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Chemistry

Elettroforesi capillare per monitorare Peptide innesto su Chitosano film in tempo reale

Published: October 26, 2016 doi: 10.3791/54549

Abstract

Free-soluzione elettroforesi capillare (CE) separa analiti, composti generalmente praticati in soluzione mediante l'applicazione di un campo elettrico. Rispetto ad altre tecniche di separazione analitiche quali la cromatografia, CE è economico, robusto e non richiede alcuna preparazione del campione (per un numero di matrici naturali complesse o campioni polimerici) effettivamente. CE è veloce e può essere utilizzata per seguire l'evoluzione delle miscele in tempo reale (per esempio, cinetica di reazione chimica), i segnali osservati per i composti separati sono direttamente proporzionali alla loro quantità in soluzione.

Qui, l'efficienza della CE è dimostrata per monitorare l'innesto covalente di peptidi su film chitosano per successive applicazioni biomediche. proprietà antimicrobiche e biocompatibili di Chitosano rendono un materiale interessante per applicazioni biomediche come substrati di crescita cellulare. Covalente innestando le RGDS peptide (arginina - glicina -acido aspartico - serina) sulla superficie del film chitosano mira a migliorare l'adesione cellulare. Storicamente, cromatografia e analisi amminoacidica sono stati utilizzati per fornire una misura diretta della quantità di peptide innestato. Tuttavia, la separazione rapida e assenza di preparazione del campione è fornito da CE permette il monitoraggio in tempo reale altrettanto precisa ancora del processo di innesto peptide. CE è in grado di separare e quantificare le diverse componenti della miscela di reazione: la (non innestate) peptide e gli agenti di accoppiamento chimici. In questo modo l'uso di CE traduce in film perfezionati per applicazioni a valle.

I film chitosano sono stati caratterizzati mediante spettroscopia NMR allo stato solido (risonanza magnetica nucleare). Questa tecnica è più tempo e non può essere applicato in tempo reale, ma produce una misura diretta del peptide e quindi convalida la tecnica CE.

Introduction

Soluzione libero elettroforesi capillare (CE) è una tecnica che separa composti in soluzioni basate sulla loro carica-attrito rapporto di 1,2. Rapporto Charge-to-size è spesso menzionato nella letteratura, ma questa semplificazione non si applica a polielettroliti, tra cui polipeptidi in questo lavoro, ed è stato anche dimostrato di non essere adatto per piccole molecole organiche 3. CE differisce da altre tecniche di separazione in quanto non hanno una fase stazionaria, solo uno sfondo elettrolita (di solito un buffer). Questo permette la tecnica per essere resistente nella sua capacità di analizzare una vasta gamma di campioni con matrici complesse 4 come fibre vegetali 5, infusi fermentazione 6 innesto su polimeri sintetici 7, campioni alimentari 8, e peptidi difficilmente solubili 9 senza preparazione del campione noioso e purificazione. Ciò è particolarmente significativo per polielettroliti complessi che hanno problemi di dissoluzione (iuch come chitosano 10 e gellano 11) e quindi esiste come aggregato o precipitato in soluzione e sono stati analizzati con successo senza filtrazione campione. Inoltre, l'analisi degli zuccheri in cereali per la colazione coinvolto l'iniezione di campioni con particelle di campioni di cereali per la colazione precipitato in acqua 8. Questo si estende anche all'analisi dei polielettroliti o copolimeri 12,13 ramificati. Un'ampia attività è stata completata nello sviluppo di tecniche CE specificamente per l'analisi di proteine per proteomica 14, separazione chirale di peptidi naturali o sintetici 15 e separazioni microchip di proteine e peptidi 16. Poiché la separazione e l'analisi avvengono in un capillare, solo piccoli volumi di campione e vengono utilizzati solventi che permette CE di avere un costo di esercizio inferiore rispetto ad altre tecniche di separazione compresa cromatografia 5,6,17. Poiché la separazione da CE è veloce, permette il monitoAnello di cinetica di reazione. Questo è stato dimostrato nel caso di innesto di peptidi su film chitosano per una migliore adesione cellulare 18.

Il chitosano è un polisaccaride derivato dal -deacetylation N di chitina. Film chitosano possono essere utilizzati per diverse applicazioni biomediche come bioadesivi 19 e substrati di crescita cellulare 18,20, a causa della biocompatibilità del chitosano 21. Attaccamento cellulare di specifiche proteine della matrice extracellulare, come fibronectina, collagene e laminina, è direttamente legata alla sopravvivenza delle cellule 22. In particolare, differenti tipi cellulari richiedono spesso attaccamento alle diverse proteine ​​della matrice extracellulare per la sopravvivenza e il corretto funzionamento. Adesione cellulare ai film di chitosano ha dimostrato di essere migliorata attraverso l'innesto di fibronectina 23; tuttavia, la preparazione, la purificazione e l'innesto di tali proteine ​​di grandi dimensioni non è economicamente sostenibile. In alternativa una serie di piccoli peptidi have stato dimostrato di essere in grado di imitare le proprietà di grandi proteine ​​della matrice extracellulare. Ad esempio, i peptidi come i RGD mimetici fibronectina (arginina - glicina - acido aspartico) e RGDS (arginina - glicina - acido aspartico - serina) sono stati utilizzati per facilitare e rafforzare il legame delle cellule 24. Covalent innesto di RGDS Onto film chitosano ha migliorato l'adesione delle cellule per cellule conosciute da allegare alla fibronectina in vivo 18. Sostituendo le proteine ​​più grandi piace fibronectina con peptidi più piccoli che hanno la stessa funzionalità fornisce una significativa riduzione dei costi.

Qui, peptide innesto di chitosano è stato eseguito come precedentemente pubblicato 18. Come precedentemente dimostrato, questo approccio fornisce innesto semplice ed efficace utilizzando agenti di accoppiamento EDC-HCl (1-etil-3 (3- dimetilaminopropil) carbodiimide ) e NHS (N -hydroxysuccinimide) per funzionalizzare l'acido carbossilico dei RGDS essere innestato sullapellicola chitosano. Due vantaggi di questo metodo sono innesto che non richiede alcuna modifica del chitosano o del peptide, e sono realizzati nel mezzo acquoso per massimizzare la compatibilità con le future applicazioni di coltura cellulare 18,20. Mentre gli agenti di accoppiamento e il peptide può essere caricata, CE è un metodo adatto per l'analisi delle cinetiche di reazione. È importante sottolineare che l'analisi delle cinetiche di reazione tramite CE consente il monitoraggio in tempo reale della reazione di innesto, e quindi permette sia ottimizzando e quantificare il grado di innesto.

Mentre non è normalmente necessaria, i risultati dell'analisi CE possono essere convalidati off-line da una misura diretta del peptide innesto su film chitosano utilizzando allo stato solido NMR (risonanza magnetica nucleare) spettroscopia 25,26 per dimostrare l'innesto covalente del peptide sulla pellicola 18. Tuttavia, rispetto a stato solido spettroscopia NMR, l'analisi in tempo reale fornito daCE consente la quantificazione del consumo peptide in tempo reale e quindi la capacità di valutare la cinetica di reazione.

Il suddetto metodo è semplice e consente l'analisi in tempo reale di peptide innesto su film chitosano con quantificazione indiretta del grado dell'innesto. Il metodo illustrato può essere esteso alla valutazione quantitativa in tempo reale di diverse reazioni chimiche purché i reagenti oi prodotti da analizzare può essere caricato.

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Protocol

1. Preparazione di chitosano Films

  1. Pesare 2 g di acido acetico glaciale, completa a 100 ml con acqua ultrapura.
  2. Pesare 1,7 g di polvere di chitosano, aggiungere 100 ml di soluzione di acido 2% m / m acetico acquoso. Mescolare per 5 giorni con ancoretta e piatto agitazione magnetica a temperatura ambiente sia coperto con un foglio di alluminio o al buio.
  3. Centrifugare la dispersione chitosano a 1.076 xg a 23 ° C per 1 ora. Raccogliere il surnatante con una siringa ed eliminare il precipitato.
  4. Per ogni film, un'aliquota da 10 ml della sospensione chitosano in a 9 cm In plastica Petri a temperatura ambiente. Lasciare i film coperti ad asciugare per almeno 7 giorni.
  5. forbici Uso tagliare i film secchi in 1 x 1 cm quadrati. Nota: L'esperimento può essere messo in pausa in questa fase.

2. Preparazione di PBS (PBS)

  1. Pesare 8 g di cloruro di sodio, cloruro di potassio 0,2 g, 1,44 g di disodio idrogeno fosfatophate e 0,24 g potassio fosfato monobasico.
  2. Sciogliere questi prodotti chimici pesati in 800 ml di acqua ultrapura e titolare la soluzione con acido cloridrico concentrato fino a pH 7,4.
    Nota: L'esperimento può essere messo in pausa in questa fase.

3. Preparazione di 75 mM Sodio borato Tampone a pH 9.2

  1. Pesare 3,0915 g di acido borico. Sciogliere in 75 ml di acqua ultrapura.
  2. Titolare la soluzione di acido borico a pH 9,2 con una soluzione di idrossido di sodio ad una concentrazione di 10 M o superiore.
    Attenzione: concentrato soluzioni d'idrossido di sodio sono corrosivi e devono essere maneggiati con i guanti.
  3. Completa di acqua ultrapura per ottenere 100 ml di soluzione. Ciò produce un tampone borato di sodio 500 mM a pH 9.2.
  4. Diluire il tampone borato di sodio da 500 mm con acqua ultrapura a 75 mm tampone borato di sodio. Nota: L'esperimento può essere messo in pausa in questa fase.

4. Preparazione di Chitosan FiLMS per la reazione di innesto

  1. Risciacquare 10 film chitosano quadrati (1 x 1 cm) in 5 ml di PBS per 2 ore in una piastra di Petri a temperatura ambiente.
  2. Durante questo tempo, preparare e validare lo strumento elettroforesi capillare (fase 5).

5. Preparazione e validazione dello strumento di elettroforesi capillare

  1. Preparare un capillare di silice fusa 43,5 cm nudo con un diametro interno di 50 micron (43,5 centimetri è la lunghezza totale, la lunghezza efficace per la finestra di rilevamento è tipicamente 35 cm) indebolendo il rivestimento esterno in polimero del capillare alla lunghezza impostata con un utensile smussato quindi scattare il capillare.
    1. Creare una finestra per il capillare usando un accendino per bruciare il rivestimento polimerico a 8,5 cm dal ingresso e dopo si raffredda pulirla con etanolo. Bruciare il rivestimento del capillare a ciascuna estremità per qualche millimetro con un accendino, e dopo si raffredda pulirla con etanolo.
    2. Luogo capillare insiFinestra di rilevamento e installarlo nel cassetto capillare mettendolo a lunghezze uguali in ingresso e uscita e avvolgerlo attorno ai mandrini della cassetta. Quindi installare la cassetta nello strumento elettroforesi capillare.
  2. Impostare i parametri del metodo per ogni separazione. Nel menu del software selezionare "metodo" e poi "modificare l'intero metodo". Impostare la temperatura, il tempo, la tensione e fiale utilizzati per la separazione (ad esempio 25 ° C, 10 min, 30 kV).
    1. Nella sezione di pre-condizionamento, impostare le vampate consecutive: 10 min con 1 M di idrossido di sodio (in acqua), 5 min con 0,1 M di idrossido di sodio (in acqua), 5 min con acqua ultrapura e 5 min con 75 mM di tampone borato di sodio a pH 9.2 per il primo metodo di una serie di analisi.
    2. Per i metodi successivi, impostare il set le vampate consecutivi nella sezione precondizionamento: 1 min con 1 M di idrossido di sodio (in acqua), 5 min con 75 mM di tampone borato di sodio a pH 9.2.
    3. Nella sezione di iniezione, parametri impostati per un'iniezione idrodinamico con pressione 30 mbar per 10 sec per tutti i metodi. Nella sezione di separazione, impostare le condizioni di separazione a 30 kV a 25 ° C per 9 minuti per tutti i metodi.
      NOTA: consultare il manuale di specifici dello strumento CE come procedura per il funzionamento dello strumento CE può variare tra i costruttori. Preparare la soluzione di idrossido di sodio 1 M il giorno.
  3. Iniettare e separare standard interno neutra (10 ml di 10% v / v dimetilsolfossido (DMSO), in acqua diluita in 450 ml di 75 mM tampone borato di sodio). Poi iniettare e separare nello stesso modo uno standard oligoacrylate (disciolto in acqua ultrapura a 10 g ∙ L -1; vedere Elenco dei materiali) per verificare la validità del capillare. Mettere in pausa la sequenza di qui fino a quando la reazione di innesto è pronto per iniziare.

6. Accrescimento di RGDS Onto chitosano Film

  1. Pesare il peptide (1 mg RGDS)e gli agenti di accoppiamento (3 mg EDC-HCl e 2 mg NHS).
  2. 2 ore dopo l'inizio della ammollo pellicola chitosano in PBS, sciogliere il peptide e gli agenti di accoppiamento in 5 ml di PBS.
    1. Dai un'aliquota 50 ml di questa soluzione. Aggiungere 2 ml di 10% v / v DMSO in acqua come standard neutro interno per aliquota. Analizzare l'aliquota con CE (vedi punto 7).
  3. Rimuovere i 5 ml di PBS utilizzati per lavare i film chitosano dalla capsula di Petri. Aggiungere la soluzione di agenti peptidici e accoppiamento 5 ml al piatto Petri contenente i film chitosano.
  4. Coprire la piastra di Petri con la pellicola di paraffina e posizionarlo su un agitatore orbitale a temperatura ambiente. Prendere 50 microlitri aliquote di mezzi di reazione ad orari prestabiliti.
    NOTA: Il tempo di analisi totale con CE è di 15 minuti, quindi una aliquota può essere assunto ogni 15 min (o ogni 30 min se due reazioni sono monitorati in parallelo, etc.).
    1. Aggiungere 2 ml di 10% v / v DMSO in acqua come standard neutro interno ad ogni alIQUOT.
      NOTA: Aliquote dovrebbero essere analizzati con CE non appena si sono presi (vedi punto 7).
  5. Dopo 4 ore di agitazione e la rimozione aliquote, rimuovere la piastra di Petri da shaker. Rimuovere il mezzo di reazione dalla piastra di Petri. Aggiungere 5 ml di PBS per risciacquare i film chitosano.
  6. Rimuovere la PBS dalla capsula di Petri, lavare il film chitosano con acqua ultrapura e lasciare asciugare durante la notte. Rimuovere l'acqua ultrapura e memorizzare i film a -20 ° C in una plastica Petri.

7. Monitoraggio di innesto di reazione Usando CE

  1. Iniettare e aliquote separate di mezzi di reazione subito dopo la rimozione dalla piastra di Petri con le condizioni di analisi, come nella sezione 5.2.
  2. Al termine delle separazioni risciacquare il capillare con acqua ultrapura per 10 min. Essiccare attraverso un filo con un flacone vuoto (aria) per 10 min.
    NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa in questa fase.

8. Trea dati tment per CE

  1. Controllare la validità di ogni separazione, verificando che sia la corrente durante la separazione e il tempo di migrazione del marcatore mobilità elettroosmotico (DMSO in questo caso) sono simili a quelli osservati per la separazione standard di oligoacrylate.
    NOTA: fino al 10-15% variazione è accettabile dal valore attuale atteso di circa 50 μA e valore temporale migrazione di 1.3 min (valori mobilità elettroforetica dovrebbero essere utilizzati al posto dei tempi di migrazione, se è richiesta una ripetibilità superiore).
  2. Per ogni separazione di successo, esportare i dati grezzi dal software elettroforesi capillare selezionando un insieme di dati specifici, a destra cliccando su esportazioni e selezionando un segnale appropriato.
  3. Convertire i dati grezzi registrati dal CE (presentata come assorbanza UV in funzione del tempo di migrazione). Convertire l'asse X (migrazione tempo t m) in un μ mobilità elettroforetica seguente Equazione 1:
    n 1 "src =" / files / ftp_upload / 54549 / 54549eq1.jpg "/> (1)
    dove L d è la lunghezza al rivelatore, L t è la lunghezza totale del capillare, V è la tensione, e t eo è il tempo di migrazione di una specie neutra (standard interno DMSO in questo caso) 27.
    Convertire l'asse Y dei dati grezzi (assorbanza in au) per una distribuzione di mobilità elettroforetica W (μ) seguente Equazione 2: 28
    Equazione 2 (2)

9. Altre caratterizzazione di film Peptide-innestato 18

  1. Inserire film chitosano peptide-innestate, laminati intorno a sé, in uno stato solido NMR rotore 4 mm. Riempire il rotore con PBS a ingrossare le pellicole, e chiudere il rotore. Attendere un paio d'ore.
  2. Analizzare il film con 13 </ sup> C spettroscopia NMR 18.

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Representative Results

CE è adatto a monitorare l'innesto di peptidi (ad esempio, rgds) sul film chitosano. Agenti di accoppiamento adatti comprendono EDC-HCl e NHS che attivano il peptide ad essere innestati su chitosano (figura 1). CE è in grado di separare le diverse molecole di interesse dal mezzo di reazione. Per assegnare i picchi sul elettroferogramma, RGDS puri, EDC-HCl e NHS sono stati sciolti, iniettati e separati separatamente. Dopo l'assegnazione dei picchi, il mezzo di reazione è stato iniettato e dei vari reagenti sono stati identificati (figura 2). EDC-HCl reagito in un prodotto lato EDH-HCl (3 - (((etilammino) (idrossi) metilene) amino) - N, N -dimethylpropan-1-ammina). Dimetilsolfossido (DMSO) è usato come standard interno per le separazioni CE. Il chitosano è presente nell'esperimento innesto in forma di film insolubili e non è quindi iniettato od osservata in CE. Si noti che per tutti i dati grezzi, tha registrato asse temporale migrazione viene convertito in un asse elettroforetica mobilità (Equazione 1) e l'asse assorbanza UV in una distribuzione di mobilità elettroforetica W (μ) (Equazione 2).

Poiché le aliquote vengono prelevate dal mezzo di reazione sono collocati nello strumento CE e iniettato. L'entità della reazione viene monitorata attraverso la diminuzione del picco associato RGDS (Figura 3). Si può anche vedere che il picco EDC-HCl a diminuire all'aumentare della punta EDH-HCl nel tempo. È importante notare che non vi è alcun segnale che può essere assegnato ad un prodotto da una reazione secondaria del peptide, in tal modo si presume che i RGDS essere rimosso dal mezzo di reazione viene innestato sulla pellicola chitosano. Elettroferogrammi sovrapposti (Figura 3A) consentono la quantificazione del consumo peptide dall'inizio alla fine della reazione. È da notare cheanche se la cinetica è stato inizialmente misurate per 18 ore (Figura 3B), 4 hr era ritenuto sufficiente per la reazione di procedere alla sua estensione massima. Per consentire la quantificazione di un volume di iniezione ottimale è necessaria per garantire il rapporto segnale-rumore è alto abbastanza evitando sovraccarico (Figura 4A) e nel caso di RGDS, iniezioni dovevano essere completato in tempo reale per impedire policondensazione (Figura 4B ).

La tecnica di base CE-descritto qui di analizzare peptide innesto ai film chitosano è semplice e veloce; tuttavia, non quantifica direttamente il processo di innesto. spettroscopia NMR è utilizzato per dimostrare l'innesto; questa misura non può essere effettuata in tempo reale (richiede tipicamente diverse ore) e deve essere completato post-reazione. Il confronto qualitativo dei film chitosano prima e dopo l'innesto mostra l'innesto positivo dei peptidi through la comparsa di un segnale a 70 ppm nei film innestate corrispondenti al legame ammidico tra il chitosano e il peptide (Figura 5).

Figura 1
Figura 1. Schema della reazione di innesto. Schema di reazione chimica che mostra l'attivazione da EDC-HCl e NHS dell'acido gruppo funzionale carbossilico di RGDS seguito dal suo innesto sulla superficie del film del chitosano. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .

figura 2
Figura 2. assegnazione picco delle specie presenti nel mezzo di reazione. A. La separazione e l'assegnazione di picco per le soluzioni di parzialmente idrolizzato EDC -HCl (Rosa), RGDS (rosso), NHS (blu), nonché per PBS (viola) e il mezzo di reazione (nero). B. elettroferogrammi di mezzi di reazione (nero) presentata come una funzione del tempo di migrazione (elettroforetica la mobilità dovrebbe essere usato per superare scarsa ripetibilità in tempi di migrazione). clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura monitoraggio 3. CE del consumo RGDS. (A) sovrapposti picchi peptide al tempo di reazione 30 min (linea continua viola), 60 min (linea tratteggiata magenta), 90 min (linea continua blu), 120 min (linea tratteggiata verde), 150 min (linea rossa continua) e (B) cinetica di innesto completato oltre 18 ore in replicati (quadrato e cerchio).PLOAD / 54549 / 54549fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. picchi peptide sovrapposti in mezzi di reazione che mostrano risultati non ottimali (A) Variabile (idrodinamica) tempi di iniezione: 5 sec. (Linea blu), 10 sec (linea nera), 20 sec (linea rossa) e 30 sec (linea magenta) . Media (B) Reazione a sinistra in un flaconcino CE per un periodo prolungato di tempo prima dell'iniezione:. 30 min (linea rossa) e 90 min (linea blu) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. 13C gonfio-stato spettri NMR di film chitosano. Confronto del film prima (linea nera) e dopo (linea blu) peptide innesto. I segnali presenti solo nello spettro registrato dopo l'innesto sono contraddistinte da un asterisco. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

La semplicità del protocollo qui descritto rende ideale per applicazione diffusa. Tuttavia, particolare attenzione deve essere prestata ai seguenti passaggi chiave.

Preparazione strumento adeguato CE

È importante separare uno standard noto immediatamente prima della separazione di campioni sconosciuti (così come al termine di una serie di separazioni) per verificare la validità del capillare e strumento il giorno. Questo standard può essere un oligoacrylate 27 o qualsiasi campione noto che invia picchi multipli in un ampio intervallo di tempi di migrazione. Monitoraggio della corrente durante tutte le separazioni e analizzando la migrazione di un marcatore neutrale in ogni separazione sono passi fondamentali per identificare i problemi. Una variazioni di corrente o grandi instabili (superiore al 10-15%) del valore di plateau della corrente possono essere dovute a incoerenza nel buffer (pH o concentrazione). Se è seguito da un migratio ritardatan tempo della macchina neutra può anche essere dovuto al capillare non sufficientemente pulito. Controlli di routine del pH del tampone ed un filo extra del capillare per 10 min con 1 M di idrossido di sodio (preparata di fresco) possono essere utilizzati per prevenire / modificare tale problema. Durante l'esperimento, fasi di pulizia supplementari possono essere impiegati per assicurare una separazione ottimale, tipicamente compresa o allungando un filo con idrossido di sodio acquoso concentrato per rigenerare la superficie capillare di silice fusibile.

Trattamento dei dati corretta

Al termine dell'esperimento, trattamento appropriato dei dati grezzi è essenziale quando si confrontano risultati. Questo comporta la conversione del X e Y ottenuto dallo strumento CE (passo 8.3). I tempi di migrazione determinati CE hanno una relativamente scarsa ripetibilità e si consiglia di utilizzare mobilità elettroforetica invece, portando ad una ripetibilità molto migliore. L'importanza di corretta t dati REAZIONE è stato mostrato in precedenza con la separazione e caratterizzazione di chitosano 10, poli (acido acrilico) 29, copolimeri a blocchi 13 e il rilevamento di zuccheri in cereali da colazione 8 attraverso deviazioni standard più piccole (RSD) osservate tra esperimenti di mobilità che per tempi di migrazione . Inoltre, CE ha dimostrato di essere più robusto HPLC nella separazione dei monosaccaridi in matrici complesse 5. Altri passaggi di ottimizzazione possono includere la regolazione del volume di iniezione (tempo di iniezione) per consentire la separazione con buona sensibilità senza causare sovraccarico che impedirebbe quantificazione. Un tempo di iniezione 10 sec è ritenuta ottimale a 30 mbar (Figura 4B): un tempo di iniezione più breve comporta una sensibilità ridotta mentre i tempi di iniezione più lunghi portano ad una distorsione forma del picco indicativa del capillare sovraccarico.

Importanza del monitoraggio in tempo reale

ove_content "> una forza critica di questo metodo basato CE è la capacità di monitorare reazioni in tempo reale. Ciò richiede condizioni ottimali CE per il rilevamento e la separazione del reagente (s) pertinenti e / o il prodotto (s). Inoltre, per la analisi delle reazioni chimiche momento opportuno zero deve essere preso come punto di riferimento della reazione; questa tipicamente consiste nella separazione dei reagenti dosati appena prima della reazione partire Ciò può essere fatto per esempio prima di introdurre un particolare reagente, prima. la temperatura viene aumentata, o prima dell'irraggiamento UV viene avviato per innescare la reazione.

In caso di innesto delle RGDS peptidici (sulle chitosano o su di un altro substrato), il peptide è in grado di reagire con se stesso per produrre oligomeri lineari o strutture ramificate per policondensazione 18. Questo perché RGDS contiene sia ammine e gruppi funzionali di acido carbossilico. Questi oligomeri del peptide non hanno lo stesso indirizzo ela mobilità lectrophoretic come le RGDS peptide iniziali e, pertanto, possono causare una quantificazione imprecisa, attraverso ad esempio co-migrazione con altre specie. È quindi importante assicurare che le aliquote del medium di reazione vengono iniettati e separati in pochi minuti di essere preso dal mezzo di reazione (Figura 4B).

Adeguata preparazione dei film chitosano

Quando si specifica in materia di film chitosano ci sono una serie di passi per aderire. Durante la produzione dei film chitosano, i film devono essere lasciati asciugare per almeno 7 giorni (preferibilmente più). Se questo non viene completata, quando le pellicole sono posti in tampone PBS per risciacquare si dissolvono piuttosto che formare una pellicola gonfio che impedisce quindi i passaggi successivi. Inoltre, è importante per neutralizzare il film prima della reazione di innesto per rimuovere l'acido acetico residuo che può percolare del film e competere conil peptide per la reazione di innesto 18. Questo può essere fatto attraverso ammollo in idrossido di sodio acquoso diluito o in PBS. Il pH del tampone usato come solvente per la reazione di innesto è anche fondamentale: se è troppo acido film si dissolveranno parzialmente o completamente. Durante la reazione di innesto è importante che il film è in grado di avere il massimo contatto con la soluzione di reazione. Pertanto, la piastra di Petri contenente i film e la miscela di reazione sono collocati su un agitatore. È inoltre indispensabile per evitare l'evaporazione della miscela di reazione per impedire variazioni di concentrazione incontrollate conseguente quantificazioni imprecisi; l'uso di pellicola di paraffina per coprire la piastra di Petri è efficace per impedirlo.

Il limite principale di questa tecnica è che CE singolarmente non è in grado di confermare il processo di innesto. Nell'ambito del processo di innesto chimico sopra menzionato, la quantificazione del innesto peptide è indiretto. Questopossono essere superati con l'uso di una tecnica complementare come spettroscopia NMR allo stato solido, come precedentemente menzionato. Altre limitazioni della tecnica CE comprendono che richiede il composto di interesse da caricare. Pertanto specie neutre migreranno allo stesso tempo. In alcuni casi questo può essere superato se il composto di complessi interesse con borato. Infine, se il composto di interesse non contiene cromofori rilevamento diverso UV come conducibilità può essere necessario utilizzare. Ciò richiede l'acquisto aggiuntivo di un rivelatore di conduttività che richiede l'ottimizzazione.

I vantaggi di analisi innesto peptide attraverso CE vs altri metodi analitici

Il metodo CE ha diversi vantaggi rispetto ai metodi indiretti alternative tra la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC), analisi degli aminoacidi (AAA) e il metodo diretto di spettroscopia NMR. Rispetto al AAA si tratta di un high-throughput, metodo robusto which permette di analizzare campioni complessi in modo efficiente senza preparazione del campione noioso. Questo è vantaggioso soprattutto nell'analisi delle reazioni chimiche in tempo reale. HPLC è stato utilizzato in precedenza per l'innesto peptide analisi 30, tuttavia si è ritenuto solo semi-quantitativa. CE ha un costo di esercizio inferiore HPLC e non richiede filtrazione campione prima dell'analisi, minimizzando il rischio di perdita del campione 5. Sebbene spettroscopia 13 C NMR è in grado di misurare direttamente il prodotto di interesse, è una tecnica costosa e non è in grado di misurare in tempo reale.

Il protocollo descripted qui fornisce un metodo rapido, efficiente, economico e affidabile per ottimizzare peptide innesto alla pellicola chitosano. Questo nuovo approccio offre quindi vantaggi significativi per adattare le proprietà di fissaggio delle cellule di film chitosano rispetto ai metodi tradizionalmente utilizzati quali la cromatografia e AAA. Questo metodo CE può essere utilizzato per monitorare un numerodi altre reazioni chimiche in tempo reale, in genere le reazioni che si verificano sul lasso di tempo di diversi HR, per il quale / i prodotti di interesse possono essere addebitati i reagenti. In questo caso, è comunque importante notare che il metodo CE deve essere ottimizzata prima dell'analisi di una diversa reazione chimica per consentire un'analisi successo. Questo include l'analisi dei reagenti puri e prodotti prima della reazione per consentire loro di essere identificati e garantire che essi possono essere rilevati e separati, nonché per assicurare che contaminanti possono impedire quantificazione. La separazione può essere migliorata e il tempo di analisi totale cambiata variando la lunghezza del capillare, composizione del tampone e la tensione, e potenzialmente usando un capillare con pareti rivestite. Il rilevamento può essere migliorata modificando le condizioni in cui il campione viene iniettato a favorire i reagenti addebitate o iniettando una quantità del campione nel capillare. Inoltre, altri rivelatori a parte rivelazione UV possono be impiegato compresi fluorescenza, rivelatori di conduttività senza contatto o la CE può essere accoppiato ad uno spettrometro di massa. La capacità di monitorare reazioni in tempo reale consente alla reazione di innesto da eseguire direttamente in una fiala CE se il substrato è in soluzione e può essere analizzato da CE. Questo può avvenire direttamente all'interno dello strumento CE, come abbiamo recentemente eseguito per innesto di aminoantipirina di poli (acido acrilico) 7 Inoltre, l'approccio non è limitato a reazioni di innesto, ma può essere esteso per monitorare varie altre reazioni chimiche. Inoltre, il monitoraggio delle reazioni consente l'ottimizzazione della reazione e può anche essere utilizzato per convalidare il prodotto della reazione. Fintanto che il composto di interesse può essere sciolto e caricato, il metodo CE consente veloce, economico e robusto separazione, rivelazione e quantificazione.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Water Millipore All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality
Chitosan powder (medium molecular weight) Sigma-Aldrich 448877 lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides
Acetic acid - Unilab Ajax Finechem 2-2.5L GL laboratory reagent
Dimethylsulfoxide Sigma-Aldrich D4540 laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested
Sodium hydroxide  Sigma-Aldrich 221465  laboratory reagent, corrosive 
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide  Sigma-Aldrich D80002 Irritant to skin 
N-hydroxysuccinimide  Sigma-Aldrich 130672 Irritant to skin
Sodium chloride  Ajax Finechem 466-500G laboratory reagent
Potassium chloride - Univar Ajax Finechem 384-500G analytical reagent, slight skin irritant
Disodium hydrogen phosphate - Unilab Ajax Finechem 1234-500G laboratory reagent, slight skin irritant
Potassium dihydrogen phosphate - Univar Ajax Finechem 4745-500G analytical reagent, slight skin irritant
Oligoacrylate standard custom made See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46
Boric acid  BDH AnalR, Merck Pty Ltd 10058 Corrosive
Hydrochloric acid - Unilab Ajax Finechem A1367-2.5L laboratory reagent, corrosivie
Fused silica tubing Polymicro (Molex) TSP050375 Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter 
Agilent 7100 CE Agilent Technologies G7100CE Capillary electrophoresis instrument
Orbital shaker  IKA KS260
Electronic balance Mettler Toledo MS204S
Milli-Q Synthesis  Millipore ZMQS5VF01 Ultrapure water filtration system
Parafilm  Labtek PM966 Parrafin wax

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References

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spettroscopia Chimica elettroforesi capillare monitoraggio delle reazioni in tempo reale l'innesto peptide chitosano i film le cellule epiteliali allo stato solido risonanza magnetica nucleare (NMR)
Elettroforesi capillare per monitorare Peptide innesto su Chitosano film in tempo reale
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Thevarajah, J. J., O'Connor, M. D., Castignolles, P., Gaborieau, M. Capillary Electrophoresis to Monitor Peptide Grafting onto Chitosan Films in Real Time. J. Vis. Exp. (116), e54549, doi:10.3791/54549 (2016).

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