Summary
Sistemas hematopoiéticas de mamífero Drosophila e compartilham muitas características comuns, tornando Drosophila um modelo genético atraente para estudar hematopoiese. Aqui demonstramos dissecção e montagem do principal órgão hematopoiético larval para imuno-histoquímica. Descrevemos também métodos para ensaiar vários compartimentos hematopoiéticos larvais incluindo hemócitos circulantes e células de cristal sésseis.
Abstract
Existem muitos paralelos entre os sistemas hematopoiéticas de mamífero Drosophila e, apesar de Drosophila não têm a linhagem linfóide que caracterizam a imunidade adaptativa mamíferos. Drosophila e hematopoiese mamíferos ocorrem em espacial e temporalmente fases distintas para produzir várias linhagens de células sanguíneas. Ambos os sistemas manter reservatórios de progenitores de células de sangue com que se expandem ou substituem linhagens maduros. O sistema hematopoiético permite Drosophila e mamíferos para responder e se adaptar aos desafios do sistema imunológico. Mais importante, os reguladores de transcrição e de vias de sinalização que controlam a geração, manutenção e funcionamento do sistema hematopoiético são conservados a partir de moscas para mamíferos. Estas semelhanças Drosophila permitem a ser utilizado para o desenvolvimento hematopoiético e geneticamente modelo de doença.
Aqui nós ensaios detalhe para examinar o sistema hematopoiético de larvas de Drosophila. Dentroem particular, descrevemos métodos para medir o número de células de sangue e concentração, visualizar uma linhagem madura específica in vivo e realizar imuno-histoquímica em células sanguíneas em circulação e no órgão hematopoiético. Estes ensaios podem revelar alterações na expressão de genes e processos celulares, incluindo a sinalização, a sobrevivência, a proliferação, a diferenciação e a e podem ser utilizados para investigar uma variedade de questões relacionadas com a hematopoiese. Combinado com as ferramentas genéticas disponíveis em Drosophila, estes ensaios podem ser utilizados para avaliar o sistema hematopoiético em cima alterações genéticas definidas. Embora não seja especificamente descrito aqui, estes ensaios também podem ser utilizados para examinar o efeito de alterações ambientais, tais como infecção ou dieta, do sistema hematopoiético.
Introduction
Os complexos mecanismos que regulam os factores de transcrição e as vias de sinalização que coordenam o desenvolvimento do sistema hematopoiético e que o mau funcionamento nas doenças hematológicas permanecem pouco compreendidos. Estes factores de transcrição e as vias de sinalização, bem como a sua regulação, são altamente conservados entre mamíferos a Drosophila e hematopoiese 1-5. Assim, o sistema hematopoiético de Drosophila representa um excelente modelo genético para definir os mecanismos moleculares que controlam a hematopoiese e doenças hematológicas subjacentes.
Semelhante a mamíferos, Drosophila gerar células sanguíneas, chamados hemócitos, em espacial e temporalmente distintas fases da hematopoiese. Tradicionalmente, a hematopoiese de Drosophila foi pensado para ser limitada a fases na mesoderme embrionária e no gânglio linfático larvar. Estudos recentes fornecem evidências de que a hematopoiese também ocorre em Clu sésseis larvalsters e no abdômen adulto 6-8. Todas as fases hematopoiéticas produzem dois tipos de hemócitos maduros: plasmatócitos e células de cristal. Plasmatócitos são células de macrófagos-like envolvidos na fagocitose, a imunidade inata, e cicatrização de feridas. células de cristal conter pro-fenoloxidases necessários para melanização, uma reacção utilizado nas respostas imunes de insectos e cicatrização de feridas. Hematopoiese larval pode gerar um terceiro tipo de hemócitos madura, um chamado lamellocyte, em resposta a certos desafios imunológicos tais como infecção parasitóides vespa 9,10. Lamellocytes são células grandes e aderentes que funcionam, em conjunto com plasmatócitos e células de cristal, para encapsular e neutralizar os ovos de vespa estabelecidas em larvas de Drosophila. Na ausência de parasitismo, lamellocytes não são encontradas no tipo selvagem larvas. massas melanotic assemelham melanizadas, ovos de vespa encapsulados; muitas estirpes mutantes de Drosophila desenvolver massas melanóticos na ausência de parasitismo. A presença de Lamellocitos e / ou massas melanóticos pode ser indicativo de anormalidades hematopoiéticas. Na verdade, o fenótipo de massa melanóticos foi usado para identificar genes e vias envolvidas na hematopoiese 11-14.
O sistema hematopoiético larval é a mais estudada até o momento. É composto de hemócitos circulantes na hemolinfa, aglomerados de hemócitos sésseis modelado sob a cutícula, e hemócitos residente no gânglio linfático. O gânglio linfático é uma série de lóbulos bilaterais ligados ao vaso dorsal. Cada lóbulo principal da glândula linfa é dividido em três zonas principais. A zona mais externa é conhecida como a zona cortical e contém amadurecimento hemócitos. A zona mais interior é chamado a zona medular e é composta de precursores de hemócitos quiescentes. A terceira zona, o centro de sinalização posterior, é um pequeno grupo de células na base do gânglio linfático que actuam como um nicho de células-tronco como. Os primeiros trabalhos estabelecida funções críticas para Notch 15-18 19,20, JAK-STAT 18 e atividade Wingless 21 para regular o desenvolvimento da glândula linfática larval. Estudos mais recentes têm demonstrado que a BMP 22, FGF-23 de Ras, e Hipopótamo 24,25 sinalização também funcionar dentro do gânglio linfático larvar.
Quatro ensaios hematopoiéticas larvais descritas aqui descrever 1) de medição de circulação concentração de hemócitos, definida como o número de células por unidade de volume, 2) isolamento e fixação hemócitos circulantes para imuno-histoquímica, 3) a visualização de células de cristal in vivo, e 4) de dissecação, de fixação e de montagem gânglios linfáticos para imuno-histoquímica. Estes ensaios podem ser usados como leituras hematopoiéticas para avaliar as funções e os regulamentos de vias de sinalização no sistema hematopoiético das larvas. Embora estes métodos tenham sido utilizados anteriormente no campo, documentação visual destes ensaios só recentemente começou 8,26-30. Várias publicações citadas aqui são de ajudaful recursos que descrevem métodos semelhantes e marcadores hematopoiéticas 26,31-33. Além disso, Trol e Viking são marcadores úteis da membrana linfático glândula porão.
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Protocol
1. Circulação Concentração hemócito
- Para obter larvas de aproximadamente o mesmo estágio de desenvolvimento para este ensaio, restringir coleta de ovos, permitindo que as fêmeas põem ovos por um período de tempo fixo de 2-6 hr.
- Recolhe larvas em dissecar poços cheia com fosfato 1x solução salina tamponada (PBS, Tabela 1).
- Para cada larva, colocar 10 ul de 1x PBS num tubo de microcentrífuga em gelo e 10 ul de PBS 1x sobre uma almofada de dissecação limpo. Coloque a almofada de dissecação em uma base stereomicroscope iluminado.
- Seque uma larva indivíduo, colocando-o em um lenço de papel antes de transferi-lo para uma queda PBS na almofada dissecção.
- Usando um par de fórceps, gentilmente rasgar e cuidadosamente inverter a cutícula para liberar a hemolinfa.
NOTA: Tenha cuidado para não raspar ou espetar a cutícula, pois isso pode potencialmente lançar hemócitos sésseis 29. - Usando uma pipeta, recolher a hemolinfa do bloco de dissecação. Evite collecting detritos larval como a gordura corporal.
- Adicione o hemolinfa para um tubo de microcentrífuga e misture pipetando cima e para baixo.
NOTA: Várias amostras podem ser recolhidas de uma só vez e mantido em gelo durante cerca de uma hora. - Opcional: Misture Trypan azul com a amostra de hemolinfa em partes iguais para tingir e excluir as células mortas. Contagem de células dentro de 3 minutos da adição de azul de Tripano, porque é tóxico para as células.
- Misturar a amostra pipetando para cima e para baixo antes de colocar 10 ml em uma câmara de hemocitômetro.
- Se estiver usando um contador de células automatizado, definir os parâmetros apropriados para o tamanho das células e circularidade. Por exemplo, definir um tamanho mínimo de células de 2 mm, uma dimensão máxima de células de 22 mm, e uma circularidade de 75 - 80% arredondamento para detectar, hemócitos normais redondas 34. Experimente com diferentes parâmetros para detectar hemócitos maiores e fusiformes, tais como lamellocytes. Como alternativa, use um hemocitômetro para contar manualmente hemócitos.
2. Circulating hemócito Imunohistoquímica
- Para obter larvas de aproximadamente o mesmo estágio de desenvolvimento para este ensaio, restringir coleta de ovos, permitindo que as fêmeas põem ovos por um período de tempo fixo de 2-6 hr.
- Coloque uma lamela em cada poço de uma placa de 6 ou 12 poços.
NOTA: lamelas Square (22 mm) se encaixam em placas de 6 poços e lamelas de partida (18 mm de diâmetro) se encaixam em placas de 12 poços. - Recolhe larvas em dissecar poços cheia com 1x PBS.
- Coloque 5 ul de 1x PBS no centro de cada lamela.
- Coloque o prato sobre uma base stereomicroscope iluminado.
- Seque uma larva indivíduo em um lenço de papel e coloque na PBS sobre a lamela.
- Usando um par de fórceps, gentilmente rasgar e inverter cuidadosamente a cutícula. Antes de retirar a carcaça larval, usá-lo para espalhar a hemolinfa uniformemente.
NOTA: Tenha cuidado para não raspar ou espetar a cutícula, pois isso pode potencialmente lançar hemócitos sésseis 29. - REPEAT para todas as larvas, coleta de hemolinfa de uma larva por lamela. Permitir hemócitos a aderir às lamelas de 5 -. 8 min a RT temperatura ambiente Não exceda 30 min antes da fixação.
- Fix hemócitos pela adição de 5 ul de 7,5% de formaldeído (Tabela 1) para cada lamela durante 15 min à temperatura ambiente.
- Lavar lamelas três vezes com PBS 1x. Incline a placa e aspirar PBS após cada lavagem. Para evitar o escoamento da solução de permeabilização na próxima etapa, use o aspirador para remover o excesso de PBS a partir perímetro das lamelas.
- Adicionar 100 ul de solução de permeabilização (Tabela 1) para cada lamela durante 20 min à TA.
- Dica e bata suavemente a placa para aspirar a solução de permeabilização.
- Diluir anticorpo primário com solução de anticorpo (Tabela 1) de acordo com as especificações do fornecedor. Adicionar pelo menos 500 ul de solução de anticorpo primário para lamelas em placas de 12 poços.Adicionar pelo menos 1,5 ml em placas de 6 poços. Incubar a 4 ° C durante a noite.
- Remover a solução de anticorpo primário e lava-se lamelas com PBS 1x durante 10 min num agitador orbital, três vezes.
- Diluir anticorpo secundário com uma solução de anticorpo de acordo com as especificações do fornecedor. Adicionar pelo menos 500 ul de solução de anticorpo secundário de lamelas em placas de 12 poços. Adicionar pelo menos 1,5 ml para placas de 6 poços. Incuba-se durante pelo menos 2 horas à temperatura ambiente.
- Remover a solução de anticorpo secundário e lava-se lamelas com PBS 1x durante 10 min num agitador orbital como no Passo 2,10, três vezes.
- Durante os passos de lavagem, de vidro de microscópio limpas lâminas com etanol a 70% (Tabela 1) utilizando toalhetes de tecido. Para cada lamela, coloque 5 mL de buffer de montagem (Tabela 1) sobre a lâmina de vidro.
NOTA: As duas lamelas caber em um slide. - Aspirar a lavagem final PBS.
- Use uma pinça para remover cuidadosamente as lamelas das placas e lugar, inverted, no topo do tampão de montagem.
Nota: As lâminas de microscópio pode ser armazenado a 4 ° C antes da imagiologia. Tempo máximo de armazenamento depende da estabilidade dos anticorpos utilizados. 6 e 12, bem as placas podem ser lavadas e reutilizadas.
3. In Vivo de cristal celular melanização
- Para obter larvas de aproximadamente o mesmo estágio de desenvolvimento para este ensaio, restringir coleta de ovos, permitindo que as fêmeas põem ovos por um período de tempo fixo de 2-6 horas.
- Antes de começar, definir uma fonte de aquecimento a 60 ° C.
NOTA: Um programa ciclador térmico de 60 ° C durante 10 min (seguido por um a 25 ° C preensão) funciona melhor, mas um banho de água ou outra fonte de aquecimento é suficiente desde que o calor é distribuído de forma consistente e uniformemente sobre cada larva. - Recolhe larvas em dissecar poços cheia com 1x PBS (Tabela 1).
- Um de cada vez, secar uma larva em um lenço de papel e colocar na parte inferior de um tubo de PCR. Coloque cada larvanum tubo de PCR separadas. (Ver Figura 3A).
- Para obter resultados consistentes, garantir que as larvas estadia na parte inferior dos tubos de PCR por arrefecimento larvas nos tubos a 4 ° C durante 10 - 15 minutos e / ou batendo suavemente os tubos antes do aquecimento.
- Coloque os tubos de PCR no termociclador (ou banho de água). Aquecer a 60 ° C durante 10 min.
- Remova cuidadosamente as larvas dos tubos PCR para dissecar poços prato cheios de fresco 1x PBS.
- larvas seca em um lenço de papel e coloque numa superfície plana para a imagem latente sob um microscópio estereoscópico.
- Pontuação imagens de larvas cegamente por vários indivíduos.
4. larval linfa Gland Imunohistoquímica
NOTA: O gânglio linfático está localizada a aproximadamente um terço do comprimento a partir da extremidade anterior de uma larva ligeiramente abaixo do cérebro no lado dorsal. (Veja seta na Figura 3B). A glândula linfática flancos do vaso dorsal e é mais facilmente dissecado ligado ao hoo bocaks ou para o cérebro. Do tipo selvagem, glândulas linfáticas terceiro instar são estruturas muito pequenas; os lóbulos principais são cerca de 100-200 uM de comprimento. (Veja a Figura 4A).
- Para obter larvas de aproximadamente o mesmo estágio de desenvolvimento para este ensaio, restringir coleta de ovos, permitindo que as fêmeas põem ovos por um período de tempo fixo de 2-6 hr.
- Linfa dissecção da glândula
- Para cada condição experimental, adicionar 1 ml de PBS 1X (Tabela 1) para um poço de uma placa de 24 poços.
- Adicionar uma gota de 0,1% PBST (Tabela 1) para cada poço utilizando uma pipeta de transferência descartável.
NOTA: detergente, tal como Tween 20, é adicionado para diminuir a tensão superficial, permitindo que o tecido a afundar para o fundo do poço. - Colocar a placa plana em gelo.
- Recolhe larvas em dissecar poços cheia com 1x PBS.
- Coloque uma almofada de dissecação limpa em uma base stereomicroscope iluminado. Usar uma pipeta de transferência descartável para colocar Small gotas de PBST a 0,01% (Tabela 1) sobre a almofada. Transferir uma larva a uma queda PBST para dissecção.
- Segurar a larva com um par de pinças de cerca de um quarto de comprimento a partir da extremidade posterior, lado dorsal para cima.
- Use um outro par de fórceps para agarrar a cutícula imediatamente anterior ao da pinça que estão segurando a larva. Puxe suavemente a cutícula em direção à extremidade anterior até a boca ganchos estão expostos.
NOTA: O objectivo é descascar a cutícula sem perturbar quaisquer estruturas internas. - Solte a cutícula e usar as duas pinças para cortar a larva em dois. Remover a extremidade posterior da gota PBST.
NOTA: Se a cutícula não descascar todo o caminho até os ganchos na boca, cortar a larva em dois e remover a extremidade posterior. Utilizar um par de pinças para segurar o bordo da cutícula, e usar o outro par de fórceps para empurrar os ganchos boca através da abertura. Isto irá inverter a cutícula e expor os ganchos boca. Este pode ser usado como uma alternaçãocomeu método de dissecação também. - Utilizar um par de fórceps para fixar para baixo da cutícula (quer a cutícula ventral, o retalho dorsal cutícula, ou ambos) para estabilidade.
- Use um outro par de fórceps para agarrar os ganchos boca expostos e puxe-os para fora.
NOTA: Isto irá separar a cutícula das estruturas internas. Idealmente, o olho / discos imaginais antenares, cérebro, glândula anel, e dos gânglios linfáticos flanqueando o vaso dorsal vai permanecer solidários com os ganchos na boca. - Enquanto ainda mantém os ganchos na boca, retire cuidadosamente estruturas indesejáveis, tais como as glândulas salivares, gordura corporal e intestino.
NOTA: Se o cérebro separa dos ganchos na boca, a glândula linfática ainda pode ser anexado a e recolhidos com o cérebro. Nesse caso, segure o cordão nervoso ventral, em vez de os ganchos na boca. - Usando os ganchos na boca ou cordão nervoso ventral como um punho, transferir o complexo dissecados contendo a glândula linfática para o bem no gelo. Não exceda 30 minantes da fixação.
- Fixação e imuno-histoquímica
- Colocar a placa de 24 poços na base estereomicroscópio.
- Usar uma pipeta p200 para remover cuidadosamente o PBST do poço.
NOTA: Vazio, poços vizinhos são úteis para depositar temporariamente resíduos. - Adicionar cuidadosamente 200 ul de 3,7% de formaldeído (Tabela 1) pelo lado do poço e agite a placa para assegurar que os tecidos dissecados são completamente submerso.
- Retornar a placa para gelo durante 30 min. Se os gânglios linfáticos expressar a proteína fluorescente (s), manter a placa coberta para evitar a fotodegradação.
- Usar uma pipeta p200 para remover cuidadosamente o fixador.
- Lavar por adição de 200 ul de 1x PBS para o poço e colocando a placa num agitador orbital durante 5 minutos à temperatura ambiente. Usar uma pipeta p200 para remover cuidadosamente a PBS.
NOTA: Fixo gânglios linfáticos podem ser deixadas no gelo em PBS até glândulas linfáticas para todas as condições experimentais são dissected e fixos. - Repita o passos de lavagem mais duas vezes.
- Adicionar 200 ul de solução de permeabilização (Tabela 1) para o poço. Definir a placa num agitador orbital durante 45 min à TA.
NOTA: 45 min é o "padrão ouro" para permeabilização dos gânglios linfáticos, mas os autores têm sucesso após apenas 20 min. - Remover a solução com uma pipeta de p200.
- Diluir anticorpo primário com solução de anticorpo (Tabela 1) de acordo com as especificações do fornecedor. Adicionar 300 ul de solução de anticorpo primário para o bem e assegurar que os tecidos dissecados são completamente submerso. Incubar a 4 ° C durante a noite.
- Usar uma pipeta p200 para remover o anticorpo primário.
- Lavar por adição de 200 ul de 1x PBS para o poço e colocando a placa num agitador orbital durante 10 min à temperatura ambiente. Usar uma pipeta p200 para remover cuidadosamente a PBS.
- Repita o passos de lavagem mais duas vezes.
- Diluir a secundáriantibody com uma solução de anticorpo de acordo com as especificações do fornecedor. Adicionar solução de anticorpo secundário 300 ul para o bem e assegurar que os tecidos dissecados são completamente submerso. Incubar num agitador orbital durante pelo menos 2 horas à temperatura ambiente.
- Usar uma pipeta p200 para remover o anticorpo secundário e lava-se tal como descrito nos Passos 4.3.12 & 4.3.13. Não remova a PBS após a lavagem final.
- Linfa montagem glândula
- Limpo microscópio lâminas de vidro usando 70% de etanol (Tabela 1) e toalhetes de papel-tecido.
- Para cada condição experimental, colocar uma gota de tampão de montagem (Tabela 1) sobre a lâmina de vidro.
NOTA: Duas condições caber em um slide. Montagem volume de tampão depende do número de glândulas linfáticas para ser montado. Utilizar 2 ul durante cerca de 18 - 20 gânglios linfáticos, 1 ul, durante 10 - 12, e 0,5 jil de 5 ou menos. - Coloque a lâmina de microscópio em uma base stereomicroscope iluminado.
- Para até duas condições ao mesmo tempo, transferir todos os gânglios linfáticos do poço para o buffer de montagem com uma pinça, utilizando os ganchos na boca ou cordão nervoso ventral como alça.
- Espaço os tecidos dissecados uniformemente em uma forma circular ou rectangular, a difusão do tampão de montagem durante o processo.
- Para cada um dos tecidos dissecados, individualmente, um deslize Tong do fórceps sob o vaso dorsal e puxe para a periferia do tampão de montagem.
NOTA: Isso vai chamar a linfa glândula fora do resto dos tecidos dissecados e achatar a glândula linfática no vidro. - Usando um Tong da pinça e um movimento de corte, cortar o vaso dorsal entre o gânglio linfático e do cérebro.
- Mover o resto dos tecidos dissecados para o lado oposto do gânglio linfático, na aresta exterior do tampão.
NOTA: Os tecidos dissecados indesejados irá, eventualmente, formar um perímetro em torno das glândulas linfáticas e servir como um suporte em cima which lamela vai descansar. - Repita até que todos os gânglios linfáticos são separados dos tecidos dissecados, reservando um dos tecidos dissecados indesejados para colocar no centro.
- Tome uma lamela entre dois dedos. Verifique se a lamela é livre de poeira e impressões digitais. Se necessário, use um lenço de papel e 70% de etanol para limpar a lamela.
- Assegurar que a extremidade da lamela é paralela ao bordo da lâmina de vidro, reduzir cuidadosamente a lamela ao longo do tampão de montagem.
NOTA: As lâminas de microscópio pode ser armazenado a 4 ° C antes da imagiologia. Tempo máximo de armazenamento depende da estabilidade dos anticorpos utilizados. placas de 24 cavidades podem ser lavadas e reutilizadas.
5. Imagiologia
- Imagem hemócitos fixo e montado glândulas linfáticas em uma fluorescência padrão apropriado ou um microscópio confocal de 20X ou maior ampliação acordo com o manual de instruções do fabricante. Imagem larvas todo em um carrinhostereomicroscope ard a 2X ampliação acordo com o manual de instruções do fabricante.
- Siga as instruções do fornecedor de software de deconvolução, se desejado.
| Solução | Composição | Armazenamento | Comentários |
| 1x PBS | cloreto de potássio / L 200 mg | temperatura do quarto | |
| 200 mg / L fosfato de potássio monobásico | |||
| 8,000 mg de cloreto de sódio / L | |||
| 1,150 mg / L de fosfato de sódio dibásico | |||
| dH2O | |||
| Fixador | 3,7% ou 7,5% de formaldeído em PBS 1x | temperatura ambiente no escuro | O formaldeído é tóxico. |
| solução de permeabilização / diluente de anticorpo | 0,4% de Triton | 4 ° C | A fórmula padrão utiliza 0,4% de Triton, mas os autores utilizam 0,1% de Tween 20 com sucesso. Use para diluir os anticorpos primários e secundários de acordo com concentrações recomendadas dos provedores. |
| 5% de albumina de soro bovino, soro de cabra normal, ou normal, soro de burro | |||
| 1x PBS | |||
| 70% de etanol | 70% de etanol 200 proof em dH2O | temperatura do quarto | |
| tampão de montagem | 0,5% galato N-propil | 4 ° C no escuro | N-propil galato é prejudicial. DAPI é um agente mutagênico. |
| 80% de glicerol | |||
| Opcional: 1 ug / ml de DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) | |||
| 1x PBS | |||
| 0,1% PBST | 0,1% de Tween 20 em PBS 1x | temperatura do quarto | |
| 0,01% PBST | Diluição 1:10 de 0,1% PBST | temperatura do quarto |
Tabela 1. Soluções utilizadas no presente protocolo.
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Representative Results
Circulando hemócito Concentração
Números de hemócitos aumentar ao longo do desenvolvimento larval 35. Para ilustrar que este método detecta diferenças nos números de hemócitos e concentração, independentemente da causa biológica, medimos as concentrações de hemócitos de larvas retardada e não retardada. Perda de hormona prothoracicotropic (PTTH) por ablação genética de neurônios produtores de PTTH (PTTH> sombrio) produz um atraso no desenvolvimento larval 36. Para cada genótipo, concentrações de hemócitos foram medidos tal como descrito no Protocolo 1 para, pelo menos, 8 larva indivíduo levantada a 25 ° C. A 120 horas após a recolha de um ovo de 2 horas, a concentração média de hemócitos por larva retardada (PTTH> desagradável) é menor do que a concentração média de hemócitos por larva de controlo (PTTH). Só depois de 9 dias faz a concentração média de hemócitos per abordagem larva atrasou o de controles (
Imagens tiradas a partir de um contador de células automatizado mostrar, uma amostra hemolinfa desejável limpo e uma amostra contendo detritos, o que pode levar a medições imprecisas (Figura 1C). tamanhos mínimos e máximos de células foram definido para 2 mm e 22 mm, respectivamente. Circularidade foi ajustado para 75-80% de circularidade. Estes parâmetros são destinados indicativos e devem ser empiricamente optimizados.
Circulando hemócito Imunohistoquímica
Hemócitos circulantes expressando verde proteína fluorescente (GFP) foram coletadas, fixadas e incubadas com uma mistura de anticorpos específicos para plasmatócito (P1a e P1B, István Andó) 31, conforme descrito no protocolo 2(Figura 2). A imagem foi tomada em um microscópio de fluorescência padrão e é mostrada inalterado e após deconvolução iterativa restrita. Neste exemplo, desconvolução não melhorou drasticamente a qualidade da imagem.
In Vivo de cristal celular melanizacao
As larvas foram colocadas na parte inferior dos tubos de PCR antes melanização de células de cristal induzida por calor como descrito no Protocolo 3 (Figura 3A). As setas vermelhas indicam tubos em que as larvas são muito longe do fundo e pode ser aquecido de forma desigual. distribuição irregular do calor através larva indivíduo pode aumentar a variabilidade na melanização de células de cristal dentro da larva.
Uma larva de tipo selvagem fotografada em um estereomicroscópio padrão mostra o padrão típico de células de cristal melanizadas em clusters sésseis após exposição ao calor (A Figura 3B). células de cristal melanizadas na glândula linfática são vistos às vezes.
Larval linfa Gland Imunohistoquímica
Terceiro instar larvar gânglios linfáticos foram dissecados, fixados, e montado como descrito no protocolo 4. A imagem de contraste de interferência diferencial (DIC) feita em um microscópio de fluorescência padrão mostra os lóbulos dos gânglios linfáticos primários e secundários que flanqueiam o vaso dorsal (Figura 4A).
Um dos gânglios linfáticos, em que a zona medular centro e sinalização do posterior foram geneticamente marcado com proteína fluorescente azul aumentada (EBFP2) e GFP, respectivamente, foi corada com um anticorpo contra o domínio intracelular de Notch (C17.9C6, estudos de desenvolvimento de hibridoma Banco) quanto descrito no Protocolo 4. imagens Z-stack foram tiradas em um microscópio de fluorescência padrão. Um único int máximo imagem de projeção ensity parece inalterado e após deconvolução iterativa restrita (Figura 4B). Neste exemplo, desconvolução drasticamente melhorada a qualidade e o pormenor da imagem.
Figura 1. Circulação hemócito Concentração. A) Uma porção de meio de Drosophila padrão foi removido (à direita) para promover a postura de ovos durante um período de 2 horas de coleta de ovos. B) A concentração média de hemócitos por larva atraso de desenvolvimento (PTTH> sombrio) foi menor do que a concentração média de hemócitos por larvas de controle (PTTH) 120 horas após a postura dos ovos (AEL). A concentração média de hemócitos por larva adiada aproximou nível de controle 9 dias AEL. As barras de erro representam ± SEM c) as amostras de hemolinfa sem (à esquerda) e com (à direita) detritos. barras de escala representam 0,1 mm.href = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54544/54544fig1large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Circulating hemócitos imuno-histoquímica. Hemócitos geneticamente expressando GFP foram recolhidas e fixadas a uma lamela. Um anticorpo específico de plasmatócito foi usada para plasmatócitos mancha (vermelho). Coloração DAPI é mostrado em azul. inalterado imagem tirada com um microscópio de fluorescência (esquerda). A mesma imagem após deconvolução (direita). Barras de escala representam 50 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. In Vivo A) As larvas foram colocados individualmente em tubos de PCR antes do aquecimento. As setas vermelhas indicam larvas que não estão na parte inferior dos tubos B) Um padrão melanização de células de cristal típico após o aquecimento, que, por vezes, revela o gânglio linfático (seta;. Lado dorsal mostrado, é anterior esquerda). Barra de escala representa 1 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. larval linfa Gland imunohistoquímica. A) Uma imagem DIC de um terceiro instar glândula linfática larval mostrando o vaso dorsal (dv), lóbulos primários (1 °), e lóbulos secundários (2 °). Barra de escala representa 100 m. B) Um representante terceiro instar larval linfático glândula fROM uma larva geneticamente expressando EBFP2 na zona medular e GFP no centro da posterior sinalização. O gânglio linfático foi corado com um anticorpo contra o domínio intracelular de Notch (vermelho). imagem inalterada tomado com um microscópio de fluorescência (superior). A mesma imagem após deconvolução (parte inferior). Barras de escala representam 20 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Após a alteração genética ou ambiental, os quatro métodos descritos aqui podem ser utilizados individualmente ou em conjunto para analisar processos distintos durante a hematopoiese, tais como sinalização, a sobrevivência, a proliferação, a diferenciação e a hematopoiese de Drosophila é um processo dinâmico.; o número de hemócitos por animal aumenta 35 e a expressão do gene e a estrutura do gânglio linfático muda 32 durante o desenvolvimento. Antes da realização do ensaio, portanto, é fundamental para restringir coleções de ovos, permitindo que as fêmeas põem ovos por um determinado período de tempo e para confirmar o estágio de desenvolvimento larval desejado. Para mais curtos coleções de ovos (menos de 6 horas) ou para casos em que as fêmeas são insalubres ou escasso, a postura de ovos pode ser incentivado através da criação de fendas no alimento. Isto pode ser conseguido através da remoção de uma porção do alimento com uma espátula limpa-etanol. Se o excesso de líquido se acumula nos alimentos, o uso de tecidos toalhetes para absorver alíquido. (Ver Figura 1A).
Sozinho, os métodos descritos aqui têm limitações. Por exemplo, medindo circulando concentração de hemócitos capta mudanças na sobrevivência hemócito ou a proliferação mas não fornece nenhuma informação sobre a distribuição linhagem hemócito ou qualquer interrupção linhagem que pode ser consequência de alteração genética ou ambiental. Por outro lado, imuno-histoquímica de hemócitos circulantes revela mudanças em linhagens de hemócitos específicos na hemolinfa mas apenas em números relativos, não absolutos,. Melanizacao célula de cristal in vivo é difícil de quantificar como a distribuição de células de cristal é variável e hemócitos sésseis são dinâmicas 8,10. Pelo contrário, vários indivíduos devem marcar melanizacao célula de cristal cegamente. Finalmente, as observações feitas em um compartimento hemócito pode não necessariamente verdade em outros compartimentos.
Quando utilizados em conjunto, esses ensaios podem ser aplicados para distinguir genealterações de tiques que regulam a proliferação ou a sobrevivência daqueles que regulam a expressão do gene ou diferenciação. Por exemplo, uma alteração genética pode aumentar a proliferação de hemócitos tal que a concentração de hemócitos aumenta, mas as proporções relativas das linhagens de hemócitos permanece a mesma. Como alternativa, uma alteração genética pode promover alterações na diferenciação de hemócitos em linhagens específicas com nenhum efeito sobre a concentração total de hemócitos. A população de células de cristal podem ser interrogados rapidamente e facilmente usando o método vivo melanizacao em, facilitando telas genéticos e estudos de interacção genética. Este método pode ser usado em corroboração com estudos genéticos que utilizam profenoloxidase 1 (PPO1, também chamadas células pretas, Bc) alelos mutantes ou ensaios imuno-histoquímicos, que utilizam anticorpos específicos para a célula de cristal. A glândula linfática larval pode ser usado para tratar de questões semelhantes no que respeita processos celulares hematopoiéticas. numerosovias de sinalização estão envolvidos no estabelecimento e manutenção da glândula linfática e seus principais zonas. Cada zona tem a expressão do gene distinto e função na hematopoiese larvar. Além disso, utilizando o gânglio linfático pode revelar funções autônomas e não autónomos dentro das zonas dos gânglios linfáticos ou hemócitos dos gânglios linfáticos.
Métodos relevantes para o estudo da Drosophila hematopoiese foram compilados em recursos baseados em texto abrangentes só recentemente 26,27. Embora indispensável para o campo, estes recursos são limitados em escopo. Os métodos para medição da concentração de hemócitos, por exemplo, não foram incluídos. métodos escritos, especialmente aquelas que descrevem técnicas de dissecação, pode ser um desafio para dominar rapidamente. As contribuições adicionais foram feitas, fornecendo recursos visuais para ajudar com métodos, mas ainda eram limitados em número e escopo 28,29. Os métodos descritos aqui, ao mesmo tempo, não é abrangente, adicionar aos recursos avaietiqueta para auxiliar no estudo da hematopoiese Drosophila.
Oferecemos modificações e alternativas aos protocolos existentes. Por exemplo, existem várias vantagens para medir a concentração de hemócitos com um contador de células automatizado em vez de um hemocitômetro manual, incluindo o aumento da velocidade, facilidade e objetividade. Na nossa experiência, utilizando um banho de água para aquecer as larvas para a visualização de células de cristal resultaram em resultados muito variáveis, especialmente se as larvas são aquecidas nos recipientes em que eles são levantados. larvas de aquecimento em tubos de PCR individuais proporcionou resultados menos variáveis e mais reprodutíveis. O método de dissecação dos gânglios linfáticos descrito aqui, embora anteriormente descrito em um protocolo escrito 26, fornece uma alternativa para referências visuais existentes 28. Finalmente, se o acesso a um microscópio confocal é limitado, sugerimos que deconvolução de imagens de fluorescência padrão pode ser um substituto adequado para imagens confocal. Deconvolutiem algoritmos remover ou reatribuir fora de foco de luz captada por microscopia de fluorescência convencional, melhora a resolução e contraste semelhante, em princípio, para a eliminação de luz para fora de foco por microscopia confocal, e pode ser aplicado a duas dimensões e 3- dimensionais (Z-stack) imagens. Para algumas aplicações, como demonstrado aqui, deconvolução pode melhorar drasticamente a imagens tiradas com microscópios de fluorescência convencionais.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes ou financeiras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | |
| formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Triton | Fisher | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
| normal goat serum | Sigma | G9023-10ML | |
| normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001 | |
| N-propyl gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| glycerol | VWR | EM-4750 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| microscope cover glass, 22 mm square | Fisher | 12-544-10 | |
| microscope cover glass, 18 mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
| glass microscope slides | Fisher | 22-034-980 | |
| thermal cycler | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
| PCR tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 24-well plate | Corning | 351147 | |
| disposable transfer pipet | Fisher | 13-711-9AM | |
| fluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
References
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