Abstract
خالية من حل الشعرية الكهربائي (CE) يفصل التحاليل والمركبات اتهم عموما في حل من خلال تطبيق مجال كهربائي. بالمقارنة مع تقنيات الفصل التحليلية الأخرى، مثل اللوني، CE رخيصة وقوية ويتطلب أي تحضير العينة (لعدد من المصفوفات الطبيعية المعقدة أو عينات البوليمر) على نحو فعال. CE سريع، ويمكن استخدامها لمتابعة تطور مخاليط في الوقت الحقيقي (على سبيل المثال، حركية التفاعل الكيميائي)، وإشارات لوحظت في المركبات فصل ويتناسب طرديا مع كمية في الحل.
هنا، وأثبت كفاءة CE لرصد تطعيم التساهمية من الببتيدات على الأفلام الشيتوزان للتطبيقات الطبية اللاحقة. الخصائص المضادة للميكروبات وحيويا الشيتوزان تجعل من مادة جذابة للتطبيقات الطبية الحيوية مثل ركائز نمو الخلايا. تطعيم تساهمي في RGDS الببتيد (أرجينين - الجلايسين -ويهدف سيرين) على سطح الأفلام الشيتوزان في تحسين مرفق الخلية - حمض الأسبارتيك. تاريخيا، تم استخدام اللوني وتحليل الحمض الأميني لتوفير قياس مباشر من مبلغ الببتيد المطعمة. ومع ذلك، فإن فصل سريع وغياب إعداد العينات المقدمة من قبل CE يمكن رصد في الوقت الحقيقي على قدم المساواة دقيقة بعد عملية ترقيع الببتيد. CE غير قادرة على فصل وتحديد مختلف مكونات خليط التفاعل: (عدم المطعمة) الببتيد وكلاء اقتران الكيميائية. في هذه الطريقة استخدام CE النتائج في تحسين الأفلام لتطبيقات المصب.
وتميزت الأفلام الشيتوزان من خلال الحالة الصلبة الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) الطيفي. هذا الأسلوب هو أكثر استهلاكا للوقت، ولا يمكن أن تطبق في الوقت الحقيقي، ولكن غلة القياس المباشر من الببتيد، وبالتالي بالتحقق من صحة تقنية CE.
Introduction
حل الحرة الشعرية الكهربائي (م) هو الاسلوب الذي يفصل بين المركبات في الحلول المبنية على من نسبة 1،2 الشحنة للاحتكاك. وكثيرا ما ذكر نسبة الشحنة للحجم في الأدب، ولكن لا ينطبق هذا التبسيط إلى polyelectrolytes، بما في ذلك البروتينية في هذا العمل، وأظهرت أيضا أن لا يكون مناسبا لجزيئات عضوية صغيرة 3. CE يختلف عن تقنيات الفصل الأخرى من حيث أنه لايوجد مرحلة ثابتة، فقط بالكهرباء الخلفية (عادة عازلة). وهذا يسمح للتقنية ليكون قويا في قدرته على تحليل مجموعة كبيرة من العينات مع المصفوفات المعقدة 4 مثل الألياف النباتية 5، التخمير يهيئ 6 مسمار على البوليمرات الاصطناعية 7، عينات المواد الغذائية 8، والببتيدات بالكاد القابلة للذوبان 9 دون تحضير عينة مملة و طهارة. وهذا أمر مهم خاصة بالنسبة للpolyelectrolytes المعقدة التي لديها قضايا الحل (قاوك والشيتوزان 10 و جيلان اللثة 11)، وبالتالي وجود مجمعة كما أو عجلت في حل وتم تحليلها بنجاح دون عينة الترشيح. وعلاوة على ذلك، فإن تحليل السكريات في حبوب الإفطار تشارك حقن عينات مع جزيئات من عينات حبوب الافطار عجلت في الماء 8. هذا يمتد أيضا إلى تحليل polyelectrolytes متفرعة أو بوليمرات 12،13. كما تم الانتهاء من أعمال مكثفة في مجال تطوير تقنيات CE خصيصا لتحليل البروتينات لالبروتينات 14، الفصل انطباقي من الببتيدات الطبيعية أو الاصطناعية 15 و فصل رقاقة من البروتينات والببتيدات 16. منذ الانفصال وتحليل تجري في شعري، وتستخدم كميات صغيرة فقط من العينة، والمذيبات التي تمكن CE لتكلفة تشغيلها أقل من تقنيات الفصل أخرى بما في ذلك 5،6،17 اللوني. منذ الانفصال من قبل CE سريع، لأنها تتيح رصد ومراقبةحلقة من حركية التفاعل. وقد تجلى ذلك في حالة تطعيم الببتيدات على الأفلام الشيتوزان لتحسين التصاق الخلية 18.
الشيتوزان هو السكاريد المستمدة من -deacetylation N من الكيتين. الأفلام الشيتوزان يمكن استخدامها لمختلف التطبيقات الطبية الحيوية مثل bioadhesives 19 وركائز نمو الخلايا 18،20، نظرا لتوافق مع الحياة الشيتوزان البالغ عددهم 21. مرفق الخلية البروتينات المصفوفة خارج الخلية المحددة، مثل فبرونيكتين، الكولاجين و laminin، يرتبط ارتباطا مباشرا لبقاء الخلايا 22. وتجدر الإشارة إلى أنواع مختلفة من الخلايا وغالبا ما تتطلب مرفق لمختلف البروتينات المصفوفة خارج الخلية من أجل البقاء وظيفة مناسبة. وقد تبين مرفق الخلية إلى الأفلام الشيتوزان ليتم تعزيزها من خلال تطعيم الفيبرونكتين 23؛ ومع ذلك، وإعداد وتنقية وتطعيم هذه البروتينات كبيرة غير قابلة للتطبيق اقتصاديا. بالتناوب مجموعة من الببتيدات الصغيرة هفثبت ه لتكون قادرة على محاكاة خصائص البروتينات كبيرة المصفوفة خارج الخلية. على سبيل المثال، الببتيدات مثل RGD محاكيات الفيبرونكتين استخدمت لتسهيل وزيادة مرفق الخلية 24 (أرجينين - الجلايسين - حمض الأسبارتيك) وRGDS (سيرين أرجينين - الجلايسين - - حمض الأسبارتيك). أدى التساهمية تطعيم RGDS على الأفلام الشيتوزان في تحسين مرفق الخلية لخلايا المعروف أن نعلق على فبرونيكتين في الجسم الحي 18. استبدال البروتينات أكبر يحب فبرونيكتين مع الببتيدات الصغيرة التي لديها نفس الوظيفة توفر انخفاض كبير في التكاليف.
هنا، تم تنفيذ الببتيد تطعيم لالشيتوزان كما نشرت سابقا (18). كما هو موضح سابقا، ويوفر هذا النهج التطعيم بسيطة وفعالة عن طريق استخدام وكلاء اقتران EDC، حمض الهيدروكلوريك (1 إيثيل-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) وNHS (N -hydroxysuccinimide) إلى functionalize الأحماض الكربوكسيلية من RGDS أن يكون تطعم بهفيلم الشيتوزان. اثنين من مزايا هذه الطريقة التطعيم هي أنه لا يتطلب أي تعديل الشيتوزان أو من الببتيد، واضطلعت بها في وسط مائي لتحقيق التوافق مع تطبيقات زراعة الخلايا المستقبلية 18،20. كما يمكن شحن وكلاء اقتران والببتيد، م هي طريقة مناسبة لتحليل حركية التفاعل. الأهم من ذلك، تحليل حركية التفاعل عبر CE يمكن رصد في الوقت الحقيقي من رد فعل التطعيم، وبالتالي تمكن كل من تحسين وقياس درجة التطعيم.
في حين أنه ليس من الضروري بشكل روتيني، ونتائج التحليل CE يمكن التحقق من صحة خارج الخط من قبل القياس المباشر من الببتيد تطعيم على الأفلام الشيتوزان باستخدام الحالة الصلبة الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) الطيفي 25،26 للتدليل على تطعيم التساهمية من الببتيد على فيلم 18. ومع ذلك، بالمقارنة مع الحالة الصلبة الرنين المغناطيسي الطيفي، في الوقت الحقيقي التحليل الذي قدمهCE تمكن من تقدير حجم استهلاك الببتيد في الوقت الحقيقي، وبالتالي القدرة على تقييم حركية التفاعل.
الطريقة المذكورة أعلاه بسيط ويسمح للتحليل في الوقت الحقيقي من الببتيد تطعيم على الأفلام الشيتوزان مع تقدير غير مباشر لمدى التطعيم. ويمكن تمديد الأسلوب هو موضح في التقييم الكمي في الوقت الحقيقي من التفاعلات الكيميائية المختلفة طالما المواد المتفاعلة أو المنتجات التي سيتم تحليلها يمكن توجيه الاتهام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الشيتوزان الأفلام
- تزن من 2 غرام من حامض الخليك الجليدي، الكامل إلى 100 مل مع الماء عالى النقاء.
- تزن من 1.7 غرام من مسحوق الشيتوزان، إضافة 100 مل من 2٪ م / م الخليك محلول مائي الحمضية. يحرك المزيج لمدة 5 أيام مع شريط التحريك ولوحة التحريك المغناطيسي في درجة حرارة الغرفة إما مغطاة بورق الألمنيوم أو في الظلام.
- أجهزة الطرد المركزي تشتت الشيتوزان في 1076 x ج في 23 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. جمع طاف مع حقنة وتجاهل راسب.
- لكل فيلم، قسامة 10 مل من تعليق الشيتوزان إلى 9 سم البلاستيك طبق بيتري في درجة حرارة الغرفة. ترك الأفلام تغطيتها لتجف لمدة 7 أيام على الأقل.
- قطع باستخدام مقص الأفلام الجافة إلى 1 × 1 سم الساحات. ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتا التجربة في هذه المرحلة.
2. إعداد المالحة الفوسفات مخزنة (PBS)
- تزن من 8 ز كلوريد الصوديوم، 0.2 غرام كلوريد البوتاسيوم، 1.44 ز فوس ثنائي الصوديوم الهيدروجينيةphate و 0.24 جم هيدروجين فوسفات البوتاسيوم.
- حل هذه المواد الكيميائية وزنه في 800 مل من الماء عالى النقاء ويعاير الحل مع حمض الهيدروكلوريك المركز لدرجة الحموضة 7.4.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتا التجربة في هذه المرحلة.
3. إعداد 75 ملم الصوديوم بورات العازلة في درجة الحموضة 9.2
- تزن من 3.0915 غرام من حمض البوريك. حله في 75 مل من الماء عالى النقاء.
- عاير محلول حمض البوريك إلى الرقم الهيدروجيني من 9.2 بمحلول هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 10 M أو أعلى.
الحذر: تتركز حلول هيدروكسيد الصوديوم هي للتآكل، وينبغي التعامل معها قفازات. - كاملة مع الماء عالى النقاء للحصول على 100 مل من محلول. هذا ينتج العازلة بورات الصوديوم 500 ملي في درجة الحموضة 9.2.
- تمييع 500 ملي العازلة بورات الصوديوم مع الماء عالى النقاء إلى 75 ملي العازلة بورات الصوديوم. ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتا التجربة في هذه المرحلة.
4. إعداد الشيتوزان فايLMS للتفاعل التطعيم
- شطف 10 الأفلام الشيتوزان مربع (1 × 1 سم) في 5 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 2 ساعة في طبق بيتري في درجة حرارة الغرفة.
- خلال هذا الوقت، وإعداد والتحقق من صحة الصك الشعرية الكهربائي (الخطوة 5).
5. إعداد والتحقق من شعري الكهربائي صك
- إعداد 43.5 سم عارية تنصهر السيليكا الشعرية التي يبلغ قطرها الداخلي 50 ميكرون (43.5 سم هو الطول الكلي، الطول الفعلي إلى إطار الكشف عادة 35 سم) عن طريق إضعاف الطلاء الخارجي البوليمر من شعري في طول مجموعة مع إناء حادة ثم يقبلون الشعرية.
- إنشاء إطار للالشعرية باستخدام ولاعة لحرق طلاء البوليمر في 8.5 سم من مدخل وبعد أن يبرد القضاء عليها نظيفة مع الايثانول. حرق طلاء الشعرية في نهاية كل لبضعة ملليمترات مع أخف وزنا، وبعد أن يبرد القضاء عليها نظيفة مع الايثانول.
- مكان الشعرية الإعلامييننافذة كشف دي وتثبيته في الكاسيت الشعرية عن طريق وضعها في أطوال متساوية في مدخل ومخرج ولف حولها ومغزل من الكاسيت. ثم تثبيت الكاسيت في الصك الشعرية الكهربائي.
- تعيين معلمات الأسلوب لكل فصل. في قائمة البرامج حدد "طريقة" ثم "تحرير طريقة بأكمله". ضبط درجة الحرارة والوقت والجهد، وقوارير تستخدم لفصل (على سبيل المثال 25 درجة مئوية، 10 دقيقة، 30 كيلو فولت).
- في قسم ما قبل تكييف، تعيين الإحمرار على التوالي: 10 دقيقة مع 1 م هيدروكسيد الصوديوم (في الماء)، 5 دقائق مع 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم (في الماء)، 5 دقائق مع الماء عالى النقاء و 5 دقائق مع 75 ملي العازلة بورات الصوديوم في الرقم الهيدروجيني 9.2 للأسلوب الأول من سلسلة من التحليلات.
- لأساليب اللاحقة، تعيين مجموعة الإحمرار متتالية في قسم ما قبل تكييف: 1 دقيقة مع 1 م هيدروكسيد الصوديوم (في الماء)، 5 دقائق مع 75 ملي العازلة بورات الصوديوم في الرقم الهيدروجيني 9.2.
- في قسم الحقن، ووضع معايير لحقن الهيدروديناميكية مع الضغط 30 مليبار لمدة 10 ثانية لجميع الأساليب. في قسم الانفصال، تهيئة الظروف الفصل إلى 30 كيلو فولت عند 25 درجة مئوية لمدة 9 دقائق لجميع الأساليب.
ملاحظة: راجع دليل المستخدم لأداة CE محدد وإجراءات تشغيل أداة CE قد تختلف بين المصنعين. تحضير محلول هيدروكسيد الصوديوم 1 م في اليوم.
- حقن وفصل معيار داخلي محايد (10 ميكرولتر من 10٪ ت / ت ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، في الماء المخفف إلى 450 ميكرولتر من 75 ملي العازلة بورات الصوديوم). ثم حقن وفصل بالطريقة نفسها معيارا oligoacrylate (المذاب في الماء عالى النقاء في 10 ز ∙ L -1، انظر قائمة من المواد) للتحقق من صحة الشعيرات الدموية. وقفة تسلسل هنا حتى رد فعل التطعيم هو على استعداد للبدء.
6. مسمار RGDS على الشيتوزان السينمائي
- تزن خارج الببتيد (1 RGDS ملغ)وكلاء اقتران (3 ملغ EDC، حمض الهيدروكلوريك و 2 ملغ NHS).
- 2 ساعة بعد بداية تمرغ فيلم الشيتوزان في برنامج تلفزيوني، حل الببتيد وكلاء اقتران في 5 مل من برنامج تلفزيوني.
- اتخاذ قسامة 50 ميكرولتر من هذا الحل. إضافة 2 ميكرولتر من 10٪ ت / ت DMSO في الماء كمعيار محايد الداخلي للقسامة. تحليل قسامة مع اوربا (راجع الخطوة 7).
- إزالة 5 مل من برنامج تلفزيوني تستخدم لشطف الأفلام الشيتوزان من طبق بيتري. إضافة محلول 5 مل من الببتيد واقتران وكلاء لطبق بتري تحتوي على الأفلام الشيتوزان.
- تغطية طبق بيتري مع فيلم البارافين ووضعه على شاكر المداري في درجة حرارة الغرفة. خذ 50 مكل من ردود فعل الإعلام في أوقات معينة.
ملاحظة: الساعة التحليل الكلي مع CE هو 15 دقيقة، وبالتالي قسامة يمكن أن تؤخذ كل 15 دقيقة (أو كل 30 دقيقة إذا تم رصد اثنين من ردود الفعل في موازاة ذلك، وما إلى ذلك).- إضافة 2 ميكرولتر من 10٪ ت / ت DMSO في الماء كمعيار محايد الداخلي لكل آلiquot.
ملاحظة: يجب أن تحلل أجزاء مأخوذة مع CE حالما يتم نقلهم (راجع الخطوة 7).
- إضافة 2 ميكرولتر من 10٪ ت / ت DMSO في الماء كمعيار محايد الداخلي لكل آلiquot.
- بعد 4 ساعات من الهز وإزالة قسامة، وإزالة طبق بيتري من شاكر. إزالة المتوسطة رد فعل من طبق بيتري. إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني لشطف الأفلام الشيتوزان.
- إزالة برنامج تلفزيوني من طبق بيتري، وشطف فيلم الشيتوزان مع الماء عالى النقاء والسماح لهم لتجف بين عشية وضحاها. إزالة الماء عالى النقاء وتخزين الأفلام في -20 درجة مئوية في البلاستيك طبق بتري.
7. رصد رد الفعل التطعيم عن طريق م
- حقن وقسامات منفصلة من ردود فعل الإعلام مباشرة بعد إزالة من طبق بيتري باستخدام الظروف التحليل كما في القسم 5.2.
- عند الانتهاء من فصل شطف الشعرية مع الماء عالى النقاء لمدة 10 دقيقة. جففه من خلال مطاردة مع قارورة فارغة (الهواء) لمدة 10 دقيقة.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتا التجربة في هذه المرحلة.
8. Trea البيانات tment لCE
- تحقق من صحة كل فصل، من خلال التأكد من أن كل من التيار خلال فصل ووقت الهجرة من علامة التنقل electroosmotic ([دمس] في هذه الحالة) هي مماثلة لتلك التي لوحظت في الفصل القياسية oligoacrylate.
ملاحظة: ما يصل إلى 10-15٪ الاختلاف هو مقبول من القيمة الحالية المتوقعة من حوالي 50 أمبير والهجرة قيمة الوقت 1.3 دقيقة (يجب أن تستخدم القيم التنقل الكهربي بدلا من مرة الهجرة إذا كنت بحاجة لتكرار أعلى). - لكل فصل ناجحة، تصدير البيانات الخام من برنامج الكهربائي الشعرية من خلال اختيار مجموعة بيانات محددة، والنقر فوق الحق على الصادرات واختيار إشارة المناسبة.
- تحويل البيانات الخام التي سجلتها م (كما عرضت امتصاص الأشعة فوق البنفسجية بوصفها وظيفة من الوقت الهجرة). تحويل المحور السيني (الهجرة وقت ر م) إلى μ التنقل الكهربي التالية المعادلة 1:
ن 1 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54549 / 54549eq1.jpg "/> (1)
حيث L d هو طول لكاشف، L ر هو الطول الكلي للالشعرية، والخامس هو الجهد، ور EO هو الوقت المناسب هجرة مسكوكة محايد (المعيار الداخلي DMSO في هذه الحالة) 27.
تحويل العمودي من البيانات الخام (الامتصاصية في الاتحاد الافريقي) لتوزيع التنقلات الكهربي W (μ) التالية المعادلة 2: 28
(2)
(2) 9. توصيف إضافية من الأفلام-المطعمة الببتيد 18
- إدراج الأفلام الشيتوزان-المطعمة الببتيد، وتوالت حول نفسها، في 4 مم الحالة الصلبة الرنين المغناطيسي الدوار. ملء الدوار مع الفوسفات مخزنة المالحة إلى تضخم الأفلام، وإغلاق الدوار. الانتظار لبضع ساعات.
- تحليل الفيلم مع 13 </ سوب> C NMR الطيفي 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
م هي مناسبة تماما لمراقبة التطعيم من الببتيدات (على سبيل المثال، RGDS) على الأفلام الشيتوزان. تشمل وكلاء اقتران مناسبة EDC، حمض الهيدروكلوريك وNHS التي تنشط الببتيد إلى أن تطعم به الشيتوزان (الشكل 1). CE قادر على فصل جزيئات مختلفة من الاهتمام من وسط التفاعل. تعيين القمم على رحلاني، RGDS نقية، وتم حل EDC، حمض الهيدروكلوريك وNHS، حقن وفصل على حدة. بعد ذروة المهمة، فقد تم حقنها وسط التفاعل وتم تحديد الكواشف المختلفة (الشكل 2). وكان رد فعل EDC، حمض الهيدروكلوريك إلى منتج الجانب EDH، حمض الهيدروكلوريك (3 - (((ethylamino) (هيدروكسي) الميثيلين) الأمينية) - N، N -dimethylpropan-1-أمين). يستخدم ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) كمعيار داخلي لفصل CE. الشيتوزان موجود في تجربة تطعيم في شكل أفلام غير قابلة للذوبان، وبالتالي لا حقن أو لوحظ في م. لاحظ أن لجميع البيانات الخام، رانه سجلت يتم تحويل محور الزمن الهجرة إلى محور الكهربي التنقل (المعادلة 1) والمحور امتصاص الأشعة فوق البنفسجية إلى توزيع التنقلات الكهربي W (μ) (المعادلة 2).
كما يتم أخذ قسامات من وسط التفاعل يتم وضعها في الصك م، وحقن. تتم مراقبة مدى رد الفعل من خلال انخفاض ذروة المرتبطة RGDS (الشكل 3). ويمكن أيضا أن ينظر إلى أن ذروة EDC، حمض الهيدروكلوريك النقصان في حين أن الزيادات ذروة EDH، حمض الهيدروكلوريك مع مرور الوقت. ومن المهم أن نلاحظ أنه لا يوجد أي إشارة التي يمكن أن تسند إلى المنتج من رد فعل الجانب من الببتيد، وبالتالي فمن المفترض أن RGDS يتم إزالتها من وسط التفاعل يتم تطعيمها الفيلم الشيتوزان. electropherograms مضافين (الشكل 3A) تسمح الكمي للاستهلاك الببتيد من البداية إلى نهاية التفاعل. ومن الجدير بالذكر أنعلى الرغم من أن حركية تم قياسها في البداية لمدة 18 ساعة (الشكل 3B)، واعتبرت 4 ساعات كافية للتفاعل والمضي قدما إلى مداه الأقصى. للسماح الكمي لا بد من وضع حجم الحقن الأمثل لضمان نسبة الإشارة إلى الضجيج عالية بما فيه الكفاية في حين منع الحمولة الزائدة (الشكل 4A) وفي حالة RGDS، وطلب من الحقن أن يتم الانتهاء في الوقت الحقيقي لمنع التكثيف المتعدد (الشكل 4B ).
ووصفت هذه التقنية على أساس CE هنا لتحليل الببتيد تطعيم للأفلام الشيتوزان هو سريعة وبسيطة. ومع ذلك، فإنه لا تحديد عملية التطعيم مباشرة. يستخدم الرنين المغناطيسي الطيفي للتدليل على التطعيم. هذا القياس لا يمكن القيام به في الوقت الحقيقي (يستغرق عادة عدة ساعات) ويحتاج إلى أن تكتمل بعد رد فعل. المقارنة النوعية من الأفلام الشيتوزان قبل وبعد التطعيم تظهر التطعيم الناجح لالببتيدات ترولاف ظهور إشارة على 70 جزءا في المليون في الأفلام المطعمة المقابلة لسندات أميد بين الشيتوزان والببتيد (الشكل 5).
الشكل 1. مخطط للتفاعل التطعيم. الكيماوية مخطط رد فعل تبين التنشيط بواسطة EDC، حمض الهيدروكلوريك وNHS من مجموعة وظيفية حمض الكربوكسيلية من RGDS تليها تطعيم لها على سطح الفيلم الشيتوزان و. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم .
الشكل 2. الاحالة الذروة من الأنواع الموجودة في وسط التفاعل. ألف فصل وذروة التنازل عن حلول للتحلل جزئيا EDC -HCl (الوردي)، RGDS (الحمراء)، NHS (الأزرق)، فضلا عن برنامج تلفزيوني (الأرجواني) ووسط التفاعل (أسود). ب. Electropherograms من ردود فعل الإعلام (الأسود) كما عرضت وظيفة من الزمن الهجرة (الكهربي وينبغي استخدام التنقل للتغلب على التكرار الفقراء في أوقات الهجرة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل مراقبة 3. م من استهلاك RGDS. (A) مضافين القمم الببتيد في رد فعل الوقت 30 دقيقة (خط الصلبة الأرجواني)، 60 دقيقة (أرجواني خط شرطة)، و 90 دقيقة (خط الصلبة الأزرق)، و 120 دقيقة (خط اندفاعة الأخضر)، 150 دقيقة (خط الصلبة الحمراء) و (ب) حركية تطعيم أكملت أكثر من 18 ساعة في مكررات (مربع ودائرة).pload / 54549 / 54549fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. القمم الببتيد مضافين في ردود فعل الإعلام تظهر النتائج المثلى (A) مختلفة (الهيدروديناميكية) مرات حقن: 5 ثانية (الخط الأزرق)، 10 ثانية (خط أسود)، 20 ثانية (خط أحمر) و 30 ثانية (خط أرجواني) . وسائل الإعلام (ب) رد فعل اليسار في قارورة CE لفترة طويلة من الزمن قبل حقن: 30 دقيقة (خط أحمر) و 90 دقيقة (الخط الأزرق) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. 13C تورم للدولة NMR أطياف من الأفلام الشيتوزان. مقارنة بين الأفلام قبل (خط أسود) وبعد (الخط الأزرق) الببتيد التطعيم. إشارات موجودة فقط في الطيف سجلت بعد بالرمز العلامات النجمية التطعيم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بساطة بروتوكول صفها هنا يجعل من مناسبة بشكل مثالي لتطبيق على نطاق واسع. ومع ذلك، يحتاج إلى عناية خاصة ليتم دفعها إلى من الخطوات الرئيسية التالية.
إعداد الأداة المناسبة CE
من المهم أن تفصل معيار معروف مسبقا على الفور لفصل العينات المجهولة (وكذلك في نهاية سلسلة من فصل) للتحقق من صحة الشعيرات الدموية وأداة في اليوم. هذا المعيار يمكن أن يكون oligoacrylate 27 أو أي عينة معروفة لإعطاء قمم متعددة على نطاق واسع من المرات الهجرة. رصد التيار خلال كل فصل وتحليل الهجرة من علامة محايدة في كل فصل هي الخطوات الأساسية لتحديد القضايا. قد يكون راجعا إلى عدم الاتساق في المخزن المؤقت (درجة الحموضة أو التركيز) على الاختلافات الحالية أو كبيرة غير مستقرة (أكثر من 10-15٪) في قيمة هضبة الحالي. إذا كان متبوعا تأخر migratioن وقت صانع محايد قد يكون راجعا إلى الشعرية لا يجري نظيفة بما فيه الكفاية أيضا. الفحوصات الروتينية من الرقم الهيدروجيني للالعازلة وتدفق اضافية من شعري لمدة 10 دقيقة مع 1 م هيدروكسيد الصوديوم (الطازجة) يمكن استخدامها لمنع / تعديل هذه المشكلة. خلال التجربة، يمكن استخدام خطوات تنظيف إضافية لضمان فصل الأمثل، وعادة بما في ذلك أو إطالة مطاردة مع تركيز هيدروكسيد الصوديوم المائي لتجديد سطح الصمامات السيليكا الشعرية.
معالجة البيانات الصحيحة
في ختام التجربة، العلاج المناسب للبيانات الخام أمر ضروري عند مقارنة النتائج. وهذا ينطوي على تحويل X و Y المحور تم الحصول عليها من صك م (الخطوة 8.3). الأوقات الهجرة تحدد في اوربا لديها التكرار فقيرة نسبيا، ونحن نوصي باستخدام التنقلات الكهربي بدلا من ذلك، مما يؤدي إلى التكرار أفضل من ذلك بكثير. أهمية بشكل صحيح ر وقد أظهرت البيانات reating سابقا مع فصل وتوصيف الشيتوزان 10، وبولي (حمض الاكريليك) 29، بوليمرات كتلة 13 والكشف عن السكريات في حبوب الإفطار من 8 إلى الانحرافات المعيارية أصغر (RSD) لاحظ بين التجارب لالتنقلات من لمرات الهجرة . وعلاوة على ذلك، فقد ثبت CE لتكون أكثر قوة من HPLC في فصل السكريات الأحادية في مصفوفات معقدة 5. ويمكن أن تشمل الخطوات الأخرى لتحسين وتعديل حجم الحقن (وقت الحقن) للسماح للفصل مع حساسية جيدة دون أن تسبب الحمولة الزائدة التي من شأنها أن تمنع الكمي. يعتبر وقت حقن 10 ثانية الأمثل في 30 مللي بار (الشكل 4B): وقت الحقن أقصر يؤدي إلى حساسية انخفاض بينما في أوقات حقن أطول تؤدي إلى ذروة شكل تشويه يدل على الحمولة الزائدة الشعرية.
أهمية الرصد في الوقت الحقيقي
ove_content "> وقوة حاسمة من هذا الأسلوب القائم على CE هو القدرة على رصد ردود الفعل في الوقت الحقيقي، وهذا يتطلب شروط CE المثلى للكشف وفصل المتفاعلة ذات الصلة (ق) و / أو المنتج (ق). وعلاوة على ذلك، ل تحليل التفاعلات الكيميائية الوقت المناسب الصفر يجب أن تؤخذ كمعيار للتفاعل، وهذا يتكون عادة في فصل المواد المتفاعلة يقاس من قبيل رد الفعل ابتداء يمكن أن يتم ذلك على سبيل المثال قبل أن يتم عرض واحد المتفاعلة معينة، من قبل. يتم زيادة درجة الحرارة، أو قبل أشعة فوق البنفسجية وبدأت في تحريك رد فعل.في حالة تطعيم من RGDS الببتيد (على الشيتوزان أو على ركيزة أخرى)، الببتيد قادر على التفاعل مع نفسها لإنتاج الأوليغومرات الخطية أو هياكل متفرعة من خلال التكثيف المتعدد 18. وذلك لأن RGDS يحتوي على كل أمين والمجموعات الوظيفية حمض الكربوكسيلية. هذه الأوليغومرات الببتيد ليست لديهم نفس البريدالتنقل lectrophoretic كما RGDS الببتيد الأولية، وبالتالي قد يؤدي إلى تقدير دقيق، من خلال على سبيل المثال شارك في الهجرة مع الأنواع الأخرى. ولذلك فمن المهم التأكد من أن aliquots من وسط التفاعل يتم حقن وفصل في غضون بضع دقائق من نقله من وسط التفاعل (الشكل 4B).
الإعداد المناسب من الأفلام الشيتوزان
عندما تتناول على وجه التحديد مع أفلام الشيتوزان هناك عدد من الخطوات لتلتزم بها. خلال إنتاج الأفلام الشيتوزان، تحتاج إلى أن تترك لتجف لمدة 7 أيام على الأقل (يفضل أكثر) الأفلام. إذا لم يتم الانتهاء من ذلك، عندما يتم وضع الأفلام العازلة في برنامج تلفزيوني لشطف أنها سوف يحل بدلا من تشكيل لفيلم تورم الذي ثم يمنع الخطوات المقبلة. بالإضافة إلى ذلك، من المهم أن تحييد الفيلم قبل رد الفعل تطعيم لإزالة أي حمض الخليك المتبقية والتي قد تتسرب من الفيلم، والتنافس معالببتيد للتفاعل تطعيم 18. ويمكن أن يتم ذلك من خلال تمرغ في تمييع هيدروكسيد الصوديوم مائي أو في برنامج تلفزيوني. الرقم الهيدروجيني للعازلة تستخدم كمذيب للتفاعل التطعيم أمر بالغ الأهمية أيضا: إذا كانت حمضية جدا والأفلام تذوب جزئيا أو كليا. خلال رد فعل تطعيم من المهم أن الفيلم هو قادرة على الحد الأقصى اتصال مع محلول التفاعل. لذلك، يتم وضع طبق بتري تحتوي على الأفلام وخليط التفاعل على شاكر. ومن الضروري أيضا لمنع التبخر من خليط التفاعل لمنع الاختلافات تركيز غير المنضبط مما أدى إلى التحديد الكمي غير دقيقة. كان استخدام فيلم البارافين لتغطية طبق بيتري فعالة لمنع ذلك.
القيد الرئيسي للتقنية CE هو أن فرادى أنها ليست قادرة على تأكيد عملية التطعيم. في سياق عملية ترقيع الكيميائية المذكورة أعلاه، القياس الكمي لتطعيم الببتيد غير مباشر. هذاويمكن التغلب عليها مع استخدام تقنية مكملة مثل الحالة الصلبة الرنين المغناطيسي الطيفي كما ذكر سابقا. وتشمل القيود الأخرى لهذه التقنية CE أنه يتطلب مجمع الفائدة التي ستحمل. لذا الأنواع محايدة وسوف تهاجر في نفس الوقت. في بعض الحالات يمكن التغلب على ذلك إذا كان المركب من مجمعات المصالح مع بورات. وأخيرا إذا كان مجمع الفائدة لا يحتوي على الكشف عن حاملات أخرى من الأشعة فوق البنفسجية مثل الموصلية قد تحتاج إلى استخدامها. وهذا يتطلب شراء إضافية من جهاز الكشف عن الموصلية التي تتطلب التحسين.
مزايا تحليل ترقيع الببتيد عبر CE مقابل الأساليب التحليلية الأخرى
طريقة CE ديها العديد من المزايا مقارنة مع الطرق غير المباشرة البديلة بما في ذلك ارتفاع الأداء اللوني السائل (HPLC)، تحليل الحمض الأميني (AAA) والطريقة المباشرة من مطيافية الرنين النووي المغناطيسي. مقارنة AAA هو الإنتاجية العالية، طريقة قوية حركتيح يسمح لتحليل عينات المعقدة بكفاءة دون إعداد عينة مملة. هذا هو مفيد خاصة في تحليل التفاعلات الكيميائية في الوقت الحقيقي. وقد استخدم HPLC سابقا لالببتيد التطعيم تحليل 30، ومع ذلك اعتبر أنه فقط نصف الكمية. CE لديها تكلفة التشغيل أقل من HPLC ولا يتطلب عينة الترشيح قبل التحليل، والتقليل من خطر فقدان العينة 5. على الرغم من أن 13 C NMR الطيفي هي قادرة على قياس مباشرة نتاج اهتمام، بل هو تقنية مكلفة وغير قادر على قياس ذلك في الوقت الحقيقي.
بروتوكول descripted هنا يوفر طريقة سريعة وفعالة وغير مكلفة ويمكن الاعتماد عليها لتحسين الببتيد تطعيم لفيلم الشيتوزان. وبالتالي يوفر هذا النهج الجديد مزايا هامة لتفصيل خصائص مرفق الخلية من الأفلام الشيتوزان مقارنة الأساليب المستخدمة تقليديا مثل اللوني وAAA. ويمكن استخدام هذه الطريقة CE لمراقبة عددمن التفاعلات الكيميائية الأخرى في الوقت الحقيقي، وعادة ردود الفعل التي تحدث على الإطار الزمني لعدة ساعة، والتي / يمكن شحن المنتجات التي تهم المتفاعلة. في هذه الحالة، غير أنه من المهم أن نلاحظ أن طريقة CE يجب أن يكون الأمثل مسبق لتحليل تفاعل كيميائي مختلف للسماح للتحليل ناجحة. ويشمل ذلك تحليل المواد المتفاعلة نقية والمنتجات قبل رد فعل للسماح لهم الكشف عن هويته والتأكد من أنها يمكن أن يتم الكشف عن وفصلها، وكذلك لضمان عدم وجود ملوثات قد تمنع الكمي. يمكن تحسين فصل ومجموع وقت تحليل تغير من خلال تغيير طول شعري، وتكوين العازلة والجهد، وربما باستخدام الشعرية مع الجدران المطلية. يمكن تحسين الكشف عن طريق تعديل الظروف التي يتم حقن العينة لصالح الكواشف تهمة أو عن طريق حقن كمية أكبر من العينة إلى الشعيرات الدموية. وعلاوة على ذلك، يمكن للكشف عن الأخرى بصرف النظر عن الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية بالبريد العاملين بما في ذلك مضان، للكشف عن التوصيل تماس أو CE يمكن أن يقترن إلى مطياف الكتلة. القدرة على رصد ردود الفعل في الوقت الحقيقي تمكن رد فعل التطعيم التي يتعين القيام بها مباشرة في قارورة CE إذا الركيزة في حل وقادرة على تحليلها من قبل م. هذا يمكن أن يتم مباشرة داخل أداة م، كما أجرينا مؤخرا انها لتطعيم aminoantipyrine على بولي (حمض الاكريليك) 7 بالإضافة إلى ذلك، فإن النهج لا يقتصر على ردود الفعل تطعيم ولكن يمكن أن تمتد إلى مراقبة مختلف التفاعلات الكيميائية الأخرى. وعلاوة على ذلك، رصد ردود الفعل يسمح الأمثل للتفاعل ويمكن أيضا أن تستخدم للتحقق من صحة المنتج من رد الفعل. طالما مجمع الفائدة يمكن حله واتهم، وطريقة CE يسمح سريعة ورخيصة وقوية الانفصال، والكشف النوعي والكمي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water | Millipore | All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality | |
| Chitosan powder (medium molecular weight) | Sigma-Aldrich | 448877 | lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides |
| Acetic acid - Unilab | Ajax Finechem | 2-2.5L GL | laboratory reagent |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | laboratory reagent, corrosive |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | Irritant to skin |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | Irritant to skin |
| Sodium chloride | Ajax Finechem | 466-500G | laboratory reagent |
| Potassium chloride - Univar | Ajax Finechem | 384-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Disodium hydrogen phosphate - Unilab | Ajax Finechem | 1234-500G | laboratory reagent, slight skin irritant |
| Potassium dihydrogen phosphate - Univar | Ajax Finechem | 4745-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Oligoacrylate standard | custom made | See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46 | |
| Boric acid | BDH AnalR, Merck Pty Ltd | 10058 | Corrosive |
| Hydrochloric acid - Unilab | Ajax Finechem | A1367-2.5L | laboratory reagent, corrosivie |
| Fused silica tubing | Polymicro (Molex) | TSP050375 | Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies | G7100CE | Capillary electrophoresis instrument |
| Orbital shaker | IKA | KS260 | |
| Electronic balance | Mettler Toledo | MS204S | |
| Milli-Q Synthesis | Millipore | ZMQS5VF01 | Ultrapure water filtration system |
| Parafilm | Labtek | PM966 | Parrafin wax |
References
- Muthukumar, M. Theory of electrophoretic mobility of a polyelectrolyte in semidilute solutions of neutral polymers. Electrophoresis. 17, 1167-1172 (1996).
- Barrat, J. L., Joanny, J. F. in Advances in Chemical Physics, Vol Xciv Vol. 94 Advances in Chemical Physics. , John Wiley & Sons Inc. 1-66 (1996).
- Fu, S. L., Lucy, C. A. Prediction of electrophoretic mobilities. 1. Monoamines. Anal. Chem. 70, 173-181 (1998).
- Harvey, D. Modern Analytical Chemistry. , McGraw Hill. (2000).
- Oliver, J. D., Gaborieau, M., Hilder, E. F., Castignolles, P. Simple and robust determination of monosaccharides in plant fibers in complex mixtures by capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 1291, 179-186 (2013).
- Oliver, J. D., Sutton, A. T., Karu, N., Phillips, M., Markham, J., Peiris, P., Hilder, E. F., Castignolles, P. Simple and robust monitoring of ethanol fermentations by capillary electrophoresis. Biotechnology and Applied Biochemistry. 62, 329-342 (2015).
- Thevarajah, J. J., Sutton, A. T., Maniego, A. R., Whitty, E. G., Harrisson, S., Cottet, H., Castignolles, P., Gaborieau, M. Quantifying the Heterogeneity of Chemical Structures in Complex Charged Polymers through the Dispersity of Their Distributions of Electrophoretic Mobilities or of Compositions. Anal. Chem. 88, 1674-1681 (2016).
- Toutounji, M. R., Van Leeuwen, M. P., Oliver, J. D., Shrestha, A. K., Castignolles, P., Gaborieau, M. Quantification of sugars in breakfast cereals using capillary electrophoresis. Carbohydr. Res. 408, 134-141 (2015).
- Miramon, H., Cavelier, F., Martinez, J., Cottet, H. Highly Resolutive Separations of Hardly Soluble Synthetic Polypeptides by Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 82, 394-399 (2010).
- Mnatsakanyan, M., Thevarajah, J. J., Roi, R. S., Lauto, A., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation of chitosan by degree of acetylation using simple free solution capillary electrophoresis. Anal. Bioanal. Chem. 405, 6873-6877 (2013).
- Taylor, D. L., Ferris, C. J., Maniego, A. R., Castignolles, P., in het Panhuis, M., Gaborieau, M. Characterization of Gellan Gum by Capillary Electrophoresis. Australian Journal of Chemistry. 65, 1156-1164 (2012).
- Thevarajah, J. J., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation and characterization of synthetic polyelectrolytes and polysaccharides with capillary electrophoresis. Adv. Chem. 2014, 798503 (2014).
- Sutton, A. T., Read, E., Maniego, A. R., Thevarajah, J., Marty, J. -D., Destarac, M., Gaborieau, M., Castignolles, P. Purity of double hydrophilic block copolymers revealed by capillary electrophoresis in the critical conditions. J. Chromatogr. A. 1372, 187-195 (2014).
- Righetti, P. G., Sebastiano, R., Citterio, A. Capillary electrophoresis and isoelectric focusing in peptide and protein analysis. Proteomics. 13, 325-340 (2013).
- Ali, I., Al-Othman, Z. A., Al-Warthan, A., Asnin, L., Chudinov, A. Advances in chiral separations of small peptides by capillary electrophoresis and chromatography. J. Sep. Sci. 37, 2447-2466 (2014).
- Kasicka, V. Recent developments in capillary and microchip electroseparations of peptides (2011-2013). Electrophoresis. 35, 69-95 (2014).
- JoVE Science Education Database. Capillary Electrophoresis (CE). Essentials of Analytical Chemistry. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/10226/capillary-electrophoresis-ce (2016).
- Taylor, D. L., Thevarajah, J. J., Narayan, D. K., Murphy, P., Mangala, M. M., Lim, S., Wuhrer, R., Lefay, C., O'Connor, M. D., Gaborieau, M., Castignolles, P. Real-time monitoring of peptide grafting onto chitosan films using capillary electrophoresis. Anal. Bioanal. Chem. 407, 2543-2555 (2015).
- Rinaudo, M. Chitin and chitosan: Properties and applications. Prog. Polym. Sci. 31, 603-632 (2006).
- Li, Z., Leung, M., Hopper, R., Ellenbogen, R., Zhang, M. Feeder-free self-renewal of human embryonic stem cells in 3D porous natural polymer scaffolds. Biomaterials. 31, 404-412 (2010).
- Domard, A. A perspective on 30 years research on chitin and chitosan. Carbohydr. Polym. 84, 696-703 (2011).
- Shekaran, A., Garcia, A. J. Nanoscale engineering of extracellular matrix-mimetic bioadhesive surfaces and implants for tissue engineering. Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj. 1810, 350-360 (2011).
- Custodio, C. A., Alves, C. M., Reis, R. L., Mano, J. F. Immobilization of fibronectin in chitosan substrates improves cell adhesion and proliferation. J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 316-323 (2010).
- Boateng, S. Y., Lateef, S. S., Mosley, W., Hartman, T. J., Hanley, L., Russell, B. RGD and YIGSR synthetic peptides facilitate cellular adhesion identical to that of laminin and fibronectin but alter the physiology of neonatal cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 288, C30-C38 (2005).
- Lefay, C., Guillaneuf, Y., Moreira, G., Thevarajah, J. J., Castignolles, P., Ziarelli, F., Bloch, E., Major, M., Charles, L., Gaborieau, M., Bertin, D., Gigmes, D. Heterogeneous modification of chitosan via nitroxide-mediated polymerization. Polym. Chem. 4, 322-328 (2013).
- Gartner, C., Lopez, B. L., Sierra, L., Graf, R., Spiess, H. W., Gaborieau, M. Interplay between Structure and Dynamics in Chitosan Films Investigated with Solid-State NMR, Dynamic Mechanical Analysis, and X-ray Diffraction. Biomacromolecules. 12, 1380-1386 (2011).
- Castignolles, P., Gaborieau, M., Hilder, E. F., Sprong, E., Ferguson, C. J., Gilbert, R. G. High resolution separation of oligo(acrylic acid) by capillary zone electrophoresis. Macromol. Rapid Commun. 27, 42-46 (2006).
- Chamieh, J., Martin, M., Cottet, H. Quantitative Analysis in Capillary Electrophoresis: Transformation of Raw Electropherograms into Continuous Distributions. Anal. Chem. 87, 1050-1057 (2015).
- Maniego, A. R., Ang, D., Guillaneuf, Y., Lefay, C., Gigmes, D., Aldrich-Wright, J. R., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation of poly(acrylic acid) salts according to topology using capillary electrophoresis in the critical conditions. Anal. Bioanal. Chem. 405, 9009-9020 (2013).
- Chung, T. W., Lu, Y. F., Wang, S. S., Lin, Y. S., Chu, S. H. Growth of human endothelial cells on photochemically grafted Gly-Arg-Gly-Asp (GRGD) chitosans. Biomaterials. 23, 4803-4809 (2002).
