Protocol
Les soins et l'expérimentation a été réalisée en conformité avec les directives des autorités locales suisse (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Bern, Suisse).
1. Préparer des solutions pour l'expérimentation
- Préparer la solution de revêtement matrice extracellulaire (ECM) (voir Tableau des Matériaux, point 6): Thaw ECM mélange sur la glace. Diluer le mélange ECM 1:10 dans un milieu de culture de base (sans facteurs neurotrophiques ou de sérum bovin fœtal (FBS)) et de stocker sur la glace.
- Préparer le milieu de culture (voir Matériel de table, point 1): Préparer un stock de milieu Neurobasal ne contenant pas de FBS ou dérivé du cerveau facteur neurotrophique (BDNF). Supplémenter des milieux frais Neurobasal avec du FBS (10%) et le BDNF (5 ng / ml) juste avant l'addition à la culture cellulaire.
- Préparer la solution extracellulaire (voir Tableau des Matériaux, point 2).
2. Lavage et stérilisation des AME
(figure 1E). Chaque électrode a une taille de 40 x 40 um2 avec un espacement de 200 um de centre à centre. Les électrodes sont constituées de platine. Les électrodes sont connectées à des contacts correspondants d'un circuit constitué d'oxyde d'indium et d'étain. Ce circuit est isolée par une couche de 5 um de SU-8. Voir le tableau Matériel pour plus de détails sur le fournisseur. D'autres dispositions des AME peuvent convenir à ces expériences.
- Pour les nouveaux AME: Rincez-les en immergeant dans 70% d'éthanol pendant 30 secondes et se laver avec de l'eau distillée pendant 30 sec. Travailler dans une hotte à flux laminaire.
- Laissez le MEA sécher pendant 30 min dans une hotte à flux laminaire.
- Mettez chaque MEA dans une boîte de Petri stérile individuel (35 mm x 10 mm) et sceller avec du papier. Les AME peuvent être stockés jusqu'à utilisation.
- Pour AME occasion: Incuber les AME dans une boîte de Pétri (35 mm x 10 mm) contenant 1 ml de solut enzymatiqueion (voir tableau des matériaux, point 6) O / N sur un agitateur orbital à température ambiante pour éliminer la matière biologique. Puis continuer comme à l'étape 2.1.
REMARQUE: Manipulez les AME avec précaution en utilisant une pince à bouts recouverts de caoutchouc.
3. Préparation des AME pour les expériences culturelles
- Retirer la feuille d'étanchéité et laisser la MEA dans la boîte de Pétri (35 mm x 10 mm) pour l'ensemble de l'expérience.
- Enduire les AME avec la solution préparée en 1.1: Utiliser un 200 pointe ul de pipette à froid (stocké à -20 ° C) à pipeter 50 pi de solution de revêtement à chaque MEA, couvrant toute la surface de l'électrode.
- Laisser meas manteau pendant 30 min à 1 heure à température ambiante.
- Retirer la solution de revêtement à l'aide d'une pipette. Appliquer 100 ul de milieu de culture supplémenté avec 10% de FBS et 5 ng / ml de BDNF et le laisser à la température ambiante jusqu'à ce que le placage du tissu.
- Placez 2 boîtes de Pétri contenant les AME enrobés dans une grande boîte de Pétri (94 mm x 16 mm) et ajouter une troisième petite boîte de Pétri contenant 1,5ml de tampon phosphate salin (PBS) pour l'humidification.
REMARQUE: Ajout d'une petite boîte de Pétri (étape 3.5) contenant du PBS est essentiel pour minimiser considérablement l'évaporation du milieu de culture.
4. Spiral Ganglion Dissection
NOTE: la dissection brute peut se faire en dehors de la hotte à flux laminaire (étape 4.1 à 4.4). Pour des conditions stériles fin de dissection (débit de la hotte laminaire) sont obligatoires (de l'étape 4.5).
- Euthanasier animaux (vieille souris 5-7 jours) par décapitation sans anesthésie préalable.
- Stériliser la tête par pulvérisation avec 70% d'éthanol.
- En tenant la tête, couper la connexion entre la peau et le crâne avec un ciseau pointu / pointu le long de la ligne sagittale.
- Couper le crâne sagittale et enlever le cerveau en utilisant des ciseaux pointus / contondants.
- Couper les os temporaux du crâne et de placer ceux dans une boîte de Pétri contenant une solution saline équilibrée de la glace froide stérile Hanks (HBSS).
- En utilisant une dissectiontion microscope, disséquer la bulle tympanique à l'aide de pinces fines et d'isoler l'oreille interne.
- Retirer l'os de la cochlée, en utilisant une pince fine.
- Retirez le ligament spiral et strie vasculaire (SV), ainsi que par la tenue avec une pince la partie basale de la ganglion spiral (SG) et la SV et dérouler lentement le SV de la base -à-apex
- Isoler l'organe de Corti (OC), le SG et la columelle (Figure 1A - C)
- Séparer l'OC du SG et modiolus en maintenant avec une pince la partie basale de la SG et le CO et le déroulement lentement le CO de la base à l'apex.
- Explants latérales Cut (200 à 500 um de diamètre) du ganglion spiral encore attachés à la columelle (figure 1D) à l' aide d' une pince et d' un micro scalpel.
5. Spiral Ganglion Explantation Culture sur les AME
- Placer deux explants ganglionnaires à côté des électrodes sur la MEA préparée précédemment avec 100 ul de milieu de culture.
- Placer l'organe de Corti d'environ 5 mm de la surface de l'électrode.
- Utiliser une pince pour épingler les explants et l'organe de Corti sur la MEA, tout en évitant d'endommager le tissu.
- Placez les AME avec précaution dans l'incubateur et la culture à 37 ° C et 5% de CO 2. Le lendemain, une inspection visuelle que les explants ont attaché à l'AEM.
NOTE: Si explants n'a pas joint O / N, ils vont rarement faire au cours des prochains jours. Le CO est placé à côté de la culture pour le soutien trophique / neurotrophique. - Ajouter 100 ul de milieu de culture contenant 10% de FBS et du BDNF par jour pendant 5 jours consécutifs.
- Au jour 6, ajouter 2 ml de milieu de culture contenant 10% de FBS et 5 ng / ml de BDNF et de la culture du tissu pendant une période supplémentaire de 13 jours.
6. électrophysiologiques Recordings à enquêter sur les activités à charge spontanée et l'électrode de stimulation
- Laver la culture de MEA avec extracellulaire afinrésolu- préparé à l'étape 1.3, à la température ambiante.
- Sécher les contacts avec un tissu et monter la MEA sur la configuration de la MEA.
NOTE: Pour garder la culture humide pendant le montage, ajouter une petite goutte de solution extracellulaire à la culture. - Ajouter 300 pi de solution extracellulaire et attendre 10 minutes avant l'enregistrement, pour permettre au système de se stabiliser.
- Enregistrer l'activité spontanée pendant 2 min de toutes les électrodes en appuyant sur la touche d'enregistrement du logiciel / acquérir et identifier des électrodes d'enregistrement.
- La stimulation de l' électrode MEA: Sélectionnez l'amplitude / durée / forme du stimulus sur le logiciel approprié et appliquer à plusieurs électrodes consécutivement comme décrit 13. Sélectionnez les électrodes à base de ceux présentant une activité spontanée (comme dans l'étape 6.4). Enregistrement à partir de toutes les électrodes restantes.
- Pour exclure artefact de stimulation, de stimuler de la même électrode 10 fois. Si la culture répond au moins 8 fois sur 10, on peut considérer commeréponse positive lors de la stimulation de l'électrode induite.
- Pour identifier le bruit de fond, appliquer tétrodotoxine (TTX) à la cultureat une concentration de 1 uM, pour bloquer les canaux et enregistrement sodiques voltage-dépendants pendant 2 min. Utilisez cette option pour effectuer une détection pic (7.1 et 7.2).
Analyse 7. Données
NOTE: L' analyse des données a été précédemment décrit en détail dans 6 et 5. Pour des détails sur les logiciels utilisés dans cette étude voir tableau des matériaux, point 7.
- En utilisant le logiciel approprié de détecter l'activité spontanée pour chaque électrode utilisant un détecteur basé sur les écarts-types et un discriminateur ultérieure. Cette procédure est décrite dans 6. Activité apparaît comme rapides transitoires de tension (<5 ms).
- Choisissez un seuil qui se traduit par aucune activité lors de l'analyse de la TTX traitée samples.Adapt la valeur seuil pour chaque expérience de discriminer entre les faux positive et détection de faux négatifs.
- Utilisation d'un logiciel approprié d' observer l'activité neuronale détectée de chaque électrode comme un complot tramé selon des procédures standard (voir Figure 2A - C).
- Déterminer et afficher l'activité totale du réseau en additionnant tous les événements détectés dans une fenêtre glissante de 10 msec, décalées par pas de 1 ms.
- Détecter l'activité induite par la stimulation par l'affichage des données brutes en utilisant un logiciel d'analyse approprié. Identifier les pointes simples déconnecté manuellement. Pics simples apparaissent transitoires de tension aussi rapide, survenant après l'artefact de stimulation (tête de flèche sur la figure 2F). Un exemple est représenté sur la figure 2E.
- En fonction de l'expérience, l' analyse du nombre d'électrodes ayant répondu, le seuil nécessaire pour obtenir une réponse, le nombre de potentiels d'action par des électrodes et d' autres paramètres d'intérêt 5.
8. Tissue Fixation et Immunohistochemistry
NOTE: Le processus de coloration va détruire la MEA. Voir le tableau Matériel (point 4) pour les réactifs.
- Directement après l'enregistrement laver les cultures avec 37 ° C chaud PBS trois fois. Jeter le PBS et on applique paraformaldehyde à 4% (PFA) (dans du PBS), préchauffé à 37 ° C pendant 10 min.
ATTENTION: PFA est toxique. Travailler dans une hotte chimique avec une protection appropriée et une solution de défausse selon les directives. - Laver les cultures trois fois avec du PBS et on bloque avec 2% de sérum-albumine bovine (BSA) dans du PBS (0,01% de Triton-X100) pendant 2 heures.
- Ajouter le premier anticorps (anti-BIII tubuline, anticorps TUJ) dilué dans du PBS (2% de BSA et 0,01% de Triton-X100) et laisser O / N à 4 ° C. Laver la culture à trois reprises avec du PBS.
NOTE: A partir de maintenant garder l'échantillon dans l'obscurité aussi souvent que possible pour réduire au minimum le blanchiment de l'anticorps marqué par fluorescence secondaire. - Ajouter l'anticorps secondaire dilué dans du PBS (BSA 2% d'uned 0,01% de Triton-X100) et incuber pendant 2 heures à 1 à la température ambiante. Pour colorer les noyaux ajouter 1: 10,000 DAPI (1 mg / ml de bouillon) pendant 10 min.
- Laver trois fois avec PBS et monter les échantillons en arrière pour fines lamelles (24 x 50 mm 2) en utilisant un milieu de montage (voir tableau des matériaux, point 4). L'image en utilisant un microscope à fluorescence avec 5X et 20X grossissement.
Representative Results
La figure 1 résume la procédure d'isolement des tissus, la préparation et la culture sur la MEA. Nous montrons les étapes successives de la dissection des tissus pour isoler le ganglion spiral (SG) de l'épithélium sensoriel de l'organe de Corti (OC) et strie vasculaire (SV) et annexé ligament spirale (Figure 1 A - C). Des explants de ganglion spiral (3-4 en nombre) sont découpées avec des micro-ciseaux du ganglion comme cela est schématiquement illustré sur la figure 1D et placé sur la MEA (figure 1E), sur la zone occupée d'électrode (2,2 mm 2). Le CO est placé à proximité, à l'extérieur de la surface de l'électrode. La croissance de la culture peut être suivie dans le temps (figure 1G). Un schéma du protocole est illustré à la figure 1F. l'activité électrophysiologique peut être détectée au bout de 6 jours de culture, qui augmentent avec le temps de culture prolongée. We recommand l' évaluation de 18 cultures de jour qui produisent un nombre significativement plus élevés d'électrodes d'enregistrement par rapport à des points de temps antérieurs 5.
Figure 1. Préparation de la culture cellulaire. (A) fraîchement disséquée souris oreille interne. Blanc ligne pointillée indique l'emplacement de la cochlée, noir ligne pointillée indique la région vestibulaire. (B) l' oreille interne de souris après le retrait de la paroi osseuse cochléaire. virages cochléaires sont indiqués par des lignes en pointillés blancs. (C) Le ganglion spiral (SG) et modiolus, l'organe de Corti (OC) et la strie vasculaire (SV) et Ligament spirale sont présentés après dissection. (D) Schéma du SG et OC dissection et préparation SG explant {figure adaptée de 5 avec l' approbation de l'éditeur}. (E) Illustration du réseau d'électrodes multiples utilisés dans cette étude. recodageles électrodes sont organisés dans une grille rectangulaire dans le centre , et occupent une surface de 2,2 mm 2. électrodes 4 au sol et des contacts latéraux sont illustrés. (F) Schéma du protocole de culture. Les enregistrements sont effectués au jour 18. (G) des images représentatives (images de champ lumineux) et les systèmes de explants SG sur MEA surveillé dans la culture au jour 1, 6 et 18. Les barres d'échelle = 400 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande cette figure.
L'activité spontanée peut être détectée sur MEA et montré comme un complot tramé où chaque ligne de la parcelle représente un pic détecté. Un exemple représentatif montrant l' activité spontanée détectée à partir de plusieurs électrodes (différentes couleurs sur les graphiques) est représenté (figure 2A, 2B et 2C).
(figure 2D), 5 électrodes répondant (traces rouges) et des électrodes non-réponse (traces bleues) est représentée sur la figure 2E. Pour ces expériences, une électrode a été utilisée pour la stimulation et toutes les autres électrodes pour l'enregistrement. Simple action potentiels sont apparus 1 msec après l'artefact de stimulation (tête de flèche noire). La MEA peut être immunocolorée à la fin de la procédure afin d'évaluer la couverture des processus neuronaux sur la zone de l'électrode. L'électrode indiquée en vert sur la figure 2F a été utilisé pour la stimulation, et les électrodes indiquées en rouge ont été utilisés pour enregistrer les réponses (Figure 2E).
Figure 2. Des enregistrements de données sur MEA. (A </ Strong>) Des traces d'enregistrements originaux des électrodes six des 63 présentant une activité spontanée. Plot (B) Raster des six électrodes de la figure 2A après la détection de pic. Chaque barre représente un potentiel d'action. (C) parcelle Raster y compris toutes les électrodes (comme dans A et B) L' activité est enregistrée à partir de 63 électrodes (chaînes numériques 0-63) pendant 2 min. (D) une stimulation biphasique , avec une durée totale de 80 microsecondes et une amplitude de 80 pA a été utilisée pour la stimulation de la culture d'une électrode (E58 sur la figure 2F). (E) Exemple représentatif des traces de données brutes obtenues après stimulation de l' électrode 58 montrant des potentiels d'action (traces rouges) ou sans réponses (traces bleues) après stimulation (noir tête de flèche). (F) la culture sur ganglionnaires MEA immunocolorées pour le marqueur neuronal TUJ (vert) à la fin de l'expérience pour visualiser neuro la couverture finale de la zone d'électrode {figure adaptée de 5 avec l' approbation de l'éditeur}. Electrode 58 utilisée pour la stimulation est indiquée en vert, les électrodes ont répondu sont indiquées en rouge. Barre d'échelle = 50 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Enfin, la configuration de la MEA permet d'étudier une éventuelle modification de la surface de l'électrode qui peut augmenter la sensibilité d'enregistrement. Deux électrodes de MEA disponibles dans le commerce ont été utilisés dans cette étude avec deux surfaces de platine différentes: gris platine (gris Pt), constitué d'un 150 nm couche de Pt d'épaisseur (impédance: 400 kQ / 1 KHz), et noir de platine, (noir, Pt), obtenus par dépôt électrochimique de Pt à la fin du processus de micro-fabrication (impédance: 20 kQ / 1 kHz). Voir le tableau des matériaux (point 6) pour plus de détails.
ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Six expériences MEA indépendantes ont été réalisées par type d'électrode Noir Pt MEA permet la détection de l' activité neuronale sur un plus grand nombre d'électrodes par MEA (Figure 3A) et la réduction de. l'amplitude du stimulus nécessaire pour obtenir une réponse (figure 3B). Nous avons analysé pour 30-35 paires d'électrodes indépendantes, en 6 expériences différentes, le seuil de courant nécessaire pour obtenir une réponse. électrodes Noir Pt rendement significativement supérieur montrant un seuil de 31,09 μ a +/- 2,4 par rapport à Gris Pt électrodes 47,57 μ A +/- 1,97.
Figure 3. Comparaison de Grey vs électrodes Noir Pt. Deux types d'électrodes (gris et noir Pt) ont été comparés côte à côte avec 12 cultures des AME indépendants, 6 sur chaque type de MEA. (A) Le nombre total de reélectrodes correspondan- par expérience est montré. (B) de seuil Amplitude pour obtenir une réponse, mesurée à l' aide de 30-35 paires d'électrodes indépendantes dans 6 expériences des AME indépendants est montré. Les données sont présentées comme de moyen de SD. (Test t de Student p <0,001) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
Le protocole décrit ici montre comment la culture des explants SGN sur MEA et d'évaluer l'activité SGN par des enregistrements non invasifs extracellulaires. Cette plate - forme et le protocole que nous avons récemment mis au point 5 permettre l'identification de nouveaux protocoles de stimulation et de matériaux d'électrodes résultant des besoins en énergie réduits pour activer SGN, avec intérêt potentiel de mise en œuvre des implants cochléaires et autres neuro-prothèses. Plusieurs précautions dans la procédure présentée sont fondamentales pour la réalisation d'expériences précises et reproductibles.
dissection minutieuse du ganglion spiral et la manipulation ultérieure du tissu primaire requiert une attention particulière. Ces expériences ont été réalisées en utilisant des souris C57 / BL6 entre 5 et 7 jours anciens. Des résultats similaires ont été obtenus en utilisant des rats Wistar dans la même tranche d'âge (données non présentées). Nous croyons que c'est le meilleur âge pour dissection fine que l'os cochléaire est encore molle enOugh pour faciliter le retrait par une pince, et le ganglion spiral et organe de Corti peuvent être facilement séparés sans rupture des processus dendritiques ou SGN somas. À un âge plus précoce du tissu est trop mou et les chances de déchirer le SGN somas conjointement avec l'organe de Corti est plus élevé, alors que lors des étapes ultérieures, le durcissement de la capsule osseuse de la cochlée augmente le risque d'endommager les tissus tout en disséquant. isolement correct du SG ainsi que la coupe minutieuse des explants est critique. Ceux-ci devraient être de l'ordre de 200-500 um pour maximiser l'attachement à la surface de la MEA et d'avoir un nombre suffisant de SG somas dans les explants, à partir de laquelle neurites repousseront. Pour accroître le soutien neurotrophique dans les premiers jours de culture, frais BDNF est ajouté tous les jours et l'organe de Corti est placé en co-culture.
La vitesse de dissection est également importante. Toutes les mesures doivent être effectuées rapidement et en utilisant des solutions froides de glace, afin de minimiser la détérioration des tissus. letemps entre l'euthanasie et de placer l'expiant sur la MEA doit être entre 10-15 min et est crucial pour les cultures réussies. Avoir tous les outils prêts, afin d'éviter des retards dans la culture placage.
Toutes les étapes, y compris dissection fine, le maintien de la culture et de la préparation du milieu et de l'équipement sont effectuées dans des conditions stériles. Lorsque le revêtement de la MEA avec la solution d'ECM il est important de décongeler sur la glace et à utiliser des embouts de pipette glacées et moyenne glacée que les gels ECM de mélange à des températures plus élevées. Lorsque vous placez les explants sur les AME, ajouter d'abord le milieu à la surface des électrodes, placer ensuite les explants. Si le milieu est ajouté dans une deuxième étape, les explants ont tendance à se détacher de la MEA en raison d'une contrainte de cisaillement. Étant donné que de petits volumes de fluide sont appliqués à la culture dans les 5 premiers jours, l'évaporation du milieu de culture doit être réduite au minimum. Par conséquent, il est fortement recommandé de créer une chambre humidifiée à l'aide de petites boîtes de Pétri contenant du PBS en étroite PROXIMlité aux AME.
Les expériences décrites ici ont été effectuées en utilisant des électrodes disponibles dans le commerce MEA avec des dimensions spécifiques d'électrodes, des matériaux de revêtement et de la distance des électrodes intra (telle que décrite au point 2, Note). Les conditions de culture ont été optimisées ici afin de maximiser la couverture neuronale de la conception spécifique du réseau d'électrodes. Il est possible que d'autres configurations d'électrodes d'espacement, des géométries et des surfaces différentes peuvent nécessiter des enrobages ou des densités cellulaires. Ces étapes peuvent nécessiter le dépannage initial afin d'obtenir des cultures à haute densité.
En ce qui concerne les enregistrements électrophysiologiques, avant de commencer l'enregistrement de la culture est transférée à partir du milieu de culture à 37 ° C à la solution extracellulaire à la température ambiante. Afin d'éviter des enregistrements instables, attendre pendant environ 10 minutes pour permettre la culture de se stabiliser. Lorsque la stimulation de la culture, une attention particulière doit être utilisé dans le choix du stimulusque de grandes amplitudes (> 3 V) et les durées peuvent causer des dommages à la culture. Pour une référence en matière de stimulation des formes d'impulsion et de la durée voir référence 5.
Pour l' acquisition des données et le traitement du matériel fait maison (chambre d' enregistrement, les connexions aux amplificateurs et amplificateurs) ont été utilisés et les programmes d'analyse spécifiques ont été sélectionnés (voir Tableau des Matériaux, point 7). Cependant, d'autres configurations de MEA commerciale et d'autres logiciels sont adaptés aussi bien pour ces opérations. Nous avons déjà évalué les réponses de nos cultures à 3 points de temps différents et a montré une activité accrue avec le temps de culture prolongée 5. Ici , nous vous proposons 18 jours in vitro pour les enregistrements. systèmes MEA permettant des enregistrements continus dans, les chambres stériles humidifiées, pourraient faciliter l'identification des points de temps optimaux pour chaque type de culture.
Un inconvénient majeur de ce bioessai est la forte variation de til nombre d'électrodes par culture qui montrent les réponses à la stimulation. Ce taux de réponses à une stimulation dépend principalement de quatre facteurs: la densité des axones dans la culture, les contacts entre les axones et les électrodes, le diamètre des neurites ou des faisceaux de neurites, ainsi que l'impédance des électrodes. En ce qui concerne la densité des neurites, seuls les neurites qui se développent sur au moins deux électrodes peuvent être utilisées pour des expériences de stimulation. Le contact entre les axones et les électrodes dépend du tissu environnant qui peut d'une part d'isoler les neurites de l'électrode, et ainsi se détériorer au contact ou, d'autre part, d'isoler neurites et l'électrode à partir du bain environnant et donc d'améliorer le contact. la densité du tissu, ainsi que la taille des neurites, sont définis par l'expiant utilisé et les conditions de culture. cultures neuronales dissociées ont également été testés avec succès, mais la densité neuronale dans ces cultures est beaucoup plus faible, ce qui entraîne un nombre réduit de recording électrodes. Par conséquent, la culture cellulaire doit être adaptée à la question scientifique spécifique à traiter.
Enfin, l'impédance des électrodes est essentiellement donnée par la taille et la surface des électrodes. Les matériaux, créant ainsi une grande surface telle que le noir de platine, comme le montre la figure 3, ce qui diminue l'impédance des électrodes peut également améliorer le couplage entre les électrodes et les neurites 7-9.
Les stratégies visant à améliorer le taux de réussite de la stimulation incluent donc l'optimisation des conditions de culture, l'augmentation du nombre d'électrodes ou masse volumique total des électrodes et la modulation de la surface d'électrode 10.
Jusqu'à présent, la caractérisation électrophysiologique des neurones SG a été réalisée en utilisant des techniques de patch-clamp. Cela permet des enregistrements intracellulaires de potentiels d'action et une analyse détaillée des courants ioniques intracellulaires deneurones isolés. Ici , nous présentons un essai biologique in vitro qui peut être utilisé pour étudier les profils d'activité des neurones du ganglion spiral en analysant l' activité spontanée ou de réponses à une stimulation extracellulaire de nombreux neurones simultanément. En outre, l'interaction entre l'électrode et les neurones du ganglion spiral peut être étudiée et optimisée par l'utilisation de matériaux nouveaux ou modifiés. Enfin, même si non représenté ici, cette plate - forme peut être utilisée en combinaison avec une électrode externe, montée sur un micromanipulateur , comme indiqué récemment par notre groupe 5, afin d'étudier la relation entre la distance de l'activité de l' électrode et de la culture stimulant. Tous ces nouveaux aspects permettent l'imitation des principales caractéristiques des électrodes de l'implant cochléaire peut conduire à la conception de nouveaux dispositifs prothétiques.
Notre modèle est très utile dans l' outil in vitro pour étudier des stratégies visant à améliorer l'efficacité de la stimulation des neurones auditifs et d' autres opLa technologie de CI timize. Une fois que la technique est maîtrisée, on pourrait envisager le dépistage de la modification d'un certain nombre de variables: a) les différentes populations neuronales, b) les différents matériaux d'électrodes / taille / impédances c) effectuer des expériences chroniques pour tester la toxicité toxicité de la matière ou de l'électrode-stimulation induite, qui pourrait faire la lumière sur les protocoles de stimulation plus sûrs et plus efficaces par des réseaux in vivo d'électrodes.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Ruth Rubli au Département de physiologie de l'Université de Berne, Suisse, pour une aide technique précieuse avec les expériences. Ce travail a été soutenu en partie par le programme UE-FP7-NMP (convention de subvention ne 281056; projet NANOCI - www.nanoci.org.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| culture medium | |||
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | 24 ml (for 25 ml) |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | 250 μl (for 25 ml) |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | 250 μl (for 25 ml) |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 500 μl (for 25 ml) |
| FBS | GIBCO | 10099-141 | 10% (for 25 ml) |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025/CF | final 5 ng/ml (for 25 ml) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| extracellular solution (pH 7.4) | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 4 mM | ||
| MgCl2 | 1 mM | ||
| CaCl2 | 2 mM | ||
| HEPES | 5 mM | ||
| Na-pyruvate | 2 mM | ||
| Glucose | 5 mM | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blocking solution | |||
| PBS | Invitrogen | 10010023 | |
| BSA | Sigma | A4503-50G | 2% |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | 0.01% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| TuJ | R&D Systems | MAB1195 | dil 1:200 |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
| Fluoreshild | Sigma | F6057 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plastic/tools | |||
| Petri dish 35 mm | Huberlab | 7.627 102 | |
| Petri dish 94 mm | Huberlab | 7.633 180 | |
| Dumont #5 tweezer | WPI | 14098 | |
| Dumont #55 tweezer | WPI | 14099 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Enzymatic solution: Terg-a-Zyme | Sigma | Z273287-11KG | |
| Extracellular Matrix (ECM) mix: Matrigel TM | Corning | 356230 | |
| MEA electrodes | Qwane Biosciences | (Lausanne, Switzerland) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Labview | National Instruments | Switzerland | |
| IgorPro | WaveMetrics | Lake Oswega, USA |
References
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