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Immunology and Infection

Generation of Two-color Antigen-Mikroarrays für den gleichzeitigen Nachweis von IgG und IgM-Autoantikörper

doi: 10.3791/54543 Published: September 15, 2016

Protocol

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1. Diluting Antigene und Generierung von Antigen-Mikroarrays

  1. Verdünnte Antigene in PBS auf eine Endkonzentration von 0,2 mg / ml. Drucken Sie bis zu 162 einzigartige Antigene in zweifacher Ausfertigung mit einer Microarrayers Konfiguration mit 9 Pins. Umfassen IgG- und IgM-Antigene in den Antigen-Bibliothek als positive Kontrollen. Umfassen PBS nur als negative Kontrolle.
  2. In 20 ul jedes Antigen an die 384-Well-Source-Platte. In Antigene an der Source - Platte in Gruppen, die den Aufbau des Druckkopf spiegeln (zB ordnen Antigene in Gruppen von 9 , wenn 9 Pins für den Druck verwendet werden).
  3. Abdeckung Source-Platte mit Folie und Einfrieren bei -80 ° C bis bereit Arrays zu drucken.
  4. Reinigen Sie feste Microarrayers Stifte, indem sie in einem Ultraschallbad mit VE-Wasser für 3 x 1 min inkubiert. Platz Stifte in Rack zu trocknen und dann Stifte in Microarray-Druckkopf anordnen. Für 9-polig, mit einem 3 x 3-Konfiguration.
  5. Programm Microarrayers für den Druck laufen nach Anzahl Pins auf Druckkopfeinstellung,Anzahl der Folien auf jeder Folie Anzahl der Kissen und die Anzahl der Wiederholungs spots für jedes Antigen zu drucken. Normalerweise verwenden 9-polig, 70 Rutschen, 2 Pads / Rutsche und zwei Wiederholungsspots für jedes Antigen. Programm Microarrayers zu beschallen pins in Wasser zwischen verschiedenen Gruppen von Antigenen.
  6. Thaw Source-Platte und dann Zentrifuge Platte für 1 min bei 100 x g. Platzieren Sie Quellenplatte in dafür vorgesehenen Stelle in Microarrayers. Entfernen Sie den Abschnitt der Folie, die die erste Gruppe von Antigenen bedeckt gedruckt werden.
  7. Vereinbaren ungedruckten gleitet auf Arrayers Oberfläche und Laufdruckprogramm. Drucken von Folien bei RT mit Feuchtigkeit setzen auf der Arrayers bei 55-60% mit dem eingebauten Luftbefeuchter der Array-Maschine.
  8. Nachdem jede Gruppe von Antigenen auf alle Folien gedruckt wird, unterbrechen Sie die Microarrayers. Decken Sie die Antigene, die wurden nur mit Folie gedruckt (zur Verhinderung von Verdunstung) und entdecken die nächste Gruppe von Antigenen gedruckt werden. Weiter Druckprogramm.
  9. Nachdem alle Antigene gedruckt wurden, decken Quelle plaß mit neuen Stück Folie und Einfrieren bei -80 ° C. Legen Sie gedruckte Folien in Gleitkastens und Vakuumdichtung. Die Objektträger können am nächsten Tag verwendet werden oder bis zu einen Monat später.

2. Probing Antigen-Mikroarrays mit verdünntem Sera

  1. Die Objektträger in Rahmen mit Inkubationskammern. Hinzufügen, 700 & mgr; l Blockierungspuffer (2,5% [vol / vol] fötalem Kälberserum (FCS), 0,1% [v / v] Tween 20 in PBS) zu jeder Array-Oberfläche.
  2. Platzieren Klebefolie über Rahmen und in einem verschlossenen Behälter mit einem Stück feuchten Tuchs. Inkubieren O / N bei 4 ° C auf einer Wippe.
  3. Verdünnte Serumproben 1: 100 in Blockierungspuffer. Absaugen Blocking-Lösung von Arrays und 500 ul verdünnte Probe zu jedem Array-Oberfläche hinzuzufügen.
  4. Mit Klebefolie abdecken und Inkubation für 1 Stunde bei 4 ° C mit Schaukeln.
  5. Verdünnen Sekundärantikörper in Blocking-Puffer. Für Humanstudien, verdünntem eine Cy3 markiertes Ziegen anti-human IgG-Antikörpers auf 0,33 & mgr; g / ml und einem Cy5 markierten Ziege-anti-human IgM-Antikörper 0,25 ug / ml. Für Maus-Studien, verdünntem a Cy3 Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörper auf 0,38 & mgr; g / ml und einem Cy5 markierten Ziege-anti-Maus IgM Antikörper auf 0,7 & mgr; g / ml markiert.
  6. Aspirat Proben von Arrays und Array spülen Oberflächen 4mal mit Spülpuffer (0,1% Tween 20 in PBS). Gieße auf, um Dias Puffer und schnell wegwedeln.
  7. In 700 l Blocking-Puffer jedes Array-Oberfläche zu waschen und 10 min bei RT inkubieren mit Schaukeln. Wiederholen Waschschritt zwei weitere Male.
  8. In 500 ul verdünnt sekundären Antikörper zu jeder Gleitfläche und Abdeckung mit Klebefolie. Inkubiere 45 Minuten bei 4 ° C unter Schütteln.
  9. Absaugen sekundären Antikörper Mischung aus Dias und 4 mal spülen, wie oben. Wasch gleitet 3-mal mit 700 & mgr; l Blockierungs / Verdünnungspuffer wie oben.
  10. Die Objektträger aus Rahmen und in Metallschlitten-Rack, das in PBS eingetaucht ist. Inkubieren 20 min bei RT mit orbitalen Schütteln. Der Platz im neuen Container von PBS und Inkubation weitere 20 min unter Schütteln.
  11. Den Objektträger-Rack in Behälter von entsalztem Wasser 15 sec. Legen Sie Rack in einem neuen Behälter mit Wasser und Inkubation weitere 15 sec.
  12. Um trockene Rutschen, Platz Dia-Rack auf einem ELISA-Plattenadapter in Zentrifuge und Spin bei 220 × g für 5 min bei RT.
  13. Die Objektträger in lichtdichten Box bis zum Scannen bereit.

3. Scannen Antigen-Mikroarrays und Exportieren von Daten

  1. Scannen von Dias einen Microarray-Scanner verwenden, die Cy3 und Cy5 Fluoreszenzsignale erkennen kann. Um die Fotovervielfacherröhre (PMT) Ebenen des Scanners, Pre-Scan eine Folie einzustellen, die nur mit sekundären Antikörpern sondiert wurde.
    Hinweis: Diese Folie, um das vollständige Antigen-Bibliothek auf sie einschließlich positiv (IgG und IgM) sowie negative (PBS) Kontrollen gedruckt haben sollte. Die Pre-Scan ist eine niedrige Auflösung scannen, die dem Benutzer ermöglicht, schnell die optimale PMT-Einstellungen zu finden.
  2. Stellen Sie die PMT-Werte, so dass die menschliche IgG-Features (auf dem Cy3-Kanal) und das Brummenein IgM-Features (auf dem Cy5-Kanal) haben eine ähnliche mittlere Fluoreszenzintensität minus Hintergrund (MFI-B) (typischerweise 40.000). Die PMT Ebenen werden durch Drücken der "Hardware" Taste eingestellt. Einmal eingestellt, halten Sie diese PMT-Einstellungen konstant.
  3. Scannen Sie die experimentellen Dias auf den beiden Kanälen durch die "Scan" -Taste drücken. Speichern Sie die Dia-Bilder (beide Kanäle) nach jedem Scan.
  4. Legen Sie die Folie werden in der Microarray-Software analysiert, indem die "Datei" Taste.
  5. Laden Sie die Gen-Array-Liste (GAL) Datei, indem Sie die "Datei" Taste. Die GAL-Datei hat das Layout des Arrays mit den Identitäten der Array-Funktionen.
  6. Platzieren des Arrays Schablone über dem gescannten Bild so, dass die Arrays Merkmale der Vorlage möglichst genau übereinstimmen.
  7. Richten Sie Funktionen in allen Blöcken mit der Vorlage durch die "align" Taste drücken. Das Programm wird im allgemeinen die Kontur der Kreis Merkmale finden aber einige manuelle Anpassungen erforderlich sein können,. Diese Einstellungen können durch Eingabe der Feature-Modus vorgenommen werden. Die Software wird dann eine MFI-B für jedes der Antigene berechnen.
  8. Verwenden Sie die "Datei", um diese Ergebnisse als eine Textdatei zu exportieren.

4. Analysieren Array Daten Bedeutung Analyse von Microarrays (SAM)

  1. Legen Sie einzelne Textdateien in Excel und identifizieren Sie die Spalten, die MFI-B für die Cy3 und Cy5-Kanälen.
  2. Berechnen Sie den Durchschnitt der doppelten Funktionen.
  3. Für jede negative MFI-B, ersetzen die negative Zahl mit 10 Daten-Transformation von rohen MFI-B durch 100 dividiert und dann durch log Basis 2 berechnet wird.
  4. Analysieren Sie log transformierten Daten mit Bedeutung Analyse von Microarrays (SAM) , wie zuvor 7 beschrieben.
  5. Für eine Studie mit zwei Gruppen (zB gesunde Kontrollen vs. Patienten), Etikett einer Gruppe "1" und die Gruppe "2." Verwenden Sie eine Zwei-Klassen, ungepaarten Analyse in SAM auf Antigene zu identifizieren, die Reaktivitäten significantly unterschiedlich zwischen den beiden Gruppen (q-Wert <0,05).
  6. Verwenden Sie Clustering und Wärme-Kartenerzeugungs Software machen Bilder für die Präsentation 8.

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Representative Results

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Antigene werden in einer 384 - Well - Platte und auf Objektträger gedruckt von einem Roboter Microarrayers angeordnet , wie in 1 gezeigt ist , Fig . 2 gleitet in einem Rahmen mit Inkubationskammern und einem abgetasteten Objektträger nach der Verarbeitung plaziert zeigt, Fig . 3 zeigt , positive und negative Kontrollobjektträger. Der negative Schieber nur mit sekundären Antikörpern sondiert, und die positive Steuerschieber mit Serum von einem Patienten mit systemischem Lupus erythematosus sondiert. Durch die Verwendung von zwei getrennt markierten sekundären Antikörper, IgG und IgM - Reaktivitäten auf derselben Gleitfläche werden getrennt. 4 zeigt die Fluoreszenzintensität von IgM Antikörper gegen einzelsträngige DNA (ssDNA) und IgG - Antikörper gegen ribosomale P (Ribo P) über einen weiten Bereich von Serumverdünnungen. In diesem Experiment positive Kontrollserum von einem Patienten mit systemischem Lupus erythematosus mit bekannter Reaktivität gegen Ribo P verwendet wurde. LinOhr-Antworten werden auf der IgM-Kanal über alle Serumverdünnungen beobachtet. Lineare Antworten werden auf dem Kanal beobachtet IgG bis zu einem MFI-B von etwa 30.000. Nach diesem Punkt beginnen die Antworten in Antikörper Ribo P zu sättigen und erhöht sich nicht zu einer entsprechenden Erhöhung der MFI-B führen. 5 zeigt , wie die Abbildung Arrays verwendet werden können Rheumafaktoren im menschlichen Serum zu detektieren. In dieser Studie Serum von einem Patienten mit cryoglobulinemic Vaskulitis mit einer dokumentierten rheumatoid factor (IgM Antikörper gegen IgG) von 167 IU / ml (normal <11 IU / ml) verwendet. Mit Sekundärantikörper allein wird keine IgM-Reaktivität gegen das IgG gesehen, die auf das Array gesichtet wird. Im Gegensatz dazu signifikante IgM - Reaktivität (MFI-B von ca. 5.000) detektiert gegen IgG , wenn der Schieber mit Serum von Patienten mit rheumatoider Faktor sondiert wird. 6 zeigt die Entwicklung eines Zwei-Farben - Antigen - Mikroarray zur Verwendung mit Mausserum. In dieser Figur Maus-IgM-thbei auf das Array getupft wird nur durch die anti-Maus - IgM sekundären Antikörper und Maus - IgG nachgewiesen , das auf das Array getupft wird nur durch die anti-Maus - IgG - Sekundärantikörpers. 7 zeigt die Ausrichtung einer Schablone Raster auf einem gescannten erkannt wird Array Bild Microarray-Analyse-Software. Sobald die Array-Funktionen wurden mit dem Raster ausgerichtet sind, können die Array-Funktionen für jede Funktion mittlere Fluoreszenzintensität minus Hintergrund zu erhalten, werden analysiert.

Abbildung 1
Figure 1. Erzeugung von Antigen - Mikroarrays. Die Antigene werden zuerst in der Quellplatte gelegt. In der Source-Platte in der Figur dargestellt, sind Antigene in Gruppen von 9 angeordnet sind, die 3 x 3 Anordnung der Druckkopfstifte passen. Die Quellenplatte wird dann in der Roboter Microarrayers gelegt und die Antigene werden dann auf die Objektträger getüpfelt. In diesem Beispiel 2-pad FAST Slides are verwendet, für identische Arrays ermöglicht auf die 2 Nitro Oberflächen entdeckt werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Die Verarbeitung von Antigen - Mikroarrays. Die Objektträger werden in FAST Rahmen platziert Inkubationskammern mit und verarbeitet werden durch Proben Hinzufügen und dann Sekundärantikörper. Antigen Reaktivitäten sind mit einem Scanner ergeben, was Fluoreszenzsignale zu detektieren. Das gescannte Bild eines 2-Pad FAST Dia angezeigt wird . Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3 <br /> Abbildung 3. Zwei-Farben - Antigen - Mikroarrays optimiert für die Verwendung mit Humanseren. (A) IgG, IgM, IgG und Fc sind auf dem nur mit Sekundärantikörper sondiert Array detektiert. Diese drei Antigene sind positive Kontrollen die Spezifität der Sekundärantikörper zu zeigen. Rote Fluoreszenz (IgM Kanal) zeigt die Bindung des anti-human IgM sekundärem Antikörper. Grüne Fluoreszenz (IgG Kanal) zeigt die Bindung des anti-human-IgG-sekundärem Antikörper. Die IgG - Fc - Antigen ist auf oversaturation weiß. (B) Viele weitere Reaktivitäten sind auf dem Array nachgewiesen sondiert mit positivem Kontrollserum von einem Patienten mit systemischem Lupus erythematosus mit bekannter Reaktivität auf Ribo P - Antigen. Die Kästen zeigen die Stellen , an denen DNA und Ribo P Antigene angeordnet sind. (C) Quantifizierung der Fluoreszenzintensitäten in der positiven Kontrollserums zeigt , dass die Mehrheit der Antikörper - Reaktivitäten gegen DNA - Antigene der Ig sindM - Isotyp. (D) Quantifizierung der Fluoreszenzintensitäten in der positiven Kontrollserums zeigt , dass die Mehrheit der Antikörper - Reaktivitäten gegen Ribo P Antigene des IgG - Isotyp sind. Array-Funktionen sind in zweifacher Ausfertigung und sind etwa 500 & mgr; m im Durchmesser entdeckt. Diagramme zeigen Mittelwert ± SD für die Array-Funktionen. dsDNA, doppelsträngige DNA; ssDNA, einzelsträngige DNA; MFI-B, mittlere Fluoreszenzintensität minus Hintergrund; Ribo P, ribosomale P. Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Fluoreszenzintensität gegen Serum Verdünnungsfaktor. (A) MFI-B über einen weiten Bereich von Serumverdünnungen für IgM gegen ssDNA und IgG gegen Ribo P. Für diese gezeigtVersuche, positive Kontrollserum mit bekannten IgG-Reaktivität gegen Ribo P und ssDNA verwendet wurde. MFI-B wird auf einen Wert von etwa 65.000 gesättigt. (B) Log2 Transformation des MFI-B Daten zeigt lineare Antworten auf beiden IgG und IgM - Kanäle über einen weiten Bereich von Antigen Reaktivitäten. Über einen MFI-B von 30.000 beginnt die IgG-Signal zu sättigen und verliert Linearität. Array-Funktionen wurden in 6 Wiederholungen gesichtet. Diagramme zeigen Mittelwert ± SD für die Array-Funktionen. ssDNA, einzelsträngige DNA; MFI-B, mittlere Fluoreszenzintensität minus Hintergrund; Ribo P, ribosomale P. Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Der Nachweis von Rheumafaktor mit Zwei-Farben - Antigen - Mikroarrays. (B) Array mit Serum mit cryoglobulinemic Vaskulitis mit einem hohen Rheumafaktor von einem Patienten sondiert. Die IgG-Funktion ist grün-gelb aufgrund von IgM in Serum des Patienten zu bindenden IgG immobilisiert. Interessanterweise hat dieser Patient auch IgG-Antikörper gegen IgM als die IgM-Funktion Orange erscheint. Der Patient hat auch eine Geschichte von angeborenen Herzkrankheit und wird darauf hingewiesen , auf dem Array nur mit sekundären Antikörpern zeigt sondiert zeichnet sich durch hohe Reaktivität mit dem Herz Protein Troponin C (C) Quantifizierung der IgG und IgM zu haben , dass die sekundären Antikörper haben keine jede Kreuzreaktivität. (D) Quantifizierungder IgG und IgM-Merkmale auf dem Array mit dem Patientenserum sondiert bestätigt die Anwesenheit von Rheumafaktoren. Die Funktionen sind in zweifacher Ausfertigung und sind etwa 500 & mgr; m im Durchmesser entdeckt. Diagramme zeigen Mittelwert ± SD für die Array-Funktionen. MFI-B, mittlere Fluoreszenzintensität minus Hintergrund. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6. Entwicklung von Zwei-Farben - Arrays zum Profil Mausserum Antikörper. (A) Array sondiert nur mit sekundären Antikörpern. Rote Fluoreszenz zeigt, der Anti-Maus-IgM sekundären Antikörperbindung. Grüne Fluoreszenz zeigt, der Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörperbindung. Die Maus-IgG, das auf das Array getupft wird nur durch die anti-mou detektiertse IgG Sekundärantikörper und der Maus-IgM, die nur durch die anti-Maus-IgM sekundären Antikörper detektiert wird getupft wird. Die anderen Merkmale auf den Arrays, die von den sekundären Antikörper sind Fänger - Antikörper gegen Maus - IgG oder Maus - IgM. (B) Array sondiert mit einem Maus - IgG monoklonalen Antikörper gegen Histidin - Tags erkannt werden. Auf diesem Array (rekombinantes His-Tag-Protein) das Ribo P-Antigen ist grün, was anzeigt, daß es nur durch die anti-Maus-IgG-sekundärem Antikörper nachgewiesen wird. Dies ist gegeben erwartet, daß der monoklonale Antikörper des IgG Isotyps. Das Antigen Ribo P nicht erfasst wird, wenn die Anordnungen mit sekundären Antikörpern alleine sondiert werden (orange - Box). (C) Quantifizierung von IgG, IgM und Ribo P Merkmale auf dem Array mit einer Maus IgG monoklonaler Antikörper gegen Histidin - Tags sondiert. Array-Funktionen sind in sechs Wiederholungen und sind etwa 500 & mgr; m im Durchmesser entdeckt. Diagramme zeigen Mittelwert ± SD für die Array-Funktionen. MFI-B, Median fluorescence Intensität minus Hintergrund; Ribo P, ribosomale P. Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

7
Abbildung 7. Ausrichtung der Vorlage Gitter auf ein Array Bild. In diesem Screenshot, ein Template - Raster, das aus einer gal - Datei erzeugt wurde, wurde mit einem zuvor gescannten Antigen - Mikroarray ausgerichtet sind . Das Array wurde mit Serum von einem Patienten mit systemischem Lupus erythematosus und einer Blutgerinnungsstörung sondiert, die viele Autoantikörper Reaktivitäten hatte. Grüne Fluoreszenz repräsentiert Bindung von IgG-Antikörpern und rote Fluoreszenz darstellt Bindung von IgM-Antikörpern. Die Merkmale gedruckt durch feste Stifte sind nahezu kreisförmig und sind leicht durch die Microarray-Software (Genepix) skizziert. Sobald die Gitterausrichtung abgeschlossen ist, die software die mittlere Fluoreszenzintensität minus Hintergrund berechnen (sowohl auf der Cy3 und Cy5 - Kanäle) für jeden der Array - Funktionen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Quantifizierung der Autoantikörper, die das Antigen Microarray-Technik verwendet wird. Antigen-Mikroarrays bieten mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen ELISA in für Autoantikörper-Screening. Zunächst einmal eine Vielzahl von Antigenen, einschließlich Nukleinsäuren, Proteine, Peptide und Zelllysate können auf die Nitrocellulose beschichtete Objektträger angeordnet werden, so dass für gemultiplexte Screening von Autoantikörpern ermöglicht. Darüber hinaus sind nur Mikrogramm Antigen notwendig, die Arrays da Nanoliter Antigen zu erzeugen, werden auf jeden Objektträger getüpfelt. Die Arrays erfordern auch sehr wenig Patientenprobe, da nur 5 ul Serum bei einem 1 benötigt wird, eine Array-Oberfläche zu sondieren: Verdünnung 100 Probe. Schließlich entdeckte Arrays auf Nitrocellulose gezeigt wurden für Autoantikörper 9 beim Screening zu sein empfindlicher als herkömmliche ELISA.

Zusätzlich zu Antigen unter Verwendung von Microarrays für Autoantikörper zu screenen, können die Arrays Einsatz seind Reaktivität gegenüber Nicht-Selbst - Proteine ​​zu erkennen (zB virale Proteine), was die Spezifität von monoklonalen Antikörpern zu definieren, und die Höhe der nicht-HLA - Antikörpern in Transplantation zu messen , wie vorher 9-12 beschrieben. Antigen-Mikroarrays können auch verwendet werden, um detaillierte Experimente Epitopkartierung auszuführen, wo überlappende Peptide eines einzelnen Proteins werden auf einem Objektträger angeordnet. Eine kürzlich veröffentlichte Studie verwendet diesen Ansatz Epitope des U1-70K Protein zu definieren , die 13 bei systemischem Lupus erythematodes Ziele von Auto - Antikörpern sind.

Unter Verwendung des Protokolls hier beschrieben, ist der Nachweis von IgG- und IgM-Reaktivitäten linear über einen weiten Bereich von Serumverdünnungen. Diese Studien wurden unter Verwendung einer positiven Kontrollserum von einem Patienten mit systemischem Lupus erythematosus mit bekannter Reaktivität auf ribosomalen P-Antigen und ssDNA durchgeführt. IgM-Reaktivität auf ssDNA ist linear bei Serumverdünnungen von 1: 125 bis 1: 32.000, entsprechend MFI-B von 17.000 bis 50. IgG ReaktivitätRibo P ist linear bei Serumverdünnungen von 1: 4000 bis 1: 512.000, entsprechend MFI-B von 32.000 bis 200. Bei Verdünnungen von weniger als 1: 4000 (und MFI-B größer als 32.000), der Nachweiskurve von IgG-Reaktivität abflacht und ist nicht mehr linear. In der Arbeit mit Empfängern Herztransplantation wird Serum routinemäßig auf 1: 100 verdünnt als MFI-B selten für Antigene 10.000 bei dieser Verdünnung übersteigt. Für Studien mit Patienten mit einer Autoimmunerkrankung mit hohem Titer Autoantikörper können Patientenproben müssen weiter verdünnt werden, um sicherzustellen, dass die Mehrheit der Autoantikörper-Reaktivitäten im linearen Bereich des Assays fallen.

Während MFI-B-Autoantikörpers nützlich sein kann Reaktivitäten zwischen Patientengruppen zu vergleichen, kann es auch nützlich sein, diesen Wert in ein quantitatives Maß für Autoantikörper-Niveaus zu konvertieren. Dies kann durch Tüpfeln mehrere bekannte Verdünnungen von gereinigten IgG und IgM auf die Objektträger durchgeführt werden, um eine Standardkurve zu erzeugen. Mit Hilfe dieser Kurve, MFI-B kann dann trans seinfür jedes Antigen in einen Autoantikörper-Ebene gebildet.

In dem Protokoll hier vorgestellten 2-Pad nitrozellulosebeschichtete Folien verwendet wurden. Auf diesen Schlitten werden zwei identische Arrays, die mit zwei separaten Serumproben untersucht werden können, werden auf jeden Objektträger gedruckt. Dies ermöglicht es, zwei Proben von demselben Patienten (beispielsweise vor und nach der Behandlung) auf demselben Objektträger verglichen werden, die interslide Variabilität minimiert. Zweiunddreißig-Objektträger mit 64 individuellen Patientenproben werden zur gleichen Zeit an einem Tag routinemßig verarbeitet. Die aktuelle Array wird mit 9 Pins gedruckt, für 162 Antigene ermöglicht in zweifacher Ausfertigung gedruckt werden (jeder Stift druckt eine 36 Feature Subarray, die in zweifacher Ausfertigung gedruckt 18 Antigene entspricht).

Die Antigen-Mikroarrays in diesem Protokoll erzeugt wurden, mit festen Microarrayers Stifte gedruckt. Drucken mit festen Stiften ist zeitaufwändiger als das Drucken mit Stiften Pinole Stil, da die Microarrayers muss neu tauchen in der Source-Platte nach jedem time, dass die Stifte die Gleitfläche berühren. Feste Stifte wurden verwendet, da sie in hohem Maße reproduzierbar, fast kreisförmige Anordnung Merkmale (etwa 500 & mgr; m im Durchmesser) zu erzeugen. Diese Funktionen können leicht durch die Scanner-Software erkannt und skizziert werden und minimale manuelle Anpassungen nötig sind, um die Array-Funktionen zu quantifizieren. Vollbolzen ermöglichen auch Zelllysate gedruckt werden, was schwierig sein kann, mit der Pinole Stifte aufgrund ihrer höheren Viskosität zu drucken. Aufgrund der mit festen Stiften beteiligt langen Druckzeiten (manchmal 10 - 11 h 70 Folien zu drucken), Antigene, die nicht in der Source-Platte mit Folie Verdunstung zu verhindern abgedeckt sind gedruckt werden.

Das hier beschriebene Protokoll stellt eine Methode IgG und IgM-Reaktivitäten auf derselben Folie Oberfläche zu trennen. Die Arrays wurden für die menschlichen und Maus-Antikörper unter Verwendung von Paaren von sekundären Antikörpern markiert mit unterschiedlichen Fluorophore Bildschirm optimiert. Entscheidend für diese Zwei-Farben-Ansatz seco IdentifizierungNdary Antikörper, die hochspezifisch für entweder IgG oder IgM Isotypen sind. Die sekundären Antikörper, die verwendet werden, erkennen den Fc-Teil von IgG oder IgM und keine Kreuzreaktion untereinander. die IgG- und IgM-Signale trennt, ist wichtig, die verschiedenen Funktionen dieser Antikörper in Immunreaktionen gegeben. Zum Beispiel wird IgM in höheren Mengen von B1-Zellen hergestellt und ist typischerweise ein Marker für eine frühe Immunantwort. Auf der anderen Seite, ist IgG eine Markierung einer späteren Immunantwort, die als Ergebnis der Klasse 14 Schalt entwickelt. Durch Erfassen getrennt die IgG- und IgM - Signale ist es auch möglich , IgM Rheumafaktoren in Patientenseren (dh IgM - Immunglobuline, die IgG binden , die auf das Array gesichtet worden ist) zu identifizieren. Durch Tüpfeln verschiedener Abschnitte von Antikörpern (beispielsweise im Vergleich zu Fc Fab), kann die Bindung von Rheumafaktor an unterschiedlichen IgG - Antikörper Epitope quantifiziert werden. Mit der Verfügbarkeit von Scannern mit mehr als zwei Laser, zusätzlicher zweiterary-Antikörper auf den aktuellen sekundären Antikörperpaar hinzugefügt werden könnten Bindung von IgA, IgD oder IgE-Antikörper zu identifizieren. Sekundäre Antikörper auch werden konnten identifiziert werden, die für die Identifizierung von separaten IgG-Subklassen (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), gebunden an Antigene auf einem einzigen Array ermöglichen würde.

Zusammenfassend ist das Antigen Microarray-Technik eine robuste Technologie für die Hochdurchsatz-Charakterisierung von Serum-Autoantikörpern ermöglicht. Diese Technik ist hochgradig anpassbar und empfindlich. Die fluoreszenzbasierten Detektionssystem für Human- und Maus-Studien optimiert und ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis von IgG- und IgM-Antikörper.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ribosomal P0 Diarect 14100 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgG Jackson Immuno 009-000-003 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgM Jackson Immuno 009-000-012 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgG Sigma-Aldrich I5381 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgM Biolegend 401601 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
double-stranded DNA Sigma-Aldrich D1626 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
single-stranded DNA Sigma-Aldrich D8899 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
microarrayer Virtek VersArray Chipwriter Pro many types of arrayers are suitable
solid printing pins Arrayit Corporation SSP015
software for robotic microarrayer Virtek Chipwriter Pro 
FAST slides (2 Pad) GVS Northa America 10485317
FAST frame GVS Northa America 10486001
FAST incubation chambers (2 Pad) GVS Northa America 10486242
384 well plates Whatman 7701-5101
plate sealers VWR 60941-062
foil plate covers VWR 60941-124
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
Fetal calf serum Invitrogen 12483020
Cy3 goat anti-human IgG Jackson Immuno 109-165-096 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-human IgM Jackson Immuno 109-175-129 use working stock in 50% glyercol
Cy3 goat anti-mouse IgG Jackson Immuno 115-165-071 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-mouse IgM Jackson Immuno 115-175-075 use working stock in 50% glyercol
Microarray Scanner Molecular Devices Axon 4200A
Microarray software Molecular Devices Genepix 6.1
Clustering software eisenlab.org Cluster 3.0
Heatmap software eisenlab.org Treeview 1.60
Microarray statistical software Stanford University SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)

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References

  1. Naparstek, Y., Plotz, P. H. The role of autoantibodies in autoimmune disease. Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).
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Generation of Two-color Antigen-Mikroarrays für den gleichzeitigen Nachweis von IgG und IgM-Autoantikörper
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Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).More

Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).

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