Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Генерация двухцветного Antigen микрочипов для одновременного определения IgG и IgM Аутоантитела

doi: 10.3791/54543 Published: September 15, 2016

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. разбавляя Антигены и генерации Антиген Microarrays

  1. Развести антигены в PBS до конечной концентрации 0,2 мг / мл. Печать до 162 уникальных антигенов в двух экземплярах с конфигурацией microarrayer с 9-ю штырями. Включить IgG и IgM антигены в библиотеке антиген качестве положительного контроля. Включите PBS только в качестве отрицательного контроля.
  2. Добавьте 20 мкл каждого антигена к 384 источника луночного планшета. Добавьте антигены к исходной пластине в группах , которые отражают установки печатающей головки (например, договоритесь антигены групп 9 , когда 9 штырьков используются для печати).
  3. Крышка источника пластины с фольгой и заморозить при температуре -80 ° С до готовности к печати массивов.
  4. Очистки твердых microarrayer штифты, при инкубировании их в ультразвуковую ванну, с деионизированной водой в течение 3 х 1 мин. Место булавки в стойке, чтобы высохнуть, а затем организовать контакты в микрочипов печатающей головки. За 9 штырьков, используйте конфигурацию 3 х 3.
  5. Программа microarrayer для печати запуска путем установки цифровых контактов на печатающей головке,количество слайдов для печати, количество прокладок на каждом слайде, и количество повторных пятен для каждого антигена. Как правило, используют 9-контактный, 70 горок, 2 колодки / слайд и 2 дублирующие места для каждого антигена. Программа microarrayer на булавки в разрушать ультразвуком воде между различными группами антигенов.
  6. Оттепель пластины источника, а затем центрифуге пластины в течение 1 мин при 100 х г. Поместите источник пластину в назначенном месте в microarrayer. Удалите участок фольги, которая покрывает первую группу антигенов, которые будут напечатаны.
  7. Устройте непропечатанных скользит по поверхности arrayer и программы запуска печати. Печать слайдов при комнатной температуре с влажностью устанавливается на arrayer при 55 - 60% при сборке в увлажнителем машины массива.
  8. После того, как каждая группа антигенов печатается на всех слайдов, пауза microarrayer. Накройте антигены, которые были только что напечатанные с фольгой (для предотвращения испарения) и раскрыть следующую группу антигенов, которые будут напечатаны. Продолжить программу печати.
  9. После того, как все антигены были напечатаны, источник крышки плел с новым куском фольги и заморозить при температуре -80 ° С. Поместите напечатанные слайды в окне слайдов и вакуумное уплотнение. Слайды могут быть использованы на следующий день или до одного месяца позже.

2. Зондирование Antigen Microarrays с разбавленных сывороток

  1. Поместите слайды в кадры с использованием инкубационных камер. Добавить 700 мкл блокирующего буфера (2,5% [об / об] эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 0,1% [об / об] твин 20 в PBS) для каждой поверхности массива.
  2. Поместите клейкую пленку на раме и поместить в герметичный контейнер с куском влажной ткани. Выдержите O / N при 4 ° С на качалке.
  3. Развести образцы сыворотки 1: 100 в блокирующем буфере. Отберите блокирующего раствора из массивов и добавить 500 мкл разведенного образца к каждой поверхности массива.
  4. Покрытие с клейкой пленкой и инкубировать в течение 1 часа при 4 ° С с качалки.
  5. Развести вторичными антителами в блокирующем буфере. Для получения человеческих исследований, разбавьте Су3 меченый козий антитела против человеческого IgG до 0,33 мкг / мл, и Cy5 меченый козий анти-HUMAN IgM-антитела к 0,25 мкг / мл. Для исследований на мышах, разбавьте Су3 меченый козий против мышиного IgG антитела к 0,38 мкг / мл и Cy5 меченый козий анти-мышиных IgM-антител до 0,7 мкг / мл.
  6. Аспирируйте образцы из массивов и промыть поверхность массива 4 раза буфером для ополаскивания (0,1% Tween 20 в PBS). Налейте буфер на к слайдам и смахнуть быстро.
  7. Добавить 700 мкл блокирующего буфера, чтобы вымыть каждую поверхность массива и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре с качалки. Повторите шаг мыть два раза больше.
  8. Добавьте 500 мкл разведенной вторичного антитела к каждой поверхности скольжения и накрыть клейкой пленкой. Инкубировать 45 мин при 4 ° С с качалки.
  9. Отберите вторичной смеси антител с горками и прополоскать в 4 раза выше. Вымойте слайды 3 раза 700 мкл блокирующего буфера / разбавления, как указано выше.
  10. Удалить слайды из рамок и места в металлической стойке слайд, который погружают в PBS. Выдержите 20 мин при комнатной температуре с орбитальным встряхивании. Место в новом контейнере PBS и инкубировать еще 20 мв при встряхивании.
  11. Место слайд стойку в контейнере деионизованной воды 15 сек. Поместите стойку в новый контейнер с водой и инкубировать еще 15 сек.
  12. Для сухих слайдов, поместите слайд-штатив на пластине адаптера ELISA в центрифуге и спина при 220 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
  13. Поместите слайды в светонепроницаемый ящик до готовности для сканирования.

3. Сканирование Антиген Microarrays и экспортирование данных

  1. Сканирование слайдов с помощью сканера микрочипов, который может обнаружить Cy3 и Cy5 флуоресцентные сигналы. Для того, чтобы изменить уровень фотоэлектронный умножитель (ФЭУ) сканера в, предварительно отсканировать слайд, который был только испытанные с вторичными антителами.
    Примечание: Этот слайд должен иметь полную библиотеку антигена, напечатанный на нем в том числе положительных (IgG и IgM), а также отрицательного контроля (PBS). Предварительное сканирование является низкое разрешение сканирования, что позволяет пользователю быстро найти оптимальные настройки PMT.
  2. Установите значения PMT так, что IgG особенности человека (на канале Cy3) и гулН. особенности IgM (на канале Cy5), имеют аналогичные медианы интенсивности флуоресценции минус величина фонового (ПТР-B) (как правило, 40 000). Уровни PMT устанавливаются нажатием кнопки "аппаратного". После установки, сохранить эти настройки PMT постоянной.
  3. Сканирование экспериментальных скользит по двум каналам, нажав на кнопку "SCAN". Сохраните слайд-изображения (оба канала) после каждого сканирования.
  4. Загрузите слайд для анализа в программное обеспечение микрочипов с помощью кнопки "Файл".
  5. Загрузите файл списка массива генов (GAL) с помощью кнопки "Файл". Файл GAL имеет расположение массива с идентичностей функций массива.
  6. Поместите шаблон массива над отсканированного изображения таким образом, чтобы массивы функции соответствуют шаблону настолько близко, насколько это возможно.
  7. Совместите функции во всех блоках с шаблоном, нажав на кнопку "Align". Программа, как правило, найти схему круговых функций, но некоторые ручные корректировки могут быть необходимы, Эти поправки могут быть сделаны путем ввода в режим функции. Программное обеспечение будет вычислять MFI-B для каждого из антигенов.
  8. экспортировать эти результаты в виде текстового файла Используйте кнопку "Файл".

4. Анализ массива данных со значением анализа микрочипов (SAM)

  1. Загрузите отдельные текстовые файлы в Excel и идентифицировать столбцы, которые имеют MFI-B для каналов Cy3 и Cy5.
  2. Вычислить среднее значение для дублирующих функций.
  3. Для любого отрицательного MFI-B, заменить отрицательное число с 10. Преобразование данных путем деления сырой MFI-B на 100, а затем путем вычисления логарифма по основанию 2.
  4. Анализ лог - преобразованных данных со значением анализа микрочипов (SAM) , как описано выше 7.
  5. Для исследования с помощью двух групп (например, здоровых людей против пациентов), этикетки одна группа "1" и группа "2." Используйте два класса, непарный анализ в SAM, чтобы идентифицировать антигены, которые являются реакционные significantly отличается между двумя группами (Q значение <0,05).
  6. Используйте кластерами и теплогенерирующего-карта программное обеспечение , чтобы сделать изображения для презентации 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Антигены расположены в 384 - луночный планшет и распечатываются на предметные стекла с помощью роботизированной microarrayer , как показано на рисунке 1. Рисунок 2 показывает слайды помещается в рамку с инкубаторе и отсканированного слайда после обработки. На рисунке 3 показаны положительные и отрицательные контрольные слайды. Отрицательный салазки только зондируют вторичными антителами, а положительный контроль салазки зондируют с сывороткой от пациентов с системной красной волчанкой. При использовании двух отдельно меченого вторичного антитела, IgG и IgM реактивность могут быть разделены на том же слайд поверхности. На рисунке 4 показана интенсивность флуоресценции IgM антител против одноцепочечной ДНК (оцДНК) и IgG антитела к рибосомной P (Рибо P) в широком диапазон разведений сыворотки. В этом эксперименте положительной контрольной сыворотки от пациента с системной красной волчанкой с известной реактивности против рибо P использовалась. LinОтветы уха наблюдаются на канале IgM над всеми разведений сывороток. Линейные ответы наблюдаются на канале IgG вплоть до MFI-B приблизительно 30000. После этого момента, ответы начинают насыщать и увеличение антител к рибо P не приводит к соответствующему увеличению MFI-B. На рисунке 5 показано , как массивы могут быть использованы для обнаружения ревматоидного фактора в сыворотке крови человека. В этом исследовании использовали сыворотку от пациента с cryoglobulinemic васкулита с документированной ревматоидного фактора (IgM антитела против IgG) 167 МЕ / мл (нормальный <11 МЕ / мл). Использование вторичных антител в одиночку, не IgM реактивности не наблюдается по отношению к IgG, который пятнистой на массив. В отличие от этого , существенное IgM - реактивность (ПТР-B приблизительно 5000) обнаруживается против IgG , когда ползун зондируют с сывороткой от пациентов с ревматоидным фактором. На рисунке 6 показано развитие двухцветным антигена микрочипов для использования с мышиной сывороткой. На этой фигуре, мышиных IgM-йв пятнистый на массив обнаруживается только вторичным антителом против мышиного IgM и мыши IgG , который наносили на массив обнаруживается только вторичным антителом против мышиного IgG. На рисунке 7 показано выравнивание матричной сетки на сканируемом массив изображений с использованием программного обеспечения для анализа микрочипов. После того, как функции массива были приведены в соответствие с сеткой, характеристики массива могут быть проанализированы, чтобы получить медиана интенсивности флуоресценции минус фон для каждой функции.

Рисунок 1
Рисунок 1. Генерация антигензависимое Микроматрицы. Антигены сначала помещают в исходной пластине. В исходной пластины, показанной на чертеже, антигены расположены в группах по 9, соответствующие раскладку 3 х 3 печатающей головки штифтов. Источник пластина помещается в роботизированной microarrayer и антигены затем наносили на слайдах. В этом примере, 2-пусковой площадки ФАСТ горок аре используется, что позволяет для идентичных массивов , которые будут замечены на 2 нитроцеллюлозные поверхности. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Обработка Antigen Microarrays. Слайды помещаются в быстродвижущихся кадров с использованием инкубационных камер и обрабатываются путем добавления образцов , а затем вторичные антитела. Антиген реактивности выявлены с помощью сканера, способного обнаруживать флуоресцентные сигналы. Отсканированное изображение 2-пусковой площадки БЫСТРОГО слайда. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3 <бр /> Рисунок 3. Двухцветный Антиген Microarrays оптимизировано для использования с сывороток человека. (А) IgG, IgM и IgG Fc , обнаруживаются на массиве зондировали только с вторичными антителами. Эти три антигены положительного контроля, чтобы показать специфичность вторичных антител. Красной флуоресценции (IgM-канал) указывает на связывание антител к человеческим IgM вторичным антителом. Зеленой флуоресценции (IgG-канал) указывает на связывание антител к человеческим IgG вторичного антитела. Антиген Fc -области IgG бел из - за перенасыщения. (В) Многие другие реакционные детектируются на массиве зондировали положительной контрольной сыворотки от пациента с системной красной волчанкой с известной реакционной способности к Рибо P антигена. Прямоугольники указывают на места , где были выстроенные ДНК и Рибо P антигены. (С) Количественная интенсивностей флуоресценции в положительной контрольной сывороткой , показывает , что большинство реакционными антител против антигенов ДНК ИГМ изотипу. (D) Количественное интенсивностей флуоресценции в положительной контрольной сывороткой , показывает , что большинство реакционными антител против Рибо P антигенов являются изотип IgG. Возможности массивов замечены в двух экземплярах и приблизительно 500 мкм в диаметре. Графики показывают среднее значение ± SD для функций массива. дц, двухцепочечной ДНК; оцДНК, одноцепочечной ДНК; MFI-B, медианная интенсивность флуоресценции минус фон; Рибо P, рибосомальная P. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. интенсивности флуоресценции по сравнению с разбавление сыворотки фактор. (А) MFI-В в широком диапазоне разведений сывороток показан на IgM против одноцепочечной ДНК и IgG против рибо P. Для нихЭксперименты, использовали положительный контроль сыворотки с известным IgG реактивность против RIBO P и оцДНК. MFI-Б насыщается при значении приблизительно 65000. (Б) Log2 преобразование данных MFI-B показывает линейные отклики на обоих каналах IgG и IgM в широком диапазоне антиген реакционными. За MFI-B 30000, то IgG сигнал начинает насыщаться и теряет линейность. Возможности массивов были замечены в 6 повторах. Графики показывают среднее значение ± SD для функций массива. оцДНК, одноцепочечной ДНК; MFI-B, медианная интенсивность флуоресценции минус фон; Рибо P, рибосомальная P. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Обнаружение ревматоидного фактора с Двухцветный Antigen микрочипов. (В) Массив зондировали с сывороткой от пациентов с cryoglobulinemic васкулит с высоким ревматоидным фактором. Функция IgG является зелено-желтого цвета из-за связывания IgM в сыворотке крови пациента с иммобилизованным IgG. Интересно, что этот пациент также имеет IgG антитела против IgM, так как функция IgM появляется оранжевый цвет. Пациент также имеет историю врожденных пороков сердца и отмечается иметь высокую реактивность к сердечной белка тропонина С (С) Количественное IgG и IgM особенности на массиве зондировали только с вторичными антителами показывает , что вторичные антитела не имеют любой перекрестную. (D) Количественнаяиз особенностей IgG и IgM в массиве зондировали с сывороткой пациента подтверждает наличие ревматоидного фактора. Особенности разысканы в двух экземплярах и приблизительно 500 мкм в диаметре. Графики показывают среднее значение ± SD для функций массива. MFI-B, медианная интенсивность флуоресценции минус фон. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6. Развитие двухцветного Массивы профиль Mouse сывороточных антител. (A) Массив зондировали только с вторичными антителами. Красной флуоресценции указывает на связывание вторичного антитела против мышиного IgM. Зеленая флуоресценция указывает на связывание вторичного антитела против мышиного IgG. IgG мыши, которая была замечена на массив обнаруживается только анти-МОВС.Е. IgG вторичного антитела, а мышиных IgM, который замечен обнаруживается только вторичным антителом против мышиного IgM. Другие особенности на массивах, которые обнаруживаются вторичными антителами являются захват антитела против IgG мыши или мышиных IgM. (В) Массив зондировали мышиной IgG моноклональных антител против гистидиновых тегов. На этом массиве, рибо Р антиген (рекомбинантный His-меченый белок) зеленого цвета, что указывает, что он обнаруживается только вторичным антителом против мышиного IgG. Это, как ожидается, учитывая, что моноклональные антитела изотипа IgG. Антиген Рибо P не обнаруживается , когда массивы зондировали только вторичными антителами (оранжевая коробка). (С) Количественная IgG, IgM и Рибо P функции на массиве зондировали мышиной IgG моноклональных антител против гистидиновых тегов. Возможности массивов замечены в шести повторах и приблизительно 500 мкм в диаметре. Графики показывают среднее значение ± SD для функций массива. MFI-B, медиана плавиковогоценции интенсивность минус фон; Рибо P, рибосомальная P. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7
Рисунок 7. Выравнивание шаблона сетки на матрицу изображения. В этом скриншоте, шаблон сетки, который был создан из файла гал, был приведен в соответствие с ранее отсканированного антигеном микрочипов. Массив зондировали с сывороткой от пациентов с системной красной волчанкой и свертыванием крови, который имел много аутоантител реакционной способности. Зеленый флуоресцентный представляет связывание IgG антител и красной флуоресценции представляет связывание IgM антител. Функции, напечатанные сплошными штифтами, почти круглую форму и легко изложены программным обеспечением микрочипов (Genepix). После выравнивания сетки завершена, Softwarе можно вычислить медиану интенсивности флуоресценции минус фон (на обоих каналах Cy3 и Cy5) для каждой из функций массива. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Протокол, описанный здесь, позволяет для количественного определения аутоантител с использованием метода антигена микрочипов. Антиген микрочипов имеют ряд преимуществ по сравнению с традиционным методом ELISA в скрининг на аутоантитела. Во-первых, различные антигены, включая нуклеиновые кислоты, белки, пептиды, и клеточные лизаты могут быть выстроены на слайдах нитроцеллюлозные покрытием, что позволяет мультиплексированных скрининг аутоантител. Кроме того, только микрограмм антигена необходимы для создания массивов, так как нанолитров антигена пятнистый на каждом слайде. Массивы также требуют очень небольшого количества образца пациента, так как только 5 мкл сыворотки необходимо прозондировать поверхность массива на 1: 100 разбавления образца. И, наконец, массивы наносили на нитроцеллюлозу , как было показано, более чувствительны , чем обычные ELISA при скрининге аутоантител 9.

В дополнение к использованию антигена микрочипов для скрининга аутоантител, массивы могут быть использованыd обнаружить реактивность против неавтомодельных белков (например, вирусные белки), чтобы определить специфичность моноклональных антител, а также для измерения уровней не-HLA антител в трансплантации , как описано выше 9-12. Антиген-микрочипов также могут быть использованы для проведения экспериментов картирования эпитопов детализированный где перекрывающие пептиды одного белка выстроены на слайд. В недавнем исследовании использовали этот подход для определения эпитопов белка U1-70K , которые являются объектами аутоантител при системной красной волчанке 13.

Используя протокол, описанный здесь, обнаружение IgG и IgM реакционными линейна в широком диапазоне разведений сыворотки. Эти исследования были проведены с использованием положительного контроля сыворотку от пациента с системной красной волчанкой с известной реакционной способности к рибосомной P антигена и оцДНК. IgM-реактивность по отношению к одноцепочечной линейна при разведений сывороток от 1: 125 до 1: 32000, что соответствует MFI-B 17000 до 50. IgG реакционной способностиРибо Р линейна при разведений сывороток от 1: 4000 до 1: 512000, что соответствует MFI-B 32000 до 200. При разбавлении ниже 1: 4000 (и MFI-B больше, чем 32000), кривой обнаружения IgG реактивности Спрямлять нет и больше не линейны. В работе с получателями по пересадке сердца, сыворотка обычно разбавляют до 1: 100 в качестве ИТР-Б для антигенов, редко превышает 10000 при этом разведении. Для исследований с пациентами с аутоиммунным заболеванием с высоким титром аутоантител, образцы пациентов, возможно, должны быть ослаблены далее, чтобы гарантировать, что большинство аутоантител реакционными попадают в пределах линейного диапазона анализа.

В то время как MFI-В может быть полезным для сравнения аутоантител между группами реактивности пациентов, она также может быть полезным для преобразования этого значения в более количественную меру уровня аутоантител. Это может быть достигнуто путем выявления нескольких известным разведений очищенного IgG и IgM на слайдах для получения стандартной кривой. Используя эту кривую, ИТР-В может затем быть трансформируют в уровне аутоантител для каждого антигена.

В протоколе, представленном здесь, были использованы 2-пусковой площадки слайдов нитроцеллюлозные покрытием. На этих слайдах, два одинаковых массивов, которые могут быть проверены с двумя отдельными образцами сыворотки, печатаются на каждый слайд. Это позволяет два образца из того же самого пациента (например, до и после лечения) в сравнении с тем же слайде, что сводит к минимуму interslide изменчивость. Тридцать два слайды с 64 отдельных образцов пациентов обычно обрабатываются одновременно в один день. Самый последний массив печатается с 9 штырьками, что позволяет на 162 антигенов, которые будут напечатаны в двух экземплярах (каждый штырь печатает 36 особенность подмассив которая равна 18 антигенов, напечатанные в двух экземплярах).

Антиген микрочипы, сгенерированные в этом протоколе были напечатаны с твердыми microarrayer штифтами. Печать с твердыми штифтами занимает больше времени, чем печать с булавками гусиным стиле, так как microarrayer должен повторно купанием в исходной пластине после каждого тIME, что контакты касаются поверхности скольжения. Твердые штифты были использованы, поскольку они производят с высокой воспроизводимостью, почти круговой характеристики массива (приблизительно 500 мкм в диаметре). Эти функции могут быть легко обнаружены и наметил программным обеспечением сканера, а минимальные ручные настройки необходимы для количественной характеристики массива. Твердые штифты позволяют также клеточные лизаты для печати, которая может быть трудно печатать с гусиными штифтов из-за их более высокой вязкости. Из-за долгого времени печати, связанных с твердыми штифтами (иногда 10 - 11 ч, ​​чтобы напечатать 70 слайдов), антигены, которые не напечатаны в исходной пластины покрыты фольгой для предотвращения испарения.

Протокол, описанный здесь, представляет собой способ, чтобы отделить IgG и IgM на реакционную способность же слайд поверхности. Массивы были оптимизированы для скрининга человеческих и мышиных антител с использованием пары вторичных антител, меченных различными флуорофоров. Решающее значение для этого двухцветного подхода заключается в определении Secondary антитела, которые являются весьма специфическими для либо IgG или IgM изотипов. Вторичные антитела, которые используются признают часть Fc IgG или из IgM и не вступают в перекрестную реакцию друг с другом. Разделение сигналов IgG и IgM важно, учитывая различные функции этих антител в иммунных реакциях. Например, IgM, производится на более высоких уровнях В1 клеток и, как правило, является маркером раннего иммунного ответа. С другой стороны, IgG , является маркером более поздней иммунного ответа, который развивается в результате класса коммутации 14. При обнаружении сигналов IgG и IgM в отдельности, также возможно идентифицировать IgM ревматоидные факторы в образцах пациента (то есть, IgM или иммуноглобулины , которые связываются с IgG , который был замечен на массив). Путем пятнистость различных частей антител (например, Fc - против Fab), связывание ревматоидного фактора на различные эпитопы IgG антител может быть определена количественно. При наличии сканеров с более чем двух лазеров, дополнительный второйичные антитела могут быть добавлены к текущей пары вторичные антитела для выявления связывания IgA, IgD или IgE антител. Вторичные антитела также могут быть идентифицированы, что позволило бы для идентификации отдельных IgG подклассов (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), связанного с антигенами на одном массиве.

В заключение отметим, что метод антиген микрочипов является надежная технология позволяет обеспечить высокую пропускную способность характеристик сыворотки аутоантител. Этот метод является очень настраиваемый и чувствительным. Система обнаружения флуоресцентный основе была оптимизирована для исследований как человека и мыши и позволяет одновременного определения IgG и IgM антител.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ribosomal P0 Diarect 14100 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgG Jackson Immuno 009-000-003 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgM Jackson Immuno 009-000-012 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgG Sigma-Aldrich I5381 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgM Biolegend 401601 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
double-stranded DNA Sigma-Aldrich D1626 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
single-stranded DNA Sigma-Aldrich D8899 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
microarrayer Virtek VersArray Chipwriter Pro many types of arrayers are suitable
solid printing pins Arrayit Corporation SSP015
software for robotic microarrayer Virtek Chipwriter Pro 
FAST slides (2 Pad) GVS Northa America 10485317
FAST frame GVS Northa America 10486001
FAST incubation chambers (2 Pad) GVS Northa America 10486242
384 well plates Whatman 7701-5101
plate sealers VWR 60941-062
foil plate covers VWR 60941-124
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
Fetal calf serum Invitrogen 12483020
Cy3 goat anti-human IgG Jackson Immuno 109-165-096 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-human IgM Jackson Immuno 109-175-129 use working stock in 50% glyercol
Cy3 goat anti-mouse IgG Jackson Immuno 115-165-071 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-mouse IgM Jackson Immuno 115-175-075 use working stock in 50% glyercol
Microarray Scanner Molecular Devices Axon 4200A
Microarray software Molecular Devices Genepix 6.1
Clustering software eisenlab.org Cluster 3.0
Heatmap software eisenlab.org Treeview 1.60
Microarray statistical software Stanford University SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naparstek, Y., Plotz, P. H. The role of autoantibodies in autoimmune disease. Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).
  2. Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention. Autoimmun Rev. 14, 555-563 (2015).
  3. Robinson, W. H., et al. Autoantigen microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses. Nature. medicine. 8, 295-301 (2002).
  4. Quintana, F. J., et al. Antigen microarrays identify unique serum autoantibody signatures in clinical and pathologic subtypes of multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18889-18894 (2008).
  5. Hueber, W., et al. Antigen microarray profiling of autoantibodies in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 52, 2645-2655 (2005).
  6. Price, J. V., et al. Protein microarray analysis reveals BAFF-binding autoantibodies in systemic lupus erythematosus. J. Clin. Invest. 123, 5135-5145 (2013).
  7. Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 5116-5121 (2001).
  8. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14863-14868 (1998).
  9. Chruscinski, A., et al. Generation of Antigen Microarrays to Screen for Autoantibodies in Heart Failure and Heart Transplantation. PloS one. 11, e0151224 (2016).
  10. Price, J. V., et al. Characterization of influenza vaccine immunogenicity using influenza antigen microarrays. PloS one. 8, e64555 (2013).
  11. Singh, H., et al. Reactivity profiles of broadly neutralizing anti-HIV-1 antibodies are distinct from those of pathogenic autoantibodies. Aids. 25, 1247-1257 (2011).
  12. Porcheray, F., et al. Chronic humoral rejection of human kidney allografts associates with broad autoantibody responses. Transplantation. 89, 1239-1246 (2010).
  13. Haddon, D. J., et al. Mapping epitopes of U1-70K autoantibodies at single-amino acid resolution. Autoimmunity. 48, 513-523 (2015).
  14. Schroeder, H. W. Jr, Cavacini, L. Structure and function of immunoglobulins. J Allergy Clin Immunol. 125, S41-S52 (2010).
Генерация двухцветного Antigen микрочипов для одновременного определения IgG и IgM Аутоантитела
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).More

Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter