Protocol
동물 관리 및 실험은 스위스 지방 자치 단체 AMT (대 Landwirtschaft 싶게 투르 데 Kantons 베른, 스위스)의 지침에 따라 수행 하였다.
1. 실험에 대한 솔루션을 준비
- 얼음에 해동 ECM 믹스 : 세포 외 기질 (ECM) 코팅 용액을 준비합니다 (재료 표, 점 6 참조). (신경 영양 인자 또는 태아 소 혈청 (FBS) 제외) 기본 배양 배지에서 ECM 믹스 1:10 희석하고 얼음에 저장합니다.
- (재료 표, 포인트 1 참조) 배지를 준비 : FBS 또는 뇌 유래 신경영 양인자 (BDNF)를 포함하지 않는로 Neurobasal 매체의 재고를 준비합니다. 직전에 세포 배양액에 첨가 신선한 FBS (10 %) 및 BDNF (5 NG / ㎖)으로 보충로 Neurobasal 매체.
- (재료 표, 포인트 2 참조) 세포 외 솔루션을 준비합니다.
다자간 2. 세척 및 살균
(그림 1E)에 배치 (68) 전극이 포함되어 있습니다. 각 전극은 센터 중심에서 200 ㎛의 간격을 40 × 40 μm의 (2)의 크기를 갖는다. 전극은 백금으로 이루어진다. 전극은 인듐 주석 산화물로 이루어지는 회로에 의해 대응하는 접점에 연결된다. 이 회로는 SU-8 5㎛의 층에 의해 절연된다. 공급자에 대한 자세한 내용은 자료 표를 참조하십시오. 기타 MEA 레이아웃이 실험에 적합 할 수있다.
- 새로운 다자간를 들어 30 초 동안 70 % 에탄올에 침지하여 그들을 헹구고 30 초 동안 증류수로 세척한다. 층류 후드에서 작업.
- 층류 후드에서 30 분 동안 MEA 건조를 할 수 있습니다.
- 개별 멸균 페트리 접시 (35mm X 10mm)로 각 MEA를 넣고 호일로 밀봉. 사용 전까지는 MEA를 저장할 수있다.
- 사용한 MEA를 들어 : 효소 오디오 솔루션 1 ㎖를 함유하는 페트리 접시 (35mm X 10mm)의 MEA의 부화이온은 생체 물질을 제거 RT에서 궤도 통에 O / N (재료 표, 점 6 참조). 다음 단계 2.1에서와 같이 계속합니다.
주 : 관리가 고무 덮인 팁 집게를 이용하여 신체의 체중 측정을 처리합니다.
문화 실험을위한 다자간 3. 준비
- 밀봉 호일을 제거하고 전체 실험 페트리 접시 (35mm X 10mm)의 MEA를 떠난다.
- 코트 1.1에서 조제한 용액과 MEA의 방법 : 전체 전극 면적 각 MEA에 도포 액 50 μL를 피펫 내지 (-20 ° C에 보관) 감기 200 μL 피펫 팁을 사용한다.
- 실온에서 30 분 ~ 1 시간 동안 코트에 MEA를 할 수 있습니다.
- 피펫을 사용하여 코팅 용액을 제거합니다. 10 % FBS 및 5ng / ml의 BDNF 보충 배양 배지 100 μl를 적용하고 조직을 도금 할 때까지 RT에 둡니다.
- 큰 페트리 접시 (94mm X 16mm)로 코팅 된 다자간 환경을 포함하는 2 배양 접시를 놓고 1.5을 포함하는 제 작은 배양 접시를 추가가습 용 인산염 완충 생리 식염수의 ㎖ (PBS).
주 : PBS를 함유하는 페트리 접시 작은 (단계 3.5)을 첨가하는 것은 상당히 배지의 증발을 최소화하기 위해 중요하다.
4. 나선 신경절 해부
주 : 총 박리가 층류 후드 외부에서 수행 될 수있다 (4.4-4.1 단계). 미세 절개 멸균 조건 (층류 후드)의 경우 (4.5 단계)에서 필수입니다.
- 이전에 마취없이 잘린에 의해 동물 (5-7일 이전 마우스)를 안락사.
- 70 % 에탄올로 분무하여 헤드 멸균.
- 헤드 유지시킴으로써, 피부 화살 선을 따라 샤프 / 예리한 가위와 두개골 사이의 연결을 자른다.
- sagittally 두개골을 잘라 날카로운 / 무딘 가위를 사용하여 뇌를 제거합니다.
- 두개골에서 시간적 뼈를 잘라 살균 얼음 차가운 행크스 '균형 소금 솔루션 (HBSS)를 포함하는 배양 접시에있는 사람들을 배치합니다.
- dissec를 사용하여기 현미경, 미세 집게를 사용하여 고막 수포를 해부 및 내이을 격리 할 것.
- 미세 집게를 사용하여 달팽이관의 뼈를 제거합니다.
- (SV) 함께 집게로 나선 신경절 (SG)와 SV의 기초 부분을 잡고 천천히-정점 -to베이스에서 SV 풀기로 나선 인대 및 맥리의 vascularis를 제거
- 코르티 (OC)의 장기 격리는 SG와 modiolus (그림 1A - C)
- 집게와 SG와 OC의 기초 부분을 잡고 천천히베이스 - 정점에서 OC 풀기에 의해 SG와 modiolus에서 OC를 분리합니다.
- 나선 신경절에서 잘라 횡 이식편 (직경 200 μm의 500)가 여전히 겸자 마이크로 메스를 사용 modiolus (도 1D)에 부착.
다자간 5. 나선 신경절 절편 문화
- 이전 10 제조 한 MEA의 전극 옆에 두 개의 나선 신경절 외식 장소배지 0 μL.
- 약 5mm 떨어진 전극 면적에서 코르티 기관을 놓습니다.
- 조직의 손상을 피하면서 MEA 상에 외식과 코르티 기관 핀 집게를 사용합니다.
- 37 ° C에서 인큐베이터와 문화에 조심스럽게 다자간를 놓고 5 % CO 2. 다음 날, 시각적으로 외식은 MEA에 부착했는지 검사합니다.
참고 : 외식이 O / N을 부착하지 않은 경우, 그들은 거의 다음 일 동안 그렇게하지 않습니다. OC는이 영양 / 신경 영양 지원을 위해 문화에 인접 배치됩니다. - 5 일 연속 10 % FBS와 BDNF 일상 포함하는 배양 배지 100 μl를 추가합니다.
- 6 일에 추가 십삼일 10 %를 FBS 및 5ng / ml의 BDNF와 문화 조직을 포함하는 배지 2 ㎖를 추가합니다.
6. 전기 생리 녹음은 자발적인 및 전극 자극 종속 활동을 조사하기
- 세포와 MEA 문화를 씻으 그래서lution 실온에서, 단계 1.3에서 준비했다.
- 조직과 연락처를 건조하고 MEA 설정에 MEA를 탑재합니다.
주 : 장착하는 동안 습기 문화를 유지하는 문화에 세포 외 용액의 작은 방울을 추가합니다. - 세포 외 용액 300 μl를 추가하고 시스템이 안정 될 수 있도록, 녹음하기 전에 10 분 동안 기다립니다.
- 기록에 눌러 모든 전극에서 2 분 녹음 자발적인 활동 / 소프트웨어의 버튼을 획득하고 기록 전극을 식별합니다.
- MEA 전극 자극 : 해당 소프트웨어에 대한 자극의 진폭 / 시간 / 형태를 선택하고 연속으로 13 설명 여러 전극에 적용됩니다. (단계 6.4에서와 같이) 운동량을 나타내는 것들에 기초하여 상기 전극을 선택한다. 나머지 모든 전극에서 기록.
- 자극 이슈를 제외하려면, 동일한 전극에서 10 배를 자극한다. 문화 10 배 중 적어도 8 응답하는 경우, 그것은으로 가정 할 수있다전극에 의한 자극에 따라 긍정적 인 반응.
- 배경 잡음을 확인하기 위해, 1 μM의 cultureat에 농도 복어 (TTX)를 적용한 2 분간 전압 게이트 된 나트륨 채널을 차단하는 레코드. 스파이크 검출 (7.1 및 7.2)을 수행하는 데 사용합니다.
7. 데이터 분석
주 : 데이터 분석 이전 6 및도 5에 상세하게 설명 하였다. 본 연구에 사용 된 소프트웨어에 대한 구체적인 내용은 재료 표, 점 (7)을 참조하십시오.
- 적절한 소프트웨어를 사용하여 표준 편차 및 후속 판별에 기초하여, 검출기를 사용한 각 전극에 대한 운동량을 검출한다. 이 절차는도 6에서 설명한다. 활동 빠른 과도 전압 (<5 밀리 초)를 나타납니다.
- 거짓 positiv 구별 각 실험 samples.Adapt을 임계 값 처리 한 TTX 분석시 전혀 활성을 초래 임계치를 선택전자 및 위음성 탐지.
- 사용하기 적합한 소프트웨어는 표준 절차 (- C도 2a 참조)에 따른 래스터 플롯 각 검출 전극의 신경 활성을 관찰한다.
- 결정하고 1 밀리 초 단계로 이동 10 밀리의 슬라이딩 윈도우 내의 모든 감지 이벤트를 합산하여 전체 네트워크 활동을 표시합니다.
- 적절한 분석 소프트웨어를 사용하여 원 데이터를 표시하여 자극 유도 활성을 검출한다. 오프라인 수동으로 하나의 스파이크를 식별합니다. 단일 스파이크 자극 이슈 (그림 2E의 화살표 머리) 이후에 발생, 빠른 과도 전압 나타납니다. 예는도 2e에 도시되어있다.
- 실험에 따라 대응 전극의 개수의 응답을 달성하기 위해 필요한 임계 전극 관심 5의 다른 파라미터에 따라 활동 전위의 수를 분석한다.
8. 조직 고정 및 IMMunohistochemistry
주 : 염색 프로세스가 MEA를 파괴 할 것이다. 시약 재료 표 (점 4)를 참조하십시오.
- 직접 녹음 한 후 37 ° C 따뜻한 PBS로 3 회 문화를 씻는다. PBS를 폐기하고 10 분 동안 37 ° C로 예열 (PBS)에 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 적용합니다.
주의 : PFA는 독성이다. 가이드 라인에 따라 적절한 보호 및 폐기 용액과 화학 후드에서 작업 할 수 있습니다. - PBS와 문화를 세 번 세척하고 2 시간 동안 PBS의 2 % 소 혈청 알부민 (BSA) (0.01 % 트리톤-X100)를 차단합니다.
- 최초의 항체를 PBS (2 % BSA와 0.01 % 트리톤-X100)에 희석 (안티 βIII 튜 불린, TUJ 항체)를 추가하고 4 ℃에서 O / N 두십시오. PBS와 문화를 세 번 씻으십시오.
참고 : 지금의 보조 형광 표지 항체의 표백을 최소화하기 위해 가능한 한 자주 어둠 속에서 샘플을 유지에서. - PBS에 희석 이차 항체를 추가 (2 % BSA의D 0.01 % 트리톤-X100)와 실온에서 1 ~ 2 시간 동안 배양한다. 핵이 1을 추가 얼룩 : 10,000 DAPI (1 ㎎ / ㎖ 주식을) 10 분 동안.
- PBS로 3 회 세척하고 얇은 커버 전표에 뒤로 샘플을 탑재 (24 × 50 ㎜ × 2) 장착 매체 (재료 표, 점 4 참조)를 사용하여. 5 배와 20 배 배율 형광 현미경을 사용하여 이미지.
Representative Results
그림 1은 MEA에 조직을 분리, 준비 및 문화에 대한 절차를 요약 한 것입니다. 우리는 코르티 (OC) 및 맥리의 vascularis (SV)의 기관의 감각 상피에서 나선 신경절 (SG)를 분리하는 조직 절개의 연속적인 단계를 표시하고 나선 인대를 첨부 (그림 1 A - C). 개략적으로 그림 1D에 예시 된 전극의 면적 (2.2 mm 2)를 통해, MEA (그림 1E)에 배치로 나선 신경절 외식 (번호 3-4) 신경절에서 마이크로 가위로 잘라된다. OC는이 전극 표면의 외부에 근접하여 배치된다. 배양의 성장 시간 (도 1G)를 통해 모니터링 할 수있다. 프로토콜의 개략도는도 1F에 도시되어있다. 전기 생리 활성을 장기간 배양 시간 증가 배양 6 일 후 검출 될 수있다. 우리는 r에ecommend 이전 시점 (5)에 비해 기록 전극의 상당히 높은 숫자를 생성 십팔일 문화를 평가.
그림 1. 세포 배양 준비. (A)는 갓 마우스 내부 귀를 해부. 화이트 라인은 달팽이관의 위치, 검은 점선은 전정 영역을 나타냅니다 나타내는 파선. 달팽이관 뼈 벽의 제거 후 (B) 마우스 내이. 인공 와우 회전 흰색 점선으로 표시됩니다. (C) 나선 신경절 (SG)와 modiolus는 코르티 (OC)와 맥리의 vascularis (SV) 및 나선형 인대의 기관 절개 후 표시됩니다. (D) SG와 OC의 해부 및 SG 이식편 준비 {게시자로부터 승인을 5에서 적응도}의 도식. 본 연구에 사용 된 여러 전극 배열 (E) 그림. 레코딩전극들은 중앙에 사각형 격자 구성 및 2.2 mm (2)의 면적을 차지한다. 4 접지 전극과면 접촉이 도시되어있다. 문화 프로토콜 (F) 도식. 녹음은 하루 18 (G) 대표 사진 (명 시야 이미지)과 하루 1, 6, 18 스케일 바 = 400 μm의에서 문화 모니터링 MEA에 SG 외식의 방식으로 수행된다. 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.
자발적인 활동은 MEA에 감지 플롯의 각 라인이 검출 된 스파이크를 나타내는 래스터 그래프로 표시 할 수 있습니다. (그래프에서 서로 다른 색) 여러 전극으로부터 검출 된 자발적인 활동을 보여주는 대표적인 예는 (그림 2A, 2B, 및 2C)에 표시됩니다.
(도 2d)의 자극에 사용되는 펄스 이상성을 나타내는 대표적인 예 5 대응 전극 (적색 트레이스) 및 비 응답 전극 (블루 트레이스)은도 2e에 도시되어있다. 이들 실험에 대해 하나의 전극은 자극 및 기록에 대한 모든 다른 전극을 사용 하였다. 단일 활동 전위는 자극 이슈 (검은 색 화살표 머리) 후 1 밀리 초 등장. MEA는 전극 영역에 신경 프로세스의 적용을 평가하기 위해 절차의 끝에서 면역 염색 할 수있다. 도 2F에서 녹색으로 표시 전극은 자극을 사용하고, 적색의 표시 전극은 응답 (도 2e)를 기록하는데 사용되었다.
MEA 그림 2. 데이터 기록. (A </ strong>을) 자발적 활동을 보여주는 여섯 63 중 전극의 원래 기록의 흔적. 스파이크 검출 후도 2a의 여섯 전극 (B) 래스터 플롯. 각 막대는 하나의 활동 전위를 나타냅니다. 모든 전극 활동 (A와 B)를 포함 (C) 래스터 플롯은 2 분 63 전극 (채널 번호 0-63)에서 기록된다. (D) 총 80 마이크로 초 지속 시간 80 μA의 진폭을 가진 이상성 자극은 하나의 전극 (그림 2 층에서 E58)에서 문화의 자극에 사용되었다. (E) 또는 자극 후 응답 (파란색 흔적)없이 전극 활동 전위 (빨간색 흔적)를 보여주는 58에서 자극 후의 원시 데이터 트레이스의 대표적인 예 (검은 색 화살표 머리). 신경을 시각화하는 실험의 끝에 (F) 신경 마커 TUJ (녹색)에 대한 면역 염색 MEA 나선형 신경절 문화 전극 면적의 최종 범위는 {그림은 게시자의 승인을 5에서 적응}. 자극에 사용되는 전극 (58)이 녹색으로 표시됩니다, 응답 전극은 빨간색으로 표시됩니다. 스케일 바 = 50 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
마지막으로, MEA 설정이 기록 감도를 증가시킬 수 전극 표면 개질을 연구 수 있습니다. 150 nm 두께의 백금 층 (임피던스 : 400 KΩ / 1 KHZ)로 구성된 그레이 백금 (그레이 PT) : 두 개의 시판 MEA 전극이 서로 다른 백금 표면이 본 연구에 사용 된 블랙 백금 (블랙, PT), 마이크로 제조 공정 (20 KΩ / 1 kHz에서의 임피던스)의 단부에 백금의 전기 화학적 증착에 의해 얻어진. 자세한 내용은 재료 표 (지점 6)를 참조하십시오.
1 "> 여섯 독립적 인 MEA 실험 전극 유형에 따라 수행 하였다 블랙 백금 MEA는 MEA (그림 3A) 당 전극의 높은 숫자에 신경 활동의 검출을 허용하고 감소."유지 - together.within 페이지 = FO "천만에 응답 (도 3b)을 유도하기 위해 필요한 자극 진폭. 우리는 6 개의 실험에서 30-35 독립 전극 쌍에 대한 응답을 달성하기 위해 필요한 임계 전류를 분석 하였다. 블랙 편 전극 상당히 더 31.09 μ (A)의 임계 값을 도시 수행 회색 백금 전극 47.57 μ +/- 1.97에 비해 +/- 2.4.
블랙 백금 전극 대 회색 3. 비교 그림. 두 전극 타입 (회색과 검은 색 편) 12 독립적 인 MEA의 문화, 각각의 MEA 유형에 6을 사용 나란히 비교 하였다합니다. (A) 재의 총계실험 당 sponding 전극이 표시됩니다. 6 독립적 MEA 실험에서 30-35 독립 전극 쌍을 이용하여 측정 한 (B)의 응답을 유도하는 진폭 임계 값을 도시한다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다. (학생 t 테스트 P <0.001) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 방법은 MEA에 문화 SGN의 외식을하고, 세포 외 비 침습적 기록에 의해 SGN 활동을 평가이다. 이 플랫폼 우리가 최근 인공 와우 및 다른 신경 보철의 추가 구현을위한 잠재적 인 관심을 가지고, SGN를 활성화하기 위해 감소 된 에너지 요구의 결과로 새로운 자극 프로토콜 및 전극 재료의 식별을 허용 5를 개발 한 프로토콜입니다. 제시된 절차의 몇 가지주의 사항을 정확하고 재현성있는 실험의 성취에 대한 기본이다.
나선 신경절 및 기본 조직의 추가 처리를주의 깊게 해부는 특히주의가 필요합니다. 이들 실험은 5 세에서 7 일 사이 C57 / BL6 마우스를 사용하여 수행되었다. 유사한 결과가 같은 연령대의 Wistar 래트를 사용하여 수득 하였다 (데이터는 보이지 않음). 우리는 인공 뼈가 엉 여전히 부드럽고으로이 미세 해부에 가장 적합한 나이 믿습니다깨닫지 못하고 있거나 남의 쉽게 집게로 제거하고, 코르티 나선 신경절 및 기관에 대해 쉽게 수지상 프로세스 또는 SGN의 somas을 파열하지 않고 분리 할 수있다. 이전 시대에 조직이 너무 부드럽고 나중 단계에서 달팽이관의 뼈 캡슐의 경화가 해부하는 동안 조직 손상의 위험을 증가하는 동안 코르티 기관이 높은과 기회는 somas 함께 SGN를 추출 할 수 있습니다. 되어있는 SG의 적절한 분리뿐만 아니라 외식주의 절단은 매우 중요하다. 200-500 μm의 크기는 MEA 표면에의 부착을 최대화하고 신경 돌기가 자라게되는로부터 이식편에 SG의 somas 충분한 수를 갖는 이들의 범위에 있어야한다. 문화의 초기 일에 신경 영양 지원을 높이기 위해 신선한 BDNF는 매일 추가되고 코르티 기관이 공동 문화에 배치됩니다.
해부의 속도도 중요하다. 모든 단계는 조직의 열화를 최소화하기 위해 신속하고 빙냉 용액을 사용하여 수행되어야한다. 그만큼안락사와 MEA에서 이식편을 배치 사이의 시간은 10 ~ 15 분 사이 성공적인 문화를 위해 매우 중요합니다. 문화 도금 지연을 방지하기 위해, 모든 도구를 준비합니다.
미세 해부, 문화의 유지 보수 및 매체 및 장비의 준비를 포함한 모든 단계는 무균 조건 하에서 수행된다. 전자 재료 용액으로 도포 MEA 때 얼음을 해동하고, 높은 온도에서 ECM 믹스 겔로 빙냉 피펫 팁, 얼음 - 냉각 매체를 사용하는 것이 중요하다. 다자간 환경에서 외식을 배치 할 때, 첫 번째 이후에 외식을 배치, 전극 영역에 미디어를 추가 할 수 있습니다. 상기 매체는 제 2 공정에 첨가되는 경우, 이식편은 MEA로부터 의한 전단 응력을 분리하는 경향이있다. 매체의 소량은 처음 5 일 동안 배양에 적용되기 때문에, 배양 배지의 증발을 최소화해야한다. 따라서 매우 가까운 프록에 PBS를 포함하는 작은 배양 접시를 사용하여 가습 실을 작성하는 것이 좋습니다신체의 체중 측정에 성만.
여기서 설명하는 실험은 특정 전극 치수 도료 인트라 전극 거리 (포인트 2에 기재된 바와 같이 주)로 시판 MEA 전극을 사용하여 수행 하였다. 배양 조건은 특정 전극 격자 설계의 신경 커버리지를 최대화하기 위해 여기에 최적화되었다. 또한 전극 간격, 형상 및 표면의 다른 구성이 다른 코팅 또는 세포 밀도가 필요할 수있다. 이러한 단계는 고밀도 배양을 달성하기 위해 초기 문제를 요구할 수있다.
배양은 실온에서 세포 외 용액을 37 ° C에서 배양 배지로부터 전송 된 기록을 시작하기 전에, 전기 생리 학적 기록 관하여. 불안정한 녹음을 방지하기 위해, 배양이 안정 될 수 있도록 약 10 분 동안 기다린다. 문화를 자극 할 때 특히주의는 자극을 선택하는데 사용되어야한다큰 진폭 (> 3 V) 및 지속 시간은 문화가 손상 될 수 있습니다. 자극 펄스 형태 및 기간에 관한 참고 문헌 5를 참조하십시오.
데이터 수집 및 처리를 만든 하드웨어 (녹화 실, 앰프와 앰프 연결)의 경우 (재료 표, 지점 7 참조)을 사용하고, 특정 분석 프로그램이 선정되었다. 그러나, 다른 상업적 MEA의 설정 및 기타 소프트웨어 패키지는 이러한 작업뿐만 아니라 적합합니다. 우리는 이전에 3 개의 다른 시점에서 우리의 문화의 응답을 평가하고, 장기간 배양 시간 5 증가 된 활성을 나타내왔다. 여기에서 우리는 레코딩을위한 체외 18 일 좋습니다. 멸균 가습 실에서 연속 기록을 허용 MEA 시스템은 각 배양 유형에 대한 최적의 시점의 식별을 용이하게 할 수있다.
이 생물 검정의 가장 큰 단점은 t에서 높은 변형자극에 대한 반응을 보여 문화 당 전극 그는 수. 자극에 대한 반응이 속도는 주로 네 가지 요인에 따라 달라 배양에서 신경 돌기의 밀도는 신경 돌기 및 전극의 신경 돌기 또는 신경 돌기 다발의 직경, 및 전극의 임피던스 사이의 접촉. 신경 돌기 밀도에 관해서는, 적어도 두 개의 전극에 걸쳐 신경 돌기 성장만을 자극 실험에 사용될 수있다. 신경 돌기 전극 사이의 접촉은 한편으로는 전극으로부터 신경 돌기를 분리하고, 따라서 한편, 접촉이 악화하거나, 상기 신경 돌기 주변 조로부터 전극을 격리함으로써 향상시킬 수있는 주위 조직에 의존 접촉. 조직 밀도뿐만 아니라, 돌기의 크기는, 사용 된 체외 이식편 배양 조건에 의해 정의된다. 해리의 연결을 문화도 성공적으로 테스트하지만, 이러한 문화의 신경 세포 밀도는 RECO의 수가 감소의 결과로, 훨씬 낮은되었습니다rding 전극. 따라서, 세포 배양은 해결되어야 구체적인 과학적 질문에 적응되어야한다.
마지막으로, 전극의 임피던스는 주로 크기 및 전극의 표면에 주어진다. 재료,도 3에 도시 된 바와 같이 전극과 같은 신경 돌기 7-9 사이의 결합을 향상시킬 수있는 전극의 임피던스를 저하, 흑색 백금 넓은 표면을 생성.
자극의 성공율을 개선하기위한 전략 따라서, 배양 조건의 최적화, 총 전극이나 전극 밀도의 수가 증가하고, 전극면 (10)의 변조를 포함한다.
지금까지 SG 뉴런의 전기 생리 학적 특성은 패치 클램프 기술을 이용하여 수행되었다. 이 활동 전위의 세포 내 녹음과에서 세포 내 이온 전류의 상세한 분석이 가능하나의 뉴런. 여기서 우리는 동시에 다수의 뉴런의 세포 외 자극에 자발 활동 또는 응답을 분석하여 나선 신경절 뉴런의 활성 프로파일을 연구하는데 사용될 수있는 생체 외 생물학적 분석을 제시한다. 또한, 전극 및 나선 신경절 신경 세포 사이의 상호 작용을 연구 수정되거나 새로운 재료의 도포에 의해 최적화 될 수있다. 최근 자극 전극과 문화 활동의 거리 사이의 관계를 연구하기 위하여, 우리 그룹 (5)에 의해 도시 된 바와 같이 마지막으로, 여기에 도시되지 않더라도,이 플랫폼은 외부 전극과 조합하여 사용될 수 있으며, 미세 조작기에 탑재. 인공 와우 전극의 주요 기능의 흉내가 새로운 보철 장치의 설계로 이어질 수에 대한 모든 새로운 측면이 있습니다.
우리의 모델은 청각 신경 및 추가 연산의 자극의 효능을 개선하기 위해 전략을 조사 체외 도구에서 매우 유용합니다timize의 CI 기술. 기술이 숙달되면, 하나는 변수의 수의 변경에 대한 심사를 상상할 수 : A) 다른 신경 인구, b)는 다른 전극 재료 / 크기 / 임피던스의 다) 물질 독성 또는 전극 자극에 의한 독성을 테스트하는 만성 실험을 수행하는 생체 전극 배열하여보다 안전하고 효과적인 자극 프로토콜을 밝혀 줄 수 있습니다.
Acknowledgments
저자는 실험에 유용한 기술 도움 베른, 스위스의 대학 생리학 교실에서 루스 Rubli 감사합니다. 이 작품은 EU-FP7-NMP 프로그램 (.; - www.nanoci.org 프로젝트 NANOCI 보조금 계약없이 281,056)에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| culture medium | |||
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | 24 ml (for 25 ml) |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | 250 μl (for 25 ml) |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | 250 μl (for 25 ml) |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 500 μl (for 25 ml) |
| FBS | GIBCO | 10099-141 | 10% (for 25 ml) |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025/CF | final 5 ng/ml (for 25 ml) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| extracellular solution (pH 7.4) | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 4 mM | ||
| MgCl2 | 1 mM | ||
| CaCl2 | 2 mM | ||
| HEPES | 5 mM | ||
| Na-pyruvate | 2 mM | ||
| Glucose | 5 mM | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blocking solution | |||
| PBS | Invitrogen | 10010023 | |
| BSA | Sigma | A4503-50G | 2% |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | 0.01% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| TuJ | R&D Systems | MAB1195 | dil 1:200 |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
| Fluoreshild | Sigma | F6057 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plastic/tools | |||
| Petri dish 35 mm | Huberlab | 7.627 102 | |
| Petri dish 94 mm | Huberlab | 7.633 180 | |
| Dumont #5 tweezer | WPI | 14098 | |
| Dumont #55 tweezer | WPI | 14099 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Enzymatic solution: Terg-a-Zyme | Sigma | Z273287-11KG | |
| Extracellular Matrix (ECM) mix: Matrigel TM | Corning | 356230 | |
| MEA electrodes | Qwane Biosciences | (Lausanne, Switzerland) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Labview | National Instruments | Switzerland | |
| IgorPro | WaveMetrics | Lake Oswega, USA |
References
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