Summary
Drosophila y sistemas hematopoyético de mamíferos comparten muchas características comunes, por lo que la Drosophila un modelo genético atractivo para estudiar la hematopoyesis. Aquí se demuestra la disección y el montaje de los principales órganos hematopoyéticos larvas para inmunohistoquímica. También describimos métodos para ensayar diversos compartimentos hematopoyéticas larvas incluyendo circulantes hemocitos y células de cristal sésiles.
Abstract
Existen muchos paralelismos entre los sistemas hematopoyético de mamíferos Drosophila y, a pesar de que carecen de la Drosophila linaje linfoide que caracterizan a la inmunidad adaptativa de los mamíferos. Drosophila y la hematopoyesis de mamíferos ocurren en fases distintas espacial y temporalmente para producir varios linajes de células sanguíneas. Ambos sistemas de mantenimiento de reservorios de células progenitoras de sangre con la que se ensanchan o se reemplazan los linajes maduros. El sistema hematopoyético permite Drosophila y mamíferos para responder y adaptarse a los desafíos inmunes. Es importante destacar que los reguladores transcripcionales y vías de señalización que controlan la generación, el mantenimiento, y la función del sistema hematopoyético se conservan de las moscas a los mamíferos. Estas similitudes permiten Drosophila que se utilizará para el desarrollo hematopoyético genéticamente modelo y la enfermedad.
Aquí ensayos detalle para examinar el sistema hematopoyético de las larvas de Drosophila. Enen particular, se describe métodos para medir el número de células de la sangre y la concentración, visualizar un linaje maduro específica in vivo, y llevar a cabo la inmunohistoquímica en células de la sangre en circulación y en el órgano hematopoyético. Estos ensayos pueden revelar cambios en la expresión génica y los procesos celulares, incluyendo la señalización, la supervivencia, la proliferación y la diferenciación y pueden ser utilizados para investigar una variedad de cuestiones relativas a la hematopoyesis. En combinación con las herramientas genéticas disponibles en Drosophila, estos ensayos se pueden utilizar para evaluar el sistema hematopoyético en alteraciones genéticas definidas. Aunque no específicamente descrito aquí, estos ensayos también se pueden usar para examinar el efecto de las alteraciones ambientales, tales como la infección o de la dieta, en el sistema hematopoyético.
Introduction
Los complejos mecanismos que regulan los factores de transcripción y vías de señalización que coordinan el desarrollo del sistema hematopoyético y que funcionan mal en las enfermedades hematológicas siguen siendo poco conocidos. Estos factores de transcripción y vías de señalización, así como su regulación, están altamente conservadas entre Drosophila y mamíferos hematopoyesis 1-5. De este modo el sistema hematopoyético Drosophila representa un modelo genético excelente para definir los mecanismos moleculares que controlan la hematopoyesis y enfermedades hematológicas subyacentes.
De manera similar a los mamíferos, Drosophila generan células de la sangre, llamados hemocitos, en fases espacial y temporalmente diferentes de la hematopoyesis. Tradicionalmente, se pensó Drosophila hematopoyesis estar restringida a las fases en el mesodermo embrionario y en la glándula de linfa larval. Estudios recientes proporcionan evidencia de que la hematopoyesis también se produce en clu sésiles larvalSters y en el abdomen adulto 6-8. Todas las fases hematopoyéticas producen dos tipos de hemocitos maduros: plasmatocitos y células de cristal. Plasmatocitos son células similares a los macrófagos que participan en la fagocitosis, la inmunidad innata y la cicatrización de heridas. células de cristal contienen pro-fenoloxidasas necesarios para melanización, una reacción utilizado en las respuestas inmunes de insectos y la cicatrización de heridas. La hematopoyesis de las larvas puede generar un tercer tipo de hemocitos maduro, llamado lamellocyte, en respuesta a ciertos desafíos inmunes tales como la infección de la avispa parasitoide 9,10. Lamellocytes son células grandes, que funcionan adherentes, en conjunción con plasmatocitos y células de cristal, para encapsular y neutralizar huevos de avispa establecidas en larvas de Drosophila. En ausencia de parasitación, lamellocytes no se encuentran en larvas de tipo salvaje. masas melanotic asemejan melanizados, huevos de avispa encapsulados; muchas cepas mutantes de Drosophila se desarrollan masas melanotic en ausencia de parasitación. La presencia de Lamellocitos y / o masas melanotic pueden ser indicativos de anomalías hematopoyéticas. De hecho, el fenotipo de masa melanotic se ha utilizado para identificar los genes y las vías de señalización implicadas en la hematopoyesis 11-14.
El sistema hematopoyético larval es el más estudiado hasta la fecha. Se compone de hemocitos que circulan en la hemolinfa, las agrupaciones de hemocitos sésiles estampadas debajo de la cutícula, y hemocitos residente en el ganglio linfático. El ganglio linfático es una serie de lóbulos bilaterales unidos al vaso dorsal. Cada lóbulo principal de la glándula linfática se divide en tres zonas principales. La zona más externa se conoce como la zona cortical y contiene maduración hemocitos. La zona más interna se llama la zona medular y se compone de precursores de hemocitos quiescentes. La tercera zona, el centro de señalización posterior, es un pequeño grupo de células en la base de la glándula de linfa que actúan como un nicho de células madre similares. Los primeros trabajos estableció las funciones críticas de Notch 15-18 19,20, JAK-STAT 18, y la actividad sin alas 21 para regular el desarrollo de las larvas de los ganglios linfáticos. Estudios más recientes han demostrado que la BMP 22, FGF-Ras 23, y la señalización del hipopótamo 24,25 también funcionan dentro de la glándula linfática de las larvas.
Cuatro ensayos hematopoyéticas larvas descritos aquí describen 1) la medición de circulación concentración de hemocitos, que se define como el número de células por unidad de volumen, 2) el aislamiento y la fijación de circulación hemocitos para inmunohistoquímica, 3) la visualización de células de cristal in vivo, y 4) la disección, fijación, y el montaje glándulas linfáticas para inmunohistoquímica. Estos ensayos se pueden utilizar como lecturas hematopoyéticas para evaluar las funciones y los reglamentos de las vías de señalización en el sistema hematopoyético larval. Mientras que estos métodos han sido utilizados previamente en el campo, la documentación visual de estos ensayos sólo recientemente ha comenzado 8,26-30. Varias publicaciones aquí citadas se ayudaful recursos que describen métodos similares y marcadores hematopoyéticos 26,31-33. Además, Trol y Viking son marcadores útiles de la membrana basal de los nódulos linfáticos.
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Protocol
1. Concentración de circulación Hemocyte
- Para obtener larvas de más o menos la misma etapa de desarrollo para este ensayo, restringir la recolección de huevos al permitir que las hembras ponen huevos que durante un período de tiempo fijo de 2 - 6 horas.
- Recoger las larvas en la disección de los pozos plato lleno de fosfato 1x solución salina tamponada (PBS, Tabla 1).
- Para cada larva, colocar 10 l 1x PBS en un tubo de microcentrífuga en hielo y 10 l 1x PBS sobre una almohadilla de disección limpia. Coloque la almohadilla de disección estereoscópico en una base iluminada.
- Secar una larva del individuo colocándolo en un tejido toallita antes de transferirla a una gota de PBS en la almohadilla de la disección.
- Con un par de pinzas, suavemente y con cuidado rasgar invertir la cutícula para liberar la hemolinfa.
NOTA: Tenga cuidado que no raspar o pinchar la cutícula ya que esto podría potencialmente liberar hemocitos sésiles 29. - Con una pipeta, recoger la hemolinfa de la almohadilla de disección. Evitar collecting restos de larvas como la grasa corporal.
- Añadir la hemolinfa a un tubo de microcentrífuga y mezclar pipeteando arriba y abajo.
NOTA: Varias muestras se pueden recoger de una vez y se mantuvo en hielo durante un máximo de una hora. - Opcional: Mezclar tripán azul con la muestra de la hemolinfa en partes iguales para teñir y excluir las células muertas. Recuento de células a menos de 3 minutos de la adición de azul de tripano, ya que es tóxico para las células.
- Mezclar la muestra con la pipeta arriba y abajo antes de cargar 10 l en una cámara de hemocitómetro.
- Si se utiliza un contador de células automatizado, establezca los parámetros apropiados para el tamaño celular y la circularidad. Por ejemplo, establecer un tamaño mínimo de células de 2 micras, un tamaño de celda máximo de 22 m, y una circularidad del 75 - 80% para detectar la redondez, redondas hemocitos normales 34. Experimenta con diferentes parámetros para detectar hemocitos más grandes y en forma de huso, como lamellocytes. Como alternativa, utilice un hemocitómetro para contar manualmente los hemocitos.
2. Circulating Hemocyte inmunohistoquímica
- Para obtener larvas de más o menos la misma etapa de desarrollo para este ensayo, restringir la recolección de huevos al permitir que las hembras ponen huevos que durante un período de tiempo fijo de 2 - 6 horas.
- Coloque un cubreobjetos en cada pocillo de una placa de 6 ó 12 pocillos.
NOTA: cubreobjetos Cuadrados (22 mm) de ajuste en placas de 6 pocillos y cubreobjetos redondos (18 mm de diámetro) de ajuste en placas de 12 pocillos. - Recoger las larvas en la disección de los pozos plato lleno de PBS 1x.
- Colocar 5 l 1x PBS en el centro de cada cubreobjetos.
- Colocar la placa en una base del microscopio estereoscópico iluminada.
- Secar una larva individual en un tejido de trapo y luego se coloca en el PBS en el cubreobjetos.
- Con un par de pinzas, suavemente romper e invertir cuidadosamente la cutícula. Antes de retirar la carcasa de las larvas, lo utilizan para difundir la hemolinfa de manera uniforme.
NOTA: Tenga cuidado que no raspar o pinchar la cutícula ya que esto podría potencialmente liberar hemocitos sésiles 29. - REPEAT para todas las larvas, la recolección de la hemolinfa de una larva por cubreobjetos. Permitir a los hemocitos se adhieran a los cubreobjetos para 5 -. 8 min a TA temperatura ambiente no exceden los 30 min antes de la fijación.
- Fijar hemocitos mediante la adición de 5 l de 7,5% de formaldehído (Tabla 1) a cada cubreobjetos de 15 min a temperatura ambiente.
- Lave cubreobjetos tres veces con PBS 1x. Inclinar la placa y aspirar PBS después de cada lavado. Para evitar el escurrimiento de la solución de permeabilización en el paso siguiente, utilizar el aspirador para eliminar el exceso de PBS de perímetro de los cubreobjetos.
- Añadir 100 l solución de permeabilización (Tabla 1) a cada cubreobjetos de 20 min a TA.
- Tip y golpear suavemente la placa para aspirar la solución de permeabilización.
- Diluir el anticuerpo primario con una solución de anticuerpo (Tabla 1) de acuerdo con las especificaciones del proveedor. Añadir al menos 500 l de solución de anticuerpo primario cubreobjetos en placas de 12 pocillos.Añadir al menos 1,5 ml en placas de 6 pocillos. Se incuba a 4 ° C durante la noche.
- Retirar la solución de anticuerpo primario y lavar cubreobjetos con 1x PBS durante 10 min en un agitador orbital, tres veces.
- Diluir anticuerpo secundario con una solución de anticuerpo de acuerdo con las especificaciones del proveedor. Añadir al menos 500 l solución de anticuerpo secundario a cubreobjetos en placas de 12 pocillos. Añadir al menos 1,5 ml para placas de 6 pocillos. Incubar durante al menos 2 horas a RT.
- Retirar la solución de anticuerpo secundario y lavar cubreobjetos con 1x PBS durante 10 min en un agitador orbital como en el paso 2,10, tres veces.
- Durante las etapas de lavado, de microscopio de vidrio limpio se desliza con 70% de etanol (Tabla 1), utilizando toallitas de tejido. Para cada cubreobjetos, coloque 5 l de tampón de montaje (Tabla 1) sobre el portaobjetos de vidrio.
NOTA: Los dos cubreobjetos caben en una diapositiva. - Aspirar el lavado final de PBS.
- El uso de fórceps para retirar cuidadosamente los cubreobjetos de las placas y lugar, inverted, en la parte superior de la memoria intermedia de montaje.
Nota: Los portaobjetos se pueden almacenar a 4 ° C antes de la imagen. El tiempo máximo de almacenamiento depende de la estabilidad de los anticuerpos utilizados. 6 y placas de 12 pocillos se pueden lavar y reutilizar.
3. En Vivo Crystal melanización Cell
- Para obtener larvas de más o menos la misma etapa de desarrollo para este ensayo, restringir la recolección de huevos al permitir que las hembras ponen huevos que para un determinado período de tiempo de 2-6 horas.
- Antes de comenzar, establecer una fuente de calor a 60 ° C.
NOTA: Un programa ciclador térmico de 60 ° C durante 10 min (seguido de un mantenimiento 25 ° C) que mejor funciona, pero un baño de agua u otra fuente de calor es suficiente siempre y cuando el calor se distribuye de manera consistente y uniformemente sobre cada larva. - Recoger las larvas en la disección de los pozos plato lleno de 1x PBS (Tabla 1).
- Uno a la vez, secar una larva en un tejido de paño y el lugar en el fondo de un tubo de PCR. Coloque cada larvaen un tubo de PCR separada. (Ver Figura 3A).
- Para obtener resultados consistentes, asegurarse de que la estancia larvas en la parte inferior de los tubos de PCR enfriando larvas en los tubos a 4 ° C durante 10 - 15 min y / o golpeando suavemente los tubos antes del calentamiento.
- Colocar los tubos de PCR en el termociclador (o baño de agua). Se calienta a 60 ° C durante 10 min.
- Retirar con cuidado las larvas de los tubos de PCR en la disección de los pozos plato lleno de frescos 1x PBS.
- larvas en seco en un tejido de paño y disponerlas sobre una superficie plana para obtener imágenes bajo un microscopio estereoscópico.
- Puntuación imágenes de larvas ciegas por varios individuos.
4. larval los nódulos linfáticos inmunohistoquímica
NOTA: El ganglio linfático se encuentra aproximadamente a un tercio longitud desde el extremo anterior de una larva ligeramente por debajo del cerebro en la cara dorsal. (Véase la flecha en la figura 3B.) El ganglio linfático flanquea el vaso dorsal y es más fácilmente disecado unido a la boca hooks o al cerebro. De tipo salvaje, inflamación de los ganglios tercer instar son estructuras muy pequeñas; los lóbulos primarios son de aproximadamente 100 a 200 micras de longitud. (Ver Figura 4A).
- Para obtener larvas de más o menos la misma etapa de desarrollo para este ensayo, restringir la recolección de huevos al permitir que las hembras ponen huevos que durante un período de tiempo fijo de 2 - 6 horas.
- Linfático disección de la glándula
- Para cada condición experimental, añadir 1 ml de 1x PBS (Tabla 1) a un pocillo de una placa de 24 pocillos.
- Añadir 1 gota de 0.1% PBST (Tabla 1) a cada pocillo usando una pipeta de transferencia desechable.
NOTA: El detergente, tal como Tween 20, se añade a disminuir la tensión superficial, lo que permite que el tejido se hunden hasta el fondo del pozo. - Coloque la placa plana en el hielo.
- Recoger las larvas en la disección de los pozos plato lleno de PBS 1x.
- Coloque una almohadilla de disección limpia en una base del microscopio estereoscópico iluminada. Utilice una pipeta de transferencia desechable para colocar Small gotas de 0,01% PBST (Tabla 1) en el teclado. Transferir una larva de una caída PBST durante la disección.
- Mantenga la larva con un par de pinzas de aproximadamente la longitud de un cuarto desde el extremo posterior, dorsal hacia arriba.
- Utilice otro par de pinzas para agarrar la cutícula inmediatamente anterior a las pinzas que sujetan la larva. Tire suavemente la cutícula hacia el extremo anterior hasta que los ganchos de la boca están expuestos.
NOTA: El objetivo es pelar la cutícula sin molestar a ningún estructuras internas. - Soltar la cutícula y usar ambas pinzas para cortar la larva en dos. Retire el extremo posterior de la gota PBST.
NOTA: Si la cutícula no se desprende todo el camino a los ganchos de la boca, cortar la larva en dos y retire el extremo posterior. Utilice un par de pinzas para sostener el borde de la cutícula, y utilizar el otro par de pinzas para empujar los ganchos de la boca a través de la abertura. Esto invertirá la cutícula y exponer los ganchos de la boca. Esto se puede utilizar como una alternmétodo de disección comió también. - Utilice un par de pinzas de precisar la cutícula (ya sea la cutícula ventral, la aleta dorsal de la cutícula, o ambos) para la estabilidad.
- Utilice otro par de pinzas para agarrar los ganchos de la boca expuestas y tire suavemente hacia fuera.
NOTA: Esto separa la cutícula de las estructuras internas. Lo ideal sería que el ojo / discos imaginales de las antenas, el cerebro, la glándula anillo, y glándula de linfa que flanquea el vaso dorsal quede unida a los ganchos de la boca. - Mientras que mantiene los ganchos de la boca, retirar con cuidado las estructuras no deseadas, tales como las glándulas salivales, la grasa corporal, y el intestino.
NOTA: Si el cerebro se separa de los ganchos de la boca, la glándula linfática todavía podría estar unido a y se recoge con el cerebro. En este caso, mantenga el cordón nervioso ventral en lugar de los ganchos de la boca. - El uso de los ganchos de la boca o cordón nervioso ventral como un mango, traslado al complejo diseccionado que contiene el ganglio linfático al pozo de hielo. No exceda de 30 minutosantes de la fijación.
- La fijación y la inmunohistoquímica
- Coloque la placa de 24 pocillos en la base microscopio estereoscópico.
- Utilizar una pipeta P200 para retirar cuidadosamente la PBST del pozo.
NOTA: Vacío, pozos vecinos son útiles para depositar temporalmente residuos. - Añadir con cuidado 200 l 3,7% de formaldehído (Tabla 1) por el lado del pozo y agitar la placa para asegurarse de que los tejidos disecados están completamente sumergidos.
- Devolver la placa de hielo durante 30 minutos. Si los ganglios linfáticos expresan la proteína (s) fluorescente, mantenga la placa de cubierta para evitar photobleaching.
- Utilizar una pipeta P200 para retirar cuidadosamente el fijador.
- Lavar mediante la adición de 200 l de PBS 1x para el bienestar y la colocación de la placa en un agitador orbital durante 5 min a temperatura ambiente. Utilizar una pipeta P200 para retirar cuidadosamente la PBS.
NOTA: Se ha corregido los ganglios linfáticos se pueden dejar en hielo en PBS hasta los ganglios linfáticos son d para todas las condiciones experimentalesissected y fija. - Repita los pasos del lavado dos veces más.
- Añadir 200 l solución de permeabilización (Tabla 1) para el pozo. Coloque la placa en un agitador orbital durante 45 minutos a temperatura ambiente.
NOTA: 45 min es el "patrón oro" para la permeabilización de los ganglios linfáticos, pero los autores tienen éxito después de sólo 20 minutos. - Retire la solución con una pipeta P200.
- Diluir el anticuerpo primario con una solución de anticuerpo (Tabla 1) de acuerdo con las especificaciones del proveedor. Añadir solución de anticuerpo primario 300 l para el bienestar y asegurar que los tejidos disecados están completamente sumergidos. Se incuba a 4 ° C durante la noche.
- Usar una pipeta de p200 para eliminar el anticuerpo primario.
- Lavar mediante la adición de 200 l de PBS 1x para el bienestar y la colocación de la placa en un agitador orbital durante 10 min a temperatura ambiente. Utilizar una pipeta P200 para retirar cuidadosamente la PBS.
- Repita los pasos del lavado dos veces más.
- Se diluye una secundariantibody con una solución de anticuerpo de acuerdo con las especificaciones del proveedor. Añadir solución de anticuerpo secundario 300 l para el bienestar y asegurar que los tejidos disecados están completamente sumergidos. Incubar en un agitador orbital durante al menos 2 horas a RT.
- Utilizar una pipeta P200 para eliminar el anticuerpo secundario y lavar como se describe en los pasos 4.3.12 y 4.3.13. No retire la PBS después del último lavado.
- Los ganglios montaje glándula
- Microscopio de vidrio limpio se desliza usando etanol al 70% (Tabla 1) y toallitas de tejido.
- Para cada condición experimental, colocar una gota de montaje tampón (Tabla 1) sobre el portaobjetos de vidrio.
NOTA: Los dos condiciones caben en una diapositiva. Montaje de volumen de tampón depende del número de ganglios linfáticos para ser montado. Utilice 2 l durante aproximadamente 18 - 20 ganglios linfáticos, 1 l a 10 - 12, y 0,5 l de 5 o menos. - Colocar el portaobjetos de un microscopio estereoscópico en una base iluminada.
- Para un máximo de dos condiciones a la vez, transferir la totalidad de los ganglios linfáticos del pozo a la memoria intermedia de montaje con una pinza, usando los ganchos de la boca o cordón nervioso ventral como asa.
- Espacio de los tejidos disecados de manera uniforme en una forma circular o rectangular, la difusión de la memoria intermedia de montaje en el proceso.
- Para cada uno de los tejidos disecados, individualmente, deslice un tong del fórceps bajo el vaso dorsal y tirar suavemente hacia la periferia de la memoria intermedia de montaje.
NOTA: Para ello se utilizará la glándula linfática del resto de los tejidos disecados y aplanar el ganglio linfático en el cristal. - El uso de una de las pinzas de las pinzas y un movimiento de sierra, corte el vaso dorsal entre la glándula de la linfa y el cerebro.
- Mueva el resto de los tejidos disecados en el lado opuesto de la glándula de la linfa, en el borde más exterior de la memoria intermedia.
NOTA: Los tejidos disecados no deseados finalmente formar un perímetro alrededor de los ganglios linfáticos y servir como un soporte sobre el which cubreobjetos descansará. - Repita hasta que todos los ganglios linfáticos están separados de los tejidos disecados, reservando uno de los tejidos disecados no deseados para colocar en el centro.
- Tome un cubreobjetos entre dos dedos. Compruebe que el cubreobjetos está libre de polvo y huellas dactilares. Si es necesario, utilice un pañuelo de papel y limpie el 70% de etanol para limpiar el cubreobjetos.
- Asegurarse de que el borde del cubreobjetos es paralelo al borde de la lámina de vidrio, baje con cuidado el cubreobjetos sobre la memoria intermedia de montaje.
NOTA: Los portaobjetos se pueden almacenar a 4 ° C antes de la imagen. El tiempo máximo de almacenamiento depende de la estabilidad de los anticuerpos utilizados. placas de 24 pocillos se pueden lavar y reutilizar.
5. Imaging
- Imagen fija hemocitos y montado glándulas linfáticas en una fluorescencia estándar apropiado o microscopio confocal a 20X o mayor magnificación de acuerdo al manual de operación del fabricante. toda la imagen larvas en un soporteard estereomicroscopio con un aumento de 2 veces de acuerdo al manual de operación del fabricante.
- Siga las instrucciones del proveedor de software de deconvolución, si se desea.
| Solución | Composición | Almacenamiento | comentarios |
| 1x PBS | / L de cloruro de potasio 200 mg | temperatura ambiente | |
| 200 mg / L de fosfato de potasio monobásico | |||
| de cloruro de sodio / L 8,000 mg | |||
| 1150 mg / L de fosfato de sodio dibásico | |||
| dH2O | |||
| Fijador | 3,7% o 7,5% de formaldehído en PBS 1x | temperatura ambiente en la oscuridad | El formaldehído es tóxico. |
| solución de permeabilización / diluyente de anticuerpos | 0,4% de Triton | 4 ° C | La fórmula estándar utiliza 0,4% de Triton pero los autores utilizan 0,1% de Tween 20 con éxito. Se utiliza para diluir los anticuerpos primarios y secundarios de acuerdo a las concentraciones recomendadas de los proveedores. |
| 5% de albúmina de suero bovino, suero de cabra normal, o suero normal de burro | |||
| 1x PBS | |||
| 70% de etanol | 70% de etanol prueba 200 en dH2O | temperatura ambiente | |
| tampón de montaje | 0,5% de galato de n-propilo | 4 ° C en la oscuridad | galato de n-propilo es perjudicial. DAPI es un mutágeno. |
| 80% de glicerol | |||
| Opcional: DAPI 1 mg / ml (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) | |||
| 1x PBS | |||
| 0,1% PBST | 0,1% de Tween 20 en PBS 1x | temperatura ambiente | |
| 0,01% PBST | Dilución 1:10 del 0,1% PBST | temperatura ambiente |
Tabla 1. Las soluciones utilizadas en este protocolo.
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Representative Results
La concentración circulante Hemocyte
Números hemocitos aumentan en todo el desarrollo larval 35. Para ilustrar que este método detecta diferencias en el número de hemocitos y concentración, independientemente de la causa biológica, medimos las concentraciones de hemocitos de larvas retardada y no retardada. La pérdida de la hormona protoracicotrópica (PTTH) mediante la ablación genética de las neuronas productoras de PTTh (PTTh> sombría) produce un retraso en el desarrollo larvario 36. Para cada genotipo, se midieron las concentraciones de hemocitos como se describe en el Protocolo 1 durante al menos 8 larva individuo elevada a 25 ° C. En 120 hr después de una recogida de huevos 2 h, la concentración media de hemocitos por larva tardía (PTTH> sombrío) es menor que la concentración media de hemocitos por larva control (PTTH). Sólo después de 9 días hace la concentración media de hemocitos por enfoque larva retrasado la de los controles (
Imágenes tomadas de un contador de células automatizado muestran una muestra de la hemolinfa deseable limpio y una muestra que contiene los desechos, lo que podría dar lugar a mediciones inexactas (Figura 1C). tamaño mínimo y máximo de células se ajusta a 2 micras y 22 micras, respectivamente. La circularidad se establece en 75-80% redondez. Estos parámetros están concebidos como directrices y deben optimizarse empíricamente.
La inmunohistoquímica circula Hemocyte
Se recogieron los hemocitos circulantes que expresan la proteína fluorescente verde (GFP), se fijaron y se incubaron con una mezcla de anticuerpos específicos plasmatocyte (P1a y P1b, István Andó) 31, como se describe en el Protocolo 2(Figura 2). La imagen fue tomada en un microscopio de fluorescencia estándar y se muestra inalterada y después de deconvolución iterativa restringido. En este caso, la deconvolución no mejoró drásticamente la calidad de la imagen.
En Vivo Crystal melanización célula
Las larvas se coloca en la parte inferior de los tubos de PCR antes melanización célula de cristal inducida por calor a como se describe en el Protocolo 3 (Figura 3A). Las flechas rojas indican tubos en los que las larvas están demasiado lejos de la parte inferior y puede ser calentado de manera desigual. la distribución desigual de calor a través de la larva individual puede aumentar la variabilidad en el melanización de células de cristal dentro de la larva.
Una larva de tipo salvaje fotografiado en un microscopio estereoscópico estándar muestra el patrón típico de células de cristal melanizados en grupos sésiles después de la exposición al calor (Figura 3B). células de cristal Melanized en el ganglio linfático se ven a veces.
Larval los nódulos linfáticos inmunohistoquímica
Tercer estadio larval de los ganglios se diseccionaron, fijaron, y se montan como se describe en el Protocolo 4. Una imagen de contraste de interferencia diferencial (DIC) tomadas en un microscopio de fluorescencia estándar muestra los lóbulos de la glándula linfáticos primarios y secundarios que flanquean el vaso dorsal (Figura 4A).
Un ganglio linfático en el que la zona medular y el centro de señalización posterior fueron genéticamente marcadas con proteína mejorada azul fluorescente (EBFP2) y GFP, respectivamente, se tiñó con un anticuerpo contra el dominio intracelular Notch (C17.9C6, Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma) como se describe en el Protocolo 4. se tomaron imágenes Z-stack en un microscopio de fluorescencia estándar. Un int única máxima imagen de proyección ensity aparece inalterada y después de deconvolución iterativa restringida (Figura 4B). En este caso, deconvolución mejoró drásticamente la calidad y el detalle de la imagen.
Figura 1. Concentración de circulación Hemocyte. A) Una porción del medio estándar de Drosophila fue removido (a la derecha) para promover la puesta de huevos durante un período de recolección de huevos 2 h. B) La concentración promedio de hemocitos por larva retraso en el desarrollo (PTTH> sombría) fue inferior a la la concentración media de hemocitos por larvas de control (PTTH) 120 horas después de la puesta de huevos (AEL). La concentración media de hemocitos por larva retraso acercó nivel de control 9 días AEL. Las barras de error representan ± SEM C) sin muestras de hemolinfa (izquierda) y con los desechos (derecha). Las barras de escala representan 0,1 mm.href = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54544/54544fig1large.jpg" target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. circulante Hemocyte inmunohistoquímica. Hemocitos expresando GFP genéticamente se recogieron y se fija a un cubreobjetos. Un anticuerpo-plasmatocyte específico se utilizó para plasmatocitos mancha (rojo). DAPI se muestra en azul. Sin transformar imagen tomada con un microscopio de fluorescencia (izquierda). La misma imagen después de deconvolución (derecha). Las barras de escala representan 50 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La Figura 3. En Vivo A) Las larvas se colocaron individualmente en tubos de PCR antes del calentamiento. Las flechas rojas indican las larvas que no están en la parte inferior de los tubos B) Un patrón melanización célula de cristal típica después del calentamiento, que a veces revela la glándula linfática (flecha;. Lado dorsal se muestra, es anterior izquierda). La barra de escala representa 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Una imagen DIC de un ganglio linfático de larvas de tercer estadio que muestra el vaso dorsal (DV), lóbulos primarios (1 °), y los lóbulos secundarios (2 °), las larvas de los nódulos linfáticos inmunohistoquímica. A). La barra de escala representa 100 micras. B) Un representante de tercer estadio larvario linfáticos glándula from una larva que expresa genéticamente EBFP2 en la zona medular y las buenas prácticas agrarias en el centro de señalización posterior. El ganglio linfático se tiñó con un anticuerpo contra el dominio intracelular Notch (rojo). imagen sin alterar tomada con un microscopio de fluorescencia (arriba). La misma imagen después de deconvolución (parte inferior). Las barras de escala representan 20 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Tras la alteración genética o ambiental, los cuatro métodos descritos aquí pueden ser utilizados individualmente o en combinación para analizar procesos distintos durante la hematopoyesis, tales como señalización, la supervivencia, la proliferación y la diferenciación de Drosophila hematopoyesis es un proceso dinámico.; el número de hemocitos por animal aumenta 35 y la expresión de genes y la estructura de la glándula de linfa cambia 32 durante el desarrollo. Antes de realizar estos ensayos, por lo tanto, es fundamental para restringir colecciones de huevo al permitir que las hembras poner huevos durante un período de tiempo determinado y para confirmar el estado de desarrollo de las larvas deseada. Para las colecciones más cortos de huevo (menos de 6 horas) o para casos en los que las mujeres no son saludables o escasa, la puesta de huevos puede fomentarse mediante la creación de grietas en la comida. Esto se puede lograr mediante la eliminación de una porción de los alimentos con una espátula de etanol-limpiado. Si el exceso de líquido se acumula en los alimentos, tejidos uso toallitas para absorber ellíquido. (Ver Figura 1A).
Sola, los métodos descritos aquí tienen limitaciones. Por ejemplo, la medición de la concentración de hemocitos circulantes captura los cambios en la supervivencia o la proliferación de hemocitos, pero no proporciona información sobre la distribución de hemocitos linaje o cualquier interrupción linaje que podría ser como consecuencia de la alteración genética o ambiental. Por el contrario, la inmunohistoquímica de hemocitos circulantes revela cambios en linajes específicos de hemocitos en la hemolinfa, pero sólo en números relativos, no absolutos,. Melanización celda de cristal in vivo es difícil de cuantificar como la distribución de celda de cristal es variable y hemocitos sésiles son dinámicos 8,10. Por el contrario, varios individuos deben anotar melanización celda de cristal ciegamente. Por último, las observaciones hechas en un compartimiento de hemocitos podría no ser necesariamente cierto en otros compartimentos.
Cuando se utilizan conjuntamente, estos ensayos se pueden aplicar a distinguir genalteraciones de tic que regulan la proliferación o la supervivencia de las que regulan la expresión génica o la diferenciación. Por ejemplo, una alteración genética puede aumentar la proliferación de hemocitos, tales que la concentración de hemocitos aumenta, pero las proporciones relativas de los linajes de hemocitos sigue siendo el mismo. Alternativamente, una alteración genética puede promover cambios en la diferenciación de hemocitos en linajes específicos que no tienen efecto sobre la concentración total de hemocitos. La población de células de cristal puede ser interrogado rápida y fácilmente usando el método melanización in vivo, lo que facilita las pantallas de genética y estudios de interacciones genéticas. Este método se puede utilizar en la corroboración con estudios genéticos que utilizan prophenoloxidase 1 (PPO1, también llamadas células negras, Bc) alelos mutantes o ensayos inmunohistoquímicos que utilizan anticuerpos específicos de la célula de cristal. El ganglio linfático larvas se puede utilizar para hacer frente a cuestiones similares con respecto a los procesos celulares hematopoyéticas. Numerosovías de señalización están involucrados en el establecimiento y mantenimiento de la glándula linfática y sus principales zonas. Cada zona tiene la expresión de genes distintos y función en la hematopoyesis larval. Además, la utilización de la glándula linfática puede revelar funciones autónomas y no autónomas dentro de las zonas de la glándula linfática o hemocitos glándula de linfa.
Métodos pertinentes para el estudio de la hematopoyesis Drosophila se han recopilado en los recursos basados en textos completos sólo recientemente 26,27. Aunque indispensable para el campo, estos recursos son limitados en su alcance. Los métodos para medir la concentración de hemocitos, por ejemplo, no se incluyeron. métodos escritos, especialmente aquellas que describen las técnicas de disección, puede ser difícil de dominar rápidamente. Las contribuciones adicionales se han hecho, la provisión de recursos visuales para ayudar con los métodos, pero todavía estaban limitados en su número como en alcance 28,29. Los métodos descritos aquí, y al mismo tiempo no es completa, añadir a los recursos AvaIlable para ayudar en el estudio de la Drosophila hematopoyesis.
Ofrecemos modificaciones y alternativas a los protocolos existentes. Por ejemplo, hay varias ventajas para medir la concentración de hemocitos con un contador de células automatizado en lugar de un hemocitómetro manual, incluyendo aumento de la velocidad, facilidad y objetividad. En nuestra experiencia, el uso de un baño de agua para calentar las larvas para la visualización celda de cristal dio lugar a resultados muy variables, sobre todo si las larvas se calientan en los viales en los que se han criado. larvas de calefacción en tubos de PCR individuales arrojó resultados menos variables y más reproducibles. El método de disección de los ganglios linfáticos se describe aquí, sin embargo esbozado previamente en un protocolo escrito 26, ofrece una alternativa a las referencias visuales existentes 28. Por último, si el acceso a un microscopio confocal es limitado, se sugiere que la deconvolución de imágenes de fluorescencia estándar podría ser un sustituto adecuado para las imágenes confocal. Deconvolutien algoritmos o bien eliminar o reasignar fuera de foco luz captada por microscopía de fluorescencia convencional, mejorar la resolución y contraste similar en principio a la eliminación de la luz fuera de foco por microscopía confocal, y se puede aplicar a 2 dimensiones y 3- dimensionales (Z-stack) imágenes. Para algunas aplicaciones, como se demuestra aquí, deconvolución puede mejorar dramáticamente las imágenes tomadas con microscopios de fluorescencia convencionales.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses en competencia o financieras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | |
| formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Triton | Fisher | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
| normal goat serum | Sigma | G9023-10ML | |
| normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001 | |
| N-propyl gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| glycerol | VWR | EM-4750 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| microscope cover glass, 22 mm square | Fisher | 12-544-10 | |
| microscope cover glass, 18 mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
| glass microscope slides | Fisher | 22-034-980 | |
| thermal cycler | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
| PCR tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 24-well plate | Corning | 351147 | |
| disposable transfer pipet | Fisher | 13-711-9AM | |
| fluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
References
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