Abstract
自由溶液キャピラリー電気泳動（CE）は、電界の印加を介して溶液中の分析物、一般的に荷電した化合物を分離します。クロマトグラフィーなどの他の分析分離技術と比較すると、CEは、堅牢、安価で効果的に（複雑な自然のマトリックスまたはポリマーサンプルの数のために）何の試料調製を必要としません。分離された化合物について観察されたシグナルは、溶液中のそれらの量に正比例するようにCEは、高速かつリアルタイムで混合物の進化を追跡するために使用され得る（ 例えば 、化学反応速度論）です。
ここでは、CEの効率は、その後の生物医学的用途のためのキトサンフィルム上へのペプチドの共有結合グラフトを監視するために示されています。キトサンの抗菌性および生体適合性特性は、このような細胞増殖基質として生物医学的応用のための魅力的な材料にします。グリシン - 共有結合ペプチドRGDS（アルギニンをグラフト -アスパラギン酸 - セリン）キトサンフィルムの表面には、細胞の付着を改善することを目的とします。歴史的には、クロマトグラフィーおよびアミノ酸分析は、グラフト化されたペプチドの量の直接測定を提供するために使用されてきました。しかし、CEが提供する試料調製の高速分離と不在がまだペプチドグラフト化プロセスのリアルタイム監視を均等に正確なことができます。 （非グラフト化）ペプチドおよび化学的カップリング剤：CEは、反応混合物の異なる成分を分離し、定量することができます。このように、CEの使用は、下流の適用のための改良されたフィルムになります。
キトサンフィルムは、固体NMR（核磁気共鳴）分光法を介して特徴付けました。この技術は、より時間がかかり、リアルタイムで適用することはできないが、ペプチドの直接的な測定値が得られるので、CE技術を検証します。
Introduction
自由溶液キャピラリー電気泳動（CE）は、それらの電荷-摩擦比1.2をベースにしたソリューションにおける化合物を分離する技術です。電荷対サイズ比は、多くの場合、文献に記載されているが、この単純化は、この作品でポリペプチドを含む、高分子電解質には適用されません、また、小有機分子3に適切ではないことが示されました。 CEは、固定相のみのバックグラウンド電解質（通常は緩衝液）を有していないという点で他の分離技術とは異なります。これは、技術は合成ポリマー7の上に、このような植物繊維5、発酵ビール6グラフトなどの複雑なマトリックス4とサンプルの大規模な範囲を分析する能力に堅牢にすることができ、食品サンプル8、及び難溶性のペプチド9面倒な試料調製なしと精製。これは、溶解の問題が複雑な高分子電解質（複数の場合に特に重要ですuchがしたがって、キトサン10とジェランガム11）ととして集約された、または溶液中に沈殿が存在し、正常サンプルろ過せずに分析されています。また、朝食用シリアルのサンプルの粒子を含む試料を注入関与朝食用シリアル中の糖の分析は、水8中に沈殿させました。これはまた、分岐した高分子電解質またはコポリマー12,13の分析にまで及びます。大規模な作業はまた、特にプロテオミクス14のためのタンパク質の分析のためにCE技術の開発、天然または合成ペプチド15およびタンパク質およびペプチド16のマイクロチップ分離のキラル分離を完了しました。分離分析はキャピラリー内で行われるので、わずかな試料の体積及び溶剤は、クロマトグラフィー5,6,17を含む他の分離技術より低いランニングコストを持ってCEを可能に用いられます。 CEによる分離が速いので、monitoを可能にします反応速度のリング。これは、改善された細胞接着18キトサンフィルム上のペプチドのグラフトの場合に実証されました。
キトサンは、キチンのN個の -deacetylation由来の多糖類です。キトサンの生体適合性21、18,20 19生体接着剤および細胞増殖基質としてキトサンフィルムは、様々な生物医学的用途に使用することができます。例えばフィブロネクチン、コラーゲンおよびラミニンなどの特定の細胞外マトリックスタンパク質への細胞接着は、直接に細胞22の生存にリンクされています。特に、異なる細胞型は、多くの場合、生存および適切な機能のために、異なる細胞外マトリックスタンパク質への付着を必要とします。キトサン膜への細胞接着は、フィブロネクチン23のグラフト化によって増強されることが示されました。しかし、このような大規模なタンパク質の調製、精製及びグラフト化が経済的に実行可能ではありません。小ペプチドの交互範囲HAVeは大きな細胞外マトリックスタンパク質の特性を模倣することができることが示され。例えば、フィブロネクチン模倣体などのペプチドRGD（アルギニン-グリシン-アスパラギン酸）およびRGDS（アルギニン-グリシン-アスパラギン酸-セリン）は、細胞接着24を促進し増加させるために使用されてきました。キトサンフィルム上へのRGDSの共有結合グラフトは、 生体内 18 でフィブロネクチンに付着することが知られている細胞のための改良された細胞付着をもたらしました。より大きなタンパク質を代入すると、同じ機能が大幅なコスト削減を提供していより小さいペプチドとフィブロネクチンが好き。
以前に18を発行し 、ここで、キトサンにグラフト化ペプチドを行いました。先に示したように、このアプローチはカップリング剤EDC塩酸（1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を使用して簡単かつ効率的なグラフト化を提供し、NHS（Nヒドロキシスクシンイミド）とRGDSのカルボン酸を官能化するために上にグラフトキトサンフィルム。このグラフト化方法の2つの利点が、それはキトサンまたはペプチドの任意の変更を必要としないことであり、将来の細胞培養アプリケーション18,20との互換性を最大にするために、水性媒体中で行われます。カップリング剤とペプチドを充電することができるように、CEは、反応速度論の分析に適した方法です。重要なことに、CEを介して反応速度論の分析は、グラフト反応のリアルタイムモニタリングを可能にし、したがって、最適化及びグラフト化の程度を定量化の両方を可能にします。
それは日常的に必要ではないが、CE分析の結果は、共有結合グラフトを実証するために、固体NMR（核磁気共鳴）分光法25,26を用いたキトサンフィルム上にグラフト化ペプチドの直接測定によってオフラインで検証することができますフィルム18上にペプチドの。しかし、固体NMR分光法と比較して、リアルタイムに分析することによって提供さCEは、リアルタイムでのペプチドの消費量の定量化、したがって反応の動態を評価する能力を可能にします。
上記の方法は簡単であり、グラフトの程度を間接的に定量化キトサンフィルム上にグラフト化ペプチドのリアルタイム分析を可能にします。実証された方法は、長い反応物または分析されるべき製品を充電することができるように、異なる化学反応のリアルタイム定量的評価に拡張することができます。
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Protocol
キトサンフィルムの調製
- 超純水で100mlに完全に氷酢酸の2グラムを、計り分けます。
- 2％メートル/ mの酢酸水溶液100mlを追加し、キトサン粉末のうち1.7グラムの重量を量ります。どちらかアルミホイルで、または暗闇の中で覆われて、室温で攪拌棒および磁気撹拌プレートで5日間撹拌します。
- 1時間、23℃で1076×gでキトサン分散液を遠心分離します。シリンジを用いて上清を回収し、沈殿物を捨てます。
- 室温の9センチのプラスチックシャーレに各フィルム、アリコートキトサン懸濁液を10ミリリットルのため。少なくとも7日間乾燥さ覆われたフィルムを残します。
- はさみを使用すると、1×1cmの正方形にドライフィルムをカット。注意：実験は、この段階で一時停止することができます。
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の調製
- 8グラムの塩化ナトリウムを秤量0.2グラムの塩化カリウム1.44グラムのナトリウム水素PHOS酸塩0.24グラムのリン酸二水素カリウム。
- 超純水800mlにこの秤量化学物質を溶解し、pH7.4に濃塩酸で溶液を滴定します。
注意：実験は、この段階で一時停止することができます。
pHは9.2で、75mMのホウ酸ナトリウム緩衝液の調製
- ホウ酸の3.0915グラムを量り分けます。超純水75 ml中に溶解します。
- 10 M以上の濃度の水酸化ナトリウム溶液で9.2のpHをホウ酸溶液を滴定します。
注意：濃水酸化ナトリウム溶液は腐食性であり、手袋をして取り扱ってください。 - 溶液100mlを得るために、超純水で完了する。これは、pH 9.2での500mMホウ酸ナトリウム緩衝液をもたらします。
- 75mMのホウ酸ナトリウム緩衝液に超純水で500 mMのホウ酸ナトリウム緩衝液を希釈します。注意：実験は、この段階で一時停止することができます。
キトサンFiは4準備グラフト反応のためのLMS
- 室温でのペトリ皿に2時間5mlのPBSで10平方キトサンフィルム（1×1センチ）すすぎます。
- この間、キャピラリー電気泳動装置（ステップ5）を調製し、検証します。
5.キャピラリー電気泳動機器の準備と検証
- 50μmの内径43.5センチメートル裸の溶融シリカキャピラリーを準備すると設定された長さで、キャピラリーのポリマー外側コーティングを弱めることによって（全長、検出ウィンドウへの効果的な長さは43.5センチメートル通常、35センチメートルです）鈍い器具は、次にキャピラリをスナップ。
- 入口から8.5センチメートルでのポリマーコーティングを燃やすためにライターを使用することにより、キャピラリーのためのウィンドウを作成し、それを冷却した後、エタノールでそれを拭いてください。軽量化と数ミリメートルのための各端部でキャピラリーのコーティングを燃やす、そしてそれが冷却した後、エタノールでそれを拭いてください。
- キャピラリーINSIを配置検出ウィンドウドと入口と出口に同じ長さでそれを配置し、カセットのスピンドルの周りに巻き付けることによりキャピラリーカセットに取り付けます。そして、キャピラリー電気泳動装置にカセットを取り付けます。
- 各分離するための方法のパラメータを設定します。ソフトウェアのメニューで、「方法」、次に「メソッド全体の編集」を選択します。 （例えば、25℃、10分、30キロボルト）分離のために用いられる温度、時間、電圧、およびバイアルを設定します。
- プレコンディショニングセクションにおいて、連続フラッシングセット（水中）、1M水酸化ナトリウムで10分、（水に）0.1 M水酸化ナトリウムで5分間、超純水及び75mMのホウ酸ナトリウム緩衝液で5分で5分間一連の分析の第一の方法のためのpH 9.2で。
- （水中）1 M水酸化ナトリウム、pHが9時75 mMのホウ酸ナトリウム緩衝液で5分間で1分：後続のメソッドの場合、セットにプレコンディショニングセクション内の連続フラッシュを設定します。2。
- 注入部では、すべてのメソッドのために10秒間30ミリバールの圧力で流体力学的注射のためのパラメータを設定します。分離部では、すべてのメソッドのための9分間、25℃で30 kVのに分離条件を設定します。
注：メーカーの間で変化してもよいCE機器を操作するための手順として、特定のCE機器のマニュアルを参照してください。日に1 M水酸化ナトリウム溶液を調製します。
- 注入し、（75mMのホウ酸ナトリウム緩衝液450μlの中に希釈した水に、10％v / vのジメチルスルホキシド10μlの（DMSO））ニュートラル内部標準を分離します。キャピラリーの有効性を確認するために、そして（材料のリストを参照してください10グラム∙L -1で超純水に溶解した）オリゴアクリレートの標準と同じように注入し、独立しました。グラフト反応を開始する準備ができるまで、ここでシーケンスを一時停止します。
キトサンフィルム上にRGDSの6グラフト
- ペプチドを秤量（1mgのRGDS）そしてカップリング剤（3 mgのEDC-HClおよび2mgのNHS）。
- 2時間PBS中キトサンフィルム浸漬開始後、ペプチド及びPBS 5ml中のカップリング剤を溶解します。
- この溶液の50μlのアリコートを取ります。アリコートに内部ニュートラル標準としての水中で10％（v / v）のDMSOの2μLを加えます。 CEとのアリコートを分析する（ステップ7を参照）。
- 5mlのPBSを削除するペトリ皿からキトサンフィルムをリンスするために使用。キトサンフィルムを含むペトリ皿にペプチドとカップリング剤5mlの溶液を加えます。
- パラフィンフィルムでペトリ皿を覆い、室温でオービタルシェーカー上に置きます。設定した時刻に反応媒体の50μlのアリコートを取ります。
注：CEとの合計分析時間は、15分では、このように一定分量を15分毎（または2つの反応が並行して監視される場合、30分毎など ）をとることができます。- 各アルの内部ニュートラル標準としての水中で10％（v / v）のDMSOの2μLを加えますiquot。
注：一定分量は、すぐに彼らが取られるようにCEを用いて分析する必要があります（ステップ7を参照）。
- 各アルの内部ニュートラル標準としての水中で10％（v / v）のDMSOの2μLを加えますiquot。
- 揺れやアリコート除去の4時間後、シェーカーからペトリ皿を削除します。ペトリ皿からの反応媒体を削除します。キトサンフィルムをすすぐためにPBSの5ミリリットルを追加します。
- ペトリ皿からPBSを削除し、超純水でキトサンフィルムをすすぎ、それらを一晩乾燥させます。超純水を外し、プラスチック製のペトリ皿に-20℃でフィルムを保管。
グラフト反応の7モニタリングCEを使用しました
- すぐにセクション5.2のように分析条件を使用して、ペトリ皿から除去した後に注入し、反応媒体の別個のアリコート。
- 分離が完了した後、10分間超純水でキャピラリーをすすぎます。 10分間の空のバイアル（空気）と同一平面を介して乾燥させます。
注記：この実験は、この段階で一時停止することができます。
8.データトリート CE用tment
- 分離時の電流と（この場合はDMSO）電気モビリティマーカーの移動時間の両方がオリゴアクリレートの標準的な分離のために認められたものと類似していることを確認することにより、各分離の妥当性を確認してください。
注：最大10〜15％の変化（高い再現性が要求される場合、電気泳動移動度の値ではなく移動時間を使用する必要があります）期待される電流は約50μAの値と1.3分の移動時間値から許容可能です。 - 成功した各分離のために、右の輸出をクリックして適切な信号を選択し、特定のデータセットを選択することにより、キャピラリー電気泳動ソフトウェアからの生データをエクスポートします。
- （移動時間の関数としてのUV吸光度として提示）CEによって記録された生データを変換します。式（1）以下の電気泳動移動度μにX軸（移動時間t m）を変換します。
nは1 "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 54549 / 54549eq1.jpg "/>（1）
L dは検出器の長さであり、L tはキャピラリーの全長であり、Vは電圧であり、 そしてT EOは中性種（この場合はDMSO、内部標準）27の移動時間です。
28：Wは、（μ）は、以下の式（2）電気泳動移動度の分布に生データ（AUにおける吸光度）のY軸の変換
（2）
（2） ペプチドグラフトされたフィルム18の9その他のキャラクタリゼーション
- ペプチドグラフト化キトサンフィルムを挿入し、4ミリメートル固体NMRローターに、自分自身の周りに巻か。フィルムを膨潤、ロータを閉じるためにリン酸緩衝生理食塩水で回転子を埋めます。数時間待ってください。
- 13でフィルムを分析</ SUP> C NMR分光法18。
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Representative Results
CEは、キトサンフィルム上のペプチド（ 例えば 、RGDS）のグラフトの監視に適しています。適切なカップリング剤としては、キトサン上にグラフトされる（ 図1）のペプチドを有効EDC・HCl及びNHSを含みます。 CEは、反応媒体から、目的の異なる分子を分離することができます。電気泳動上のピークを割り当てるには、純粋なRGDSは、EDC-HCl及びNHSは、溶解注射し、別々に分離しました。ピークの割り当て後、反応媒体を注入し、様々な反応物（ 図2）を同定しました。 （ - （（（エチルアミノ）（ヒドロキシ）メチレン）アミノ） - N、N -dimethylpropan -1-アミン3）EDC-HClが副生成物EDH-HCl中に反応しました。ジメチルスルホキシド（DMSO）は、CE分離のための内部標準として使用されます。キトサンは、不溶性フィルムの形態で移植実験中に存在し、従って、注射またはCEでは観察されません。トン、すべての生データのためにそれを注意してください彼は、移行時間軸は、電気泳動移動度のW（μ）（式2）の分布に電気泳動移動度の軸（式1）及びUV吸収軸に変換され記録されます。
アリコートを反応媒体から取得され、それらは、CE機器に入れ、注入されます。反応の程度は、RGDS（ 図3）に関連したピークの減少を通じて監視されています。また、EDC-HClのピークが経時一方EDH塩酸ピーク増加を減少することが分かります。したがって、反応媒体から除去さRGDSキトサンフィルム上にグラフトされていると想定される、ペプチドの副反応からの生成物に割り当て可能な信号がないことに注意することが重要です。オーバーレイ電気泳動（ 図3A）は、反応の開始から終了までのペプチド量の定量化を可能にします。これは、ことに留意すべきです反応速度が最初に18時間（ 図3B）を測定したが、4時間はその最大程度まで反応を進行させるために十分と考えられました。 （最適な注入量は、過負荷（ 図4A）を防止しながら、信号対雑音比が十分に高い確実にするために必要であり、RGDSの場合、注射が重縮合を防ぐために、実時間で完了することが要求された定量化を可能にするために、図4B ）。
キトサンフィルムにペプチドグラフトを分析するために、ここで説明CEベースの技術は、高速かつ簡単です。しかしながら、それは直接グラフト化プロセスを定量化しません。 NMR分光法は、移植を実証するために使用されます。この測定はリアルタイムで行うことができない（それは、典型的には数時間を要する）と反応後に完了する必要があります。前と移植後のキトサンフィルムの定性的比較は、ペプチドの成功グラフトのthroを示していますキトサンとペプチドとの間のアミド結合（ 図5）に対応したグラフトされた映画の中で70 ppmのシグナルの出現ぐふ。
グラフト反応の図1.スキーム。キトサンのフィルム表面上にそのグラフトが続くRGDSのカルボン酸官能基のEDC-HCl及びNHSによる活性化を示す化学反応スキーム。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 。
反応媒体中に存在する種の 図2. ピークの割り当て。部分的に加水分解EDCのソリューションのためのA.分離とピークの割り当て -HCl（ピンク）、RGDSと同様にPBS（紫）用（赤）、NHS（青）、および反応媒体（黒）。移動時間の関数として提示反応媒体（黒）のB.電気泳動図（電気泳動移動度は、移動時間に乏しい再現性を克服するために使用されるべきである）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
RGDS消費の 図3. CE監視。（A） は 、反応時間30分（紫色の実線）、60分（マゼンタ破線）、90分（青実線）、120分（緑の破線）でのペプチドピークをオーバーレイさ150分（赤実線）および複製（四角と円）で18時間かけて完成したグラフト（B）の動態。PLOAD / 54549 / 54549fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 次善の結果を示す反応媒体中 4 オーバーレイペプチドピーク （A）変（流体力学）噴射時間：5秒（青線）、10秒（黒線）、20秒（赤線）と30秒（マゼンタライン） 。 （B）反応媒体は、注射の前に長期間CEバイアルに残っ：30分（赤線）と90分（青線）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5. 13Cキトサンフィルムの膨潤した状態のNMRスペクトル。（黒線）前と（青線）ペプチド移植後のフィルムの比較。アスタリスクだけによって示され、移植後記録されたスペクトル内に存在することを通知します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明されたプロトコルのシンプルさは、広範囲のアプリケーションに、それは理想的に適しています。しかし、特に注意は、以下の重要なステップのに支払われる必要があります。
適切なCE機器の準備
日に毛細管及び機器の正当性を確認する直前に、未知試料の分離（ならびに分離の一連の終了時）に知られている標準を分離することが重要です。この標準は、オリゴアクリレート27や移動時間の広い範囲にわたって複数のピークを与えることが知られている任意の試料であることができます。すべての分離時の電流を監視し、各分離中の中性マーカーのマイグレーションを分析して問題を特定するための重要なステップです。現在のプラトー値の不安定な電流や大きな変動（以上百分の10から15まで）は、バッファ（pHまたは濃度）で矛盾に起因する可能性があります。それが遅れmigratioが続く場合nは中立メーカーの時間は、それはまた、毛細血管が十分にきれいではないに起因する可能性があります。緩衝液のpHおよび1 M水酸化ナトリウム（新たに調製した）で10分間、キャピラリーの余分なフラッシュのルーチンチェックが修正/この問題を回避するために使用することができます。実験中に、余分な洗浄工程は、典型的には含む、またはヒューズシリカキャピラリー表面を再生するために、濃縮水酸化ナトリウム水溶液でフラッシュを長く、最適な分離を確実にするために使用することができます。
適切なデータ処理
結果を比較すると、実験の終わりに、生データの適切な処理が不可欠です。これは、CE機器（ステップ8.3）から得られたXおよびY軸の変換を含みます。 CEで決定された移動時間は比較的乏しい再現性を持って、私たちはより良い再現性につながる、代わりに電気泳動移動度を使用することをお勧めします。正しくトンの意義 reatingデータは、分離および特性キトサン10、ポリ（アクリル酸）29、ブロック共重合体13の8移動時間よりも移動度のために、実験の間で観察さより小さい標準偏差（RSD）を介して、朝食用シリアル中の糖の検出を、以前に示されています。さらに、CEは、複雑なマトリックス5中の単糖類の分離をHPLCよりも堅牢であることが示されています。最適化の他のステップは、定量化を妨げる過負荷を引き起こすことなく、良好な感度との分離を可能にする噴射量（噴射時間）を調整することを含むことができます。 10秒の注入時間は、30ミリバール（ 図4B）で最適とみなされる：長い注入時間はキャピラリーのオーバーロードを示すピーク形状の歪みにつながりながら、短い注入時間は、感受性の低下につながります。
リアルタイム監視の重要性
用ove_content ">このCEベースの方法の重要な強度をリアルタイムで反応を監視する能力である。これは検出と関連する反応物質および/または生成物の分離のための最適なCE条件を必要とする。さらに、化学反応の分析に適切な時間ゼロは、反応のベンチマークとして採用されている必要があり、これは典型的には直前に反応開始に計り反応物の分離にある一つの特定の反応物が導入される前に、これは前に、例えば行うことができます。温度が上昇する、またはUV照射の前に反応を誘発するために開始されます。ペプチドRGDS（キトサン上または他の基板上への）のグラフト化の場合には、ペプチドは、重縮合18を介して線状オリゴマーまたは分岐構造を生成するためにそれ自体と反応することができます。 RGDS、アミンおよびカルボン酸官能基の両方を含むためです。これらのペプチドオリゴマーは、同じ電子を持っていませんしたがってlectrophoretic初期ペプチドRGDSなどのモビリティとは、他の種と例えば同時移行を通じて、不正確な定量化を引き起こす可能性があります。反応媒体のアリコートを注入し、反応媒体（ 図4B）から取られてから数分以内に分離されていることを確認することが重要です。
キトサンフィルムの適切な準備
具体的には、キトサンフィルムを扱う際に付着するステップの数があります。キトサンフィルムの製造時、フィルムは（好ましくは）、少なくとも7日間乾燥させされる必要があります。これが完了していない場合には、膜をPBS緩衝液中に置かれるときに溶解するのではなく、その後、次のステップを妨げる膨潤膜を形成するリンスします。加えて、膜から浸出し、と競合することができる任意の残存酢酸を除去するために、グラフト化反応の前にフィルムを中和することが重要ですグラフト反応18のためのペプチド。これは、希水酸化ナトリウム水溶液で、またはPBSで浸漬を介して行うことができます。グラフト反応のための溶媒として使用される緩衝液のpHも重要である：フィルムが部分的にまたは完全に溶解するあまりに酸性である場合。グラフト反応時には、フィルムは、反応液との最大接触を持つことができることが重要です。したがって、フィルム、反応混合物を含むペトリ皿をシェーカー上に配置されています。不正確な数量化をもたらす制御されない濃度の変動を防止するために、反応混合物の蒸発を防ぐためにも不可欠です。ペトリ皿を覆うようにパラフィンフィルムの使用は、それを防止するのに効果的でした。
CE技術の主な限界は、個別にはグラフト化プロセスを確認することができないことです。上記化学グラフト法の文脈では、ペプチドグラフトの定量化は間接的です。この前述のように、そのような固体状態NMR分光法などの補完的な技術を用いて克服することができます。 CEの技術の他の制限は、それを充電する目的の化合物を必要とすることを含みます。したがって、中性種は同時に移動します。特定の場合において、これはホウ酸と関心錯体化合物場合に克服することができます。目的の化合物は、発色団を含んでいない場合は最後に、このような導電性などのUV以外の検出を使用する必要があるかもしれません。これは、最適化を必要とする導電率検出器の追加購入が必要です。
他の分析方法対CE介してペプチドグラフトを分析することの利点
CE法は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、アミノ酸分析（AAA）及びNMR分光法の直接法を含む代替的な間接的な方法に比べていくつかの利点を有します。 AAAに比べて高スループット、ロバストな方法であるwhichは、それが面倒な試料調製なしで効率的に複雑なサンプルを分析することができます。これは、特にリアルタイムでの化学反応の分析に有利です。 HPLCは、ペプチド分析30を移植するために以前に使用されている、しかし、それだけで、半定量的と見なされました。 CEはHPLCより低いランニングコストが、サンプル損失5のリスクを最小限に抑え、分析前に、サンプルの濾過を必要としません。 13 C NMRスペクトルは、直接、目的の生成物を測定することができるが、それは高価な技術であり、実時間で測定することができません。
ここdescriptedプロトコルは、キトサンフィルムにグラフト化ペプチドを最適化するための、迅速、効率的、安価で信頼性の高い方法を提供します。この新しいアプローチは、このように、クロマトグラフィーやAAAなど、伝統的に用いられている方法に比べキトサンフィルムの細胞接着特性を調整するための重要な利点を提供します。このCE法は、数を監視するために使用することができリアルタイムで他の化学反応、関心の反応物質/製品を充電することができるためのいくつかの時間の時間枠、上で発生する一般的に反応。この場合には、CE法が成功した分析を可能にする前に、異なる化学反応の分析に最適化されるべきであることに留意することが重要です。これは、それらを識別し、それらを検出し、分離することができることを確認できるようにするだけでなく、いかなる汚染物質が定量化を防止しなくてもよいことを保証するために、反応前に純粋な反応物および生成物の分析を含みます。分離を向上させることができ、総分析時間は、キャピラリーの長さ、緩衝液組成及び電圧を変化させること、そして潜在的に被覆された壁を有する毛細管を使用して変更します。検出は、試料が帯電し、反応物を支持するために注入された条件を変更することにより、またはキャピラリー内に試料を大量に注入することによって改善することができます。さらに、UV検出から離れた他の検出器は、bはすることができ蛍光、非接触導電率検出器またはCEを含む使用Eは、質量分析計に結合することができます。リアルタイムでの反応をモニターする能力は、基質が溶液中にあり、CEによって分析することができる場合CEバイアル中で直接実行されるグラフト反応を可能にします。我々は最近、ポリ（アクリル酸）のアミノアンチピリンのグラフト化のためにそれを行う、これは図7に加えて、このアプローチは、グラフト反応に限定されず、他の種々の化学反応を監視するために拡張することができ、CE機器の内部で直接行うことができます。さらに、反応のモニタリングは、反応の最適化を可能にし、また、反応の生成物を確認するために使用されてもよいです。限り、目的の化合物を溶解し、充電することができるように、CE法は、速く、安価で堅牢な分離、検出及び定量を可能にします。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water | Millipore | All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality | |
| Chitosan powder (medium molecular weight) | Sigma-Aldrich | 448877 | lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides |
| Acetic acid - Unilab | Ajax Finechem | 2-2.5L GL | laboratory reagent |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | laboratory reagent, corrosive |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | Irritant to skin |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | Irritant to skin |
| Sodium chloride | Ajax Finechem | 466-500G | laboratory reagent |
| Potassium chloride - Univar | Ajax Finechem | 384-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Disodium hydrogen phosphate - Unilab | Ajax Finechem | 1234-500G | laboratory reagent, slight skin irritant |
| Potassium dihydrogen phosphate - Univar | Ajax Finechem | 4745-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Oligoacrylate standard | custom made | See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46 | |
| Boric acid | BDH AnalR, Merck Pty Ltd | 10058 | Corrosive |
| Hydrochloric acid - Unilab | Ajax Finechem | A1367-2.5L | laboratory reagent, corrosivie |
| Fused silica tubing | Polymicro (Molex) | TSP050375 | Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies | G7100CE | Capillary electrophoresis instrument |
| Orbital shaker | IKA | KS260 | |
| Electronic balance | Mettler Toledo | MS204S | |
| Milli-Q Synthesis | Millipore | ZMQS5VF01 | Ultrapure water filtration system |
| Parafilm | Labtek | PM966 | Parrafin wax |
References
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