grotere versie te bekijken dit figuur.
Spontane activiteit kan worden gedetecteerd op MEA en weergegeven als een raster plot waarbij elke lijn van de grafiek geeft een gedetecteerde piek. Een representatief voorbeeld toont spontane activiteit gedetecteerd in verscheidene elektroden (kleuren in de grafieken) wordt getoond (Figuur 2A, 2B en 2C).
(Figuur 2D), 5 reageert elektroden (rood sporen) en niet reagerende elektroden (blauw sporen) is weergegeven in figuur 2E. Voor deze experimenten werd één elektrode voor stimulatie en alle andere elektroden voor opname. Single actiepotentialen verscheen 1 msec na de stimulatie artefact (zwarte pijl hoofd). De MEA kan worden immunostained aan het einde van de procedure om de dekking van de neuronale processen van via elektrodeoppervlak. De elektrode groen aangegeven in figuur 2F gebruikt voor het stimuleren en het in rode elektroden werden gebruikt om responsen (figuur 2E) opnemen.
Figuur 2. Gegevens opnamen op MEA. (A </ Strong>) Sporen van de originele opnames van zes van de 63 elektroden tonen spontane activiteit. (B) Raster plot van de zes elektroden van figuur 2A na spike detectie. Elke staaf vertegenwoordigt een actiepotentiaal. (C) Raster perceel inclusief alle elektroden (zoals in A en B) activiteit wordt opgenomen met 63 elektroden (kanalen nummer 0-63) gedurende 2 min. (D) Een tweefasige stimulus met een totale duur van 80 usec en amplitude van 80 uA werd gebruikt voor stimulatie van de kweek van de ene elektrode (E58 figuur 2F). (E) Representatief voorbeeld van de ruwe data sporen verkregen na stimulatie van de elektrode 58 toont actiepotentialen (rood sporen) of zonder reacties (blauw sporen) na stimulatie (zwarte pijl-head). (F) ganglion spirale cultuur op MEA immuno de neuronale merker tuj (groen) aan het einde van het experiment neuro visualiseren nal dekking van de elektrode gebied {figuur aangepast van 5 met toestemming van de uitgever}. Elektrode 58 gebruikt voor de stimulatie is aangegeven in het groen, reageren elektroden in rood aangegeven. Schaal bar = 50 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tenslotte de MEA opstelling maakt het bestuderen van mogelijke elektrodeoppervlak modificatie die registratiegevoeligheid kan toenemen. Twee commercieel verkrijgbare MEA elektroden werden gebruikt in deze studie met twee verschillende platina oppervlakken: Grijs platina (grijs Pt), bestaande uit een 150 nm dikke Pt-laag (impedantie: 400 kQ / 1 KHz) en zwart platina, (zwart, Pt), verkregen door electrochemische depositie van Pt aan het einde van de micro-fabricageproces (impedantie: 20 kQ / 1 KHz). Zie Materials Table (punt 6) voor meer informatie.
ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> zes onafhankelijke experimenten werden uitgevoerd MEA per electrode Black Pt MEA maakt detectie van neuronale activiteit op een groter aantal elektroden per MEA (figuur 3A) en vermindering van. de stimulus amplitude nodig is om een respons (Figuur 3B) lokken. We analyseerden 30-35 onafhankelijke elektrodenparen in 6 verschillende experimenten, de huidige drempel nodig is om een respons. Black Pt elektroden uitgevoerd significant beter met een drempel van 31,09 μ a +/- 2.4 ten opzichte van Grey Pt elektroden 47,57 μ A +/- 1,97.
Figuur 3. Vergelijking van Grey vs Black Pt elektroden. Er zijn twee soorten van elektroden (Grey en Black Pt) werden vergeleken zij aan zij met behulp van 12 onafhankelijke MEA culturen, 6 op elk type MEA. (A) Het totale aantal rekomstige elektroden per experiment wordt getoond. (B) amplitudedrempel een reactie bewerkstelligen gemeten met 30-35 onafhankelijke elektrodeparen in 6 onafhankelijke experimenten MEA wordt weergegeven. Gegevens zijn weergegeven als gemiddelde +/- SD. (Student t Test p <0,001) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
De hier beschreven protocol laat zien hoe de cultuur SGN explantaten op MEA en SGN activiteit beoordelen door het extracellulaire niet-invasieve opnames. Dit platform en het protocol wij onlangs hebben ontwikkeld 5 zorgen voor identificatie van nieuwe stimulatie protocollen en elektrodematerialen wat resulteert in een verminderde energie-eisen te SGN te activeren, met potentieel belang voor de verdere uitvoering van cochleaire implantaten en andere neuro-protheses. Verschillende voorzorgsmaatregelen in de gepresenteerde procedure zijn van fundamenteel belang voor de verwezenlijking van nauwkeurige en reproduceerbare experimenten.
Zorgvuldige dissectie van de spiraal ganglion en de verdere behandeling van de primaire weefsel vereist bijzondere voorzichtigheid. Deze experimenten werden uitgevoerd middels C57 / Bl6 muizen tussen 5 en 7 dagen. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met Wistar ratten in dezelfde leeftijdsgroep, (gegevens niet getoond). Wij geloven dat dit de beste leeftijd voor fijne dissectie als het cochleair bot is nog zacht endoorgedreven voor gemakkelijke verwijdering van forceps en de ganglion spirale en orgaan van Corti kan gemakkelijk worden afgescheiden zonder scheuren dendriet processen of SGN SOMA. Bij vroegere tijden het weefsel te zacht en de kans op het scheuren SGN SOMA samen met het orgaan van Corti hoger, terwijl in latere stadia, het verharden van de benige capsule van de cochlea risico van weefselbeschadiging terwijl ontleden toeneemt. Goede isolatie van de SG en zorgvuldige snijden van de explantaten kritisch. Deze dienen in het traject van 200-500 urn in grootte bijlage maximaliseren de MEA oppervlak en voldoende SG SOMA in de explantaten, waaruit neurieten zal teruggroeien hebben. Neurotrofe steun te verlenen in de eerste dagen kweken is vers BDNF dd toegevoegd en het orgaan van Corti wordt in co-cultuur.
De snelheid van ontleding is ook belangrijk. Alle stappen moeten snel en met behulp van ijskoude oplossingen worden uitgevoerd om weefsel verslechtering te minimaliseren. Detussen euthanasie en plaatsen van het explantaat op MEA moet tussen 10-15 min en is essentieel voor een succesvolle kweken. Zijn alle hulpmiddelen klaar om vertragingen in de cultuur plating te vermijden.
Alle stappen, met inbegrip van fijne dissectie, het onderhoud van de cultuur en de voorbereiding van de middelgrote en apparatuur worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden. Bij het bekleden van de MEA de ECM oplossing is het belangrijk om te ontdooien op ijs en ijskoud pipetpunten en ijskoud medium als ECM mix gels bij hogere temperaturen. Bij het plaatsen van de explantaten op MMO's, eerst het medium toe te voegen aan de elektroden, vervolgens plaatst u de explantaten. Als het medium wordt toegevoegd in een tweede stap, explantaten neiging om los te maken van de MEA door afschuifspanning. Omdat kleine hoeveelheden drager wordt toegepast op de cultuur in eerste 5 dagen, afdampen van het kweekmedium moet worden geminimaliseerd. Daarom is het sterk aan te raden om een vochtige kamer met behulp van kleine platen met PBS in nauwe Proxim creërenteit van de MEA.
De hier beschreven experimenten werden uitgevoerd met behulp van in de handel verkrijgbare MEA elektroden met specifieke elektrode afmetingen, bekledingsmaterialen en intra-elektrode afstand (zoals beschreven in punt 2, Note). De kweekomstandigheden zijn hier geoptimaliseerd om neuronale dekking van de specifieke elektroderooster ontwerp maximaliseren. Het is mogelijk dat andere configuraties van elektrodenafstand, geometrieën en oppervlakken verschillende coatings of celdichtheden nodig. Deze stappen kunnen initiële oplossen verlangen bij hoge dichtheid kweken bereiken.
Wat de elektrofysiologische opnames, voordat de opnames wordt de kweek overgebracht uit kweekmedium bij 37 ° C op extracellulaire oplossing bij kamertemperatuur. Om instabiele opnamen voorkomen, wacht ongeveer 10 minuten om de kweek te stabiliseren. Bij het stimuleren van de cultuur, moet bijzondere voorzichtigheid worden betracht bij het selecteren van de stimuluszoals grote amplitudes (> 3 V) en perioden kan schade veroorzaken aan de kweek. Voor een verwijzing met betrekking tot stimulatie puls vormen en de duur zie referentie 5.
Voor data-acquisitie en verwerking van zelfgemaakte hardware (opname kamer, verbindingen met de versterkers en versterkers) werden gebruikt en specifieke analyse programma's werden geselecteerd (zie tabel Materiaal, punt 7). Echter, andere commerciële MEA setups en andere software pakketten ook geschikt voor deze operaties. We hebben eerder onderzocht de reacties van onze culturen op 3 verschillende tijdstippen en toonde een verhoogde activiteit met een verlengde cultuur tijd 5. Hier stellen we voor 18 dagen in vitro voor opnames. MEA-systemen voor continue opnames steriele bevochtigde kamers, kan de identificatie van de optimale tijdstippen voor elk kweek vergemakkelijken.
Een belangrijk nadeel van deze bioassay is de hoge variatie in tHij aantal elektroden per cultuur die reacties op stimulatie te laten zien. Deze mate waarin reacties op stimulatie hangt voornamelijk af van vier factoren: de dichtheid van de neurieten in de cultuur, de contacten tussen neurieten en de elektroden, de diameter van de neurieten of neurieten bundels en de impedantie van de elektroden. Wat de neurieten dichtheid, alleen neurieten die groeien via ten minste twee elektroden gebruikt worden voor stimulatie experimenten. Het contact tussen neurieten en de elektroden afhankelijk van het omringende weefsel dat enerzijds isoleren de neurieten van de elektrode, en daarmee verslechtert het contact, of, anderzijds, isoleren de neurieten en de elektrode uit de omringende bad en aldus het contact. Weefseldichtheid, alsook neuriet grootte, gedefinieerd door de gebruikte explantaat en kweekomstandigheden. Gedissocieerde neuronale culturen zijn ook met succes getest, maar neuronale dichtheid in deze culturen veel lager, wat resulteert in een verminderd aantal recording elektroden. Dus de celkweek worden aangepast aan de specifieke wetenschappelijke vraag die moet worden aangepakt.
Tenslotte wordt de impedantie van de elektroden hoofdzakelijk gegeven door de grootte en het oppervlak van de elektroden. Materialen, waardoor een groot oppervlak zoals platina zwart, zoals getoond in figuur 3, het verminderen van de impedantie van de elektroden mag de koppeling tussen elektroden en neurieten 7-9 verbeteren.
Strategieën om het succes van de stimulatie verbeteren daarom ook het optimaliseren van de kweekomstandigheden, de toename van het totale aantal elektroden of elektroden dichtheid en de modulatie van het elektrodeoppervlak 10.
Tot nu toe was elektrofysiologische karakterisering van SG neuronen werd uitgevoerd dmv patch clamp technieken. Dit zorgt voor intracellulaire opnames van actiepotentialen en gedetailleerde analyse van de intracellulaire ionische stromen uitenkele neuronen. Hier presenteren we een in vitro bioassay die kunnen worden gebruikt om de activiteit profielen van ganglion spirale neuronen te bestuderen door het analyseren spontane activiteit of responsen op extracellulaire stimulatie van vele neuronen tegelijk. Bovendien kan de wisselwerking tussen de elektrode en ganglion spirale neuronen bestudeerd en geoptimaliseerd door toepassing van gemodificeerde of nieuwe materialen. En zelfs als hier niet getoond, dit platform kan worden gebruikt in combinatie met een uitwendige elektrode, gemonteerd op een micromanipulator zoals onlangs aangetoond door onze groep 5, teneinde de verhouding tussen de afstand van de stimulerende elektrode en cultuur -activiteit. Al deze nieuwe aspecten oog op het nabootsen van de belangrijkste functies van cochleair implantaat elektroden kan leiden tot het ontwerp van nieuwe prothesen.
Ons model is een zeer nuttig gereedschap in vitro strategieën onderzocht om de effectiviteit van stimulatie van auditieve neuronen en verder op verbeterentimize CI technologie. Zodra de techniek beheerst, kan men screenen voor ogen om wijziging van een aantal variabelen: a) de verschillende neuronale populaties, b) andere elektrodematerialen / grootte / impedanties c) voert chronische experimenten materiaal toxiciteit of elektrode-stimulatie geïnduceerde toxiciteit te testen, die kan licht werpen op veiligere en effectievere stimulatie protocollen in vivo elektrode arrays.
Acknowledgments
De auteurs danken Ruth Rubli aan de fysiologie van de Universiteit van Bern, Zwitserland voor waardevolle technische hulp bij de experimenten. Dit werk werd ondersteund in het kader van de EU-FP7-NMP-programma (subsidieovereenkomst geen 281.056; project NANOCI - www.nanoci.org.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| culture medium | |||
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | 24 ml (for 25 ml) |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | 250 μl (for 25 ml) |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | 250 μl (for 25 ml) |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 500 μl (for 25 ml) |
| FBS | GIBCO | 10099-141 | 10% (for 25 ml) |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025/CF | final 5 ng/ml (for 25 ml) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| extracellular solution (pH 7.4) | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 4 mM | ||
| MgCl2 | 1 mM | ||
| CaCl2 | 2 mM | ||
| HEPES | 5 mM | ||
| Na-pyruvate | 2 mM | ||
| Glucose | 5 mM | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blocking solution | |||
| PBS | Invitrogen | 10010023 | |
| BSA | Sigma | A4503-50G | 2% |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | 0.01% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| TuJ | R&D Systems | MAB1195 | dil 1:200 |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
| Fluoreshild | Sigma | F6057 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plastic/tools | |||
| Petri dish 35 mm | Huberlab | 7.627 102 | |
| Petri dish 94 mm | Huberlab | 7.633 180 | |
| Dumont #5 tweezer | WPI | 14098 | |
| Dumont #55 tweezer | WPI | 14099 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Enzymatic solution: Terg-a-Zyme | Sigma | Z273287-11KG | |
| Extracellular Matrix (ECM) mix: Matrigel TM | Corning | 356230 | |
| MEA electrodes | Qwane Biosciences | (Lausanne, Switzerland) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Labview | National Instruments | Switzerland | |
| IgorPro | WaveMetrics | Lake Oswega, USA |
References
- O'Donoghue, G. Cochlear implants--science, serendipity, and success. N Engl J Med. 369 (13), 1190-1193 (2013).
- Shepherd, R. K., Hatsushika, S., Clark, G. M. Electrical stimulation of the auditory nerve: the effect of electrode position on neural excitation. Hear Res. 66 (1), 108-120 (1993).
- Tykocinski, M., et al. Comparison of electrode position in the human cochlea using various perimodiolar electrode arrays. Am J Otol. 21 (2), 205-211 (2000).
- Wilson, B. S., Dorman, M. F. Cochlear implants: current designs and future possibilities. J Rehabil Res Dev. 45 (5), 695-730 (2008).
- Hahnewald, S., et al. Response profiles of murine spiral ganglion neurons on multi-electrode arrays. J. Neural Eng. 13, (2015).
- Tscherter, A., Heuschkel, M. O., Renaud, P., Streit, J. Spatiotemporal characterization of rhythmic activity in rat spinal cord slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 179-190 (2001).
- Heim, M., Yvert, B., Kuhn, A. Nanostructuration strategies to enhance microelectrode array (MEA) performance for neuronal recording and stimulation. J Physiol Paris. 106 (3-4), 137-145 (2012).
- Kim, R., Nam, Y. Novel platinum black electroplating technique improving mechanical stability. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 184-187 (2013).
- Cellot, G., et al. Carbon nanotubes might improve neuronal performance by favouring electrical shortcuts. Nat Nanotechnol. 4 (2), 126-133 (2009).
- Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nat Nano. 8 (2), 83-94 (2013).
