Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generation af tofarvede Antigen Microarrays til samtidig påvisning af IgG og IgM-autoantistoffer

doi: 10.3791/54543 Published: September 15, 2016

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. fortynding Antigener og Generering Antigen Microarrays

  1. Fortynd antigener i PBS til en slutkoncentration på 0,2 mg / ml. Print op til 162 unikke antigener i to eksemplarer med en microarrayer konfiguration med 9 ben. Medtag IgG og IgM antigener i antigenet biblioteket som positive kontroller. Indbefatter kun PBS som en negativ kontrol.
  2. Tilsæt 20 pi af hvert antigen til brøndens kildepladen 384. Føj antigener til kilden plade i grupper, der afspejler opsætningen af printhovedet (fx arrangere antigener i grupper på 9, når der anvendes 9 nedenfor udskrivning).
  3. Cover kilde plade med folie og fryse ved -80 ° C indtil den er klar til at udskrive arrays.
  4. Rengør solid microarrayer pins ved at inkubere dem i et sonikerende bad med deioniseret vand i 3 x 1 min. Placer stifter i rack til at tørre og derefter arrangere stifter i microarray printhovedet. I 9 pins, brug en 3 x 3 konfiguration.
  5. Program microarrayer for print køre ved at sætte antal pins på printhoved,Antallet af dias skal udskrives, antallet af puder på hver slide, og antal replikater pletter for hvert antigen. Typisk anvende 9 pins, 70 dias, 2 puder / dias, og 2 replikat spots for hvert antigen. Program microarrayer at sonikeres stifter i vand mellem forskellige grupper af antigener.
  6. Tø kilde plade og derefter centrifugeres plade i 1 min ved 100 x g. Placer kilde plade i udpegede stedet i microarrayer. Fjern den del af folien, der dækker den første gruppe af antigener, der skal udskrives.
  7. Arranger utrykte glider på arrayer overflade og køre print program. Print objektglas ved stuetemperatur med fugtighed indstillet på arrayer ved 55 - 60% med den indbyggede befugteren af ​​array maskinen.
  8. Efter hver gruppe af antigener er trykt på alle dias, holde pause i microarrayer. Dæk antigener, der var bare trykt med folie (for at forhindre fordampning) og afdække den næste gruppe af antigener, der skal udskrives. Fortsæt print program.
  9. Efter alle antigener er udskrevet, dækning kilde plspiste med nyt stykke folie og fryse ved -80 ° C. Placer trykte dias i slide boksen og vakuum forsegling. Slides kan blive brugt næste dag eller op til en måned senere.

2. Sondering Antigen Microarrays med Fortyndet Sera

  1. Placer dias i rammer ved hjælp af inkubation kamre. Tilføj 700 pi blokeringspuffer (2,5% [vol / vol] Føtalt kalveserum (FCS), 0,1% [vol / vol] Tween 20 i PBS) til hvert array overflade.
  2. Placer klæbende film over rammen og sted i en forseglet beholder med et stykke vådt væv. Inkuber O / N ved 4 ° C på en rocker.
  3. Fortynd serumprøver 1: 100 i blokeringspuffer. Aspirer blokerende opløsning fra arrays og tilsæt 500 pi fortyndet prøve til hvert array overflade.
  4. Dæk med selvklæbende film, og der inkuberes i 1 time ved 4 ° C med vipning.
  5. Fortynd sekundære antistoffer i blokerende buffer. For humane studier, fortyndes et Cy3 mærket gede-anti-humant IgG-antistof til 0,33 ug / ml og en Cy5 mærket gede-anti-human IgM-antistof til 0,25 ug / ml. For musestudier, fortyndes et Cy3 mærket gede-anti-muse-IgG-antistof til 0,38 ug / ml og en Cy5 mærket gede-anti-muse-IgM-antistof til 0,7 ug / ml.
  6. Aspirer prøver fra arrays og skyl array-overflader 4 gange med skyllepuffer (0,1% Tween 20 i PBS). Pour buffer på til lysbilleder og svirpe off hurtigt.
  7. Tilføj 700 pi blokerende buffer til at vaske hvert array overflade og inkuberes 10 minutter ved stuetemperatur med rocking. Gentag vasketrin to gange mere.
  8. Der tilsættes 500 pi fortyndet sekundært antistof til hvert objektglas overflade og dækkes med selvklæbende film. Inkuber 45 min ved 4 ° C med vipning.
  9. Aspirer sekundært antistof blandingen fra objektglassene, og skyl 4 gange som ovenfor. Wash slides 3 gange med 700 pi blokerende / fortyndingspuffer som ovenfor.
  10. Fjern slides fra rammer og sted i metal slide rack, der er nedsænket i PBS. Inkuber 20 min ved stuetemperatur med orbital omrystning. Sted i ny beholder med PBS og inkuberes anden 20 mi under omrystning.
  11. Sted slide rack i beholder med deioniseret vand 15 sek. Placer rack i en ny beholder med vand og inkuberes yderligere 15 sek.
  12. Til tørre dias, sted slide rack på en ELISA plade adapter i centrifuge og centrifugering ved 220 xg i 5 min ved stuetemperatur.
  13. Placer dias i lystæt kasse indtil den er klar til scanning.

3. Scanning Antigen Microarrays og Eksport af data

  1. Scan dias ved hjælp af en microarray-scanner, der kan registrere Cy3 og Cy5 fluorescerende signaler. For at justere fotomultiplikatorrør (PMT) niveauer af scanneren, pre-scan et dias, der kun blev testet med sekundære antistoffer.
    Bemærk: Dette dias bør have fuld antigen bibliotek trykt på det herunder positive (IgG og IgM) og negative (PBS) kontroller. Den præ-scanning er en lav opløsning scanning, der giver brugeren mulighed for hurtigt at finde de optimale PMT-indstillingerne.
  2. Indstil PMT-værdier, så de humane IgG funktioner (på Cy3 kanal) og brummenet IgM funktioner (på Cy5 Channel) har en lignende median fluorescensintensitet minus baggrund (MFI-B) (typisk 40.000). PMT-niveauer indstilles ved at trykke på "hardware" -knappen. Når de er indstillet, holder disse PMT indstillinger konstant.
  3. Scan de eksperimentelle glider på de to kanaler ved at trykke på "scan" knappen. Gem lysbilederne (begge kanaler) efter hver scanning.
  4. Indlæse objektglasset skal analyseres, i mikroarrayet software ved hjælp af "fil" knappen.
  5. Læg genet vifte listen (GAL) fil ved at bruge knappen "fil". Den GAL fil har layoutet af array med identiteten af ​​de array-funktioner.
  6. Placer arrayet skabelon over det scannede billede, så de arrays funktioner matcher skabelonen så tæt som muligt.
  7. Juster funktioner i alle blokke med skabelonen ved at trykke på "align" knappen. Programmet vil generelt finde omridset af de cirkulære funktioner, men nogle manuelle justeringer kan være nødvendige. Disse justeringer kan foretages ved at indtaste funktionstilstand. Softwaren vil derefter beregne en MFI-B for de enkelte antigener.
  8. Brug knappen "fil" for at eksportere disse resultater som en tekstfil.

4. Analyse Array data med betydning Analyse af microarrays (SAM)

  1. Indlæs individuelle tekstfiler til Excel og identificere de kolonner, der har MFI-B for Cy3 og Cy5 kanaler.
  2. Beregn gennemsnittet for de dublerede funktioner.
  3. For enhver negativ MFI-B, erstatte den negative tal med 10. Omdan data ved at dividere rå MFI-B med 100 og derefter ved at beregne log basis 2.
  4. Analyser log transformerede data med betydning Analyse af microarrays (SAM) som tidligere 7 beskrevet.
  5. For et studie med to grupper (f.eks raske kontrolpersoner vs. patienter), label én gruppe "1" og gruppens "2." Brug en to-klasse, uparrede analyse i SAM at identificere antigener reaktiviteter, som er significantly forskellige mellem de to grupper (q-værdi <0,05).
  6. Brug klyngedannelse og varme-map genererer software til at gøre billeder til præsentation 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Antigener er anbragt i en plade med 384 og trykt på objektglas af en robot microarrayer som vist i figur 1. Figur 2 viser lysbilleder anbragt i en ramme med inkubation kamre og et scannet dias efter forarbejdning. Figur 3 viser positive og negative kontrolprøver objektglas. Den negative skyderen kun probet med sekundære antistoffer, og den positive kontrol slide er probet med serum fra en patient med systemisk lupus erythematosus. Ved at bruge to separat mærkede sekundære antistoffer, kan IgG og IgM reaktiviteter adskilles på samme glideflade. Figur 4 viser fluorescensintensiteten af IgM-antistoffer mod enkeltstrenget DNA (ssDNA) og IgG antistoffer mod ribosomale P (Ribo P) over en bred vifte af serumfortyndinger. I dette eksperiment positivt kontrolserum fra en patient med systemisk lupus erythematosus med kendt reaktivitet mod Ribo P blev anvendt. Linøre svar er observeret på IgM-kanalen over alle fortyndinger. Lineære reaktioner observeret på IgG kanal op til en MFI-B på ca. 30.000. Efter dette tidspunkt svarene begynder at mætte og forøgelser i antistof til Ribo P fører ikke til en tilsvarende stigning i MFI-B. Figur 5 viser, hvordan arrayene kan anvendes til at detektere rheumatoid faktor i humant serum. I denne undersøgelse blev serum fra en patient med cryoglobulinemic vaskulitis med en dokumenteret rheumatoid faktor (IgM-antistoffer mod IgG) af 167 IE / ml (normal <11 IU / ml) anvendt. Brug sekundære antistoffer alene, ingen IgM reaktivitet ses på IgG, der er spottet på array. I modsætning hertil er signifikant IgM reaktivitet (MFI-B på ca. 5.000) detekteret mod IgG, når glideren probet med serum fra patienten med rheumatoid faktor. Figur 6 viser udviklingen af en to-farve-antigen microarray til brug med museserum. I denne figur muse IgM thpå, er plettet på arrayet detekteres kun af anti-muse-IgM sekundært antistof, og muse-IgG, der er plettet på arrayet kun detekteres af anti-muse-IgG sekundært antistof. Figur 7 viser alignment af en skabelon gitter på et scannet matrix billedet ved hjælp microarray analyse software. Når array-funktioner er blevet afstemt med gitteret, kan array funktioner analyseres for at opnå median fluorescensintensitet minus baggrund for hver funktion.

figur 1
Figur 1. generation af antigen Microarrays. Antigener først tages i kilden plade. I kildepladen vist i figuren, er antigener anbragt i grupper på 9, der matcher 3 x 3 opstilling af skrivehovedets stifter. Kildepladen placeres derefter i robotic microarrayer og antigenerne derpå plettet på objektglassene. I dette eksempel 2-pad FAST slides are anvendt, giver mulighed for identiske arrays til at blive opdaget på de 2 nitrocellulose overflader. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Behandling af Antigen Microarrays. Slides er placeret i FAST rammer ved hjælp inkubation kamre og behandles ved at tilføje prøver og derefter sekundære antistoffer. Antigen reaktiviteter afsløres med en scanner stand til at detektere fluorescerende signaler. Det scannede billede af en 2-pad FAST slide vises. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 <br /> Figur 3. To farve Antigen Microarrays Optimeret til brug med human Sera. (A) IgG, IgM, og IgG-Fc detekteres på array'et probet kun med sekundære antistoffer. Disse tre antigener er positive kontroller for at vise specificiteten af ​​de sekundære antistoffer. Rød fluorescens (IgM kanal) indikerer binding af det anti-humane IgM sekundært antistof. Grøn fluorescens (IgG kanal) indikerer binding af det anti-humane IgG sekundært antistof. IgG Fc-antigen er hvid på grund af overmætning. Detekteres (B) Mange flere reaktiviteter på arrayet undersøgt med positivt kontrolserum fra en patient med systemisk lupus erythematosus med kendt reaktivitet over Ribo P antigen. Kasserne angiver de steder, hvor DNA- og Ribo P antigener er blevet array. (C) Kvantificering af fluorescensintensiteterne i det positive kontrolserum afslører, at de fleste af de antistofreaktiviteter mod DNA antigener er af IgM isotype. (D) Kvantificering af fluorescensintensiteterne i det positive kontrolserum afslører, at de fleste af de antistofreaktiviteter mod Ribo P antigener er af IgG-isotypen. Array funktioner er spottet i to eksemplarer og er ca 500 um i diameter. Grafer viser middel ± SD for array-funktioner. dsDNA, dobbeltstrenget DNA; ssDNA, enkeltstrenget DNA; MFI-B, median fluorescensintensitet minus baggrund; Ribo P, ribosomale P. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Fluorescens Intensitet vs. Serum fortyndingsfaktor. (A) MFI-B over et bredt område af serumfortyndinger er vist for IgM mod ssDNA og IgG mod Ribo P. For disseeksperimenter blev positiv kontrol serum med kendte IgG reaktivitet imod Ribo P og ssDNA brugt. MFI-B er mættet ved en værdi på ca. 65.000. (B) log2 transformation af MFI-B data afslører lineære responser på både IgG og IgM kanaler over en bred vifte af antigen reaktiviteter. Over en MFI-B på 30.000, IgG signal begynder at mætte og mister linearitet. Array funktioner blev spottet i 6 gentagelser. Grafer viser middel ± SD for array-funktioner. ssDNA, enkeltstrenget DNA; MFI-B, median fluorescensintensitet minus baggrund; Ribo P, ribosomale P. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Påvisning af Rheumatoid Factor med To farve Antigen Microarrays. (B) Array probet med serum fra en patient med cryoglobulinemic vaskulitis med en høj rheumatoid faktor. IgG funktion er grøn-gul grundet bindingen af ​​IgM i patientens serum til immobiliseret IgG. Interessant, denne patient har også IgG-antistoffer mod IgM som IgM Feature vises orange. Patienten har også en medfødt hjertesygdom og er kendt for at have høj reaktivitet med hjertes protein troponin C. (C) Kvantificering af IgG og IgM funktioner på arrayet probet kun med sekundære antistoffer viser, at de sekundære antistoffer ikke har enhver krydsreaktivitet. (D) Kvantificeringaf IgG og IgM funktioner på arrayet probet med patienten serum bekræfter tilstedeværelsen af ​​rheumatoid faktor. Funktioner er spottet i to eksemplarer og er ca 500 um i diameter. Grafer viser middel ± SD for array-funktioner. MFI-B, median fluorescensintensitet minus baggrund. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. Udvikling af tofarvet Arrays til Profil Mouse Serum antistoffer. (A) Array kun undersøgt med sekundære antistoffer. Rød fluorescens indikerer binding af det anti-muse-IgM sekundært antistof. Grøn fluorescens indikerer binding af det anti-muse-IgG sekundært antistof. Den muse-IgG, der er plettet på arrayet detekteres kun af anti-mouSE IgG sekundært antistof, og muse IgM, der er plettet detekteres kun af anti-muse-IgM sekundært antistof. De andre funktioner på arrays, der er opdaget af de sekundære antistoffer er capture-antistoffer mod muse-IgG eller muse-IgM. (B) Array probes med en muse-IgG monoklonalt antistof mod histidinmærker. På dette array, den Ribo P-antigenet (rekombinant His-mærket protein) er grøn, hvilket indikerer, at det kun detekteres af anti-muse-IgG sekundært antistof. Dette forventes givet at det monoklonale antistof er af IgG-isotypen. Den Ribo P antigen ikke detekteres, når arrayene probes med sekundære antistoffer alene (orange felt). (C) Kvantificering af IgG, IgM, og Ribo P funktioner på arrayet probet med et muse IgG monoklonalt antistof mod histidinmærker. Array funktioner er spottet i seks gentagelser og er cirka 500 um i diameter. Grafer viser middel ± SD for array-funktioner. MFI-B, median fluorescence intensitet minus baggrund; Ribo P, ribosomale P. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7
Figur 7. Tilpasning af en skabelon Grid på en Array billede. I dette skærmbillede, en skabelon gitter, som blev genereret fra en gal fil, blev på linje med en tidligere scannet antigen microarray. Grupperingen blev probet med serum fra en patient med systemisk lupus erythematosus og en blodstørkningsforstyrrelser der havde mange autoantistofniveauer reaktiviteter. Grøn fluorescens repræsenterer binding af IgG-antistoffer og rød fluorescens repræsenterer binding af IgM-antistoffer. De funktioner, trykt af solide ben er næsten cirkulær og er let skitseret af microarray-softwaren (GenePix). Når gitteret justeringen er færdig, Software kan beregne medianen fluorescensintensitet minus baggrund (på både Cy3 og Cy5 kanaler) for hver af de array-funktioner. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollen beskrevet her muliggør kvantificering af autoantistoffer anvendelse af antigenet microarray teknik. Antigen mikroarrays tilbyder flere fordele i forhold til konventionel ELISA ved screening for autoantistoffer. Først og fremmest kan en række antigener, herunder nukleinsyrer, proteiner, peptider og cellelysater grupperes onto nitrocellulose-coatede objektglas, således tillader multiplekset screening af autoantistoffer. Desuden er det kun mikrogram antigen er nødvendige for at generere arrays siden nanoliter af antigen plettet på hvert objektglas. Opstillingerne kræver også meget lidt patientprøve, som kun 5 pi serum er nødvendig til at probe et array overflade ved en 1: 100 fortynding af prøver. Endelig arrays plettet på nitrocellulose har vist sig at være mere følsomme end konventionelle ELISA ved screening for autoantistoffer 9.

Ud over at anvende antigen microarrays at screene for autoantistoffer, kan grupperingerne være brugd til påvisning reaktivitet mod ikke-selv-proteiner (f.eks virale proteiner), for at definere specificiteten af monoklonale antistoffer og til at måle niveauet af ikke-HLA-antistoffer i transplantation som tidligere 9-12 beskrevne. Antigen microarrays kan også anvendes til at udføre detaljerede epitopkortlægning eksperimenter, hvor overlappende peptider af et enkelt protein grupperes på et objektglas. En nylig undersøgelse anvendt denne metode til at definere epitoper af U1-70K protein, der er mål for autoantistoffer i systemisk lupus erythematosus 13.

Under anvendelse af protokollen beskrevet her, påvisning af IgG- og IgM reaktiviteter er lineær over et bredt område af serumfortyndinger. Disse undersøgelser blev udført under anvendelse positivt kontrolserum fra en patient med systemisk lupus erythematosus med kendt reaktivitet over for ribosomale P-antigen og ssDNA. IgM-reaktivitet til ssDNA er lineær ved serumfortyndinger på 1: 125 til 1: 32.000, svarende til MFI-B på 17.000 til 50. IgG reaktivitet over forRibo P er lineær ved serumfortyndinger på 1 4000 til 1: 512,000, svarende til MFI-B i 32.000 til 200. På fortyndinger på under 1: 4000 (og MFI-B er større end 32.000), påvisning kurve af IgG reaktivitet flader ud og er ikke længere lineært. I arbejdet med hjerte transplanterede patienter, er serum rutinemæssigt fortyndet til 1: 100 som MFI-B for antigener sjældent overstiger 10.000 på denne fortynding. Til undersøgelser med patienter med autoimmun sygdom med høj titer autoantistoffer, kan patientprøver være nødvendigt at fortynde yderligere for at sikre, at størstedelen af ​​autoantistof reaktiviteter falder inden for det lineære område af assayet.

Mens MFI-B kan være nyttigt at sammenligne autoantistofniveauer reaktiviteter mellem grupper af patienter, kan det også være nyttigt at omdanne denne værdi i en mere kvantitativ måling af autoantistofniveauer. Dette kan udføres ved at spotte flere kendte fortyndinger af oprenset IgG og IgM på gliderne til at generere en standardkurve. Brug af denne kurve, kan MFI-B så være transformet til et autoantistof niveau for hvert antigen.

I den protokol, der præsenteres her, blev 2-pad nitrocellulose-coatede slides brugt. På disse slides, to identiske arrays, som kan probet med to separate serumprøver, er trykt på hvert objektglas. Dette giver mulighed for to prøver fra den samme patient (såsom før og efter behandling), der skal sammenlignes på samme glas, som minimerer interslide variabilitet. Toogtredive dias med 64 individuelle patientprøver rutinemæssigt behandles på samme tid i én dag. Den mest aktuelle vifte udskrives med 9 pins, der giver mulighed for 162-antigener, der skal udskrives i to eksemplarer (hver pin udskriver en 36 funktion undergruppering hvilket svarer 18 antigener trykt i to eksemplarer).

De antigen microarrays genereres i denne protokol blev trykt med solide microarrayer ben. Udskrivning med solide ben er mere tidskrævende end udskrivning med fjerpen stil pins siden microarrayer skal re-dip i kilden plade efter hver tIME, at stifterne rører slide overfladen. Faste stifter blev anvendt som de producerer meget reproducerbare, næsten cirkulære opstilling features (ca. 500 um i diameter). Disse funktioner kan nemt opdages og skitseret af scanneren software, og der er behov minimale manuelle justeringer at kvantificere array-funktioner. Faste stifter også give mulighed for cellelysater, der skal trykkes, hvilket kan være vanskeligt at udskrive med quill stifter på grund af deres højere viskositet. På grund af de lange udskrivning gange involveret med solide ben (undertiden 10 - 11 timer til at udskrive 70 slides), antigener, der ikke bliver trykt i kilden pladen er dækket med folie for at forhindre fordampning.

Protokollen beskrevet her præsenterer en fremgangsmåde til at adskille IgG- og IgM reaktiviteter på samme glas overflade. De arrays er optimeret til at screene for både mennesker og mus antistoffer ved hjælp af par af sekundære antistoffer mærket med forskellige fluoroforer. Kritisk til denne to-farve tilgang er at identificere secondary antistoffer, som er yderst specifik for enten IgG eller IgM isotyper. De sekundære antistoffer, der anvendes genkender Fc-delen af ​​IgG eller IgM, og ikke krydsreagerer med hinanden. Adskillelse af IgG og IgM signaler er vigtigt i betragtning af de forskellige funktioner af disse antistoffer i immunresponser. For eksempel er IgM fremstilles i højere niveauer af B1-celler og er typisk en markør for en tidlig immunreaktion. På den anden side, IgG er en markør for en senere immunrespons, der udvikles som følge af klasseskift 14. Ved at detektere IgG og IgM signaler separat, er det også muligt at identificere IgM rheumatoide faktorer i patientprøver (dvs. IgM-immunoglobuliner, som binder til IgG, der er blevet plettet på arrayet). Ved spotting forskellige dele af antistoffer (f.eks Fc versus Fab), binding af rheumatoid faktor til forskellige IgG-antistof-epitoper kan kvantificeres. Med tilgængeligheden af ​​scannere med flere end to lasere, ekstra sekunderAry antistoffer kunne føjes til den aktuelle sekundære antistof par til at identificere binding af IgA, IgD eller IgE antistoffer. Sekundære antistoffer kan også identificeres som ville give mulighed for identifikation af separate IgG-underklasser (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) bundet til antigener på et enkelt array.

Afslutningsvis antigenet microarray teknik er en robust teknologi giver mulighed for high-throughput karakterisering af serum-autoantistoffer. Denne teknik er meget tilpasselig og følsom. Den fluorescerende-baseret detektion system er blevet optimeret til både humane og murine undersøgelser og muliggør samtidig påvisning af IgG og IgM-antistoffer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ribosomal P0 Diarect 14100 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgG Jackson Immuno 009-000-003 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgM Jackson Immuno 009-000-012 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgG Sigma-Aldrich I5381 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgM Biolegend 401601 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
double-stranded DNA Sigma-Aldrich D1626 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
single-stranded DNA Sigma-Aldrich D8899 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
microarrayer Virtek VersArray Chipwriter Pro many types of arrayers are suitable
solid printing pins Arrayit Corporation SSP015
software for robotic microarrayer Virtek Chipwriter Pro 
FAST slides (2 Pad) GVS Northa America 10485317
FAST frame GVS Northa America 10486001
FAST incubation chambers (2 Pad) GVS Northa America 10486242
384 well plates Whatman 7701-5101
plate sealers VWR 60941-062
foil plate covers VWR 60941-124
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
Fetal calf serum Invitrogen 12483020
Cy3 goat anti-human IgG Jackson Immuno 109-165-096 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-human IgM Jackson Immuno 109-175-129 use working stock in 50% glyercol
Cy3 goat anti-mouse IgG Jackson Immuno 115-165-071 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-mouse IgM Jackson Immuno 115-175-075 use working stock in 50% glyercol
Microarray Scanner Molecular Devices Axon 4200A
Microarray software Molecular Devices Genepix 6.1
Clustering software eisenlab.org Cluster 3.0
Heatmap software eisenlab.org Treeview 1.60
Microarray statistical software Stanford University SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naparstek, Y., Plotz, P. H. The role of autoantibodies in autoimmune disease. Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).
  2. Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention. Autoimmun Rev. 14, 555-563 (2015).
  3. Robinson, W. H., et al. Autoantigen microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses. Nature. medicine. 8, 295-301 (2002).
  4. Quintana, F. J., et al. Antigen microarrays identify unique serum autoantibody signatures in clinical and pathologic subtypes of multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18889-18894 (2008).
  5. Hueber, W., et al. Antigen microarray profiling of autoantibodies in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 52, 2645-2655 (2005).
  6. Price, J. V., et al. Protein microarray analysis reveals BAFF-binding autoantibodies in systemic lupus erythematosus. J. Clin. Invest. 123, 5135-5145 (2013).
  7. Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 5116-5121 (2001).
  8. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14863-14868 (1998).
  9. Chruscinski, A., et al. Generation of Antigen Microarrays to Screen for Autoantibodies in Heart Failure and Heart Transplantation. PloS one. 11, e0151224 (2016).
  10. Price, J. V., et al. Characterization of influenza vaccine immunogenicity using influenza antigen microarrays. PloS one. 8, e64555 (2013).
  11. Singh, H., et al. Reactivity profiles of broadly neutralizing anti-HIV-1 antibodies are distinct from those of pathogenic autoantibodies. Aids. 25, 1247-1257 (2011).
  12. Porcheray, F., et al. Chronic humoral rejection of human kidney allografts associates with broad autoantibody responses. Transplantation. 89, 1239-1246 (2010).
  13. Haddon, D. J., et al. Mapping epitopes of U1-70K autoantibodies at single-amino acid resolution. Autoimmunity. 48, 513-523 (2015).
  14. Schroeder, H. W. Jr, Cavacini, L. Structure and function of immunoglobulins. J Allergy Clin Immunol. 125, S41-S52 (2010).
Generation af tofarvede Antigen Microarrays til samtidig påvisning af IgG og IgM-autoantistoffer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).More

Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter