Protocol
1.を希釈抗原との生成抗原マイクロアレイ
- 0.2mg / mlの最終濃度までPBS中に抗原を希釈します。 9ピンのマイクロアレイの構成で二重に162までのユニークな抗原を印刷します。陽性対照として、抗原ライブラリ内のIgGおよびIgMの抗原が含まれます。唯一のネガティブコントロールとしてPBSを含めます。
- 384ウェルソースプレートに各抗原の20μlのを追加します。 （9ピンは印刷に使用されている場合など 、9のグループにおける抗原を手配）プリントヘッドのセットアップをミラーグループ内のソースプレートに抗原を追加します。
- アレイを印刷する直前まで-80℃で箔と凍結で覆いソースプレート。
- 3×1分間脱イオン水で超音波処理浴中でそれらをインキュベートすることにより、固体マイクロアレイヤーピンを清掃してください。乾燥した後、マイクロアレイプリントヘッドのピンを配置するラックにピンを配置します。 9ピンの場合、3×3の構成を使用します。
- プリントヘッドの数のピンを設定することにより、印刷実行のためのプログラムのマイクロアレイヤー、印刷、各スライド上のパッドの数、および各抗原のための複製スポットの数にスライド数。一般的に、9ピン、70スライド、2パッド/スライド、および各抗原について2複製スポットを使用します。プログラムのマイクロアレイは、抗原の異なるグループ間で水の中にピンを超音波処理します。
- 解凍ソースプレートと100×gで1分間、その後遠心プレート。マイクロアレイ内の指定の場所にソースプレートを置きます。印刷する抗原の最初のグループを覆っている箔の部分を削除してください。
- アレイヤー表面に印刷されていないスライドを手配し、印刷プログラムを実行します。アレイ機の加湿器でビルドで60％ - 湿度と室温での印刷スライドは55でアレイヤーに設定してください。
- 抗原の各グループは、すべてのスライドに印刷された後、マイクロアレイヤーを一時停止します。ちょうど箔で印刷された抗原をカバーする（蒸発を防ぐため）、抗原の次のグループを印刷する明らかにする。印刷プログラムを続行します。
- 全ての抗原が印刷された後、カバーソースPL-80℃で箔、凍結の新しい作品で食べました。スライドボックスと真空シールに印刷されたスライドを配置します。スライドは、翌日使用されるか、または最大1ヶ月後にすることができます。
2.希釈した血清を用いて抗原マイクロアレイをプロービング
- インキュベーションチャンバーを使用してフレームにスライドを配置します。各アレイ表面にブロッキング緩衝液700μlの（2.5％[容量/容量]ウシ胎児血清（FCS）を、0.1％[容量/容量]をPBS中のTween 20）を追加します。
- ウェットティッシュの切れ端で密封容器にフレームと場所の上に接着フィルムを置きます。ロッカーに4℃でO / Nインキュベートします。
- 血清サンプル1を希釈：100をブロッキング緩衝液中。吸引物は、配列からブロッキング溶液を、各アレイ表面に希釈した試料500μlのを追加します。
- 接着フィルムで覆い、揺動しながら4℃で1時間インキュベートします。
- ブロッキング緩衝液中で二次抗体を希釈します。人間の研究のために、0.33 / mlのおよびCy5へのCy3標識したヤギ抗ヒトIgG抗体を希釈ヤギ抗フーマー標識0.25 / mlのにIgM抗体のn。マウス研究のために、Cy3の0.38 / mlのおよびCy5にヤギ抗マウスIgG抗体を標識希釈0.7μgの/ mlのヤギ抗マウスIgM抗体標識。
- アレイからの吸引サンプルとアレイ表面をリンス緩衝液（PBS中0.1％のTween 20）で4回洗浄します。スライドに上にバッファ注ぎ、すぐにオフにフリック。
- 各アレイ表面を洗浄し、揺り動かしながら室温で10分間インキュベートするブロッキング緩衝液700μlのを追加します。繰り返し洗浄ステップをさらに2回。
- 各スライドの表面に希釈した二次抗体の500μlを添加して、接着フィルムでカバーしています。揺らしながら4℃で45分間インキュベートします。
- スライドから吸引した二次抗体の混合物と上記のように4回すすいでください。洗浄液は、上記のように/希釈ブロッキング緩衝液700μLで3回スライド。
- PBSに浸漬された金属スライドラック内のフレームと場所からスライドを削除します。軌道振とうしながら室温で20分間インキュベートします。 PBSの新たな容器に入れて、別の20メートルをインキュベート振盪しながらインチ
- 脱イオン水15秒の容器にスライドラックを置きます。水の新たな容器にラックを配置し、別の15秒インキュベートします。
- 室温で5分間、220×gで遠心分離し、スピンでELISAプレートアダプタのスライド、場所のスライドラックを乾燥させます。
- スキャンの準備ができるまで、光を通さない箱にスライドを置きます。
3.スキャン抗原マイクロアレイおよびデータのエクスポート
- Cy3およびCy5の蛍光シグナルを検出することができる、マイクロアレイスキャナーを用いてスキャンスライド。スキャナの光電子増倍管（PMT）のレベルを調整するために、唯一の二次抗体でプローブしたスライドをプレスキャン。
注：このスライドはフルプラス（IgGおよびIgM）を含む、その上に印刷された抗原ライブラリと同様に負（PBS）のコントロールを持っている必要があります。プリスキャンは、最適なPMTの設定を見つけるために、迅速にユーザを可能にする低解像度スキャンです。 - PMT値を設定しているので（Cy3のチャネル上の）ヒトIgGの機能とハム（Cy5のチャネル上の）IgM抗体の機能は、同様の蛍光強度中央値マイナス背景（MFI-B）（通常、40,000）を有しています。 PMTレベルは、「ハードウェア」ボタンを押すことによって設定されます。いったん設定すると、一定のこれらのPMTの設定を保持します。
- 「スキャン」ボタンを押して、2チャンネルに関する実験スライドをスキャンします。各スキャンの後にスライド画像（両チャンネル）を保存します。
- 「ファイル」ボタンを使用してマイクロアレイソフトウェアに分析しようとするスライドをロードします。
- 「ファイル」ボタンを使用することにより、遺伝子の配列リスト（GAL）ファイルをロードします。 GALファイルは、アレイの機能のアイデンティティを持つアレイのレイアウトを持っています。
- アレイの機能はできるだけテンプレートと一致するように、スキャンした画像の上に配列テンプレートを配置します。
- 「整列」ボタンを押して、テンプレートを使用してすべてのブロックの機能を合わせます。プログラムは、ほぼ円形の機能の概要を見つけるだろうが、いくつかの手動調整が必要になることがあり。これらの調整は、機能モードに入ることによって作製することができます。ソフトウェアは、抗原のそれぞれについて、MFI-Bを計算します。
- テキストファイルとしてこれらの結果をエクスポートするには、「ファイル」ボタンを使用します。
4.マイクロアレイの有意性分析（SAM）との配列データの分析
- Excelに個々のテキストファイルをロードし、Cy3およびCy5のチャネルのためのMFI-Bを持つ列を識別します。
- 重複した機能の平均値を計算します。
- 任意の負のMFI-Bの場合は、10と負の数を置き換えるログベース2を計算することにより、次に100とにより生MFI-Bを分割したデータを変換します。
- ログを分析し、以前に7説明したようにマイクロアレイの有意性分析（SAM）を使用してデータを形質転換しました。
- 2基（ 例えば 、健常対照対患者）を用いた研究については、ラベル1のグループ"1"とグループ"2"秒である抗原の反応性を識別するために、SAMにおける2クラス、不対分析を使用してください両群間でignificantly異なる（q値<0.05）。
- プレゼンテーション8用の画像を作るために、クラスタリングやヒートマップ作成ソフトウェアを使用してください。
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Representative Results
抗原は、384ウェルプレートに配置され、 図1に示すように、ロボットマイクロアレイヤーによりスライド上に印刷されている。 図2をインキュベーション室と処理した後にスキャンしたスライドとフレームに配置されたスライドを示している。 図3は、正および負の対照スライドを示しています。負のスライドのみ、二次抗体でプローブされ、陽性対照スライドは、全身性エリテマトーデスを有する患者からの血清でプローブされます。 2別々に標識された二次抗体を用いて、IgGおよびIgMの反応性は、同じスライドの表面に分離することができる。4図は、一本鎖DNA（ssDNA）およびIgG広い上リボソームP（リボP）に対する抗体に対するIgM抗体の蛍光強度を示します血清希釈の範囲。リボPに対する既知の反応性を有する全身性エリテマトーデスを有する患者から、この実験の陽性対照血清を用いました。リン耳応答は、すべての血清希釈上のIgMチャネルで観察されます。線形応答は約30,000 MFI-Bに対するIgGチャネル上に観察されます。このポイントの後、応答が飽和し始めるとリボPに対する抗体の上昇は、MFI-Bの対応する増加をもたらさない。配列は、ヒト血清中のリウマチ因子を検出するために使用することができる方法を図5に示す図 。本研究では、文書化されたリウマチ因子とcryoglobulinemic血管炎の患者からの血清（正常<11 IU / ml）を167 IU / mlでの（IgGに対するIgM抗体）を用いました。一人で二次抗体を使用して、全くIgMの反応性は、アレイ上にスポットされたIgGに対して見られません。スライドは、リウマチ因子を有する患者からの血清でプローブされた場合は対照的に、有意なIgMの反応性（約5,000のMFI-B）は、IgGに対する検出された。 図6は、マウス血清と共に使用するための二色抗原マイクロアレイの開発を示します 。この図において、マウスIgM番目アレイ上にスポットされている時にのみ配列のみ抗マウスIgG二次抗体によって検出された上にスポットされた抗マウスIgM二次抗体、およびマウスIgGによって検出される。スキャンのテンプレートグリッドの図7のアライメントを図マイクロアレイ解析ソフトウェアを用いて配列画像。配列特徴がグリッドに整列された後、アレイの特徴は、各機能のメジアン蛍光強度マイナスバックグラウンドを得るために分析することができます。
抗原マイクロアレイ。抗原の図1の生成は、最初のソースプレートに配置されます。図に示したソースプレートに、抗原は、プリントヘッドのピンの3×3のレイアウトに一致する、9のグループに配置されています。ソースプレートは、その後、ロボットマイクロアレイに配置され、抗原は、その後スライド上にスポットされます。この例では、2パッドFASTスライドは、AR同一の配列を可能に使用される電子は、2ニトロセルロース表面上にスポットする。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
抗原マイクロアレイ。スライドの 図2 の処理は、インキュベーションチャンバーを使用してFASTフレームに配置され、その後、二次抗体をサンプルに添加することによって処理されます。抗原反応性は、蛍光シグナルを検出することができるスキャナで明らかにされます。 2パッドFASTスライドのスキャンされた画像が示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
<BR /> 図3. ヒト血清で使用するための二色抗原マイクロアレイ最適化されました。 （A）のIgG、IgM抗体、およびIgG Fcをのみ、二次抗体でプローブアレイ上で検出されています。これら3つの抗原は、二次抗体の特異性を示す陽性対照です。赤色蛍光（IgMのチャネル）は、抗ヒトIgM二次抗体の結合を示します。緑色蛍光（IgGのチャネル）は、抗ヒトIgG二次抗体の結合を示します。 IgG Fc抗原は、過飽和に起因する白である。（B）さらに多くの反応性は、リボP抗原に対する既知の反応性を有する全身性エリテマトーデスを有する患者からの陽性対照血清でプローブしたアレイ上で検出されています。ボックスは、DNAとリボP抗原が配列された位置を示す。（C）陽性コントロール血清中の蛍光強度の定量化は、DNA抗原に対する抗体反応性の大部分はIgのあることが明らかになりましたMアイソタイプ（D）陽性対照血清における蛍光強度の定量化は、リボP抗原に対する抗体反応性の大部分がIgGアイソタイプであることがわかります。アレイの特徴は、二重にスポットし、約500μmの直径がされています。グラフは、アレイの機能についての平均±SDを示します。二本鎖DNA、二本鎖DNA;一本鎖DNA、一本鎖DNA; MFI-B、蛍光強度中央値マイナス背景。リボP、リボソームP.は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
血清希釈ファクター対 図4. 蛍光強度。血清希釈の広い範囲にわたって（A）MFI-Bは、これらについてはリボP.に対する一本鎖DNAおよびIgGに対するIgMのために示されています実験は、リボPとのssDNAに対する既知のIgG反応性を有する陽性対照血清を使用しました。 MFI-Bを、約65,000の値で飽和する。MFI-Bデータの（B）LOG2変換は、抗原反応性の広い範囲にわたって、両方のIgGおよびIgMチャンネルの線形応答を明らかにする。 30,000 MFI-Bの上に、IgGの信号が飽和し始めると直線性を失い。配列の特徴は6連でスポットしました。グラフは、アレイの機能についての平均±SDを示します。一本鎖DNA、一本鎖DNA; MFI-B、蛍光強度中央値マイナス背景。リボP、リボソームP.は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
二色抗原マイクロアレイとリウマチ因子の 図5. 検出。
マウス血清抗体をプロファイルに二色の配列の 図6. 開発。（A）配列は、二次抗体でのみプローブしました。赤色蛍光抗マウスIgM二次抗体の結合を示します。緑色蛍光抗マウスIgG二次抗体の結合を示します。アレイ上にスポットされたマウスIgGのみ抗畝によって検出されますSE IgG二次抗体のみ抗マウスIgM二次抗体によって検出されたスポットするマウスIgM。二次抗体によって検出されたアレイ上の他の機能は、マウスIgGまたはマウスIgMに対する捕捉抗体。ヒスチジンタグに対するマウスIgGモノクローナル抗体でプローブ（B）の配列です。この配列では、リボP抗原（組換えHisタグ化タンパク質）は、それが唯一の抗マウスIgG二次抗体によって検出されたことを示す、緑です。これは、モノクローナル抗体がIgGアイソタイプのものであることを考えると予想されます。アレイは単独の二次抗体（オレンジボックス）でプローブするときリボP抗原は検出されません。ヒスチジンタグに対するマウスIgGモノクローナル抗体でプローブアレイ上のIgG、IgM抗体、およびリボPの特徴の（C）定量。アレイの特徴は6連でスポットし、約500μmの直径がされています。グラフは、アレイの機能についての平均±SDを示します。 MFI-B、メジアンフルオル強度マイナス背景をescence。リボP、リボソームP.は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
アレイ画像上にテンプレートのグリッドの 図7. アライメントは。このスクリーンショットでは、ギャルのファイルから生成されたテンプレートグリッドは、以前にスキャン抗原マイクロアレイを用いて整列させました。アレイは、全身性エリテマトーデス、多くの自己抗体反応性を持っていた血液凝固障害を有する患者からの血清でプローブしました。緑色蛍光は、IgG抗体の結合を表し、赤色蛍光は、IgM抗体の結合を表します。固体ピンによってプリントされたフィーチャは、ほぼ円形であり、容易にマイクロアレイソフトウェア（GENEPIX）によって概説されています。格子整合が完了すると、softwareは、配列の各機能のための蛍光強度中央値マイナス（両方のCy3およびCy5チャネル上の）背景を計算することができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明するプロトコルは、抗原マイクロアレイ技術を使用して自己抗体の定量を可能にします。抗原マイクロアレイは自己抗体をスクリーニングすることで、従来のELISA法に比べていくつかの利点を提供します。まず、核酸、タンパク質、ペプチド、および細胞溶解物を含む種々の抗原は、従って、自己抗体の多重スクリーニングを可能にする、ニトロセルロースでコーティングしたスライド上に配列することができます。抗原のナノリットルを各スライド上にスポットされているので、また、抗原の唯一のマイクログラムは、配列を生成するために必要です。 100サンプル希釈：血清のわずか5μlのが1でアレイ表面を探査するために必要とされる配列はまた、非常に少ない患者のサンプルを必要とします。最後に、ニトロセルロース上にスポットアレイは、自己抗体9をスクリーニングすることで、従来のELISAよりも感度であることが示されています。
自己抗体をスクリーニングするための抗原マイクロアレイの使用に加えて、アレイは、使用することができdは、モノクローナル抗体の特異性を規定するために、以前に9-12説明したように、移植における非HLA抗体のレベルを測定するために、非自己タンパク質（ 例えば 、ウイルスタンパク質）に対する反応性を検出します。抗原マイクロアレイはまた、単一のタンパク質の重複ペプチドは、スライド上に配列されている詳細なエピトープマッピング実験を行うために使用することができます。最近の研究では、全身性エリテマトーデス13中の自己抗体の標的であるU1-70Kタンパク質のエピトープを定義するために、このアプローチを使用していました。
ここに記載されるプロトコルを使用して、IgGおよびIgM反応性の検出は、血清希釈の広い範囲にわたって線形です。これらの研究は、リボソームP抗原とのssDNAに既知の反応性全身性エリテマトーデスを有する患者からの陽性対照血清を用いて行きました。に17000 50に対するIgG反応性のMFI-Bに対応し、32,000：1から125：一本鎖DNAに対するIgM反応性は、1の血清希釈で直線的です4000（およびMFI-B 32000より大きい）、IgGの反応性の平坦化の検出曲線：1よりも低い希釈率では200に32,000のMFI-Bに対応し、512,000：1から4000：リボPは、1の血清希釈で直線的ですもはや線形ではありません。抗原に対するMFI-Bはめったにこの希釈で万を超えないように100：心臓移植レシピエントとの仕事では、血清を日常1に希釈します。高力価の自己抗体と自己免疫疾患の患者との研究のために、患者サンプルは、自己抗体の反応性の大部分は、アッセイの直線範囲内に収まることを確実にするためにさらに希釈する必要があるかもしれません。
MFI-B患者のグループ間の自己抗体反応性を比較するのに有用であり得るが、また、自己抗体レベルのより定量的測定に、この値を変換するのに有用であり得ます。これは、標準曲線を生成するためにスライド上に精製IgGおよびIgMの複数の既知の希釈物をスポットすることによって達成することができます。この曲線を使用して、MFI-Bは、次いで、トランスすることができ各抗原に対する自己抗体のレベルに形成されました。
ここに提示プロトコルでは、2パッドのニトロセルロースでコーティングされたスライドを使用しました。これらのスライド上に、二つの別々の血清試料でプローブすることができる2つの同一のアレイは、各スライド上にプリントされています。これは、（このような前と後の処置として）同じ患者からの2つの標本がinterslideの変動を最小限に同じスライド上で比較することができます。 64個々の患者のサンプルと32個のスライドを日常的に一日の同じ時間に処理されます。最新の配列は162抗原二重に印刷される（各ピンが二重に印刷された18の抗原に等しい36の特徴部分配列を出力します）を可能にする、9ピンで印刷されています。
このプロトコルで生成された抗原マイクロアレイは、固体マイクロアレイピンで印刷しました。マイクロアレイは、それぞれのトン後にソースプレートにディップを再なければならないので、固体ピンで印刷することがクイルスタイルピンで印刷するよりも時間がかかり、ピンがスライド面を触れることIME。彼らは、再現性の高い、ほぼ円形アレイ機能（直径約500μm）を生成するように固定ピンを使用しました。これらの特徴は、容易に検出され、スキャナソフトウェアによって概説され、最小限の手動調整は、アレイの特徴を定量化するために必要とされることができます。細胞溶解物を印刷するために、固体のピンもまた、それらのより高い粘度にクイルピンで印刷することが困難であり得る、可能にします。固体ピンに伴う長い記録時間に（時には10 - 70のスライドを印刷する11時間）、ソースプレートに印刷されていない抗原は、蒸発を防ぐために、ホイルで覆われています。
ここで説明するプロトコルは、同じスライドの表面にIgGおよびIgM反応性を分離する方法を提供します。アレイは、異なるフルオロフォアで標識された二次抗体の対を用いてヒトおよびマウス抗体をスクリーニングするために最適化されています。この2色のアプローチのクリティカルセコを識別していますIgGまたはIgMのいずれかのアイソタイプのための高度に特異的であるndary抗体。使用される二次抗体は、IgGまたはIgMのFc部分を認識し、相互に交差反応しません。 IgGおよびIgMの信号を分離することは、免疫応答におけるこれらの抗体の異なる機能与えられた重要です。例えば、IgM抗体は、B1細胞によって高レベルで産生され、典型的には、初期の免疫応答のマーカーです。一方、IgGは14級スイッチングの結果として発症後の免疫応答のマーカーです。別々 IgGおよびIgMの信号を検出することにより、患者サンプル中のIgMリウマチ因子を同定することも可能である（ すなわち 、アレイ上にスポットされたIgGに結合するIgMの免疫グロブリン）。異なるIgG抗体エピトープにリウマチ因子の結合、抗体（ 例えば 、Fab対のFc）の異なる部分をスポットすることによって定量することができます。以上の2つのレーザとスキャナの利用可能性と、さらに第二次aryの抗体は、IgA、IgDのまたはIgE抗体の結合を識別するために、現在の二次抗体のペアに追加することができます。二次抗体は、単一アレイ上の抗原に結合した別個のIgGサブクラス（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4の）の同定を可能にするものを同定することができました。
結論として、抗原マイクロアレイ技術は、血清自己抗体の高スループット特性評価を可能にする堅牢な技術です。この技術は、高度にカスタマイズ可能と小文字が区別されます。蛍光ベースの検出システムは、ヒトおよびマウスの両方の研究のために最適化され、IgGおよびIgM抗体の同時検出を可能にされています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ribosomal P0 | Diarect | 14100 | dilute to 0.2 mg/ml in PBS |
| human IgG | Jackson Immuno | 009-000-003 | dilute to 0.2 mg/ml in PBS |
| human IgM | Jackson Immuno | 009-000-012 | dilute to 0.2 mg/ml in PBS |
| mouse IgG | Sigma-Aldrich | I5381 | dilute to 0.2 mg/ml in PBS |
| mouse IgM | Biolegend | 401601 | dilute to 0.2 mg/ml in PBS |
| double-stranded DNA | Sigma-Aldrich | D1626 | dilute to 0.2 mg/ml in PBS |
| single-stranded DNA | Sigma-Aldrich | D8899 | dilute to 0.2 mg/ml in PBS |
| microarrayer | Virtek | VersArray Chipwriter Pro | many types of arrayers are suitable |
| solid printing pins | Arrayit Corporation | SSP015 | |
| software for robotic microarrayer | Virtek | Chipwriter Pro | |
| FAST slides (2 Pad) | GVS Northa America | 10485317 | |
| FAST frame | GVS Northa America | 10486001 | |
| FAST incubation chambers (2 Pad) | GVS Northa America | 10486242 | |
| 384 well plates | Whatman | 7701-5101 | |
| plate sealers | VWR | 60941-062 | |
| foil plate covers | VWR | 60941-124 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Fetal calf serum | Invitrogen | 12483020 | |
| Cy3 goat anti-human IgG | Jackson Immuno | 109-165-096 | use working stock in 50% glyercol |
| Cy5 goat anti-human IgM | Jackson Immuno | 109-175-129 | use working stock in 50% glyercol |
| Cy3 goat anti-mouse IgG | Jackson Immuno | 115-165-071 | use working stock in 50% glyercol |
| Cy5 goat anti-mouse IgM | Jackson Immuno | 115-175-075 | use working stock in 50% glyercol |
| Microarray Scanner | Molecular Devices | Axon 4200A | |
| Microarray software | Molecular Devices | Genepix 6.1 | |
| Clustering software | eisenlab.org | Cluster 3.0 | |
| Heatmap software | eisenlab.org | Treeview 1.60 | |
| Microarray statistical software | Stanford University | SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays) |
References
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