Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Genereren van tweekleurige Antigen Microarrays voor de simultane detectie van IgG en IgM Autoantistoffen

doi: 10.3791/54543 Published: September 15, 2016

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Verdunning antigenen en genereren Antigen Microarrays

  1. Verdun antigenen in PBS tot een eindconcentratie van 0,2 mg / ml. Druk tot 162 unieke antigenen in tweevoud met een microarrayprinter configuratie met 9 pinnen. Onder IgG en IgM antigenen in het antigeen bibliotheek als positieve controles. Omvatten PBS alleen als een negatieve controle.
  2. Voeg 20 ul van elk antigeen aan de 384 goed bronplaat. Antigenen toevoegen bronplaat in groepen die de instelling van de printkop spiegel (bv regelen antigenen in groepen van 9 bij 9 kunnen worden gebruikt voor het afdrukken).
  3. Cover bron plaat met folie en bevriezen bij -80 ° C tot klaar om arrays te drukken.
  4. Reinig solide microarrayprinter pinnen door hen te incuberen in een sonicatie bad met gedemineraliseerd water gedurende 3 x 1 min. Plaats pinnen in rack te drogen en te regelen dan pinnen in microarray printkop. 9 pinnen, gebruik dan een 3 x 3-configuratie.
  5. Programma microarrayprinter voor print gerund door het instellen van het aantal pinnen op de printkop,aantal dia's af te drukken, het aantal kussentjes op elke dia, en het aantal herhaalde plekken voor elk antigeen. Gewoonlijk gebruiken 9 pins, 70 dia's, 2 pads / glijbaan, en 2 herhaalde plekken voor elk antigeen. Programma microarrayprinter pinnen ultrasone trillingen in het water tussen verschillende groepen antigenen.
  6. Dooi bron plaat en vervolgens centrifuge plaat gedurende 1 minuut bij 100 x g. Plaats de bron plaat in de aangewezen plek in microarrayprinter. Neem de snij folie die over de eerste groep van antigenen te drukken.
  7. Schik onbedrukte dia's op Arrayer oppervlak en run druk programma. Print slides bij RT met vocht zich op de Arrayer bij 55-60% met de ingebouwde bevochtiger van de array machine.
  8. Nadat elke groep antigenen op de objectglaasjes geprint, pauzeren microarrayprinter. Bedek de antigenen die net waren bedrukt met folie (om verdamping te voorkomen) en onthullen de volgende groep antigenen te drukken. Doorgaan druk programma.
  9. Nadat alle antigenen zijn afgedrukt, cover bron plat met nieuw stuk folie en bevriezen bij -80 ° C. Plaats gedrukt dia's in dia doos en vacuüm afdichting. Slides kunnen de volgende dag tot een maand later worden gebruikt of niet.

2. Probing Antigen Microarrays met verdunde Sera

  1. Plaats de dia's in frames met behulp van incubatie kamers. Voeg 700 pl blokkerende buffer (2,5% [v / v] Foetaal kalfsserum (FCS), 0,1% [vol / vol] Tween 20 in PBS) aan elk array-oppervlak.
  2. Plaats de zelfklevende folie over frame en plaats in een afgesloten container met een stukje natte weefsel. Incubate O / N bij 4 ° C op een rocker.
  3. Verdunde serummonsters 1: 100 in het blokkeren van buffer. Aspireren blokkeeroplossing van arrays en voeg 500 pl verdund monster op elke array oppervlak.
  4. Dek af met zelfklevende folie en incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C met schommelen.
  5. Verdun secundaire antilichamen in het blokkeren van buffer. Menselijke studies, verdun een Cy3 gelabeld geit anti-humaan IgG antilichaam tegen 0,33 ug / ml en een Cy5 gelabeld geit anti-human IgM-antilichaam tot 0,25 ug / ml. Voor muizen hebben verdun een Cy3 gelabeld geit anti-muis IgG antilichaam tegen 0,38 ug / ml en een Cy5 gelabeld geit anti-muis IgM antilichaam aan 0,7 ug / ml.
  6. Aspireren monsters van arrays en spoel matrix oppervlakken 4 keer met spoelbuffer (0,1% Tween 20 in PBS). Pour buffer op om dia's en flick snel af.
  7. Voeg 700 ul van het blokkeren van buffer aan elke array oppervlak wassen en incubeer 10 min bij RT met schommelen. Herhaal wasstap nog twee keer.
  8. Voeg 500 ul van verdund secundair antilichaam aan elke dia oppervlak en dek af met zelfklevende folie. Incubeer 45 min bij 4 ° C met schommelen.
  9. Zuig secundair antilichaam mengsel van dia's en spoel 4 keer als hierboven. Wassen slides 3 maal met 700 ui blokkerende / verdunningsbuffer als hierboven.
  10. Verwijder dia's uit frames en plaats in de metalen schuif rack dat is ondergedompeld in PBS. Incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur met orbitaal schudden. Plaats in nieuwe container van PBS en incubeer nog eens 20 min met schudden.
  11. Plaats dia rek in container van gedemineraliseerd water 15 sec. Plaats rek in een nieuwe bak met water en incubeer nog eens 15 sec.
  12. Om droge dia's, dia plaats rek op een ELISA-plaat adapter in centrifuge en draaien op 220 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  13. Plaats de dia's in lichtdichte doos tot klaar om te scannen.

3. Scanning Antigen Microarrays en Gegevens exporteren

  1. Scan dia's met behulp van een microarray scanner die Cy3 en Cy5 fluorescente signalen kan detecteren. Om de fotomultiplicatorbuis (PMT) niveau van de scanner passen, pre-scan één dia die alleen werd geprobed met secundaire antilichamen.
    Opmerking: Deze schuif is moeten de antigeen library erop gedrukt waaronder positieve (IgG en IgM) en negatieve (PBS) controlegroep. De pre-scan is een lage resolutie scan dat de gebruiker snel maakt het mogelijk om de optimale PMT instellingen te vinden.
  2. Stel de PMT waarden, zodat het menselijk IgG-functies (op de Cy3 kanaal) en de bromeen IgM kenmerken (de Cy5 kanaal) dezelfde mediane fluorescentie-intensiteit minus achtergrond (MFI-B) (typisch 40.000). De PMT niveaus worden door op de 'hardware' knop in te stellen. Eenmaal ingesteld, constant te houden deze PMT instellingen.
  3. Scan de experimentele dia's op de twee kanalen door te drukken op de knop "Scannen". Sla de dia's (beide kanalen) na elke scan.
  4. Plaats de dia te analyseren in de microarray-software met behulp van de "file" knop.
  5. Laad het bestand gen-array lijst (GAL) met behulp van de "file" knop. GAL bestand heeft de indeling van de array met de identiteit van de matrix functies.
  6. Plaats de arraysjabloon via gescande afbeelding zodat de arrays kenmerken overeenkomen met de sjabloon zo dicht mogelijk.
  7. Lijn functies in alle blokken met de sjabloon door op de "align" knop. Het programma zal in het algemeen vindt de omtrek van de cirkelvormige functies maar handmatige aanpassingen nodig zijn. Deze aanpassingen kunnen worden gemaakt door lopen de toepassingsmode. De software berekent dan een MFI-B voor elk van de antigenen.
  8. Gebruik de "file" knop om deze resultaten te exporteren als een tekstbestand.

4. analyseren Array gegevens met de Betekenis Analyse van Microarrays (SAM)

  1. Laad individuele tekstbestanden in Excel en identificeren van de kolommen die MFI-B voor de Cy3 en Cy5 kanalen.
  2. Bereken het gemiddelde van de dubbele functies.
  3. Voor eventuele negatieve MFI-B, vervang de negatief getal met 10. Transformeer gegevens door te delen raw MFI-B met 100 en vervolgens door het berekenen van log base 2.
  4. Analyseer log-getransformeerde gegevens Betekenis Analyse van Microarrays (SAM) zoals eerder 7 beschreven.
  5. Voor een onderzoek met behulp van twee groepen (bijvoorbeeld gezonde controles vs. patiënten), label één groep "1" en de groep "2." Gebruik een twee-klasse, ongepaarde analyse in SAM antigenen reactiviteiten die s te identificerenignificantly verschillend tussen beide groepen (q-waarde <0,05).
  6. Gebruik clustering en warmte-map genererende software om foto's te maken voor de presentatie 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Antigenen zijn aangebracht in een plaat met 384 putjes en gedrukt op objectglaasjes door een robot microarrayprinter zie figuur 1. Figuur 2 toont glaasjes geplaatst in een frame met incubatie kamers en een gescande dia na verwerking. Figuur 3 toont positieve en negatieve controleglaasjes. De negatieve schuif alleen maar geprobed met secundaire antilichamen, en de positieve controle dia geprobed met serum van een patiënt met systemische lupus erythematosus. Door twee gescheiden gelabelde secundaire antilichamen, kunnen IgG en IgM reactiviteiten worden gescheiden op dezelfde glijoppervlak. Figuur 4 toont fluorescentie-intensiteit van IgM antilichamen tegen enkelstrengs DNA (ssDNA) en IgG antilichamen tegen ribosomale P (Ribo P) over een groot scala aan serumverdunningen. In dit experiment positieve controle serum van een patiënt met systemische lupus erythematosus bekende reactiviteit tegen Ribo P werd gebruikt. Linoor reacties worden waargenomen op de IgM kanaal over alle serumverdunningen. Lineaire reacties worden waargenomen op de IgG-kanaal tot een MFI-B van ongeveer 30.000. Na dit punt de reacties beginnen te verzadigen en antilichaamtoenames om Ribo P niet tot een overeenkomstige toename van MFI-B. Figuur 5 toont hoe de arrays kunnen worden gebruikt voor reumatoïde factor detecteren in menselijk serum. In deze studie, serum van een patiënt met cryoglobulinemic vasculitis met een gedocumenteerde reumatoïde factor (IgM antilichamen tegen IgG) van 167 IU / ml (normaal <11 IU / ml) werd gebruikt. Het gebruik van secundaire antilichamen alleen, is er geen IgM reactiviteit gezien tegen de IgG dat is gespot op de array. Daarentegen is significant IgM reactiviteit (MFI-B van ongeveer 5000) gedetecteerd tegen IgG wanneer de schuif wordt geprobed met serum van de patiënt met reumatoïde factor. Figuur 6 toont de ontwikkeling van een tweekleurige antigeen microarray voor gebruik met muizenserum. In deze figuur, muis IgM thbij gespot op de array alleen gedetecteerd door anti-muis IgM secundair antilichaam en muizen IgG dat is gespot op de matrix alleen gedetecteerd door anti-muis IgG secundair antilichaam. Figuur 7 toont positionering van een sjabloon raster op een gescand image array met behulp van microarray-analyse software. Zodra de array functies zijn afgestemd op de grid, kan de array functies worden geanalyseerd om mediaan fluorescentie-intensiteit minus achtergrond voor elke functie te verkrijgen.

Figuur 1
Figuur 1. Generatie van Antigen Microarrays. De antigenen worden eerst geplaatst in de bron plaat. In de bronplaat in de figuur zijn antigenen in groepen van 9 afstemming van 3 x 3 indeling van de printkop pennen. De bron plaat wordt vervolgens in de robot microarrayprinter geplaatst en de antigenen worden vervolgens door aanstippen op de objectglaasjes. In dit voorbeeld, 2-pad FAST slides are gebruikt, waardoor voor identieke arrays te worden gespot op de 2 nitrocellulose oppervlakken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Verwerking van Antigen Microarrays. Slides zijn in FAST frames geplaatst met behulp van incubatie kamers en worden verwerkt door het toevoegen van samples en vervolgens secundaire antilichamen. Antigeen reactiviteiten worden onthuld met een scanner voor het opsporen fluorescentiesignalen. De gescande afbeelding van een 2-pad FAST dia wordt getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3 <br /> Figuur 3. Twee-kleuren Antigen Microarrays geoptimaliseerd voor gebruik met humane sera. (A) IgG, IgM en IgG Fc gedetecteerd in de array gehybridiseerd alleen secundaire antilichamen. Deze drie antigenen positieve controles voor de specificiteit van de secundaire antilichamen vertonen. Rode fluorescentie (IgM kanaal) geeft de binding van anti-humaan IgM secundair antilichaam. Groene fluorescentie (IgG kanaal) geeft de binding van anti-humaan IgG secundair antilichaam. De IgG Fc antigen wit door oververzadiging. (B) Veel meer reactiviteit worden gedetecteerd in de array onderzocht met positieve controle serum van een patiënt met systemische lupus erythematosus bekende reactiviteit tegen Ribo P antigen. De vakken geven de plaatsen waar DNA en Ribo P antigenen zijn bekleed. (C) Kwantificering van de fluorescentie-intensiteiten in het positieve controleserum blijkt dat het merendeel van het antilichaam reactiviteit tegen DNA antigenen van de IgM isotype. (D) Kwantificering van de fluorescentie-intensiteiten in het positieve controleserum blijkt dat het merendeel van het antilichaam reactiviteit tegen Ribo P antigenen van het IgG isotype. Array functies zijn gespot in tweevoud en zijn ongeveer 500 micrometer in diameter. Grafieken tonen gemiddelde ± SD voor matrix functies. dsDNA, dubbelstrengs DNA; ssDNA, enkelstrengs DNA; MFI-B, mediaan fluorescentie-intensiteit minus achtergrond; Ribo P, ribosomale P. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. fluorescentie- intensiteit versus serum verdunningsfactor. (A) MFI-B over uiteenlopende serumverdunningen wordt getoond IgM en IgG tegen ssDNA tegen Ribo blz Om dezeexperimenten, positieve controle serum met bekende IgG reactiviteit tegen Ribo P en ssDNA werd gebruikt. MFI-B is verzadigd bij een waarde van ongeveer 65.000. (B) Log2 transformatie van de MFI-B data onthult lineaire responsen op zowel IgG en IgM kanalen over een groot aantal antigeen reactiviteiten. Over een MFI-B van 30.000, begint de IgG-signaal te verzadigen en verliest lineariteit. Array functies werden gespot in 6 herhalingen. Grafieken tonen gemiddelde ± SD voor matrix functies. ssDNA, enkelstrengs DNA; MFI-B, mediaan fluorescentie-intensiteit minus achtergrond; Ribo P, ribosomale P. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5. Detectie van reumatoïde Factor met Twee kleuren Antigen Microarrays. (B) Array geprobed met serum van een patiënt met cryoglobulinemic vasculitis met een hoge reumatoïde factor. De IgG functie is groengele door binding van IgM in het serum van de patiënt geïmmobiliseerd IgG. Interessant is dat deze patiënt ook IgG antilichamen tegen IgM als functie IgM lijkt oranje. De patiënt heeft een geschiedenis van aangeboren hartafwijkingen en is bekend om hoge reactiviteit naar het cardiaal troponine proteïne C. (C) Kwantificering van IgG en IgM functies op de array gehybridiseerd met enige secundaire antilichamen toont aan dat de secundaire antilichamen niet have geen kruisreactiviteit. (D) kwantificeringvan de IgG en IgM functies op de array onderzocht met serum van de patiënt, de aanwezigheid van reumatoïde factor. Kenmerken zijn gespot in tweevoud en zijn ongeveer 500 micrometer in diameter. Grafieken tonen gemiddelde ± SD voor matrix functies. MFI-B, mediaan fluorescentie-intensiteit minus achtergrond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 6
Figuur 6. ontwikkeling van twee-kleuren Arrays naar profiel Mouse Serum antilichamen. (A) Array gesondeerd alleen met secundaire antilichamen. Rode fluorescentie duidt binding van het anti-muis IgM secundair antilichaam. Groene fluorescentie geeft binding van de anti-muis IgG secundair antilichaam. De muis IgG dat is gespot op de array wordt gedetecteerd alleen door het anti-mouse IgG secundair antilichaam en de muis IgM die bevlekt wordt alleen gedetecteerd door anti-muis IgM secundair antilichaam. De andere mogelijkheden van de arrays die worden gedetecteerd door de secundaire antilichamen capture antilichamen tegen muizen IgG of IgM van muis. (B) Array gehybridiseerd met een muis IgG monoklonaal antilichaam tegen histidine-tags. Op deze array, de Ribo P antigeen (recombinant aangemaakt eiwit) groen is, wat aangeeft dat het alleen wordt herkend door de anti-muis IgG secundair antilichaam. Dit wordt verwacht omdat het monoklonale antilichaam van het IgG isotype. De Ribo P antigeen wordt niet gedetecteerd wanneer de arrays worden gehybridiseerd met secundaire antilichamen alleen (oranje doos). (C) Kwantificering van IgG, IgM en Ribo P voorzien in de array gehybridiseerd met een muis IgG monoklonaal antilichaam tegen histidine-tags. Array functies zijn gespot in zes herhalingen en zijn ongeveer 500 micrometer in diameter. Grafieken tonen gemiddelde ± SD voor matrix functies. MFI-B, mediaan fluorescence intensiteit minus achtergrond; Ribo P, ribosomale P. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 7
Figuur 7. Afstemming van een sjabloon Grid op een Array Image. In dit screenshot, een sjabloon rooster, dat werd gegenereerd uit een gal-bestand, werd in lijn met een eerder gescande antigeen microarray. De array werd geprobed met serum van een patiënt met systemische lupus erythematosus en bloedstolling die veel autoantilichaam reactiviteiten hebben. Groene fluorescentie vertegenwoordigt de binding van IgG antistoffen en rode fluorescentie vertegenwoordigt binding van IgM antilichamen. De functies gedrukt door stevige pennen zijn bijna rond en zijn gemakkelijk geschetst door de microarray software (GenePix). Zodra het rooster uitlijning voltooid, de software kan de mediaan fluorescentie-intensiteit minus achtergrond (op zowel de Cy3 en Cy5 kanalen) voor elk van de reeks functies te berekenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De hier beschreven protocol maakt de kwantificering van auto-antilichamen met het antigeen microarray techniek. Antigeen microarrays bieden verscheidene voordelen boven conventionele ELISA screening voor autoantilichamen. Allereerst een grote antigenen zoals nucleïnezuren, eiwitten, peptiden, en cellysaten worden opgesteld op de met nitrocellulose gecoate glaasjes, hetgeen aldus gemultiplexte screenen van autoantilichamen. Bovendien, slechts microgram antigeen nodig om de arrays genereren aangezien nanoliters antigeendosis gespot op elke dia. De arrays vereisen ook weinig patiëntmonster, aangezien slechts 5 pl serum nodig om een ​​array oppervlak probe bij een 1: 100 verdunning monster. Tenslotte arrays gespot op nitrocellulose bleken gevoeliger dan conventionele ELISA bij onderzoek voor autoantilichamen 9 te zijn.

Naast het gebruik van antigeen microarrays te screenen op auto-antilichamen, kan de arrays gebruiktd tot de reactiviteit tegen niet-eigen eiwitten (bijvoorbeeld virale eiwitten) te detecteren, om de specificiteit van monoklonale antilichamen bepalen en niveaus van niet-HLA-antilichamen bij transplantatie meten zoals hierboven 9-12 beschreven. Antigen microarrays kunnen ook worden gebruikt om de exacte epitoop mapping experimenten waarbij overlappende peptiden van een enkel eiwit zijn gerangschikt op een dia voeren. Een recente studie dit benadering epitopen van de U1-70K eiwitten die doelwitten van autoantilichamen bij systemische lupus erythematosus 13 definiëren.

Met de hier beschreven protocol, de detectie van IgG en IgM reactiviteiten is lineair over uiteenlopende serumverdunningen. Deze studies werden uitgevoerd onder positieve controle serum van een patiënt met systemische lupus erythematosus bekende reactiviteit tegen ribosomale P antigeen en ssDNA. IgM-reactiviteit tegen ssDNA lineair in serum verdunningen van 1 125 tot 1: 32.000, overeenkomend met MFI-B van 17.000 tot 50. IgG reactiviteitRibo P lineair in serum verdunningen van 1 in 4000 tot 1: 512.000, corresponderend met MFI-B van 32.000 tot 200. Bij verdunningen van minder dan 1: 4000 (en MFI-B groter dan 32.000), de detectie van IgG reactiviteit kromme vlakker en is niet meer lineair. In het werk met hart transplantatie ontvangers, wordt serum routinematig verdund tot 1: 100 als MFI-B antigenen zelden meer dan 10.000 bij deze verdunning. Voor studies met patiënten met auto- immuunziekte met hoge titer autoantilichamen kan patiëntmonsters moeten verder worden verdund dat de meeste auto-antilichaam reactiviteiten binnen het lineaire gebied van de assay valt.

Terwijl MFI-B nuttig autoantilichaam reactiviteiten vergelijking tussen groepen patiënten, kan het nuttig zijn om deze waarde te zetten in een kwantitatieve maat autoantilichaamsspiegels. Dit kan worden bewerkstelligd door het spotten meerdere bekende verdunningen van gezuiverde IgG en IgM op de dia een standaardcurve. Met behulp van deze curve, kunnen MFI-B dan transgevormd in een autoantilichaam voor elk antigeen.

In het protocol hier gepresenteerde werden 2-pad-nitrocellulose gecoat slides gebruikt. Op deze dia, twee identieke arrays, die kunnen worden onderzocht met twee verschillende serummonsters, afgedrukt op elke dia. Hierdoor kunnen twee monsters van dezelfde patiënt (zoals voor en na behandeling) worden vergeleken op dezelfde dia die interslide variabiliteit geminimaliseerd. Tweeëndertig dia's met 64 individuele patiëntenmonsters routinematig verwerkt tegelijkertijd in één dag. De meest recente reeks is bedrukt met 9 pinnen, waardoor 162 antigenen af ​​te drukken in tweevoud (elke pen drukt een 36 functie subarray waarvan 18 antigenen gedrukt in tweevoud is gelijk).

Het antigeen microarrays gegenereerd in dit protocol werden bedrukt met stevige microarrayprinter pinnen. Afdrukken met stevige pinnen is meer tijd in beslag dan afdrukken met schacht stijl pinnen omdat de microarrayprinter moet opnieuw dip naar de bron plaat na elke tIME de pennen raken de dia oppervlak. Vaste pennen werden als zij produceren zeer reproduceerbaar, nagenoeg cirkelvormig reeks kenmerken (ca. 500 pm in diameter). Deze functies kunnen gemakkelijk worden opgespoord en geschetst door de scanner software, en minimale handmatige aanpassingen zijn nodig om de array functies kwantificeren. Solid pinnen ook mogelijk voor cellysaten worden afgedrukt, die moeilijk kan zijn om af te drukken met ganzenveer pennen als gevolg van hun hogere viscositeit. Vanwege de lange afdruktijden betrokken bij vaste pennen (soms 10 - 11 uur op 70 slides drukken), antigenen die niet in het bronplaat gedrukt worden bedekt met een folie om verdamping te voorkomen.

De hier beschreven protocol biedt een methode om IgG en IgM reactiviteiten gescheiden op dezelfde glijoppervlak. De arrays zijn geoptimaliseerd om te screenen voor zowel mens en muis antilichamen onder gebruikmaking paren secundaire antilichamen gelabeld met verschillende fluoroforen. Van cruciaal belang voor deze twee kleuren aanpak is het identificeren van secondary antilichamen die zeer specifiek zijn voor ofwel IgG of IgM isotypen zijn. De secundaire antilichamen die gebruikt herkent het Fc deel van IgG of IgM en niet kruisreageren met elkaar. Het scheiden van de IgG en IgM signalen is belangrijk gezien de verschillende functies van deze antilichamen in immuunresponsen. Zo wordt IgM geproduceerd op hogere niveaus door B1 cellen en is typisch een merker van vroege immuunreactie. Anderzijds, IgG is een marker van een latere immuunrespons, die zich ontwikkelt als gevolg van omschakeling van klasse 14. Door het detecteren van IgG en IgM signalen gescheiden, is het ook mogelijk om IgM rheumatoïde factoren in patiëntenmonsters identificeren (bijv IgM immunoglobulinen die binden aan IgG dat is gespot op de matrix). Door het spotten verschillende gedeelten van antilichamen (bijvoorbeeld Fc versus Fab), binding van reumatoïde factor verschillende IgG antilichaam epitopen kunnen worden gekwantificeerd. Met de beschikbaarheid van scanners met meer dan twee lasers aanvullende tweedeary antilichamen kunnen worden toegevoegd aan de huidige secundaire antilichaampaar binding van IgA, IgD of IgE-antilichamen te identificeren. Secundaire antilichamen kunnen ook worden geïdentificeerd die het mogelijk maken voor de identificatie van afzonderlijke IgG subklassen (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) gebonden aan antigenen op een array.

Concluderend, het antigeen microarray techniek een robuuste technologie waardoor de hoge-doorvoer analyse van serum autoantilichamen. Deze techniek is zeer flexibel en gevoelig. De fluorescentie-gebaseerde detectie systeem is geoptimaliseerd voor mens en muizen hebben en maakt de gelijktijdige detectie van IgG- en IgM-antilichamen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ribosomal P0 Diarect 14100 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgG Jackson Immuno 009-000-003 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgM Jackson Immuno 009-000-012 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgG Sigma-Aldrich I5381 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgM Biolegend 401601 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
double-stranded DNA Sigma-Aldrich D1626 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
single-stranded DNA Sigma-Aldrich D8899 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
microarrayer Virtek VersArray Chipwriter Pro many types of arrayers are suitable
solid printing pins Arrayit Corporation SSP015
software for robotic microarrayer Virtek Chipwriter Pro 
FAST slides (2 Pad) GVS Northa America 10485317
FAST frame GVS Northa America 10486001
FAST incubation chambers (2 Pad) GVS Northa America 10486242
384 well plates Whatman 7701-5101
plate sealers VWR 60941-062
foil plate covers VWR 60941-124
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
Fetal calf serum Invitrogen 12483020
Cy3 goat anti-human IgG Jackson Immuno 109-165-096 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-human IgM Jackson Immuno 109-175-129 use working stock in 50% glyercol
Cy3 goat anti-mouse IgG Jackson Immuno 115-165-071 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-mouse IgM Jackson Immuno 115-175-075 use working stock in 50% glyercol
Microarray Scanner Molecular Devices Axon 4200A
Microarray software Molecular Devices Genepix 6.1
Clustering software eisenlab.org Cluster 3.0
Heatmap software eisenlab.org Treeview 1.60
Microarray statistical software Stanford University SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naparstek, Y., Plotz, P. H. The role of autoantibodies in autoimmune disease. Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).
  2. Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention. Autoimmun Rev. 14, 555-563 (2015).
  3. Robinson, W. H., et al. Autoantigen microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses. Nature. medicine. 8, 295-301 (2002).
  4. Quintana, F. J., et al. Antigen microarrays identify unique serum autoantibody signatures in clinical and pathologic subtypes of multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18889-18894 (2008).
  5. Hueber, W., et al. Antigen microarray profiling of autoantibodies in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 52, 2645-2655 (2005).
  6. Price, J. V., et al. Protein microarray analysis reveals BAFF-binding autoantibodies in systemic lupus erythematosus. J. Clin. Invest. 123, 5135-5145 (2013).
  7. Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 5116-5121 (2001).
  8. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14863-14868 (1998).
  9. Chruscinski, A., et al. Generation of Antigen Microarrays to Screen for Autoantibodies in Heart Failure and Heart Transplantation. PloS one. 11, e0151224 (2016).
  10. Price, J. V., et al. Characterization of influenza vaccine immunogenicity using influenza antigen microarrays. PloS one. 8, e64555 (2013).
  11. Singh, H., et al. Reactivity profiles of broadly neutralizing anti-HIV-1 antibodies are distinct from those of pathogenic autoantibodies. Aids. 25, 1247-1257 (2011).
  12. Porcheray, F., et al. Chronic humoral rejection of human kidney allografts associates with broad autoantibody responses. Transplantation. 89, 1239-1246 (2010).
  13. Haddon, D. J., et al. Mapping epitopes of U1-70K autoantibodies at single-amino acid resolution. Autoimmunity. 48, 513-523 (2015).
  14. Schroeder, H. W. Jr, Cavacini, L. Structure and function of immunoglobulins. J Allergy Clin Immunol. 125, S41-S52 (2010).
Genereren van tweekleurige Antigen Microarrays voor de simultane detectie van IgG en IgM Autoantistoffen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).More

Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter