Summary
Drosophila en zoogdieren hematopoietische systemen hebben veel gemeenschappelijke kenmerken, waardoor Drosophila een aantrekkelijke genetische model om hematopoiese te bestuderen. Hier laten we dissectie en montage van grote larvale hematopoëtische organen voor immunohistochemie. We beschrijven ook werkwijzen om verschillende larvale hematopoietische compartimenten waaronder circulerende hemocytes sessiele kristalcellen testen.
Abstract
Vele parallellen tussen de Drosophila en zoogdierlijke bloedvormende organen, hoewel niet de Drosophila lymfoïde oorsprong die zoogdieren adaptieve immuniteit karakteriseren. Drosophila en zoogdieren hematopoiese voorkomen in ruimte en tijd verschillende fasen verschillende bloedcellijnen produceren. Beide systemen onderhouden reservoirs van bloedcel voorlopers waarmee uit te breiden of te vervangen volwassen geslachten. Het hematopoietische systeem maakt Drosophila en zoogdieren te reageren op en aan te passen aan immune uitdagingen. Belangrijk is dat de transcriptie regulatoren en signaalwegen dat de productie, het onderhoud, en de functie van het hematopoietische systeem te bedienen zijn geconserveerd uit vliegt naar zoogdieren. Deze overeenkomsten laten Drosophila worden gebruikt om genetisch model hematopoietische ontwikkeling en ziekte.
Hier hebben we detail assays voor het hematopoietische systeem van Drosophila larven te onderzoeken. InVooral schetsen we methoden om bloedcellen nummers en concentratie te meten, visualiseren een specifiek volwassen afkomst in vivo, en het uitvoeren van immunohistochemie op bloedcellen in omloop en in de hematopoietische orgel. Deze testen kunnen veranderingen in genexpressie en cellulaire processen waaronder signalering, overleving, proliferatie en differentiatie zichtbaar en kan worden gebruikt om een verscheidenheid van vragen met betrekking hematopoiese onderzoeken. Gecombineerd met de genetische hulpmiddelen in Drosophila, kunnen deze assays worden toegepast om het hematopoëtische systeem van gedefinieerde genetische veranderingen te evalueren. Hoewel niet specifiek hier beschreven, kunnen deze bepalingen ook worden gebruikt voor kwantificering van de veranderingen, zoals infectie of voeding, van het hematopoietische systeem te onderzoeken.
Introduction
De complexe mechanismen reguleren van de transcriptiefactoren en signaalroutes die de ontwikkeling van het hematopoietische systeem dat storingen in hematologische ziekten coördineren blijven slecht begrepen. Deze transcriptiefactoren signaalbanen, en hun regulatie, zijn sterk geconserveerd tussen Drosophila en zoogdieren hematopoiese 1-5. Dus de Drosophila hematopoëtische systeem vormt een uitstekende genetisch model om de moleculaire mechanismen die hematopoiese en onderliggende hematologische ziektes bepalen.
Soortgelijke zoogdieren, Drosophila genereren bloedcellen, genaamd hemocytes in ruimte en tijd verschillende fasen van hematopoiese. Traditioneel werd gedacht Drosophila hematopoiese te beperken tot fasen in de embryonale mesoderm en het larvale lymfeklier. Recente studies bewijzen dat hematopoiese komt ook voor in larvale wintereik clusters en in de volwassen buik 6-8. Alle hematopoietische fasen produceren twee soorten volwassen hemocytes: plasmatocytes en kristal cellen. Plasmatocytes zijn macrofaag-achtige cellen betrokken bij fagocytose, aangeboren immuniteit en wondgenezing. Kristalcellen bevatten pro-fenoloxidasen nodig melanisatie, een reactie die in insectencellen immuunresponsen en wondgenezing. Larvale hematopoiese kan een derde volwassen hemocyte soort genereren, een zogenaamde lamellocyte, als reactie op bepaalde immuun uitdagingen, zoals de sluipwesp infectie 9,10. Lamellocytes zijn groot, hechtende cellen die functioneren in samenhang met plasmatocytes en kristal cellen, te integreren en te neutraliseren gelegd in Drosophila larven wesp eieren. Aangezien parasitering worden lamellocytes niet gevonden in wildtype larven. Melanotisch massa's lijken gemelamineerde, ingekapselde wesp eieren; vele Drosophila mutant stammen ontwikkelen melanotisch massa in afwezigheid van parasitering. De aanwezigheid van Lamellocyten en / of melanotisch massa's kan een indicatie van hematopoietische afwijkingen zijn. In feite heeft de melanotisch massa fenotype gebruikt om genen en routes die betrokken zijn bij hematopoiese 11-14 identificeren.
Het larvale hematopoietische systeem is het meest uitgebreid bestudeerd tot nu toe. Het bestaat uit hemocytes circuleert in de hemolymfe, zittend hemocyte clusters gevormd onder de opperhuid en hemocytes die in de lymfeklier. De lymfeklier is een reeks bilaterale lobben aan de dorsale vat. Elke primaire kwab van de lymfeklier is verdeeld in drie belangrijke zones. De buitenste zone staat bekend als de corticale zone en bevat rijpen hemocytes. De binnenste zone wordt het medullaire zone genoemd en bestaat uit zwakke hemocyte precursors. De derde zone, het achterste signalering centrum, is een kleine groep cellen aan de basis van de lymfeklier die fungeren als stamcelachtige niche. Vroeg werk opgericht kritische functies voor Notch 15-18 19,20, JAK-STAT 18 en Vleugelloze 21 activiteit larvale lymfeklier ontwikkeling reguleren. Meer recente studies hebben aangetoond dat 22 BMP, FGF-Ras 23 en Hippo 24.25 signalering ook functioneert binnen de larvale lymfeklier.
Vier larvale hematopoietische assays geschetste beschrijven 1) het meten van circulerende hemocyte concentratie, gedefinieerd als het aantal cellen per volume-eenheid, 2) het isoleren en fixeren circulerende hemocytes voor immunohistochemie, 3) visualiseren crystal cellen in vivo, en 4) het ontleden, het bevestigen en mounting lymfeklieren voor immunohistochemie. Deze testen kunnen worden gebruikt als hematopoietische uitlezingen de functies en voorschriften van signaaltransductiewegen in het larvale hematopoietische systeem te beoordelen. Hoewel deze werkwijzen die eerder in het veld zijn gebruikt, is beelddocumentatie van deze testen pas onlangs begonnen 8,26-30. Verschillende publicaties hier aangehaald zijn hulpful middelen beschrijven gelijkaardige methodes en hematopoietische markers 26,31-33. Bovendien, Trol en Viking zijn nuttige markers van de lymfeklier basaal membraan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Circulerende hemocyte Concentratie
- Om larven van ruwweg hetzelfde ontwikkelingsstadium te krijgen voor deze test beperken eierverzameling doordat vrouwtjes om eieren te leggen voor een vaste periode van 2-6 uur.
- Verzamel larven ontleden schotel putjes gevuld met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, tabel 1).
- Voor elke larve, plaats 10 pi 1x PBS in een microcentrifugebuis op ijs en 10 pi 1x PBS op een schone dissectie pad. Plaats de dissectie pad op een verlichte stereomicroscoop basis.
- Droog een individuele larve door het op een tissue af te vegen voordat overdraagt aan een PBS druppel op de dissectie pad.
- Met behulp van een pincet voorzichtig openscheuren en voorzichtig omkeren de cuticula naar de hemolymfe vrij te geven.
LET OP: Wees voorzichtig niet te schrapen of jab de cuticula als deze potentieel ongesteeld hemocytes 29 kunnen vrijkomen. - Met behulp van een pipet, het verzamelen van de hemolymfe uit de dissectie pad. Vermijd collecting larvale vuil zoals het vet lichaam.
- Voeg de hemolymfe naar een microcentrifugebuis en meng door en neer te pipetteren.
OPMERKING: Meerdere monsters kunnen worden verzameld in een keer en op ijs bewaard tot een uur. - Optioneel: Meng trypan blauw met de hemolymfe monster in gelijke delen te verven en te sluiten dode cellen. Aantal cellen in 3 minuten van het toevoegen trypan blauw omdat het giftig is voor cellen.
- Meng het monster door en neer te pipetteren voordat 10 pi in een hemocytometer kamer.
- Bij gebruik van een geautomatiseerde cel tegen te gaan, stellen de juiste parameters voor celgrootte en circulariteit. Bijvoorbeeld een minimumaantal celgrootte van 2 urn, een maximale celgrootte van 22 urn en een circulariteit van 75-80% rondheid normale ronde hemocytes 34 detecteren. Experimenteren met verschillende parameters groter en spoelvormig hemocytes zoals lamellocytes detecteren. U kunt ook gebruik maken van een hemocytometer om hemocytes handmatig tellen.
2. Circulating hemocyte Immunohistochemie
- Om larven van ruwweg hetzelfde ontwikkelingsstadium te krijgen voor deze test beperken eierverzameling doordat vrouwtjes om eieren te leggen voor een vaste periode van 2-6 uur.
- Plaats een dekglaasje in elk putje van een 6- of 12-well plaat.
OPMERKING: Vierkante dekglaasjes (22 mm) passen in 6-well platen en rond dekglaasjes (18 mm diameter) passen in 12-well platen. - Verzamel larven in ontleden schotel putten gevuld met 1x PBS.
- Plaats 5 pl 1x PBS in het midden van elke dekglaasje.
- Plaats de plaat op een verlichte stereomicroscoop basis.
- Droog een individuele larve op een tissue af te vegen en vervolgens plaatsen in de PBS op het dekglaasje.
- Met behulp van een pincet voorzichtig scheuren en zorgvuldig keren de cuticula. Voor het verwijderen van de larvale karkas, gebruik deze om de hemolymfe gelijkmatig verspreid.
LET OP: Wees voorzichtig niet te schrapen of jab de cuticula als deze potentieel ongesteeld hemocytes 29 kunnen vrijkomen. - REPEAT voor alle larven, het verzamelen van de hemolymfe van een larve per dekglaasje. Sta hemocytes te houden aan de dekglaasjes 5 -. 8 min bij kamertemperatuur KT Niet meer dan 30 minuten voor fixatie.
- Fix hemocytes door toevoeging van 5 ul van 7,5% formaldehyde (tabel 1) aan elk dekglaasje gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Wassen dekglaasjes driemaal met 1x PBS. Tip de plaat en zuig PBS na elke wasbeurt. Om run-off van de permeabilisatie oplossing in de volgende stap te voorkomen, gebruikt u de aspirator om overtollige PBS uit omtrek van de dekglaasjes te verwijderen.
- Voeg 100 ul permeabilisatie oplossing (tabel 1) aan elk dekglaasje gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Tip en klop de plaat aan de permeabilisatie oplossing te zuigen.
- Verdun primair antilichaam met antilichaamoplossing (Tabel 1) volgens de specificaties provider. Voeg ten minste 500 ui primaire antilichaamoplossing voor dekglaasjes in 12-well platen.Voeg ten minste 1,5 ml in 6-well platen. Incubeer bij 4 ° C overnacht.
- Verwijder de primaire antilichaamoplossing en wassen dekglaasjes met 1x PBS gedurende 10 minuten op een rondschudapparaat, driemaal.
- Verdun secundair antilichaam met antilichaam oplossing volgens de specificaties van provider. Voeg ten minste 500 ul secundair antilichaam oplossing dekglaasjes in 12-well platen. Voeg ten minste 1,5 ml voor 6-well platen. Incubeer gedurende ten minste 2 uur bij KT.
- Verwijder de secundaire antilichaamoplossing en wassen dekglaasjes met 1x PBS gedurende 10 minuten op een schudapparaat als in stap 2,10, driemaal.
- Tijdens de wasstappen schone glazen microscoopglaasjes met 70% ethanol (Tabel 1) met behulp van weefsel doekjes. Voor elke dekglaasje plaatst 5 gl montage buffer (Tabel 1) op het glaasje.
OPMERKING: Twee dekglaasjes passen op één dia. - Zuig het uiteindelijke PBS wassen.
- Gebruik een tang om de dekglaasjes voorzichtig verwijderen van de platen en plaats, inverted bovenop de montage buffer.
Noot: Objectglaasjes kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C voorafgaand aan de beeldvorming. Opslagduur afhankelijk van de stabiliteit van de gebruikte antilichamen. 6- en 12-putjes worden gewassen en opnieuw gebruikt.
3. In vivo Crystal Cell melanisatie
- Om larven van ruwweg hetzelfde ontwikkelingsstadium te krijgen voor deze test beperken eierverzameling doordat vrouwtjes om eieren te leggen voor een vaste periode van 2-6 uur.
- Voordat u begint, stel een warmtebron bij 60 ° C.
OPMERKING: een thermocycler programma van 60 ° C gedurende 10 minuten (gevolgd door een ruim 25 ° C) het beste werkt, maar een waterbad of een andere warmtebron is voldoende zolang de warmte consistent en gelijkmatig wordt verdeeld over elke larve. - Verzamel larven ontleden schotel putjes gevuld met 1x PBS (tabel 1).
- Een tegelijk drogen een larve op een tissue wipe en plaats op de bodem van een PCR buis. Plaats elke larvein een aparte PCR buis. (Zie Figuur 3A).
- Voor consistente resultaten, om het verblijf van larven op de bodem van de PCR buizen door koelen larven in de buizen bij 4 ° C gedurende 10-15 min en / of voorzichtig tikken de buizen vóór het verwarmen.
- Plaats de PCR-buizen in de thermische cycler (of waterbad). Verhit bij 60 ° C gedurende 10 minuten.
- Verwijder voorzichtig larven uit de PCR-buizen in het ontleden schotel putten gevuld met verse 1x PBS.
- Droge larven op een tissue wipe en regelen op een vlakke ondergrond voor beeldvorming onder een stereomicroscoop.
- beelden van larven Score blindelings door meerdere personen.
4. larvale lymfeklier Immunohistochemie
OPMERKING: De lymfeklier ligt ongeveer een derde lengte vanaf het voorste uiteinde van een larve iets onder de hersenen op de rugzijde. (Zie pijl in figuur 3B.) De lymfeklier flankeert de dorsale vat en wordt het gemakkelijkst ontleed aan de mond hooks of de hersenen. Wildtype, derde instar lymfeklieren zijn zeer kleine; de primaire lobben ongeveer 100-200 urn lang. (Zie figuur 4A).
- Om larven van ruwweg hetzelfde ontwikkelingsstadium te krijgen voor deze test beperken eierverzameling doordat vrouwtjes om eieren te leggen voor een vaste periode van 2-6 uur.
- Lymfeklier dissectie
- Voor elke experimentele conditie, voeg 1 ml 1x PBS (tabel 1) op een putje van een 24-wells plaat.
- Voeg 1 druppel 0,1% PBST (tabel 1) aan elk putje met een wegwerpbare pipet overdracht.
OPMERKING: Detergens, zoals Tween 20, toegevoegd aan de oppervlaktespanning te verlagen, waardoor het weefsel zinken naar de bodem van de put. - Plaats de plaat plat op het ijs.
- Verzamel larven in ontleden schotel putten gevuld met 1x PBS.
- Plaats een schone dissectie pad op een verlichte stereomicroscoop basis. Gebruik een wegwerp overdracht pipet smal te plaatsenl daalt van 0,01% PBST (tabel 1) op het pad. Transfer een larve van een PBST druppel voor dissectie.
- Houd de larve met een pincet ongeveer een kwart lengte vanaf het achterste einde, dorsale kant naar boven.
- Gebruik een andere tang te grijpen de cuticula onmiddellijk anterior aan de tang dat zijn bedrijf de larve. Trek de cuticula in de richting van het voorste einde totdat de mond haken worden blootgesteld.
NB: Het doel is om de cuticula te pellen zonder interne structuren te verstoren. - Laat de cuticula en gebruik zowel een tang om de larve in tweeën geknipt. Verwijder het achterste einde van de PBST druppel.
LET OP: Als de cuticula helemaal niet schil om de mond te haken, snijd de larve in tweeën en verwijder de achterste einde. Met een pincet naar de rand van de cuticula houden en gebruiken andere pincet de mondhaken duwen door de opening. Dit zal de cuticula omkeren en bloot de mond haken. Dit kan worden gebruikt als alternaten dissectie methode ook. - Met een pincet vast te pinnen de cuticula (ofwel de ventrale cuticula, de dorsale cuticula flap of beide) voor stabiliteit.
- Gebruik een pincet om de blootgestelde mond haken grijpen en trek ze uit.
LET OP: Dit zal de cuticula scheiden van de interne structuren. In het ideale geval zal de ogen / antennaal verbeelding schijven, hersenen, ring klier, en lymfeklier aan weerszijden van de dorsale schip naar de mond haken gehecht blijven. - Terwijl u nog steeds de mond haken, verwijder voorzichtig ongewenste structuren zoals de speekselklieren, dikke lichaam, en darm.
NB: Als de hersenen scheidt van de mond haken, de lymfeklier kan nog worden bevestigd aan en verzameld met de hersenen. In dit geval houdt de ventrale zenuwkoord plaats van de mond haken. - Via de mond haken of ventrale zenuwkoord als handvat, overdragen ontleed complex dat de lymfeklier het goed op ijs. Niet meer dan 30 minvoor fixatie.
- Fixatie en immunohistochemie
- Plaats de 24-well plaat op de stereomicroscoop basis.
- Gebruik een p200 pipet om de PBST verwijder voorzichtig uit de put.
LET OP: Lege, naburige putten zijn nuttig om afval tijdelijk storten. - Voorzichtig voeg 200 ul 3,7% formaldehyde (Tabel 1) langs de zijkant van de put en schud de plaat zodat de ontleed weefsel volledig ondergedompeld.
- Zet de plaat ijs gedurende 30 min. Als de lymfeklieren te uiten fluorescerend eiwit (s), houden de plaat afgedekt om fotobleken te voorkomen.
- Gebruik een p200 pipet om verwijder voorzichtig de fixeermiddel.
- Wassen door toevoeging van 200 pl 1x PBS naar de bron en het plaatsen van de plaat op een orbitale schudder gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik een p200 pipet om voorzichtig verwijderen van de PBS.
OPMERKING: Vaste lymfeklieren kan worden gelaten op ijs in PBS tot lymfeklieren voor alle experimentele omstandigheden zijn dissected en gefixeerd. - Herhaal het wassen stappen nog twee keer.
- Voeg 200 ul permeabilisatie oplossing (tabel 1) aan de put. Zet de plaat op een orbitale schudder gedurende 45 min bij kamertemperatuur.
OPMERKING: 45 min is de "gouden standaard" voor lymfeklier permeabilisatie maar de auteurs succes na 20 min. - Verwijder de oplossing met een p200 pipet.
- Verdun primair antilichaam met antilichaamoplossing (Tabel 1) volgens de specificaties provider. Voeg 300 ul primaire antilichaam oplossing voor het goed en ervoor te zorgen dat de ontleed weefsels volledig ondergedompeld. Incubeer bij 4 ° C overnacht.
- Gebruik een pipet P200 aan het primaire antilichaam te verwijderen.
- Wassen door toevoeging van 200 pl 1x PBS naar de bron en het plaatsen van de plaat op een orbitale schudder gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Gebruik een p200 pipet om voorzichtig verwijderen van de PBS.
- Herhaal het wassen stappen nog twee keer.
- Verdun een secundairentibody met antilichaam oplossing volgens de specificaties van provider. Voeg 300 ul secundair antilichaam oplossing voor het goed en ervoor te zorgen dat de ontleed weefsels volledig ondergedompeld. Incubeer op een orbitale schudinrichting gedurende ten minste 2 uur bij KT.
- Gebruik een p200 pipet om het secundaire antilichaam te verwijderen en te wassen, zoals beschreven in de stappen 4.3.12 en 4.3.13. Laat de PBS niet verwijderen nadat de laatste wasbeurt.
- Lymfeklier montage
- Schone glazen microscoopglaasjes gebruik 70% ethanol (Tabel 1) en weefsel doekjes.
- Voor elke experimentele conditie plaats één druppel montage buffer (Tabel 1) op het glaasje.
LET OP: twee voorwaarden passen op één dia. Montage buffervolume afhankelijk van het aantal lymfeklieren te monteren. Gebruik 2 pi ongeveer 18-20 lymfeklieren, 1 ui van 10 - 12 en 0,5 ul van 5 of minder. - Plaats de microscoop dia op een verlichte stereomicroscoop basis.
- Voor maximaal twee voorwaarden tegelijk overdragen alle lymfeklieren uit de put op de montageplaat buffer met een tang, met de mond haken of ventrale zenuwkoord als handvat.
- De ruimte ontleed weefsel gelijkmatig in een ronde of rechthoekige vorm, spreiden de montage buffer in de werkwijze.
- Voor elk van de ontleed weefsel, individueel, schuift een tong van de forceps onder de dorsale vat en trek naar de omtrek van de montage buffer.
LET OP: Dit stelt de lymfeklier van de rest van de ontleed weefsels en plat de lymfeklier op het glas. - Met behulp van een tong van de tang en een zagende beweging, snijd de dorsale vat tussen de lymfeklier en de hersenen.
- Verplaats de rest van de ontleed weefsel naar de andere kant van de lymfeklier, aan de buitenste rand van de buffer.
OPMERKING: De ongewenste ontleed weefsels zal uiteindelijk een omtrek rond de lymfeklieren en dienen als een ondersteuning bij which het dekglaasje zal rusten. - Herhaal dit tot alle van de lymfeklieren worden gescheiden van de ontleed weefsel, reserveren van een van de ongewenste ontleed weefsel te plaatsen in het centrum.
- Neem een dekglaasje tussen twee vingers. Controleer of het dekglaasje is vrij van stof en vingerafdrukken. Indien nodig een tissue wipe en 70% ethanol aan het dekglaasje reinigen.
- Ervoor zorgen dat de rand van het dekglaasje evenwijdig is aan de rand van het glasplaatje, kantel de dekglaasje over de montage buffer.
OPMERKING: Objectglaasjes kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C voorafgaand aan de beeldvorming. Opslagduur afhankelijk van de stabiliteit van de gebruikte antilichamen. 24-well platen worden gespoeld en opnieuw gebruikt.
5. Imaging
- Afbeelding vaste hemocytes en gemonteerd lymfeklieren op een passende standaard fluorescentie of confocale microscoop bij 20X of hogere vergroting volgens de operationele fabrikant handleiding. Afbeelding hele larven op een tribuneard stereomicroscoop bij 2X vergroting volgens de operationele fabrikant handleiding.
- Volg de instructies van de software provider voor deconvolutie, indien gewenst.
| Oplossing | Samenstelling | opslagruimte | Comments |
| 1x PBS | 200 mg / l kaliumchloride | kamertemperatuur | |
| 200 mg / l monobasisch kaliumfosfaat | |||
| 8000 mg / l natriumchloride | |||
| 1150 mg / l dibasisch | |||
| dH 2 O | |||
| fixatief | 3,7% of 7,5% formaldehyde in 1x PBS | kamertemperatuur in het donker | Formaldehyde is giftig. |
| Permeabilisatie oplossing / antilichaam verdunner | 0,4% Triton | 4 ° C | De standaardformule gebruikt 0,4% Triton maar de auteurs gebruiken 0,1% Tween 20 met succes. Gebruiken om de primaire en secundaire antilichamen verdund volgens de aanbevolen concentraties providers '. |
| 5% runderserumalbumine, normaal geit serum, of normaal serum ezel | |||
| 1x PBS | |||
| 70% ethanol | 70% 200 proof ethanol in dH2O | kamertemperatuur | |
| montage buffer | 0,5% N-propyl gallaat | 4 ° C in het donker | N-propyl gallaat schadelijk. DAPI is een mutagene stof. |
| 80% glycerol | |||
| Optioneel: 1 ug / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) | |||
| 1x PBS | |||
| 0,1% PBST | 0,1% Tween 20 in 1x PBS | kamertemperatuur | |
| 0,01% PBST | 1:10 verdunning van 0,1% PBST | kamertemperatuur |
Tabel 1. Solutions gebruikt in dit protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Circulerende hemocyte Concentratie
Hemocyte aantallen toenemen gedurende larvale ontwikkeling 35. Om te illustreren dat deze methode detecteert verschillen hemocyte aantallen en concentratie, ongeacht de biologische oorzaak, maten we hemocyte concentraties van vertraagde en niet-vertraagde larven. Verlies van prothoracicotropic hormoon (ptth) door genetische ablatie van ptth producerende neuronen (ptth> grim) produceert een vertraging in larvale ontwikkeling 36. Voor elk genotype werden hemocyte concentraties gemeten zoals beschreven in protocol 1, gedurende minstens 8 individuele larve verhoogd bij 25 ° C. 120 uur na een 2 uur eieren ophalen, de gemiddelde hemocyte concentratie per vertraagd larve (ptth> grim) kleiner is dan de gemiddelde hemocyte concentratie per controle larve (ptth). Pas na 9 dagen doet de gemiddelde hemocyte concentratie per vertraagd larve benadering die van de controles (
Foto's genomen van een geautomatiseerde celgetalmeter tonen een schone, wenselijke hemolymph monster en een monster dat puin, wat kan leiden tot onnauwkeurige metingen (figuur 1C). Minimale en maximale celgrootte werd ingesteld op 2 urn en 22 urn respectievelijk. Circulariteit werd ingesteld op 75-80% rondheid. Deze parameters zijn richtwaarden en moeten empirisch worden geoptimaliseerd.
Circulerende hemocyte Immunohistochemie
Circulerende hemocytes expressie groen fluorescerend eiwit (GFP) werden verzameld, gefixeerd en geïncubeerd met een mengsel van plasmatocyte-specifieke antilichamen (P1a en P1b István Ando) 31 zoals beschreven in protocol 2(Figuur 2). Het beeld werd genomen op een standaard fluorescentie microscoop en is ongewijzigd en na constrained iteratieve deconvolutie getoond. In dit geval heeft deconvolutie niet drastisch verbeteren van de beeldkwaliteit.
In Vivo Crystal Cell melanisatie
Larven werden geplaatst op de bodem van PCR buisjes voorafgaand aan hitte-geïnduceerde kristalcel melanisatie zoals beschreven in protocol 3 (Figuur 3A). Rode pijlen geven buizen waarin larven te ver van de bodem en kan ongelijkmatig worden verwarmd. Ongelijke verdeling van de warmte over individuele larve kan variabiliteit in de melanisatie van kristal cellen in de larve te verhogen.
Een wildtype larve afgebeeld op een standaard stereomicroscoop toont het typische patroon van gemelanizeerd kristalcellen in sessiele clusters na blootstelling warmte (Figuur 3B). Gemelanizeerd crystal cellen in de lymfeklier soms gezien.
Larvale lymfeklier Immunohistochemie
Derde instar larven lymfeklieren werden uitgesneden, gefixeerd en bevestigd zoals beschreven in protocol 4. Een differentiële interferentie contrast (DIC) foto genomen op een standaard fluorescentiemicroscoop toont de primaire en secundaire lymfeklier lobben aan weerszijden van de dorsale vat (Figuur 4A).
Een lymfeklier waarin het medullaire zone en de achterste treindienstleiding genetisch werden gemerkt met verbeterde blauw fluorescerend eiwit (EBFP2) en GFP respectievelijk werd gekleurd met een antilichaam tegen het Notch intracellulaire domein (C17.9C6, Developmental Studies Hybridoma Bank) als in protocol beschreven 4. Z-stack foto's zijn genomen op een standaard fluorescentie microscoop. Een enkele maximale int image ensity projectie verschijnt ongewijzigd en na constrained iteratieve deconvolutie (Figuur 4B). In dit geval, deconvolutie drastisch verbeterde de kwaliteit en de gedetailleerdheid van het beeld.
Figuur 1. Circulerende hemocyte Concentratie. A) Een deel van standaard Drosophila medium werd verwijderd (rechts) om het leggen van eieren te bevorderen tijdens een 2 uur eierverzameling periode. B) De gemiddelde hemocyte concentratie per ontwikkelingsgebied vertraagd larve (ptth> grim) was lager dan de gemiddelde hemocyte concentratie per controle larven (ptth) 120 uur na de eileg (AEL). De gemiddelde hemocyte concentratie per vertraagd larve benaderd regelniveau 9 dagen AEL. Foutbalken ± sem C) hemolymfe monsters zonder (links) en met (rechts) vuil. Schaalbalken vertegenwoordigen 0,1 mm.href = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54544/54544fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. De doorgeven hemocyte Immunohistochemie. Hemocytes genetisch die GFP werden verzameld en een dekglaasje vast. Een plasmatocyte-specifiek antilichaam werd gebruikt om de vlek plasmatocytes (rood). DAPI kleuring wordt weergegeven in het blauw. Onveranderd beeld genomen met een fluorescentiemicroscoop (links). Dezelfde afbeelding na deconvolutie (rechts). Schaal bars vertegenwoordigen 50 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. In vivo A) Larven werden individueel in PCR-buisjes geplaatst voorafgaand aan de verwarming. Rode pijlen geven larven die niet op de bodem van de buizen B) Een typische kristalcel melanisatie patroon na verhitting, die soms onthult de lymfeklier (pijl;. Rugzijde getoond anterior links). Schaal bar vertegenwoordigt 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. larvale lymfeklier Immunohistochemie. Een DIC beeld van een derde instar larvale lymfeklier waarop de dorsale vat (dv), primaire kwabben (1 °), en secundaire kwabben (2 °) A). Schaal bar vertegenwoordigt 100 micrometer. B) Een vertegenwoordiger derde instar larvale lymfeklier from een larve genetisch uitdrukken EBFP2 in de medullaire zone en GFP in het achterste signalering centrum. De lymfeklier werd gekleurd met een antilichaam tegen het Notch intracellulaire domein (rood). Onveranderd beeld genomen met een fluorescentiemicroscoop (boven). Dezelfde afbeelding na deconvolutie (onderaan). Schaal bars vertegenwoordigen 20 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bij genetische of ecologische verandering kunnen de vier methoden beschreven afzonderlijk of samen worden gebruikt om verschillende processen tijdens hematopoiese zoals signalering, overleving, proliferatie, differentiatie en hematopoëse analyseren Drosophila is een dynamisch proces.; het aantal hemocytes per dier verhoogt 35 de en genexpressie van de lymfeklier 32 verandert tijdens de ontwikkeling. Voorafgaand aan het uitvoeren van deze testen, daarom is het essentieel om eieren verzamelingen beperken doordat vrouwtjes eitjes leggen bepaalde tijd en de gewenste larvale ontwikkelingsstadium bevestigen. Voor kortere egg verzamelingen (minder dan 6 uur) of voor gevallen waarbij vrouwtjes ongezonde of schaars kunnen eierleggen worden bevorderd door het creëren spleten in het voedsel. Dit kan worden bereikt door een deel van voedsel met een spatel-ethanol schoongemaakt. Als er teveel vloeistof hoopt zich op in het eten, gebruik weefsel doekjes om te genieten van devloeistof. (Zie figuur 1A).
Alleen al de hier beschreven werkwijzen hebben hun beperkingen. Bijvoorbeeld, het meten van circulerende hemocyte concentratie vangt veranderingen in hemocyte overleving of proliferatie, maar geeft geen informatie over hemocyte lineage verdeling of enig andere lineage verstoring die als gevolg van genetische of ecologische verandering zou kunnen zijn. Omgekeerd immunohistochemie circulerende hemocytes toont veranderingen in specifieke hemocyte lineages in de hemolymfe maar alleen in relatieve, geen absolute getallen. Crystal cel melanisatie in vivo is moeilijk te kwantificeren als kristal cel distributie is variabel en zittend hemocytes zijn dynamisch 8,10. In plaats daarvan moet meerdere personen blindelings scoren kristallen cel melanisatie. Tot slot, opmerkingen in een hemocyte compartiment is misschien niet per se waar in andere compartimenten.
In combinatie kunnen deze assays worden toegepast om genen te onderscheidentic veranderingen die proliferatie of overleving reguleren van degenen die genexpressie of differentiatie te reguleren. Zo kan een genetische verandering proliferatie van hemocytes verhogen zodat hemocyte concentratie toeneemt maar de relatieve verhoudingen van hemocyte lijnen blijft hetzelfde. Als alternatief kan een genetische verandering veranderingen hemocyte differentiatie in specifieke lineages zonder effect op de totale concentratie hemocyte promoten. Het kristal cel bevolking kan snel en eenvoudig worden ondervraagd met behulp van de in vivo melanisatie methode, het vergemakkelijken van genetische screens en genetische onderzoek naar interacties. Deze methode kan worden gebruikt in genetische studies bevestiging dat profenoloxidase 1 (PPO1, ook wel zwart cellen, Bc) gebruiken mutante allelen of immunohistochemische assays die kristalcel-specifieke antilichamen te gebruiken. Het larvale lymfeklier kan worden gebruikt om soortgelijke vragen over hematopoietische cellulaire processen pakken. talrijksignaalwegen zijn betrokken bij het opzetten en onderhouden van de lymfeklier en haar belangrijkste zones. Elke zone heeft verschillende genexpressie en functie larvale hematopoiese. Bovendien, met behulp van de lymfeklier kan zelfstandige en niet-zelfstandige functies binnen de lymfeklier zones of lymfeklier hemocytes onthullen.
Relevante methoden voor het bestuderen van Drosophila hematopoiese zijn gebundeld in uitgebreide tekst-gebaseerde middelen pas onlangs 26,27. Hoewel onmisbaar voor het veld, zijn deze middelen beperkt. Werkwijzen voor het meten hemocyte concentratie, bijvoorbeeld, niet inbegrepen. Geschreven methoden, met name die het beschrijven van dissectie technieken, kunnen worden uitdagend om snel onder de knie. Extra bijdragen zijn gemaakt, het verstrekken van visuele middelen om te helpen met methoden, maar waren nog steeds beperkt in aantal als in omvang 28,29. De werkwijzen die hier worden beschreven, terwijl ook niet volledig, toe te voegen aan de middelen beschiklable te helpen bij de studie van Drosophila hematopoiese.
Wij kunnen modificaties en alternatieven voor bestaande protocollen. Zo zijn er verschillende voordelen aan meten hemocyte concentratie van een geautomatiseerde celtelinrichting plaats van een handmatige hemocytometer, waaronder verhoogde snelheid, gemak en objectiviteit. In onze ervaring met een waterbad om larven te kristalcel visualisatie warmte resulteerde in sterk uiteenlopende resultaten, vooral als de larven in de flesjes waarin zij worden opgewekt verhit. Verwarming larven in afzonderlijke PCR-buisjes leverden minder variabel en reproduceerbare resultaten. De lymfeklier dissectie hier beschreven methode, maar eerder uiteengezet in een schriftelijke protocol 26, biedt een alternatief voor de bestaande visuele referenties 28. Tot slot, als de toegang tot een confocale microscoop beperkt is, stellen we voor dat deconvolutie van standaard fluorescentie beelden van een geschikte vervanger voor confocale beelden zou kunnen zijn. Deconvolutiop algoritmes verwijderen of opnieuw toewijzen out-of-focus licht opgevangen door conventionele fluorescentiemicroscopie, het verbeteren van de resolutie en contrast in beginsel vergelijkbaar met de eliminatie van licht out-of-focus door confocale microscopie, en kan worden toegepast op 2-dimensionale en 3- dimensionale (Z-stack) beelden. Voor sommige toepassingen, zoals hier aangetoond, deconvolutie kan drastisch verbeteren van beelden die met conventionele fluorescentie microscopen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende of financiële belangen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | |
| formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Triton | Fisher | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
| normal goat serum | Sigma | G9023-10ML | |
| normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001 | |
| N-propyl gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| glycerol | VWR | EM-4750 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| microscope cover glass, 22 mm square | Fisher | 12-544-10 | |
| microscope cover glass, 18 mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
| glass microscope slides | Fisher | 22-034-980 | |
| thermal cycler | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
| PCR tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 24-well plate | Corning | 351147 | |
| disposable transfer pipet | Fisher | 13-711-9AM | |
| fluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
References
- Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5 (5), 673-690 (2003).
- Crozatier, M., Meister, M. Drosophila haematopoiesis. Cell Microbiol. 9 (5), 1117-1126 (2007).
- Crozatier, M., Vincent, A. Drosophila: a model for studying genetic and molecular aspects of haematopoiesis and associated leukaemias. Dis Model Mech. 4 (4), 439-445 (2011).
- Gold, K. S., Bruckner, K. Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates. Exp Hematol. 42 (8), 717-727 (2014).
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).
- Ghosh, S., Singh, A., Mandal, S., Mandal, L. Active hematopoietic hubs in Drosophila adults generate hemocytes and contribute to immune response. Dev Cell. 33 (4), 478-488 (2015).
- Leitao, A. B., Sucena, E. Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation. Elife. 4, (2015).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
- Crozatier, M., Ubeda, J. M., Vincent, A., Meister, M. Cellular immune response to parasitization in Drosophila requires the EBF orthologue collier. PLoS Biol. 2 (8), 196 (2004).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4805-4809 (2009).
- Minakhina, S., Steward, R. Melanotic mutants in Drosophila: pathways and phenotypes. Genetics. 174 (1), 253-263 (2006).
- Bina, S., Wright, V. M., Fisher, K. H., Milo, M., Zeidler, M. P. Transcriptional targets of Drosophila JAK/STAT pathway signalling as effectors of haematopoietic tumour formation. EMBO Rep. 11 (3), 201-207 (2010).
- Avet-Rochex, A., et al. An in vivo RNA interference screen identifies gene networks controlling Drosophila melanogaster blood cell homeostasis. BMC Dev Biol. 10, 65 (2010).
- Rodriguez, A., et al. Identification of immune system and response genes, and novel mutations causing melanotic tumor formation in Drosophila melanogaster. Genetics. 143 (2), 929-940 (1996).
- Mandal, L., Banerjee, U., Hartenstein, V. Evidence for a fruit fly hemangioblast and similarities between lymph-gland hematopoiesis in fruit fly and mammal aorta-gonadal-mesonephros mesoderm. Nat Genet. 36 (9), 1019-1023 (2004).
- Grigorian, M., Mandal, L., Hakimi, M., Ortiz, I., Hartenstein, V. The convergence of Notch and MAPK signaling specifies the blood progenitor fate in the Drosophila mesoderm. Dev Biol. 353 (1), 105-118 (2011).
- Lebestky, T., Jung, S. H., Banerjee, U. A Serrate-expressing signaling center controls Drosophila hematopoiesis. Genes Dev. 17 (3), 348-353 (2003).
- Krzemien, J., et al. Control of blood cell homeostasis in Drosophila larvae by the posterior signalling centre. Nature. 446 (7133), 325-328 (2007).
- Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. A Hedgehog- and Antennapedia-dependent niche maintains Drosophila haematopoietic precursors. Nature. 446 (7133), 320-324 (2007).
- Benmimoun, B., Polesello, C., Haenlin, M., Waltzer, L. The EBF transcription factor Collier directly promotes Drosophila blood cell progenitor maintenance independently of the niche. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), 9052-9057 (2015).
- Sinenko, S. A., Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Banerjee, U. Dual role of wingless signaling in stem-like hematopoietic precursor maintenance in Drosophila. Dev Cell. 16 (5), 756-763 (2009).
- Pennetier, D., et al. Size control of the Drosophila hematopoietic niche by bone morphogenetic protein signaling reveals parallels with mammals. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3389-3394 (2012).
- Dragojlovic-Munther, M., Martinez-Agosto, J. A. Extracellular matrix-modulated Heartless signaling in Drosophila blood progenitors regulates their differentiation via a Ras/ETS/FOG pathway and target of rapamycin function. Dev Biol. 384 (2), 313-330 (2013).
- Ferguson, G. B., Martinez-Agosto, J. A. Yorkie and Scalloped signaling regulates Notch-dependent lineage specification during Drosophila hematopoiesis. Curr Biol. 24 (22), 2665-2672 (2014).
- Milton, C. C., et al. The Hippo pathway regulates hematopoiesis in Drosophila melanogaster. Curr Biol. 24 (22), 2673-2680 (2014).
- Evans, C. J., Liu, T., Banerjee, U. Drosophila hematopoiesis: Markers and methods for molecular genetic analysis. Methods. 68 (1), 242-251 (2014).
- Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68 (1), 116-128 (2014).
- Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response. J Vis Exp. (63), e3347 (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Rizki, M. T. M., Rizki, R. M. Functional significance of the crystal cells in the larva of Drosophila mekmogaster. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 5, 235-240 (1959).
- Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, Suppl 95-111 (2007).
- Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis. Development. 132 (11), 2521-2533 (2005).
- Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism. Int J Dev Biol. 54 (6-7), 1117-1125 (2010).
- Rizki, T. M., Rizki, R. M. Properties of the Larval Hemocytes of Drosophila-Melanogaster. Experientia. 36 (10), 1223-1226 (1980).
- Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M. Postembryonic hematopoiesis in Drosophila. Dev Biol. 230 (2), 243-257 (2001).
- McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic hormone regulates developmental timing and body size in Drosophila. Dev Cell. 13 (6), 857-871 (2007).
- Reimels, T. A., Pfleger, C. M. Drosophila Rabex-5 restricts Notch activity in hematopoietic cells and maintains hematopoietic homeostasis. J Cell Sci. 128 (24), 4512-4525 (2015).
