Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generering av To-farge Antigen Mikromatriser for samtidig påvisning av IgG og IgM autoantistoffer

doi: 10.3791/54543 Published: September 15, 2016

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. fortynne antigener og generere Antigen Mikromatriser

  1. Fortynn antigener i PBS til en sluttkonsentrasjon på 0,2 mg / ml. Skriv ut opp til 162 unike antigener i duplikat med en microarrayer konfigurasjon med 9 pinner. Består av IgG- og IgM-antigener på antigen-biblioteket som positive kontroller. Omfatte PBS bare som en negativ kontroll.
  2. Tilsett 20 ul av hver antigen til 384 godt kilde plate. Legg antigener til kilden plate i grupper som speil oppsettet av skrivehodet (f.eks ordne antigener i grupper på 9 når 9 pins brukes til utskrift).
  3. Cover kilde plate med folie og fryse ved -80 ° C til den er klar til å skrive ut arrays.
  4. Rens faste microarrayer nålene ved å inkubere dem i en sonicating bad med deionisert vann til 3 x 1 min. Plasser pinnene i stativet for å tørke og deretter ordne pinner i microarray hodet. For 9 pins, bruk en 3 x 3-konfigurasjon.
  5. Program microarrayer for opplag ved å sette antall pinner på skrivehodet,antall lysbilder som skal skrives ut, antall pads på hvert lysbilde, og antall gjentatte plasser for hvert antigen. Vanligvis bruker 9 pins, 70 sider, to pads / slide, og 2 replikere plasser for hvert antigen. Program microarrayer å sonicate pinner i vannet mellom ulike grupper av antigener.
  6. Tine kilde plate og deretter sentrifugeplate i 1 min ved 100 x g. Plasser kilde plate i utpekt sted i microarrayer. Fjern den delen av folien som dekker den første gruppen av antigener som skal skrives ut.
  7. Ordne blanke lysbilder på arrayer overflaten og løp utskriftsprogram. Skriv ut lysbilder på RT med fuktighet satt på arrayer på 55 - 60% med bygge i luftfukter i matrisen maskinen.
  8. Etter hver gruppe av antigener er trykket på alle lysbildene, pause microarrayer. Dekk antigener som nettopp ble trykt med folie (for å hindre fordamping) og avdekke den neste gruppen av antigener som skal skrives ut. Fortsett utskriftsprogram.
  9. Etter at alle antigenene er skrevet ut, cover kilde plspiste med nytt stykke folie og fryse ved -80 ° C. Plasser trykte lysbilder i lysbilde boksen og vakuum segl. Lysbilder kan brukes neste dag eller opptil en måned senere.

2. Sondering Antigen Mikromatriser med Fortynnet Sera

  1. Plasser lysbilder i rammer ved hjelp av ruge kamre. Legg 700 ul blokkeringsbuffer (2,5% [volum / volum] Føtalt kalveserum (FCS), 0,1% [volum / volum] Tween 20 i PBS) i hver matrise overflate.
  2. Plasser klebende film over rammen og plasseres i en lukket beholder med et stykke av vått vev. Inkuber O / N ved 4 ° C på en rocker.
  3. Fortynn serumprøver 1: 100 i blokkeringsbuffer. Sug blokkering løsning fra arrays og tilsett 500 mL fortynnet prøve til hver matrise overflaten.
  4. Dekk med klebefilm og inkuberes i 1 time ved 4 ° C med gynge.
  5. Fortynnet sekundære antistoffer i blokkering buffer. For studier på mennesker, fortynne en Cy3-merket geit anti-humant IgG antistoff til 0,33 ug / ml og et Cy5-merket geit anti-human resn IgM-antistoff til 0,25 ug / ml. For musestudier, fortynne en Cy3 merket geit anti-mus IgG antistoff til 0,38 ug / ml og et Cy5-merket geit anti-muse-IgM-antistoff til 0,7 mikrogram / ml.
  6. Sug prøver fra matriser og skyll array-flater 4 ganger med skyllebuffer (0,1% Tween 20 i PBS). Pour buffer på å lysbilder og flick av raskt.
  7. Legg 700 ul blokkeringsbuffer til å vaske hver matrise overflate og inkuberes 10 minutter ved romtemperatur med gynge. Gjenta vasketrinn to ganger.
  8. Legg til 500 mL fortynnet sekundært antistoff til hvert glideflate og dekk med selvklebende film. Inkuber 45 min ved 4 ° C med gynge.
  9. Sug sekundært antistoff blandingen fra lysbilder og skyll 4 ganger som ovenfor. Vask glir 3 ganger med 700 mL av blokkering / fortynning buffer som ovenfor.
  10. Fjern lysbilder fra rammer og sted i metall lysbilde rack som er nedsenket i PBS. Inkuber 20 minutter ved romtemperatur med kretsende rysting. Sett i ny beholder med PBS og inkuberes ytterligere 20 mpå med risting.
  11. Place lysbilde rack i beholder med avionisert vann 15 sek. Plasser rack i en ny beholder med vann og inkuberes ytterligere 15 sek.
  12. Å tørre lysbilder, sted lysbilde rack på en ELISA plate adapter i sentrifuger og sentrifugering ved 220 xg i 5 min ved RT.
  13. Plasser lysbilder i lystett boks til alt er klart til skanning.

3. Skanning Antigen Mikromatriser og eksport av data

  1. Skann lysbilder ved hjelp av en microarray scanner som kan oppdage Cy3 og Cy5 fluorescerende signaler. For å justere fotomultiplikatorrør (PMT) nivåer av skanneren, pre-skanne et lysbilde som bare ble probet med sekundære antistoffer.
    Merk: Denne lysbildet skal ha den fulle antigenet biblioteket trykket på den herunder positiv (IgG og IgM), så vel som negative kontroller (PBS). Den pre-scan er en lav oppløsning skanning som lar brukeren raskt å finne de optimale PMT innstillinger.
  2. Still inn PMT verdiene slik at de humane IgG funksjoner (på Cy3 kanal) og nynneen IgM-funksjoner (på Cy5 kanal) har en tilsvarende midlere fluorescensintensitet minus bakgrunn (MFI-B) (typisk 40 000). PMT nivåene er satt ved å trykke på "hardware" -knappen. Når det er satt, holde disse PMT innstillingene konstant.
  3. Skann eksperimentelle lysbilder på de to kanalene ved å trykke på "scan" -knappen. Redd lysbildene (begge kanaler) etter hver skanning.
  4. Last lysbildet som skal analyseres i microarray-programvaren ved å bruke "fil" -knappen.
  5. Last ned filen genet rekke liste (GAL) ved å bruke "fil" -knappen. Den GAL filen har utformingen av tabellen med identiteten til array-funksjoner.
  6. Plasser matrisen malen over skannede bildet slik at arrays funksjoner samsvarer med malen så tett som mulig.
  7. Juster funksjoner i alle blokkene med malen ved å trykke på "align" -knappen. Programmet vil som regel finne omrisset av de sirkulære funksjoner, men noen manuelle justeringer kan være nødvendig. Disse justeringene kan gjøres ved å skrive inn funksjonen modus. Programvaren vil så beregne en MFI-B for hver av antigenene.
  8. Bruk "fil" -knappen for å eksportere disse resultatene som en tekstfil.

4. Analysere Array data med Betydningen Analyse av mikromatriser (SAM)

  1. Last individuelle tekstfiler i excel og identifisere kolonnene som har MFI-B for Cy3 og Cy5 kanaler.
  2. Beregn gjennomsnittet for de dupliserte funksjoner.
  3. For noen negativ MFI-B, erstatte den negative tall med 10. Transform data ved å dele rå MFI-B med 100 og deretter ved å beregne log base 2.
  4. Analysere loggtransformerte data med Betydningen Analyse av mikromatriser (SAM) som beskrevet tidligere 7.
  5. For en studie med to grupper (f.eks friske kontroller vs pasienter), etikett en gruppe "1" og konsernets "2." Bruk en to-klasse, uparede analyse i SAM å identifisere antigener reaktivitet som er significantly forskjellig mellom de to gruppene (q-verdi <0,05).
  6. Bruk clustering og varme kartet generere programvare for å lage bilder for presentasjon åtte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Antigener er anordnet i en 384 brønners plate og trykkes på objektglass med en robot microarrayer som vist i figur 1. Figur 2 viser objektglass som er plassert i en ramme med inkuberings kammer og en skannet lysbilde etter behandling. Figur 3 viser positive og negative kontrollobjektglass. Den negative lysbildet er kun undersøkt med sekundære antistoffer, og den positive kontrollen lysbildet er undersøkt med serum fra en pasient med systemisk lupus erythematosus. Ved hjelp av to hver for seg merkede sekundære antistoffer, kan IgG- og IgM-reaktiviteter separeres på den samme glideflate. Figur 4 viser fluorescens-intensiteten av IgM antistoffer mot enkelt-trådet DNA (ssDNA) og IgG antistoffer mot ribosomale P (Ribo P) over et stort spekter av serum fortynninger. I dette forsøket positivt kontrollserum fra en pasient med systemisk lupus erythematosus med kjente reaktivitet mot Ribo P ble anvendt. Linøret responser observert på IgM kanal over alt serum fortynninger. Lineære responser observert på IgG kanal opp til en MFI-B på omtrent 30.000. Etter dette punktet, svarene begynner å mette og økninger i antistoff til Ribo P ikke fører til en tilsvarende økning i MFI-B. Figur 5 viser hvordan rekkene kan brukes for å påvise revmatoid faktor i humant serum. I denne studien ble serum fra en pasient med cryoglobulinemic vaskulitt med en dokumentert reumatoid faktor (IgM antistoffer mot IgG) av 167 IU / ml (normale <11 IU / ml) anvendt. Ved hjelp av sekundære antistoff alene, er det ikke IgM reaktivitet sett mot IgG som er flekket på matrisen. I motsetning til dette er signifikant IgM-reaktivitet (MFI-B på ca. 5000) har oppdaget mot IgG når sleiden er probet med serum fra pasienter med revmatoid faktor. Figur 6 viser utviklingen av en to-farge antigen microarray til bruk med museserum. I denne figur mus IgM thved blir flekket ut på matrisen blir bare oppdaget av anti-mus-IgM, sekundært antistoff, og muse-IgG som er flekket på matrisen blir bare oppdaget av anti-mus IgG sekundært antistoff. Figur 7 viser oppstilling av en mal gitter på en skannet matrise bilde ved hjelp av microarray analyse programvare. Når tabell funksjoner har blitt justert med rutenettet, kan tabellfunksjoner bli analysert for å få median fluorescensintensitet minus bakgrunn for hver funksjon.

Figur 1
Figur 1. Generering av antigen mikromatriser. Antigener blir først plassert i kildeplaten. I kildeplaten vist i figuren, er antigener arrangert i grupper på 9, matchende 3 x 3 utformingen av hodenålene. Kilden plate plasseres deretter i robot microarrayer og antigenene blir deretter flekket på skinnene. I dette eksemplet 2-pad FAST lysbilder are brukt, noe som åpner for identiske arrays for å bli oppdaget på de 2 nitrocellulose overflater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Behandling av Antigen Mikromatriser. Slides er plassert i FAST rammer ved hjelp av ruge kamre og behandles ved å legge prøver og deretter sekundære antistoffer. Antigen reaktivitet blir avslørt med en skanner som kan påvise fluorescerende signaler. Det skannede bildet av en 2-pad FAST lysbilde vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 <br /> Figur 3. To-farge Antigen Mikromatriser optimalisert for bruk med menneskelig Sera. (A) IgG, IgM, og IgG Fc blir oppdaget på tabellen undersøkt kun med sekundære antistoffer. Disse tre antigener er positive kontroller for å vise spesifisiteten av de sekundære antistoffer. Rød fluorescens (IgM kanal) viser binding av anti-humant IgM-sekundært antistoff. Grønn fluorescens (IgG kanal) viser binding av anti-humant IgG sekundært antistoff. IgG-Fc-antigenet er hvite på grunn av oversaturation. (B) Mange flere reaktiviteter detekteres på matrisen probet med positivt kontrollserum fra en pasient med systemisk lupus erythematosus med kjent reaktivitet til Ribo P antigen. Boksene angir posisjonene hvor DNA og Ribo P-antigenene er blitt oppstilt. (C) Kvantifisering av fluorescensstyrkene i positive kontrollserum viser at størstedelen av antistoff reaktiviteter mot DNA-antigener er av IgM isotype. (D) Kvantifisering av fluorescensstyrkene i positive kontrollserum viser at størstedelen av antistoff reaktiviteter mot Ribo P antigener er av IgG-isotypen. Array funksjonene er oppdaget i to eksemplarer, og er ca 500 mikrometer i diameter. Grafene viser gjennomsnitt ± SD for array-funksjoner. dsDNA, dobbelttrådet DNA; ssDNA, enkelttrådet DNA; MFI-B, median fluorescensintensiteten minus bakgrunn; Ribo P, ribosomalt P. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Fluorescens Intensitet vs. Serum Fortynningsfaktor. (A) MFI-B over et bredt område av serumfortynninger er vist for IgM mot ssDNA og IgG mot Ribo P. For disseeksperimenter, positivt kontrollserum med kjente IgG reaktivitet mot Ribo P og ssDNA ble anvendt. MFI-B er mettet til en verdi på ca. 65.000. (B) log2 transformasjon av MFI-B data avslører lineære responser på både IgG- og IgM-kanaler med et bredt spekter av antigen reaktivitet. I løpet av en MFI-B på 30.000, begynner IgG signal for å mette og taper linearitet. Array funksjoner ble oppdaget i 6 paralleller. Grafene viser gjennomsnitt ± SD for array-funksjoner. ssDNA, enkelttrådet DNA; MFI-B, median fluorescensintensiteten minus bakgrunn; Ribo P, ribosomalt P. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Påvisning av revmatoid faktor med to-farge Antigen Mikromatriser. (B) Array probet med serum fra en pasient med cryoglobulinemic vaskulitt med en høy reumatoid faktor. IgG-funksjonen er grønn-gult på grunn av binding av IgM i pasientens serum til immobilisert IgG. Interessant nok har denne pasienten også IgG-antistoffer mot IgM som IgM-funksjonen vises orange. Pasienten har også en historie med medfødt hjertesykdom og er kjent for å ha høy reaktivitet til hjerte protein troponin C (C) Kvantifisering av IgG og IgM har på tabellen undersøkt kun med sekundære antistoffer viser at sekundære antistoffer ikke har noen kryssreaktivitet. (D) Kvantifiseringav IgG- og IgM-funksjoner på matrisen probet med pasientserum bekrefter tilstedeværelsen av reumatoid faktor. Funksjoner er oppdaget i to eksemplarer, og er ca 500 mikrometer i diameter. Grafene viser gjennomsnitt ± SD for array-funksjoner. MFI-B, median fluorescens intensitet minus bakgrunn. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Utvikling av Two-farge Arrays til profil musserum Antistoffer. (A) Array undersøkt kun med sekundære antistoffer. Rød fluorescens indikerer at bindingen av de anti-muse-IgM-sekundært antistoff. Grønn fluorescens indikerer at bindingen av de anti-mus IgG sekundært antistoff. Musen IgG som er prikket inn rekken oppdages bare av anti-mouse IgG sekundært antistoff, og de muse-IgM som er flekket blir detektert bare av den anti-muse-IgM-sekundært antistoff. De andre funksjonene på arrays som er oppdaget av de sekundære antistoffer er fangst antistoffer mot mus IgG eller mus IgM. (B) Array undersøkt med en mus IgG monoklonalt antistoff mot histidin tags. På denne matrisen, den Ribo P-antigenet (rekombinant his-merket protein) er grønn, noe som indikerer at det er bare oppdaget av anti-mus IgG sekundært antistoff. Dette forventes gis at det monoklonale antistoff er av IgG-isotypen. Den Ribo P antigen gjenkjennes ikke når arrays er undersøkt med sekundære antistoffer alene (oransje boks). (C) Kvantifisering av IgG, IgM, og Ribo P har på tabellen undersøkt med en mus IgG monoklonalt antistoff mot histidin tags. Array funksjonene er oppdaget i seks paralleller og er ca 500 mikrometer i diameter. Grafene viser gjennomsnitt ± SD for array-funksjoner. MFI-B, median fluorescence intensitet minus bakgrunn; Ribo P, ribosomalt P. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7. Justering av en mal Grid på en Array bilde. I dette skjermbilde, en mal rutenett, som ble generert fra en gal fil, ble justert med en tidligere skannet antigen microarray. Matrisen ble probet med serum fra en pasient med systemisk lupus erythematosus og en blodpropp lidelse som hadde mange autoantistoff reaktiviteter. Grønn fluorescens representerer bindingen av IgG-antistoffer og rød fluorescens representerer binding av IgM-antistoffer. Funksjonene er skrevet ut av solide bolter er nesten sirkulær og er lett skissert av microarray programvare (GenePix). Når rutenettet justeringen er fullført, software kan beregne median fluorescensintensitet minus bakgrunnen (på både Cy3 og Cy5 kanaler) for hver av array-funksjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollen er beskrevet her gjør det mulig for kvantifisering av autoantistoffer ved hjelp av antigenet microarray teknikk. Antigen mikromatriser tilbyr flere fordeler fremfor konvensjonelle ELISA for screening for autoantistoffer. Først av alt, kan en rekke antigener inkludert nukleinsyrer, proteiner, peptider, og cellelysatene bli kledd på nitrocellulose-belagt lysbilder, og dermed gir for multiplex screening av autoantistoffer. I tillegg bare mikrogram antigen er nødvendig for å generere matriser siden nanoliter av antigen er oppdaget på hvert lysbilde. Matriser også krever svært lite pasientprøve, som bare 5 ul av serum som er nødvendig for å undersøke en rekke flate ved en 1: 100 fortynning prøven. Endelig arrays oppdaget på nitrocellulose har vist seg å være mer sensitiv enn konvensjonell ELISA ved screening for autoantistoffer 9.

I tillegg til å bruke antigen mikromatriser å screene for autoantistoffer kan arrays være brukd for å detektere reaktivitet mot ikke-selv-proteiner (f.eks virale proteiner), for å definere den spesifisitet av monoklonale antistoffer, og til å måle nivåer av ikke-HLA-antistoffer i transplantasjon som beskrevet tidligere 9-12. Antigen mikromatriser kan også brukes til å utføre detaljerte epitopkartlegging forsøk hvor overlappende peptider av et enkelt protein er kledd på et lysbilde. En fersk studie brukt denne tilnærmingen til å definere epitoper av U1-70K protein som er mål for autoantistoffer i systemisk lupus erythematosus 13.

Ved anvendelse av protokollen som er beskrevet her, er deteksjon av IgG- og IgM-reaktiviteter lineær over et vidt område av serumfortynninger. Disse studiene ble utført ved anvendelse av positivt kontrollserum fra en pasient med systemisk lupus erythematosus med kjent reaktivitet til ribosomale P antigen og ssDNA. IgM reaktivitet til ssDNA er lineær ved serumfortynninger på 1: 125 til 1: 32000, svarende til MFI-B fra 17 000 til 50. IgG reaktivitet overforRibo P er lineær ved serum fortynninger på 1: 4000 til 1: 512 000, svarende til MFI-B fra 32 000 til 200. Ved fortynninger lavere enn 1: 4000 (og MFI-B er større enn 32000), påvisning kurve av IgG reaktivitet flater og er ikke lenger lineær. I arbeidet med hjertetransplanterte resipienter er serum rutinemessig fortynnet til 1: 100 som MFI-B for antigener sjelden overstiger 10 000 på dette fortynning. For studier med pasienter med autoimmun sykdom med høy titer autoantistoffer, kan pasientprøver må fortynnes videre for å sikre at mesteparten av autoantistoff reaktiviteter faller innenfor det lineære området av analysen.

Mens MFI-B kan være nyttig å sammenligne autoantistoff reaktiviteter mellom grupper av pasienter kan det også være nyttig for å omdanne denne verdi til en mer kvantitativ måling av autoantistoffnivåer. Dette kan oppnås ved å fange opp flere kjente fortynninger av renset IgG og IgM på skinnene for å generere en standardkurve. Ved hjelp av denne kurve kan MFI-B da være transformes til et autoantistoff nivå for hvert antigen.

I protokollen som presenteres her, ble 2-pad nitrocellulose-belagt lysbilder brukes. På disse sidene ved to identiske arrays, som kan probet med to separate serumprøver, er trykt på hvert lysbilde. Dette gjør at to prøver fra samme pasient (for eksempel før og etter behandling) som skal sammenlignes på samme lysbilde, noe som minimerer interslide variabilitet. Trettito lysbilder med 64 individuelle pasientprøver rutinemessig behandles på samme tid i en dag. Den mest aktuelle matrisen skrives med 9 pinner, slik at for 162 antigener som skal skrives ut i to eksemplarer (hver pinne ut en 36 funksjon undergruppe som tilsvarer 18 antigener trykt i to eksemplarer).

De antigen mikromatriser som genereres i denne protokollen ble trykket med solide microarrayer nålene. Utskrift med solide pinner er mer tidkrevende enn utskrift med fjærpenn stil pins siden microarrayer må re-dip inn i kildeplaten etter hver tIME at pinnene berøre glideflate. Solid pins ble brukt som de produserer svært reproduserbare, nesten sirkulære array-funksjoner (ca. 500 mikrometer i diameter). Disse funksjonene kan lett oppdages og skissert av skannerprogramvaren, og minimalt med manuelle justeringer for å kvantifisere array-funksjoner. Solid pins også gi rom for cellelysatene som skal skrives ut, noe som kan være vanskelig å skrive med fjærpenn pins på grunn av sin høyere viskositet. På grunn av den lange utskrifts ganger involvert med solide pins (noen ganger 10 - 11 timer å skrive ut 70 lysbilder), antigener som ikke blir skrevet ut i kildeplaten er dekket med folie for å hindre fordamping.

Protokollen er beskrevet her presenterer en metode for å separere IgG- og IgM-reaktiviteter på den samme glideflate. Matriser har blitt optimalisert for å screene for både humane og muse-antistoffer ved hjelp av par av sekundære antistoffer merket med forskjellige fluoroforer. Kritisk til denne to-farge tilnærming er å identifisere secondary antistoffer som er svært spesifikke for enten IgG eller IgM-isotyper. De sekundære antistoffer som brukes gjenkjenner Fc-delen av IgG eller IgM, og ikke kryssreagerer med hverandre. Separering av IgG- og IgM-signaler er viktig gitt de forskjellige funksjonene til disse antistoffer i immunresponser. For eksempel er IgM produsert ved høyere nivåer av B1 celler og er typisk en markør for tidlig immunrespons. På den annen side, er IgG en markør på et senere immunrespons, som utvikler seg som et resultat av klasse bytte 14. Ved påvisning av IgG- og IgM-signaler hver for seg, er det også mulig å identifisere IgM reumatoidfaktorer i pasientprøver (dvs. IgM-immunoglobuliner som binder til IgG som er flekket på matrisen). Ved å fange opp ulike deler av antistoffer (f.eks Fc versus Fab), binding av revmatoid faktor til forskjellige IgG antistoff epitoper kan kvantifiseres. Med tilgjengeligheten av skannere med mer enn to lasere, ytterligere andreAry antistoffer kan bli lagt til den aktuelle sekundære antistoff par for å identifisere bindingen av IgA, IgD eller IgE-antistoffer. Sekundære antistoffer kan også bli identifisert som ville muliggjøre identifikasjon av forskjellige IgG-subklasser (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) bundet til antigener på en enkelt matrise.

I konklusjonen, er antigenet microarray teknikken en robust teknologi som åpner for high-throughput karakterisering av serum autoantistoffer. Denne teknikken er lett å tilpasse og følsom. Det fluorescerende-baserte deteksjonssystem har blitt optimalisert for både humane og musestudier og muliggjør samtidig deteksjon av IgG og IgM-antistoffer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ribosomal P0 Diarect 14100 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgG Jackson Immuno 009-000-003 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgM Jackson Immuno 009-000-012 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgG Sigma-Aldrich I5381 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgM Biolegend 401601 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
double-stranded DNA Sigma-Aldrich D1626 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
single-stranded DNA Sigma-Aldrich D8899 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
microarrayer Virtek VersArray Chipwriter Pro many types of arrayers are suitable
solid printing pins Arrayit Corporation SSP015
software for robotic microarrayer Virtek Chipwriter Pro 
FAST slides (2 Pad) GVS Northa America 10485317
FAST frame GVS Northa America 10486001
FAST incubation chambers (2 Pad) GVS Northa America 10486242
384 well plates Whatman 7701-5101
plate sealers VWR 60941-062
foil plate covers VWR 60941-124
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
Fetal calf serum Invitrogen 12483020
Cy3 goat anti-human IgG Jackson Immuno 109-165-096 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-human IgM Jackson Immuno 109-175-129 use working stock in 50% glyercol
Cy3 goat anti-mouse IgG Jackson Immuno 115-165-071 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-mouse IgM Jackson Immuno 115-175-075 use working stock in 50% glyercol
Microarray Scanner Molecular Devices Axon 4200A
Microarray software Molecular Devices Genepix 6.1
Clustering software eisenlab.org Cluster 3.0
Heatmap software eisenlab.org Treeview 1.60
Microarray statistical software Stanford University SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naparstek, Y., Plotz, P. H. The role of autoantibodies in autoimmune disease. Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).
  2. Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention. Autoimmun Rev. 14, 555-563 (2015).
  3. Robinson, W. H., et al. Autoantigen microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses. Nature. medicine. 8, 295-301 (2002).
  4. Quintana, F. J., et al. Antigen microarrays identify unique serum autoantibody signatures in clinical and pathologic subtypes of multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18889-18894 (2008).
  5. Hueber, W., et al. Antigen microarray profiling of autoantibodies in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 52, 2645-2655 (2005).
  6. Price, J. V., et al. Protein microarray analysis reveals BAFF-binding autoantibodies in systemic lupus erythematosus. J. Clin. Invest. 123, 5135-5145 (2013).
  7. Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 5116-5121 (2001).
  8. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14863-14868 (1998).
  9. Chruscinski, A., et al. Generation of Antigen Microarrays to Screen for Autoantibodies in Heart Failure and Heart Transplantation. PloS one. 11, e0151224 (2016).
  10. Price, J. V., et al. Characterization of influenza vaccine immunogenicity using influenza antigen microarrays. PloS one. 8, e64555 (2013).
  11. Singh, H., et al. Reactivity profiles of broadly neutralizing anti-HIV-1 antibodies are distinct from those of pathogenic autoantibodies. Aids. 25, 1247-1257 (2011).
  12. Porcheray, F., et al. Chronic humoral rejection of human kidney allografts associates with broad autoantibody responses. Transplantation. 89, 1239-1246 (2010).
  13. Haddon, D. J., et al. Mapping epitopes of U1-70K autoantibodies at single-amino acid resolution. Autoimmunity. 48, 513-523 (2015).
  14. Schroeder, H. W. Jr, Cavacini, L. Structure and function of immunoglobulins. J Allergy Clin Immunol. 125, S41-S52 (2010).
Generering av To-farge Antigen Mikromatriser for samtidig påvisning av IgG og IgM autoantistoffer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).More

Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter