Abstract
Vrije oplossing capillaire electroforese (CE) scheidt analyten algemeen geladen verbindingen in oplossing door het aanleggen van een elektrisch veld. Vergeleken met andere analytische scheidingstechnieken zoals chromatografie, CE is goedkoop, robuust en effectief vereist geen monstervoorbereiding (voor een aantal complexe natuurlijke of polymère matrices monsters). CE is snel en kan worden gebruikt om de ontwikkeling van mengsels direct (bijvoorbeeld kinetica) volgen de signalen waargenomen voor de gescheiden verbindingen rechtstreeks evenredig met de hoeveelheid in oplossing.
Hier, is de efficiëntie van CE aangetoond voor controle op de covalent enten van peptiden op chitosan films voor daaropvolgende biomedische toepassingen. Chitosan's antimicrobiële en biocompatibele eigenschappen maken het een aantrekkelijk materiaal voor biomedische toepassingen zoals celgroei substraten. Covalent enten van het peptide RGDS (arginine - glycine -asparaginezuur - serine) op het oppervlak van chitosan films gericht op verbetering van celhechting. Historisch gezien chromatografie en aminozuuranalyse gebruikt om een directe meting van de hoeveelheid geënte peptide verschaffen. Echter, de snelle scheiding en afwezigheid van het monster voorbereiding door CE stelt even nauwkeurige nog real-time monitoring van het peptide enten proces. CE kan scheiden en kwantificeren van de verschillende componenten van het reactiemengsel: de (niet-geënte) peptide en chemische koppelingsmiddelen. Op deze wijze het gebruik van CE resulteert in verbeterde films voor verdere toepassingen.
De chitosan films werden gekarakteriseerd door middel van solid-state NMR (nucleaire magnetische resonantie) spectroscopie. Deze techniek is tijdrovend en kan in real time worden toegepast, maar levert een directe meting van het peptide en aldus valideert de CE-techniek.
Introduction
Vrije oplossing capillaire elektroforese (CE) is een techniek die verbindingen in oplossingen op basis van hun lading naar wrijvingsgetal 1,2 scheidt. Charge-gewicht verhouding wordt vaak genoemd in de literatuur, maar deze vereenvoudiging geldt niet polyelektrolyten, waaronder polypeptiden in dit werk, en bleek ook niet geschikt voor kleine organische moleculen 3 te zijn. CE verschilt van andere scheidingstechnieken, dat het geen stationaire fase slechts achtergrondelektrolyt (gewoonlijk een buffer) hebben. Hierdoor kan de techniek robuust zijn vermogen om een groot aantal monsters analyseren complexe matrices 4 zoals plantaardige vezels 5, fermentatie brouwsels 6 enting op synthetische polymeren 7, voedselsteekproeven 8, en nauwelijks oplosbare peptiden 9 zonder vervelende monstervoorbereiding en zijn zuivering. Dit is vooral van belang voor complexe polyelektrolyten die ontbinding kwesties (such als chitosan 10 en gellangom 11) en daarom bestaan als geaggregeerde of neergeslagen in oplossing en zijn met succes geanalyseerd zonder monster filtratie. Verder is de analyse van suikers in ontbijtgranen was het injecteren van monsters met deeltjes van granen monsters b geprecipiteerd in water 8. Dit geldt ook voor de analyse van vertakte polyelektrolyten of copolymeren 12,13. Uitgebreid werk is ook bij de ontwikkeling van technieken CE specifiek voor de analyse van eiwitten voor proteomics 14, chirale scheiding van natuurlijke of synthetische peptiden 15 en microchip scheidingen van eiwitten en peptiden 16 afgerond. Aangezien de scheiding en analyse plaatsvinden in een capillair worden slechts kleine hoeveelheden monster en oplosmiddelen die CE mogelijk maakt een lagere operationele kosten dan andere scheidingstechnieken zoals chromatografie 5,6,17 hebben. Aangezien de scheiding door CE is snel, kan de monitoring van de reactie kinetiek. Dit werd aangetoond bij het enten van peptiden op chitosan films voor betere celadhesie 18.
Chitosan is een polysaccharide afgeleid van de N -deacetylation chitine. Chitosan films kunnen gebruikt worden voor verschillende biomedische toepassingen zoals biologische hechtmiddelen 19 en celgroei substraten 18,20, vanwege chitosan van 21 biocompatibiliteit. Celhechting specifieke extracellulaire matrixeiwitten zoals fibronectine, collageen en laminine, is direct verbonden met de overleving van de cellen 22. Met name verschillende celtypen vereisen vaak hechting aan verschillende extracellulaire matrixeiwitten op overleving en goede werking. Celhechting chitosan films bleek worden verbeterd door het enten van 23 fibronectine; Echter, de voorbereiding, zuivering en enten van dergelijke grote eiwitten is economisch niet haalbaar. Afwisselend een reeks van kleine peptiden have aangetoond kunnen de eigenschappen van grote extracellulaire matrixeiwitten nabootsen. Bijvoorbeeld, peptiden zoals fibronectine mimetica RGD (arginine - glycine - asparaginezuur) en RGDS (arginine - glycine - asparaginezuur - serine) zijn gebruikt om vergemakkelijken en celhechting 24. Covalent enten van RGDS op chitosan films resulteerde in een verbeterde celbinding op cellen bekend te hechten aan fibronectine in vivo 18. Substitueren grotere eiwitten vindt fibronectine met kleinere peptiden die dezelfde functionaliteit levert een aanzienlijke kostenreductie.
Hier peptide enten chitosan werd uitgevoerd zoals eerder gepubliceerd 18. Zoals eerder aangetoond, deze aanpak levert eenvoudige en efficiënte enting met de koppelingsmiddelen EDC-HCI (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) en NHS (N-hydroxysuccinimide) om het carbonzuur van de RGDS te functionaliseren geënt op dechitosan film. Twee voordelen van deze enten methode zijn dat zij geen wijziging van de chitosan of van het peptide vereist, en wordt uitgevoerd in waterig medium compatibiliteit met toekomstige celcultuurtoepassingen 18,20 maximaliseren. Als de koppelingsmiddelen en het peptide kan worden opgeladen, CE is een geschikte methode voor de analyse van de reactiekinetiek. Belangrijker analyse van de reactiekinetiek via CE maakt real-time monitoring van de entreactie, en dus stelt beide optimaliseren en te kwantificeren van de mate van enten.
Hoewel het niet routinematig nodig kan de resultaten van de CE analyse gevalideerd off-line door een directe meting van het peptide enting op het chitosan films via solid-state NMR (kernspinresonantie) spectroscopie 25,26 aan de covalente enten tonen van het peptide op de film 18. Vergeleken met solid-state NMR spectroscopie, de real-time analyse doorCE maakt de kwantificering van het peptide in realtime en dus in staat zijn de kinetica van de reactie te evalueren.
Bovenstaande werkwijze is eenvoudig en maakt het real-time analyse van peptide enting op chitosan films indirecte kwantificering van de omvang van de enten. De aangetoonde werkwijze kan worden uitgebreid tot de real time kwantitatieve evaluatie van verschillende chemische reacties zolang de reactanten of de produkten worden onderzocht kunnen worden gebracht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van chitosan Films
- Weeg 2 g ijsazijn, compleet tot 100 ml met ultrapuur water.
- Weeg 1,7 g chitosan poeder, voeg 100 ml van de 2% m / m azijnzuur waterige oplossing. Roer gedurende 5 dagen onder roeren bar en magnetisch roeren plaat bij kamertemperatuur ofwel afgedekt met aluminiumfolie of in het donker.
- Centrifugeer de chitosan dispersie bij 1076 xg bij 23 ° C gedurende 1 uur. Verzamel de bovenstaande vloeistof met een spuit en gooi de neerslag.
- Voor elke film, aliquot 10 ml van de suspensie chitosan in een 9 cm plastic Petrischaal bij kamertemperatuur. Laat de films overdekte drogen gedurende ten minste 7 dagen.
- Met behulp van een schaar snijd de droge films in 1 x 1 cm pleinen. Opmerking: Het experiment kan worden onderbroken in dit stadium.
2. Bereiding van fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)
- Weeg 8 g natriumchloride, 0,2 g kaliumchloride, 1,44 g dinatrium waterstof fosfaatfosfaat en 0,24 g kaliumdiwaterstoffosfaat.
- Ontbinden deze afgewogen stoffen in 800 ml ultrazuiver water en titreer de oplossing met geconcentreerd zoutzuur tot pH 7,4.
Opmerking: Het experiment kan worden onderbroken in dit stadium.
3. Bereiding van 75 mM natriumboraat bij pH 9,2
- Weeg 3,0915 g boorzuur. Oplossen in 75 ml ultrapuur water.
- Titreer de boorzuuroplossing een pH van 9,2 met een natriumhydroxideoplossing met een concentratie van 10 M of hoger.
Let op: geconcentreerde natriumhydroxide oplossingen zijn corrosief en moeten met handschoenen worden behandeld. - Compleet met ultrapuur water om 100 ml oplossing te verkrijgen. Dit levert een 500 mM natriumboraat bij pH 9,2.
- Verdun de 500 mM natriumboraatbuffer met ultrazuiver water 75 mM natriumboraat buffer. Opmerking: Het experiment kan worden onderbroken in dit stadium.
4. Voorbereiding van Chitosan Films voor de entreactie
- Spoel 10 vierkante chitosan films (1 x 1 cm) in 5 ml PBS gedurende 2 uur in een petrischaal bij kamertemperatuur.
- Gedurende deze tijd, voor te bereiden en valideren van de capillaire elektroforese instrument (stap 5).
5. Voorbereiding en Validatie van de capillaire elektroforese Instrument
- Bereid een 43,5 cm kale fused silica capillair met een inwendige diameter van 50 urn (43,5 cm is de totale lengte, de effectieve lengte het detectievenster typisch 35 cm) van het verzwakken van de polymere buitenlaag van het capillair op de ingestelde lengte met een stomp gebruiksvoorwerp dan snapping de capillaire.
- Maak een venster voor het capillair met behulp van een aansteker aan het polymeer coating op 8,5 cm van de inlaat te verbranden en na het afkoelt veeg het schoon met ethanol. Brand de coating van het capillair aan beide uiteinden een paar millimeter met een lichtere en daarna koelt het schoonvegen met ethanol.
- Plaats capillaire INSIde detectievenster en installeren in de capillaire cassette door deze op gelijke lengte in de inlaat en uitlaat en wikkelen rond de spillen van de cassette. Installeer vervolgens de cassette in de capillaire elektroforese instrument.
- De parameters van de werkwijze voor elke kleurscheiding. In de software menu "methode" dan "uitgeeft het hele methode". Stel de temperatuur, tijd, spanning en flesjes voor de scheiding (bijvoorbeeld 25 ° C, 10 min, 30 kV).
- In de pre-conditioning sectie, stel de opeenvolgende flushes: 10 min met 1 M natriumhydroxide (in water), 5 min met 0,1 M natriumhydroxide (in water), 5 min met ultrapuur water en 5 min met 75 mm natriumboraatbuffer bij pH 9,2 voor de eerste werkwijze van een reeks analyses.
- Voor de volgende methoden, zet de set van de opeenvolgende flushes in de pre-conditioning sectie: 1 min met 1 M natriumhydroxide (in water), 5 min met 75 mM natriumboraat bij pH 9.2.
- In de sectie injectie parameters voor een hydrodynamische injectie met 30 mbar druk gedurende 10 sec voor alle methoden. In het afscheidingsgedeelte Stel de scheidingsomstandigheden tot 30 kV bij 25 ° C gedurende 9 minuten voor alle methoden.
OPMERKING: Raadpleeg de handleiding van de specifieke CE instrument als procedure voor het bedienen van de CE-instrument kan variëren tussen de fabrikanten. Bereid de 1 M natriumhydroxideoplossing op de dag.
- Injecteer en scheiden een neutrale interne standaard (10 pl 10% v / v dimethylsulfoxide (DMSO), in water verdund in 450 ui 75 mM natriumboraat buffer). Dan injecteren en te scheiden op dezelfde manier een oligoacrylate standaard (opgelost in ultrapuur water bij 10 g ∙ L -1, zie Lijst van Materials) om de geldigheid van het capillair te controleren. Pauzeer de volgorde hier tot het enten reactie is klaar om te beginnen.
6. Enten van RGDS op Chitosan Film
- Weeg de peptide (1 mg RGDS)en de koppelingsmiddelen (3 mg EDC-HCl en 2 mg NHS).
- 2 uur na het begin van de chitosan film onderdompelen in PBS, los de peptide en de koppelingsmiddelen in 5 ml PBS.
- Neem een 50 pl aliquot van deze oplossing. Voeg 2 ul van 10% v / v DMSO in water als interne standaard neutraal het monster. Analyseer het monster met CE (zie stap 7).
- Verwijder de 5 ml PBS gebruikt om het chitosan films uit de petrischaal spoelen. Voeg 5 ml oplossing van peptide en koppelingsmiddelen aan de petrischaal met de chitosan films.
- Dek de petrischaal met paraffine folie en leg het op een orbitale schudder bij kamertemperatuur. Neem 50 ul porties van de reactie media op vaste tijden.
OPMERKING: De totale analysetijd met CE is 15 minuten, waardoor een monster kan worden genomen om de 15 minuten (of elke 30 minuten als deze twee reacties bewaakt parallel, etc.).- Voeg 2 ul van 10% v / v DMSO in water als interne standaard neutrale elk alIQUOT.
LET OP: Monsters moeten zo snel als ze worden genomen worden geanalyseerd met CE (zie stap 7).
- Voeg 2 ul van 10% v / v DMSO in water als interne standaard neutrale elk alIQUOT.
- Na 4 uur schudden en monster verwijderen, verwijder de petrischaal uit de shaker. Verwijder het reactiemedium uit de petrischaal. Voeg 5 ml PBS om de chitosan films spoelen.
- Verwijder de PBS uit de petrischaal, spoel de chitosan film met ultrapuur water en laat ze een nacht drogen. Verwijder het ultrazuiver water en de films bij -20 ° C in een plastic petrischaal.
7. Monitoring van entreactie Met behulp van CE
- Injecteren en afzonderlijke fracties van de reactie media onmiddellijk na verwijdering uit de petrischaal met behulp van de analyse omstandigheden als in paragraaf 5.2.
- Na voltooiing van de scheidingen spoel de capillair met ultrazuiver water gedurende 10 min. Droog het door een flush met een lege flacon (lucht) gedurende 10 min.
NB: Het experiment kan worden gepauzeerd in dit stadium.
8. Gegevens Trea tment voor CE
- De geldigheid van elke separatie, door te controleren of zowel de stroom tijdens de scheiding en de migratietijd van de elektro mobiliteit marker (DMSO in dit geval) zijn vergelijkbaar met die waargenomen voor de oligoacrylate standaard scheiding.
OPMERKING: Tot 10-15% verschillen zijn aanvaardbaar van de verwachte actuele waarde van ongeveer 50 uA en migratie tijdswaarde van 1,3 min (elektroforetische mobiliteit waarden moeten worden gebruikt in plaats van migratietijden indien een hogere herhaalbaarheid vereist). - Voor elke succesvolle scheiding exporteren de ruwe data uit de capillaire elektroforese software door het selecteren van een specifieke data set, rechts te klikken op de export en het selecteren van een geschikt signaal.
- Omzetten van de ruwe gegevens die door de CE (gepresenteerd als UV-absorptie als functie van de migratietijd). Zetten de X-as (migratietijd tm) in een elektroforetische mobiliteit μ volgende Vergelijking 1:
n 1 "src =" / files / ftp_upload / 54549 / 54549eq1.jpg "/> (1)
waarbij L de lengte d van de detector, L t is de totale lengte van het capillair, V de spanning en t eo de migratietijd van een neutrale soort (de DMSO interne standaard in dit geval) 27.
Zetten de Y-as van de ruwe gegevens (in absorptie au) een verdeling van elektroforetische mobiliteiten W (μ) volgende vergelijking 2: 28
(2)
(2) 9. Bijkomende karakterisering van Peptide geënte Films 18
- Steek-peptide geënte chitosan films, rolden om zich heen, in een 4 mm solid-state NMR rotor. Vul de rotor met fosfaat gebufferde zoutoplossing om de films zwellen en sluit de rotor. Wacht een paar uur.
- Analyseer de film met 13 </ sup> C-NMR-spectroscopie 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CE is zeer geschikt voor het monitoren van de enten van peptiden (bijvoorbeeld RGDS) op chitosan films. Geschikte koppelingsmiddelen omvatten EDC-NHS HCl en waarbij de peptide (figuur 1) geactiveerd worden geënt op het chitosan. CE kan de verschillende moleculen van belang te scheiden van het reactiemedium. Om de pieken op het elektroferogram toewijzen, pure RGDS, EDC-HCl en NHS werden opgelost, geïnjecteerd en afzonderlijk van elkaar gescheiden. Na de piek opdracht, werd het reactiemedium geïnjecteerd en de verschillende reactanten werden geïdentificeerd (Figuur 2). EDC-HCl omgezet in een bijproduct EDH-HCl (3 - (((ethylamino) (hydroxy) methyleen) amino) - N, N -dimethylpropan-1-amine). Dimethylsulfoxide (DMSO) wordt gebruikt als interne standaard voor de CE-scheidingen. Chitosan is in de enten experiment in de vorm van onoplosbare films en derhalve niet geïnjecteerd of waargenomen CE. Merk op dat voor alle ruwe gegevens, thij geregistreerd migratie tijdas wordt omgezet in een elektroforetische mobiliteit as (vergelijking 1) en de UV absorptie as in een verdeling van elektroforetische mobiliteiten W (μ) (Vergelijking 2).
Aangezien de monsters genomen uit het reactiemedium zij in de CE instrument geplaatst en geïnjecteerd. De omvang van de reactie wordt gevolgd door de afname van de piek geassocieerd met RGDS (figuur 3). Ook kan worden gezien dat de EDC-HCl piek afneemt terwijl de EDH-HCl piek tijd toeneemt. Het is belangrijk op te merken dat er geen signaal dat een product kan worden toegewezen van een nevenreactie van het peptide, waardoor wordt aangenomen dat de RGDS uit het reactiemedium wordt verwijderd wordt geënt op het chitosan film. Overlay electroferogrammen (figuur 3A) kan de kwantificering van peptide verbruik van het begin tot het einde van de reactie. Het zij opgemerkt dathoewel de kinetiek werd oorspronkelijk gemeten 18 uur (figuur 3B), werd 4 uur voldoende geacht om de reactie te gaan tot de maximale omvang. Kwantificering waardoor een optimale injectievolume is vereist om de signaal-ruisverhouding hoog genoeg en voorkomt overbelasting (figuur 4A) te waarborgen en bij RGDS, werden injecties vereist realtime kunnen voorkomen polycondensatie (Figuur 4B te vullen ).
De CE-gebaseerde techniek hier beschreven peptide analyseren enten chitosan films snel en eenvoudig; echter niet de entwerkwijze direct kwantificeren. NMR spectroscopie wordt gebruikt voor het enten tonen; deze meting kan niet worden gedaan in real time (het duurt meestal enkele uren) en moet na de reactie in te vullen. De kwalitatieve vergelijking van de chitosan films voor en na transplantatie toont de succesvolle enting van de peptiden through het verschijnen van een signaal bij 70 ppm in het geënte films overeenkomt met de amidebinding tussen het chitosan en het peptide (Figuur 5).
Figuur 1. Schema van het enten reactie. Chemische reactie regeling die de activering door EDC-HCl en NHS van het carbonzuur functionele groep RGDS gevolgd door de enten op de film oppervlak van de chitosan's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken .
Figuur 2. Extra toewijzing van de in het reactiemedium species. A. Scheiding en piek opdracht voor oplossingen van gedeeltelijk gehydrolyseerde EDC -HCl (Roze), RGDS (rood), NHS (blauw), alsook voor PBS (paars) en de reactie medium (zwart). B. electroferogrammen reactie media (zwart) gepresenteerd als een functie van de migratie tijd (elektroforetische mobiliteit moeten worden gebruikt om een slechte herhaalbaarheid in de migratie keer) te overwinnen. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. CE monitoring van RGDS consumptie. (A) Bedekt peptide pieken op reactietijd 30 min (paarse doorgetrokken lijn), 60 min (magenta streeplijn), 90 min (blauwe ononderbroken lijn), 120 min (groen streepje lijn), 150 min (rode doorgetrokken lijn) en (B) kinetiek van enten afgerond meer dan 18 uur in duplo (vierkant en cirkel).Pbelasting / 54549 / 54549fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Overlaid peptide pieken in reactie media tonen suboptimale resultaten (A) Verschillend (hydrodynamische) injectie tijden. 5 sec (blauwe lijn), 10 sec (zwarte lijn), 20 sec (rode lijn) en 30 sec (paarse lijn) . (B) Reactie media achtergelaten in een CE flesje voor een langere periode van tijd voordat de injectie: 30 min. (Rode lijn) en 90 min (blauwe lijn) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. 13C gezwollen-NMR spectra van chitosan films. Vergelijking van de films vóór (zwarte lijn) en na (blauwe lijn) peptide enten. Signalen alleen aanwezig in het spectrum opgenomen na enten zijn aangegeven met een asterisk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De eenvoud van de hier beschreven protocol maakt het ideaal voor brede toepassing. Echter, bijzondere aandacht moet worden besteed aan de volgende belangrijke stappen.
Proper CE instrument voorbereiding
Het is belangrijk om een bekende standaard onmiddellijk voorafgaand aan de scheiding van onbekende monsters (en aan het einde van een reeks scheidingen) geïsoleerde de geldigheid van de capillair en het instrument op de dag controleren. Deze norm kan een oligoacrylate 27 of een monster waarvan bekend is dat meerdere pieken geven over een breed scala van migratie tijden. Monitoring van de huidige gedurende alle scheidingen en het analyseren van de migratie van een neutrale marker in elke separatie zijn belangrijke stappen om problemen te identificeren. Een onstabiele stroom of grote variaties (meer dan 10-15%) in het plateau van de stroom kan het gevolg zijn inconsistentie in de buffer (pH of concentratie). Als het wordt gevolgd door een vertraagde MIGRATIEn tijd van de neutrale maker kan ook worden veroorzaakt door het capillair niet op voldoende schoon. Routinecontroles van de pH van de buffer en extra spoelen van de capillair voor 10 min met 1 M natriumhydroxide (vers bereid) kan worden gebruikt om te voorkomen / dit probleem te wijzigen. Tijdens het experiment kan extra reinigingsstappen worden gebruikt om een optimale scheiding te bewerkstelligen, typisch onder of verlengen van een spoeling met geconcentreerd waterig natriumhydroxide om de zekering silica capillair oppervlak te regenereren.
Proper gegevensverwerking
Na afloop van het experiment, passende behandeling van de ruwe gegevens is essentieel bij vergelijking van de resultaten. Daarbij worden de X- en Y-as verkregen uit de CE instrument (stap 8,3). De migratie tijden bepaald CE hebben een relatief slechte herhaalbaarheid en we raden het gebruik van elektroforetische mobiliteiten plaats, wat leidt tot een veel betere herhaalbaarheid. De betekenis van de juiste t reating data werd aangetoond met de scheiding en karakterisering van chitosan 10, poly (acrylzuur) 29, blokcopolymeren 13 en de detectie van suikers in ontbijtgranen 8 tot kleinere standaardafwijking (RSD) waargenomen tussen experimenten mobiliteit dan migratietijden . Verder is aangetoond CE robuuster dan HPLC om de scheiding van monosachariden in complexe matrices 5. Andere stappen van optimalisatie kunnen aanpassen van de injectie volume (de tijd van de injectie) om de scheiding met goede gevoeligheid mogelijk zonder dat overbelasting die kwantificering zou verhinderen. Een injectie van 10 sec wordt geacht optimaal bij 30 mbar (Figuur 4B): een kortere injectie tijd leidt tot een verminderde gevoeligheid tijdje langer injectie tijden leiden tot een piek vorm vervorming indicatief voor capillaire overbelasting.
Het belang van real-time monitoring
ove_content "> Een kritische kracht van deze CE gebaseerde methode is het vermogen om reacties in real time. Hiervoor optimale CE omstandigheden voor detectie en scheiding van de relevante reactant (en) en / of product (en). Voorts kan voor de analyse van chemische reacties een geschikt tijdstip nul worden genomen als maatstaf van de reactie, dit bestaat typisch in de scheiding van de uitgemeten reactanten vlak voor de reactie begint dit kan bijvoorbeeld voor een bepaalde reactant wordt ingevoerd vóór. de temperatuur wordt verhoogd, of voor UV-bestraling wordt gestart om de reactie te activeren.Bij het enten van het peptide RGDS (op chitosan of op een ander substraat), het peptide kan reageren met zichzelf lineaire oligomeren of vertakte structuren produceren door middel van polycondensatie 18. Dit komt omdat RGDS bevat zowel amine en carbonzuur-functionele groepen. Deze peptide oligomeren hebben niet dezelfde electrophoretic mobiliteit als de eerste peptide RGDS en daarom kan een onnauwkeurige kwantificering veroorzaken, door middel van bijvoorbeeld co-migratie met andere soorten. Het is daarom belangrijk dat monsters van het reactiemedium geïnjecteerd en gescheiden binnen enkele minuten na uit het reactiemedium (figuur 4B).
Juiste opstelling van de chitosan films
Als specifiek betrekking heeft chitosan films zijn er een aantal stappen te voldoen. Tijdens de productie van de chitosan films, hebben de films gedroogd worden gedurende ten minste 7 dagen (bij voorkeur meer). Indien deze niet is voltooid, wanneer de films in PBS buffer geplaatst spoelen ze oplossen in plaats vormen een gezwollen film die vervolgens voorkomen dat de volgende stappen. Bovendien is het belangrijk om de film vóór neutraliseren de entreactie om alle overblijvende azijnzuur die uit de film kan uitlogen en concurreren met verwijderenhet peptide van de entreactie 18. Dit kan worden gedaan door onderdompelen in verdund waterig natriumhydroxyde of PBS. De pH van de buffer als oplosmiddel voor de entreactie is ook kritisch: bij een te zuur de films gedeeltelijk of volledig oplossen. Tijdens de entreactie is het belangrijk dat de film kan maximaal contact met de reactieoplossing hebben. Daarom is de petrischaal met de films en het reactiemengsel werd geplaatst op een shaker. Het is ook noodzakelijk om de verdamping van het reactiemengsel tot ongecontroleerde concentratie verschillen wegens onnauwkeurige kwantificering voorkomen voorkomen; het gebruik van paraffine folie op de petrischaal dekken effectief te voorkomen.
De belangrijkste beperking van de CE-techniek is dat individueel is niet de entwerkwijze bevestigen. In het kader van de bovengenoemde chemische entwerkwijze, de kwantificering van het peptide enten indirect. Dezekunnen worden overwonnen met behulp van een complementaire technieken zoals vaste-toestand NMR spectroscopie zoals eerder vermeld. Andere beperkingen van de CE-techniek onder meer dat het vereist dat de verbinding van belang om in rekening gebracht. Daarom zal neutrale deeltjes migreren tegelijkertijd. In sommige gevallen kan dit worden overwonnen als de verbinding van belang complexen met boraat. Indien ten slotte de verbinding van belang chromoforen detectie uitzondering UV bevat zoals geleidbaarheid moet worden gebruikt. Dit vereist extra aankoop van een geleidbaarheidsdetector namelijk optimaal gebruik vereist.
Voordelen analyseren peptide enten via CE versus andere analysemethoden
De CE werkwijze heeft verschillende voordelen boven andere indirecte werkwijzen zoals hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC), aminozuuranalyse (AAA) en de directe methode van NMR spectroscopie. Vergeleken met AAA is een high-throughput, robuuste methode which maakt het mogelijk om complexe monsters efficiënter te analyseren zonder lastige monstervoorbereiding. Dit is vooral voordelig in de analyse van de chemische reacties in real time. HPLC is eerder gebruikt voor peptidesynthese enten analyse 30, maar het was geacht slechts semi-kwantitatief. CE een lagere exploitatiekosten dan HPLC en vereist geen monsterfiltratie voorafgaand aan analyse, wat het risico op verlies van monster 5. Hoewel 13 C NMR spectroscopie kan het product van interesse direct te meten, is een dure techniek en deze niet kan meten in real time.
Het protocol hier descripted geeft een snelle, efficiënte, goedkope en betrouwbare methode voor het optimaliseren peptide enten chitosan film. Deze nieuwe aanpak biedt dus aanzienlijke voordelen voor het afstemmen van de celhechting eigenschappen van chitosan films in vergelijking met traditioneel gebruikte methoden, zoals chromatografie en AAA. Deze CE methode kan worden gebruikt om een aantal monitorenandere chemische reacties in real time, gewoonlijk optraden op het tijdsbestek van enkele uren, waarbij de reagentia / producten plaats kan worden gebracht. In dit geval is het echter van belang op te merken dat de CE methode voor de analyse van een verschillende chemische reactie op een succesvolle analyse mogelijk moet worden geoptimaliseerd. Dit omvat de analyse van de zuivere reactanten en producten voor de reactie om hen te identificeren en te waarborgen dat zij kunnen worden gedetecteerd en gescheiden, en te voorkomen dat verontreinigingen kwantificering kunnen verhinderen. De scheiding kan worden verbeterd en de totale analysetijd veranderd door het variëren van de capillaire lengte, buffersamenstelling en spanning, en mogelijk met een capillair met beklede wanden. De detectie kan worden verbeterd door aanpassing van de omstandigheden waaronder het monster wordt geïnjecteerd om de geladen reactanten begunstigd of door injectie van een grotere hoeveelheid van het monster in het capillair. Voorts kunnen andere detectoren naast UV-detectie be gebruikt, waaronder fluorescentie, contactloze geleidbaarheidsdetectoren of CE zijn gekoppeld aan een massaspectrometer. De mogelijkheid om reacties in real time kan de entreactie direct worden uitgevoerd in een CE flacon als het substraat in oplossing en kan worden geanalyseerd met behulp van CE. Dit kan rechtstreeks in de CE instrument, zoals onlangs uitgevoerd het voor enten van aminoantipyrine op poly (acrylzuur) 7 Daarnaast is de benadering is niet beperkt tot entreacties maar kan worden uitgebreid tot verschillende andere chemische reacties te volgen. Verder is de bewaking van de reacties maakt optimalisatie van de reactie en kan ook worden gebruikt om het product van de reactie te valideren. Zolang de verbinding van belang kan worden opgelost en geladen, de CE-methode zorgt voor een snelle, goedkope en robuuste scheiding, detectie en kwantificering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water | Millipore | All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality | |
| Chitosan powder (medium molecular weight) | Sigma-Aldrich | 448877 | lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides |
| Acetic acid - Unilab | Ajax Finechem | 2-2.5L GL | laboratory reagent |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | laboratory reagent, corrosive |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | Irritant to skin |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | Irritant to skin |
| Sodium chloride | Ajax Finechem | 466-500G | laboratory reagent |
| Potassium chloride - Univar | Ajax Finechem | 384-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Disodium hydrogen phosphate - Unilab | Ajax Finechem | 1234-500G | laboratory reagent, slight skin irritant |
| Potassium dihydrogen phosphate - Univar | Ajax Finechem | 4745-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Oligoacrylate standard | custom made | See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46 | |
| Boric acid | BDH AnalR, Merck Pty Ltd | 10058 | Corrosive |
| Hydrochloric acid - Unilab | Ajax Finechem | A1367-2.5L | laboratory reagent, corrosivie |
| Fused silica tubing | Polymicro (Molex) | TSP050375 | Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies | G7100CE | Capillary electrophoresis instrument |
| Orbital shaker | IKA | KS260 | |
| Electronic balance | Mettler Toledo | MS204S | |
| Milli-Q Synthesis | Millipore | ZMQS5VF01 | Ultrapure water filtration system |
| Parafilm | Labtek | PM966 | Parrafin wax |
References
- Muthukumar, M. Theory of electrophoretic mobility of a polyelectrolyte in semidilute solutions of neutral polymers. Electrophoresis. 17, 1167-1172 (1996).
- Barrat, J. L., Joanny, J. F. in Advances in Chemical Physics, Vol Xciv Vol. 94 Advances in Chemical Physics. , John Wiley & Sons Inc. 1-66 (1996).
- Fu, S. L., Lucy, C. A. Prediction of electrophoretic mobilities. 1. Monoamines. Anal. Chem. 70, 173-181 (1998).
- Harvey, D. Modern Analytical Chemistry. , McGraw Hill. (2000).
- Oliver, J. D., Gaborieau, M., Hilder, E. F., Castignolles, P. Simple and robust determination of monosaccharides in plant fibers in complex mixtures by capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 1291, 179-186 (2013).
- Oliver, J. D., Sutton, A. T., Karu, N., Phillips, M., Markham, J., Peiris, P., Hilder, E. F., Castignolles, P. Simple and robust monitoring of ethanol fermentations by capillary electrophoresis. Biotechnology and Applied Biochemistry. 62, 329-342 (2015).
- Thevarajah, J. J., Sutton, A. T., Maniego, A. R., Whitty, E. G., Harrisson, S., Cottet, H., Castignolles, P., Gaborieau, M. Quantifying the Heterogeneity of Chemical Structures in Complex Charged Polymers through the Dispersity of Their Distributions of Electrophoretic Mobilities or of Compositions. Anal. Chem. 88, 1674-1681 (2016).
- Toutounji, M. R., Van Leeuwen, M. P., Oliver, J. D., Shrestha, A. K., Castignolles, P., Gaborieau, M. Quantification of sugars in breakfast cereals using capillary electrophoresis. Carbohydr. Res. 408, 134-141 (2015).
- Miramon, H., Cavelier, F., Martinez, J., Cottet, H. Highly Resolutive Separations of Hardly Soluble Synthetic Polypeptides by Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 82, 394-399 (2010).
- Mnatsakanyan, M., Thevarajah, J. J., Roi, R. S., Lauto, A., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation of chitosan by degree of acetylation using simple free solution capillary electrophoresis. Anal. Bioanal. Chem. 405, 6873-6877 (2013).
- Taylor, D. L., Ferris, C. J., Maniego, A. R., Castignolles, P., in het Panhuis, M., Gaborieau, M. Characterization of Gellan Gum by Capillary Electrophoresis. Australian Journal of Chemistry. 65, 1156-1164 (2012).
- Thevarajah, J. J., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation and characterization of synthetic polyelectrolytes and polysaccharides with capillary electrophoresis. Adv. Chem. 2014, 798503 (2014).
- Sutton, A. T., Read, E., Maniego, A. R., Thevarajah, J., Marty, J. -D., Destarac, M., Gaborieau, M., Castignolles, P. Purity of double hydrophilic block copolymers revealed by capillary electrophoresis in the critical conditions. J. Chromatogr. A. 1372, 187-195 (2014).
- Righetti, P. G., Sebastiano, R., Citterio, A. Capillary electrophoresis and isoelectric focusing in peptide and protein analysis. Proteomics. 13, 325-340 (2013).
- Ali, I., Al-Othman, Z. A., Al-Warthan, A., Asnin, L., Chudinov, A. Advances in chiral separations of small peptides by capillary electrophoresis and chromatography. J. Sep. Sci. 37, 2447-2466 (2014).
- Kasicka, V. Recent developments in capillary and microchip electroseparations of peptides (2011-2013). Electrophoresis. 35, 69-95 (2014).
- JoVE Science Education Database. Capillary Electrophoresis (CE). Essentials of Analytical Chemistry. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/10226/capillary-electrophoresis-ce (2016).
- Taylor, D. L., Thevarajah, J. J., Narayan, D. K., Murphy, P., Mangala, M. M., Lim, S., Wuhrer, R., Lefay, C., O'Connor, M. D., Gaborieau, M., Castignolles, P. Real-time monitoring of peptide grafting onto chitosan films using capillary electrophoresis. Anal. Bioanal. Chem. 407, 2543-2555 (2015).
- Rinaudo, M. Chitin and chitosan: Properties and applications. Prog. Polym. Sci. 31, 603-632 (2006).
- Li, Z., Leung, M., Hopper, R., Ellenbogen, R., Zhang, M. Feeder-free self-renewal of human embryonic stem cells in 3D porous natural polymer scaffolds. Biomaterials. 31, 404-412 (2010).
- Domard, A. A perspective on 30 years research on chitin and chitosan. Carbohydr. Polym. 84, 696-703 (2011).
- Shekaran, A., Garcia, A. J. Nanoscale engineering of extracellular matrix-mimetic bioadhesive surfaces and implants for tissue engineering. Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj. 1810, 350-360 (2011).
- Custodio, C. A., Alves, C. M., Reis, R. L., Mano, J. F. Immobilization of fibronectin in chitosan substrates improves cell adhesion and proliferation. J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 316-323 (2010).
- Boateng, S. Y., Lateef, S. S., Mosley, W., Hartman, T. J., Hanley, L., Russell, B. RGD and YIGSR synthetic peptides facilitate cellular adhesion identical to that of laminin and fibronectin but alter the physiology of neonatal cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 288, C30-C38 (2005).
- Lefay, C., Guillaneuf, Y., Moreira, G., Thevarajah, J. J., Castignolles, P., Ziarelli, F., Bloch, E., Major, M., Charles, L., Gaborieau, M., Bertin, D., Gigmes, D. Heterogeneous modification of chitosan via nitroxide-mediated polymerization. Polym. Chem. 4, 322-328 (2013).
- Gartner, C., Lopez, B. L., Sierra, L., Graf, R., Spiess, H. W., Gaborieau, M. Interplay between Structure and Dynamics in Chitosan Films Investigated with Solid-State NMR, Dynamic Mechanical Analysis, and X-ray Diffraction. Biomacromolecules. 12, 1380-1386 (2011).
- Castignolles, P., Gaborieau, M., Hilder, E. F., Sprong, E., Ferguson, C. J., Gilbert, R. G. High resolution separation of oligo(acrylic acid) by capillary zone electrophoresis. Macromol. Rapid Commun. 27, 42-46 (2006).
- Chamieh, J., Martin, M., Cottet, H. Quantitative Analysis in Capillary Electrophoresis: Transformation of Raw Electropherograms into Continuous Distributions. Anal. Chem. 87, 1050-1057 (2015).
- Maniego, A. R., Ang, D., Guillaneuf, Y., Lefay, C., Gigmes, D., Aldrich-Wright, J. R., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation of poly(acrylic acid) salts according to topology using capillary electrophoresis in the critical conditions. Anal. Bioanal. Chem. 405, 9009-9020 (2013).
- Chung, T. W., Lu, Y. F., Wang, S. S., Lin, Y. S., Chu, S. H. Growth of human endothelial cells on photochemically grafted Gly-Arg-Gly-Asp (GRGD) chitosans. Biomaterials. 23, 4803-4809 (2002).
