Protocol
Dyr omsorg og eksperimentering ble utført i samsvar med retningslinjene i de sveitsiske lokale myndigheter (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Bern, Sveits).
1. Forbered Løsninger for Experiments
- Klargjør ekstracellulære matriks (ECM) beleggsløsning (se Materiale tabell, punkt 6): Thaw ECM mix på is. Fortynn ECM mix 1:10 i grunnleggende kulturmedium (uten neurotrofiske faktorer eller Fetal Bovine Serum (FBS)) og lagre på is.
- Klargjør kulturmedium (se Materiale tabell, punkt 1): Forbered et lager av Neurobasal medium som ikke inneholder FBS eller Brain nevrotrop Factor (BDNF). Supplere Neurobasal media med nye FBS (10%) og BDNF (5 ng / ml) like før tilsetning til cellekulturen.
- Klargjør ekstracellulære løsningen (se Materiale tabell, punkt 2).
2. Vask og Sterilisering av MEAs
(figur 1E). Hver elektrode har en størrelse på 40 x 40 mikrometer 2 med en avstand på 200 pm fra senter til senter. Elektrodene er laget av platina. Elektrodene er forbundet med de tilsvarende kontakter av en krets laget av indiumtinnoksid. Denne krets er isolert med et 5 um lag av SU-8. Se Materiale tabell for detaljer om leverandøren. Andre MEA oppsett kan være egnet for disse eksperimentene.
- For nye MEAs: Skyll dem ved å dyppe i 70% etanol i 30 sek og vask med destillert vann i 30 sek. Arbeid i en laminær hette.
- La MEA tørke i 30 minutter i en laminær strømningshette.
- Sett hver MEA i en individuell steril petriskål (35 mm x 10 mm) og forsegle med folie. De MEAs kan lagres inntil bruk.
- For brukte MEAs: Inkuber MEAs i en petriskål (35 mm x 10 mm) som inneholder 1 ml av enzymatisk solution (se Materialer tabell, punkt 6) O / N på orbital shaker ved RT for å fjerne biologisk materiale. Deretter fortsetter som i trinn 2.1.
MERK: Håndter MEAs med forsiktighet ved bruk av pinsett med gummibelagte tips.
3. Utarbeidelse av MEAs for kultur Experiments
- Fjern den tettende folien og la MEA i petriskål (35 mm x 10 mm) for hele forsøket.
- Smør MEAs med oppløsningen fremstilt i 1,1: Bruk en kald 200 ul pipettespiss (oppbevart ved -20 ° C) for å pipettér 50 ul av beleggløsning til hver MEA, som dekker hele elektrodeareal.
- Tillat MEAs å belegge i 30 minutter til 1 time ved RT.
- Fjerne beleggoppløsningen ved hjelp av en pipette. Påfør 100 mL av kultur medium supplert med 10% FBS og 5 ng / ml BDNF og la den på RT til plating vevet.
- Legg 2 petriskåler som inneholder belagte MEAs i en stor petriskål (94 mm x 16 mm) og legge til en tredje liten petriskål som inneholder 1,5ml fosfatbufret saltvann (PBS) for luftfukting.
MERK: Legge til en liten petriskål (trinn 3.5) som inneholder PBS er avgjørende for å betydelig redusere fordamping av kulturmedium.
4. Spiral Ganglion Dissection
MERK: Brutto disseksjon kan gjøres utenfor laminær hette (trinn 4.1 til 4.4). For fine disseksjon sterile forhold (laminær hette) er obligatoriske (fra trinn 4.5).
- Avlive dyr (5-7 dager gamle mus) med halshogging uten forutgående bedøvelse.
- Steril hodet ved å spraye med 70% etanol.
- Ved å holde hodet, bryte forbindelsen mellom huden og skallen med en skarp / skarp saks langs den sagittale linje.
- Skjær skallen sagittally og fjerne hjernen ved hjelp av skarpe / sløv saks.
- Skjær timelige bein fra hodeskallen og legg de i en petriskål som inneholder steril iskald Hanks Balanced Salt Solution (HBSS).
- Ved hjelp av en dissecsjon mikroskop, dissekere tromme bulla hjelp fin pinsett og isolere det indre øret.
- Fjern bein av sneglehuset, ved hjelp av fine tang.
- Fjern spiral ligament og stria vascularis (SV) sammen ved å holde med pinsett basal del av spiral ganglion (SG) og SV og sakte slappe SV fra basen -til-apex
- Isoler organ Corti (OC), SG og modiolus (Figur 1A - C)
- Separer OC fra SG og modiolus ved å holde med pinsett basedelen av SG og OC og langsomt avkobling OC fra basen til spissen.
- Skåret side eksplantater (200 til 500 pm i diameter) fra spiral ganglion fremdeles er festet til modiolus (figur 1D) ved hjelp av en tang og en mikro skalpell.
5. Spiral Ganglion Eksplantering Kultur på MEAs
- Plasser to spiral ganglion explants ved siden av elektrodene på MEA tidligere utarbeidet med 100 mL av kulturmedium.
- Plasser organ Corti ca 5 mm fra elektrodeområdet.
- Bruk pinsett til å feste explants og orgel av Corti på MEA samtidig unngå å skade vev.
- Plasser MEAs forsiktig inn i inkubatoren og kultur ved 37 ° C og 5% CO 2. Neste dag, visuelt inspisere at explants har festet til MEA.
MERK: Hvis explants ikke har festet O / N, vil de sjelden gjøre det i løpet av de neste dagene. The OC er plassert ved siden av kultur for trofisk / neurotrophic støtte. - Tilsett 100 ul kulturmedium inneholdende 10% FBS og BDNF daglig i 5 påfølgende dager.
- På dag 6 tilsett 2 ml kulturmedium inneholdende 10% FBS og 5 ng / ml BDNF og kulturen vevet i ytterligere 13 dager.
6. Elektro Recordings å etterforske Spontan og elektrode Stimulering Dependent aktivitet
- Vask MEA kultur med ekstracellulære såning fremstilt i trinn 1.3, ved RT.
- Tørk av kontaktene med en vev og montere MEA på MEA oppsett.
MERK: For å holde kulturen fuktig under montering, legg en liten dråpe av ekstracellulært løsning på kultur. - Legg 300 mL av ekstracellulært løsning og vente i 10 minutter før du spiller, slik at systemet til å stabilisere seg.
- Record spontan aktivitet i 2 min fra alle elektrodene ved å trykke på posten / erverve knappen av programvaren og identifisere opptak elektroder.
- MEA elektrode stimulering: Velg amplitude / varighet / form av stimulans på riktig programvare og gjelder for flere elektroder etter hverandre som beskrevet 13. Velge elektrodene basert på de som viser spontan aktivitet (som i trinn 6.4). Record fra alle de gjenværende elektroder.
- For å utelukke stimulering gjenstand, stimulere fra samme elektrode 10 ganger. Hvis dyrkningen reagerer på minst 8 av 10 ganger, kan det antas som enpositiv respons på elektrode indusert stimulering.
- Å identifisere bakgrunnsstøy, gjelder tetrodotoxin (TTX) til cultureat en konsentrasjon på 1 mikrometer, for å blokkere spenningsstyrte natriumkanaler og rekord i 2 min. Bruk denne til å utføre pigg deteksjon (7,1 og 7,2).
analyse 7. data
MERK: Dataanalyse er tidligere beskrevet i detalj i seks og fem. For nærmere detaljer om programvare som brukes i denne studien se Materialer Table, punkt 7.
- Ved hjelp av den aktuelle programvaren oppdager spontan aktivitet for hver elektrode ansette en detektor basert på standardavvik og en påfølgende discriminator. Denne fremgangsmåten er beskrevet i seks. Aktivitet ser ut så fort spenningstransienter (<5 msek).
- Velg en terskel som resulterer i ingen aktivitet når analysere TTX behandlet samples.Adapt terskelverdien for hvert forsøk til å skille mellom falsk positive og falske negative oppdagelser.
- Ved hjelp av egnet programvare observere den detekterte neuronal aktivitet av hver elektrode som et raster plott i henhold til standard fremgangsmåter (se figur 2A - C).
- Bestem og vise den totale nettverksaktivitet ved å summere opp alle registrerte hendelser innenfor et glidende vindu på 10 ms, forskjøvet med 1 ms trinn.
- Oppdage stimulering-indusert aktivitet ved å vise rådata ved hjelp av egnet programvare for analyse. Identifisere de enkelte toppene offline manuelt. Enkle pigger vises så fort spenningstransienter, som oppstår etter stimulering gjenstand (pil hodet i figur 2E). Et eksempel er vist i figur 2E.
- Avhengig av forsøket, analysere antallet responderende elektroder, terskelen nødvendig for å oppnå en respons, antall virkningspotensialet per elektroder og andre parametere av interesse 5.
8. Tissue Fiksering og Immunohistochemistry
MERK: Den fargeprosessen vil ødelegge MEA. Se Material Table (punkt 4) for reagenser.
- Rett etter innspillingen vaske kulturer med 37 ° C varme PBS tre ganger. Kast PBS og anvende 4% paraformaldehyd (PFA) (i PBS), forvarmet til 37 ° C i 10 min.
FORSIKTIG: PFA er giftig. Arbeid i en kjemisk hette med nødvendig vern og må oppløsningen kastes i henhold til retningslinjene. - Vask kulturene tre ganger med PBS og blokker med 2% bovint serumalbumin (BSA) i PBS (0,01% Triton-X100) i 2 timer.
- Legge til den første antistoff (anti-SIII Tubulin, TUJ antistoff) fortynnet i PBS (2% BSA og 0,01% Triton-X100) og la O / N ved 4 ° C. Vask kulturen tre ganger med PBS.
MERK: Fra nå av holde prøven i mørket så ofte som mulig for å minimere bleking av den sekundære fluorescens-merket antistoff. - Tilsett sekundært antistoff fortynnet i PBS (2% BSA end 0,01% Triton-X100) og inkuberes i 1 til 2 timer ved RT. For å farge kjerner legge til 1: 10.000 DAPI (1 mg / ml lager) i 10 minutter.
- Vask tre ganger med PBS og montere prøvene bakover for å tynne dekkglass (24 x 50 mm 2) ved hjelp av monteringsmedium (se Materialer tabell, punkt 4). Bilde ved hjelp av et fluorescerende mikroskop med 5x og 20X forstørrelse.
Representative Results
Figur 1 oppsummerer prosedyren for vev isolasjon, forberedelse og kultur på MEA. Vi viser de påfølgende trinnene i vev disseksjon å isolere spiral ganglion (SG) fra sensorisk epitel av orgelet i Corti (OC) og stria vascularis (SV) og annekterte spiral ligament (figur 1 A - C). Spiral ganglion eksplantater (3-4 i antall) er kuttet med mikro-saks fra ganglion som skjematisk er vist i figur 1D og plassert på MEA (figur 1E), over elektroden okkuperte området (2,2 mm 2). OC er plassert i umiddelbar nærhet, utenfor elektrodeoverflaten. Veksten av kulturen kan overvåkes over tid (figur 1G). Et skjematisk diagram av protokollen er vist i figur 1F. Elektrofysiologiske aktivitet kan påvises etter 6 dagers dyrking, som øker med langvarig kultur tid. Vi recommend vurdere 18 dagers kulturer som produserer vesentlig høyere antall opptak elektroder i forhold til tidligere tidspunkter 5.
Figur 1. Cellekultur preparat. (A) Fersk dissekert mus indre øret. Hvit stiplede linjen viser plasseringen av sneglehuset, indikerer svart stiplet linje vestibular regionen. (B) Mus indre øre etter fjerning av sneglehuset bony veggen. Cochlea svinger vises med hvite stiplede linjer. (C) The Spiral ganglion (SG) og modiolus, er det organ Corti (OC) og stria vascularis (SV) og spiral ligament vist etter disseksjon. (D) Skjematisk av SG og OC disseksjon og SG explant forberedelse {figure tilpasset fra 5 med godkjenning fra forlaget}. (E) Illustrasjon av flerelektrodegruppen anvendt i denne studien. recodingelektrodene er organisert i et rektangulært rutenett i sentrum og oppta et areal på 2,2 mm 2. 4 Bakke elektroder og sidekontakter er illustrert. (F) Skjematisk av kulturen protokollen. Opptakene blir utført på dag 18. (G) Representative bilder (lyse felt bilder) og ordninger av SG explants på MEA overvåkes i kultur på dag 1, 6 og 18. Scale barer = 400 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Spontan aktivitet kan påvises på MEA og vist som et plott raster der hver linje av tomten representerer et detektert pigg. Et representativt eksempel som viser spontan aktivitet oppdages fra flere elektroder (forskjellige farger i grafene) er vist (figur 2A, 2B og 2C).
(figur 2D), er 5 reagerer elektroder (rød spor) og ikke-reagere elektroder (blå spor) vist i Figur 2E. For disse eksperimentene en elektrode ble brukt for stimulering og alle de andre elektroder for opptak. Enkeltaksjonspotensialer dukket 1 msek etter stimulering gjenstand (svart pil hodet). MEA kan immunostained ved slutten av fremgangsmåten for å vurdere dekning av neuronal prosessene over elektrodeareal. Elektroden er angitt i grønt i figur 2F ble benyttet for stimulering, og elektrodene er angitt i rødt ble brukt til å registrere responser (figur 2E).
Figur 2. Oppgaver opptak på MEA. (A </ Strong>) Spor av originalopptak av seks av 63 elektroder som viser spontan aktivitet. (B) Raster plott av de seks elektroder av figur 2A etter pigg deteksjon. Hver søyle representerer en aksjonspotensial. (C) Raster plottet inkludert alle elektroder (som i A og B) Aktivitet tas opp fra 63 elektrodene (kanal nummer 0-63) i 2 min. (D) En bifasisk stimulus med total varighet på 80 usek og amplitude på 80 uA ble benyttet for stimulering av kulturen fra en elektrode (E58 i figur 2F). (E) Representant eksempel på rådata spor oppnådd etter stimulering fra elektroden 58 viser aksjonspotensialer (rød spor) eller uten svar (blå spor) etter stimulering (svart pil-hode). (F) Spiral ganglion kultur på MEA immunofarget for neuronal markør TUJ (grønn) ved slutten av forsøket for å visualisere neuro nal dekning av elektrodeområdet {figure tilpasset fra 5 med godkjenning fra forlaget}. Elektrode 58 brukes for stimulering er angitt i grønt, responderer elektroder angitt i rødt. Scale bar = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Til slutt, gjør at MEA oppsett for å studere mulig elektrodeoverflaten modifikasjon som kan øke opptaket følsomhet. To kommersielt tilgjengelige MEA-elektroder ble anvendt i denne studien med to forskjellige platina overflater: Grå platina (Grey Pt), bestående av et 150 nm tykt Pt lag (impedans: 400 Kn / 1 KHz) og svart platina, (sort, Pt), oppnådd ved elektrokjemisk avsetning av Pt ved enden av mikrofabrikasjonsprosessen (impedans: 20 Kn / 1 KHz). Se Materialer Table (punkt 6) for detaljer.
ent "fo: holde-together.within-siden =" en "> Seks uavhengige MEA-eksperimenter ble utført per elektrodetype sort Pt MEA gir mulighet for påvisning av neuronal aktivitet på et større antall elektroder pr MEA (figur 3A) og reduksjon av. stimulans amplituden nødvendig for å fremkalle en respons (figur 3B). Vi har analysert for 30-35 uavhengige elektrodepar, i 6 forskjellige eksperimenter, den nåværende grensen nødvendig for å oppnå en reaksjon. sort Pt elektroder utført vesentlig bedre viser en terskel på 31,09 μ A +/- 2,4 sammenlignet med Grey Pt elektroder 47.57 μ A +/- 1,97.
Figur 3. Sammenligning av Grey vs Svart Pt elektroder. To typer elektroder (Grå og sort PT) ble sammenlignet side ved side ved hjelp av 12 uavhengige MEA kulturer, seks på hver MEA type. (A) Det totale antallet gjenEnde elektroder per eksperiment er vist. (B) Amplitude terskel for å lokke fram et svar, målt ved hjelp av 30-35 uavhengige elektrodeparene i 6 uavhengige MEA eksperimenter er vist. Data er vist som gjennomsnitt +/- SD. (Student t test p <0,001) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Protokollen er beskrevet her viser hvordan kultur SGN explants på MEA og vurdere SGN aktivitet ved ekstracellulære ikke-invasive opptak. Denne plattformen og protokollen vi nylig har utviklet fem tillate identifisering av nye stimuleringsregimer og elektrodematerialer som resulterer i reduserte energibehovet for å aktivere SGN, med potensiell interesse for videre implementering av cochleaimplantat og andre nevro-protetikk. Flere forholdsregler i den framlagte prosedyren er grunnleggende for gjennomføring av nøyaktige og reproduserbare eksperimenter.
Forsiktig disseksjon av spiral ganglion og videre håndtering av den primære vev krever spesiell forsiktighet. Disse forsøk er blitt utført ved hjelp av C57 / BL6 mus mellom 5 og 7 dager gamle. Lignende resultater ble oppnådd ved bruk av Wistar-rotter i den samme aldersgruppe, (data ikke vist). Vi tror dette er den beste alderen for fine disseksjon som cochlea bein er fortsatt myk noough for enkel fjerning av tang, og spiral ganglion og orgel av Corti lett kan skilles uten sprekker dendrite prosesser eller SGN Somas. Ved tidligere tider vevet er for myk og sjansene for å rippe SGN Somas sammen med orgel av Corti er høyere, mens på senere stadier, herding av den benete kapsel av sneglehuset øker risikoen for å skade vev mens dissekere. Riktig isolering av SG samt forsiktig skjæring av explants er kritisk. Disse bør være i størrelsesorden 200-500 um i størrelse for å maksimere feste til MEA overflaten og for å ha tilstrekkelig antall SG Somas i eksplantater, fra hvilke neuritter vil regrow. For å øke neurotrophic støtte i de første dagene av kultur, frisk BDNF lagt til daglig, og det organ Corti er plassert i co-kultur.
Hastigheten på disseksjon er også viktig. Alle trinn skal utføres raskt og bruke isen kalde løsninger for å minimere vev forverring. DeTiden mellom eutanasi og plassere eksplantatet på MEA bør være mellom 10-15 min og er avgjørende for vellykket kulturer. Har alle verktøyene klar, for å unngå forsinkelser i kultur plating.
Alle trinn, inkludert fin disseksjon, vedlikehold av kulturen og utarbeidelse av medium og utstyr utføres under sterile forhold. Ved belegning av MEA med ECM-løsningen er det viktig å tine den på is og til å bruke iskald pipettespisser og iskaldt medium som de ECM blandings geler ved høyere temperaturer. Når du plasserer explants på MEAs, først legge mediet til elektrodeområdene, deretter plassere explants. Dersom mediet tilsettes i et andre trinn, eksplantater en tendens til å løsne fra MEA på grunn av skjærspennings. Fordi små volumer av medium blir tilført til kulturen i første 5 dagene, har fordampning av kulturmediet for å bli minimalisert. Derfor er det sterkt anbefalt å opprette en fuktet kammer ved hjelp av små petriskåler som inneholder PBS i nært PROXIMligheten til MEAs.
Forsøkene som er beskrevet her ble utført ved hjelp av kommersielt tilgjengelige MEA elektroder med spesifikke elektrode dimensjoner, belegg materialer og intra elektrodeavstand (som beskrevet i punkt 2, note). Dyrkningsbetingelsene er optimalisert her for å maksimalisere neuronal dekning av den spesielle elektrode gitter utforming. Det er mulig at andre konfigurasjoner av elektrodeavstand, geometrier og overflater kan kreve forskjellige belegg eller celletettheter. Disse trinnene kan kreve innledende feilsøking for å oppnå høy tetthet kulturer.
Når det gjelder de elektrofysiologiske opptakene, før oppstart av opptak kulturen overføres fra dyrkningsmediet ved 37 ° C til ekstracellulær løsning ved romtemperatur. For å unngå ustabile opptak, vente i ca. 10 minutter for å tillate kulturen å stabilisere seg. Når stimulere kultur, bør spesiell forsiktighet brukes ved valg av stimulussom store amplituder (> 3 V) og varighet kan forårsake skade på kulturen. For en referanse om stimulerings puls former og varighet se referanse 5.
For datainnsamling og prosessering hjemmelaget maskinvare (opptak kammer, forbindelser til forsterkere og forsterkere) ble brukt og spesifikke analyseprogrammer ble valgt (se Materiale tabell, punkt 7). Men andre kommersielle MEA oppsett og andre programvarepakker egnet også for disse operasjonene. Vi har tidligere vurdert de svarene av våre kulturer på 3 forskjellige tidspunkter og viste en økt aktivitet med langvarig kultur tid fem. Her foreslår vi 18 dager in vitro for opptak. MEA systemer åpner for kontinuerlige opptak i sterile, fuktede kamre, kan lette identifiseringen av de optimale tidspunkter for hver kultur type.
En stor ulempe ved denne bioanalysen er den høye variasjon i than antall elektroder per kultur som viser respons på stimulering. Denne frekvensen av responser på stimulering avhenger i hovedsak av fire faktorer: tetthet av neuritter i kultur, kontaktene mellom neuritter og elektrodene, diameteren av neuritter eller neuritter bunter, og impedansen av elektrodene. Når det gjelder den neuritt-tetthet, kan bare neuritter som vokser over i det minste to elektroder brukes for stimulering eksperimenter. Kontakten mellom neuritter og elektroder er avhengig av omgivende vev som kan på den ene side isolere neuritter fra elektroden, og således forverre kontakten, eller, på den annen side, isolere neuritter og elektroden fra det omgivende badet og således forbedre kontakten. Vevstetthet, samt neuritt-størrelse, er definert av eksplantatet benyttet og dyrkningsbetingelser. Dissosierte neuronale kulturer har også blitt testet, men neuronal tetthet i disse kulturene er mye lavere, noe som resulterer i et redusert antall recording elektroder. Derfor cellekulturen bør tilpasses den spesifikke vitenskapelige spørsmål som skal behandles.
Til slutt blir impedansen av elektrodene hovedsakelig gitt av størrelsen og overflaten av elektrodene. Materialer, og skaper en stor overflate som for eksempel svart platina, som vist i figur 3, avtar impedansen av elektrodene kan også forbedre koblingen mellom elektroder og neuritter 7-9.
Strategier for å forbedre suksessrate på stimulering inkluderer derfor optimalisering av dyrkningsforhold, økning av den totale antallet elektroder eller elektroder tetthet og modulering av elektrodeoverflaten 10.
Opp til nå, hadde elektrofysiologisk karakterisering av SG nevroner blitt utført med patch clamp teknikker. Dette gjør det mulig for intracellulære opptak av aksjonspotensialer og detaljert analyse av intracellulære ioniske strømmer fraenkeltnerveceller. Her presenterer vi en in vitro bioanalyse som kan brukes til å studere aktivitetsprofiler spiral ganglion neuroner ved å analysere spontan aktivitet eller respons til ekstracellulære stimulering av mange nerveceller samtidig. I tillegg kan interaksjonen mellom elektroden og spiral ganglion neuroner bli studert og optimaliseres ved anvendelse av modifiserte eller nye materialer. Til slutt, selv om det ikke er vist her, denne plattformen kan brukes i kombinasjon med en ytre elektrode, som er montert på en mikromanipulator som nylig vist ved vår gruppe 5, for å studere sammenhengen mellom avstanden av den stimulerende elektrode og kultur-aktivitet. Alle disse nye aspektene tillate for etterligning av viktige funksjoner cochleaimplantat- elektroder kan føre til utforming av nye proteseinnretninger.
Vår modell er en meget nyttig in vitro redskap for å undersøke strategier for å forbedre effektiviteten ved stimulering av auditive nevroner og videre optimize CI-teknologien. Når teknikken er mestret, kan man tenke seg screening for modifisering av en rekke variabler: a) ulike nevrale populasjoner, b) ulike elektrodematerialer / størrelse / impedanser c) utføre kroniske eksperimenter for å teste materialet toksisitet eller elektrode-stimulering indusert toksisitet, noe som kunne belyse tryggere og mer effektive stimuleringsregimer ved in vivo elektrodegrupper.
Acknowledgments
Forfatterne takker Ruth Rubli på fysiologi avdeling ved Universitetet i Bern, Sveits for verdifull teknisk hjelp med forsøkene. Dette arbeidet ble støttet delvis av EU-FP7-NMP-programmet (tilskuddsavtalen ingen 281056, prosjekt NANOCI - www.nanoci.org.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| culture medium | |||
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | 24 ml (for 25 ml) |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | 250 μl (for 25 ml) |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | 250 μl (for 25 ml) |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 500 μl (for 25 ml) |
| FBS | GIBCO | 10099-141 | 10% (for 25 ml) |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025/CF | final 5 ng/ml (for 25 ml) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| extracellular solution (pH 7.4) | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 4 mM | ||
| MgCl2 | 1 mM | ||
| CaCl2 | 2 mM | ||
| HEPES | 5 mM | ||
| Na-pyruvate | 2 mM | ||
| Glucose | 5 mM | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blocking solution | |||
| PBS | Invitrogen | 10010023 | |
| BSA | Sigma | A4503-50G | 2% |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | 0.01% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| TuJ | R&D Systems | MAB1195 | dil 1:200 |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
| Fluoreshild | Sigma | F6057 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plastic/tools | |||
| Petri dish 35 mm | Huberlab | 7.627 102 | |
| Petri dish 94 mm | Huberlab | 7.633 180 | |
| Dumont #5 tweezer | WPI | 14098 | |
| Dumont #55 tweezer | WPI | 14099 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Enzymatic solution: Terg-a-Zyme | Sigma | Z273287-11KG | |
| Extracellular Matrix (ECM) mix: Matrigel TM | Corning | 356230 | |
| MEA electrodes | Qwane Biosciences | (Lausanne, Switzerland) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Labview | National Instruments | Switzerland | |
| IgorPro | WaveMetrics | Lake Oswega, USA |
References
- O'Donoghue, G. Cochlear implants--science, serendipity, and success. N Engl J Med. 369 (13), 1190-1193 (2013).
- Shepherd, R. K., Hatsushika, S., Clark, G. M. Electrical stimulation of the auditory nerve: the effect of electrode position on neural excitation. Hear Res. 66 (1), 108-120 (1993).
- Tykocinski, M., et al. Comparison of electrode position in the human cochlea using various perimodiolar electrode arrays. Am J Otol. 21 (2), 205-211 (2000).
- Wilson, B. S., Dorman, M. F. Cochlear implants: current designs and future possibilities. J Rehabil Res Dev. 45 (5), 695-730 (2008).
- Hahnewald, S., et al. Response profiles of murine spiral ganglion neurons on multi-electrode arrays. J. Neural Eng. 13, (2015).
- Tscherter, A., Heuschkel, M. O., Renaud, P., Streit, J. Spatiotemporal characterization of rhythmic activity in rat spinal cord slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 179-190 (2001).
- Heim, M., Yvert, B., Kuhn, A. Nanostructuration strategies to enhance microelectrode array (MEA) performance for neuronal recording and stimulation. J Physiol Paris. 106 (3-4), 137-145 (2012).
- Kim, R., Nam, Y. Novel platinum black electroplating technique improving mechanical stability. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 184-187 (2013).
- Cellot, G., et al. Carbon nanotubes might improve neuronal performance by favouring electrical shortcuts. Nat Nanotechnol. 4 (2), 126-133 (2009).
- Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nat Nano. 8 (2), 83-94 (2013).
