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Chemistry

Eletroforese Capilar para monitorar Peptide Enxertia em quitosana Films em Tempo real

Published: October 26, 2016 doi: 10.3791/54549

Abstract

electroforese capilar de solução livre (CE) separa os analitos, compostos geralmente praticados na solução por meio da aplicação de um campo eléctrico. Em comparação com outras técnicas de separação analíticas, tais como cromatografia, CE é barato, robusto e eficaz não requer a preparação da amostra (por um certo número de matrizes naturais complexas ou amostras poliméricas). CE é rápido e pode ser utilizado para seguir a evolução de misturas em tempo real (por exemplo, cinética de reacção química), tal como os sinais observados para os compostos são separados são directamente proporcional à sua quantidade em solução.

Aqui, a eficiência da CE é demonstrada para a monitorização do enxerto covalente de péptidos sobre os filmes de quitosana para aplicações biomédicas subsequentes. propriedades antimicrobianas e biocompatíveis da quitosana torná-lo um material atraente para aplicações biomédicas, tais como substratos de crescimento celular. Enxerto covalentemente os RGDS péptido (arginina - glicina -ácido aspártico - serina) sobre a superfície de filmes de quitosano tem por objectivo melhorar a fixação celular. Historicamente, a cromatografia e a análise de aminoácidos têm sido utilizados para fornecer uma medida directa da quantidade de péptido enxertado. No entanto, a separação rápida e ausência de preparação de amostras fornecidas pela CE permite o monitoramento em tempo real igualmente precisa ainda do processo de enxertia peptídeo. CE é capaz de separar e quantificar os diferentes componentes da mistura reaccional: o (não enxertados) péptido e os agentes de acoplamento químico. Deste modo, o uso de CE resulta em filmes melhoradas para aplicações a jusante.

Os filmes de quitosana foram caracterizados por meio de estado sólido RMN (ressonância magnética nuclear) espectroscopia. Esta técnica é mais demorada e não pode ser aplicada em tempo real, mas produz uma medição directa do péptido e, assim, valida a técnica CE.

Introduction

Electroforese capilar solução livre (CE) é uma técnica que separa os compostos em soluções com base na sua razão de carga de 1,2-para-fricção. Relação carga-to-size é frequentemente mencionado na literatura, mas essa simplificação não se aplica a polielectr�itos, incluindo polipeptídeos neste trabalho, e também foi mostrado para não ser apropriado para pequenas moléculas orgânicas 3. CE difere de outras técnicas de separação em que o mesmo não possui uma fase estacionária, apenas uma electrólito fundo (geralmente um tampão). Isso permite que a técnica para ser robusto em sua capacidade de analisar uma grande variedade de amostras com matrizes complexas 4, tais como fibras de plantas 5, cervejas de fermentação 6 de enxertia em polímeros sintéticos 7, amostras de alimentos 8, e peptídeos dificilmente solúveis 9 sem preparação da amostra tedioso e purificação. Isto é especialmente significativo para polielectrólitos complexos que têm problemas de dissolução (suito como quitosano 10 e goma de gelano 11) e, por conseguinte, existir como agregados ou precipitado na solução e foram analisados com sucesso sem a filtração da amostra. Além disso, a análise de açúcares em cereais de pequeno almoço envolveu injetar amostras com partículas de amostras de cereais de pequeno-almoço precipitado em água 8. Isto também se estende para a análise de polielectrólitos ou copolímeros ramificados 12,13. Extenso trabalho também foi concluído no desenvolvimento de técnicas de CE especificamente para a análise de proteínas para proteómica 14, separação quiral de péptidos naturais ou sintéticos 15 e separações microchip de proteínas e péptidos 16. Uma vez que a separação e a análise ter lugar em um capilar, apenas pequenos volumes de amostra e são usados solventes que permite CE ter um custo de exploração mais baixa do que outras técnicas de separação, incluindo 5,6,17 cromatografia. Uma vez que a separação por CE é rápido, que permite que o monitoanel de cinética da reacção. Isto foi demonstrado no caso do processo de enxerto de péptidos sobre os filmes de quitosano para uma melhor adesão da célula 18.

O quitosano é um polissacárido derivado do -deacetylation N de quitina. Filmes de quitosano pode ser usado para várias aplicações biomédicas, tais como bio-adesivos 19 e substratos de crescimento de células 18,20, devido à biocompatibilidade do quitosano 21. Ligação de células a proteínas de matriz extracelular específicos, tais como fibronectina, laminina e colagénio, está directamente relacionada com a sobrevivência das células 22. Notavelmente, tipos de células diferentes, muitas vezes exigem apego a diferentes proteínas da matriz extracelular para a sobrevivência e funcionamento correto. A fixação de células de filmes de quitosana foi mostrado para ser melhorada através da enxertia de fibronectina 23; No entanto, a preparação, purificação e enxertia de tais proteínas grandes não é economicamente viável. Em alternativa uma variedade de pequenos péptidos Have foi mostrado ser capaz de imitar as propriedades de grandes proteínas da matriz extracelular. Por exemplo, péptidos, tais como os miméticos de fibronectina RGD (arginina - glicina - ácido aspártico) e RGDS (arginina - glicina - ácido aspártico - serina) têm sido usadas para facilitar e aumentar a ligação de células 24. Covalente enxerto de RGDS sobre os filmes de quitosana resultou na fixação das células melhorado para células conhecidas para anexar a fibronectina in vivo 18. Substituindo proteínas maiores gosta fibronectina com péptidos mais pequenos que têm a mesma funcionalidade proporciona uma significativa redução de custos.

Aqui, o péptido de enxertia para a quitosana foi realizada como publicado anteriormente 18. Como demonstrado previamente, esta abordagem fornece enxerto simples e eficiente, utilizando os agentes de acoplamento de EDC-HCl (1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida) e NHS (N-hidroxissuccinimida) para funcionalizar o ácido carboxílico da RGDS ser enxertado nafilme de quitosana. Duas vantagens deste método são que o enxerto não exige qualquer modificação do quitosano ou do péptido, e é realizada em meio aquoso, para maximizar a compatibilidade com as aplicações de cultura de células futuras 18,20. Como os agentes de acoplamento e o péptido pode ser cobrado, CE é um método adequado para a análise da cinética de reacção. Mais importante, a análise da cinética da reacção por meio de CE permite a monitorização em tempo real da reacção de enxerto, e, portanto, permite a optimização tanto e quantificar o grau de enxertamento.

Embora não seja necessário rotineiramente, os resultados da análise de CE pode ser validado off-line por uma medição directa do péptido enxertando sobre os filmes de quitosano usando espectroscopia de 25,26-RMN de estado sólido (ressonância magnética nuclear) para demonstrar o enxerto covalente do péptido sobre a película 18. No entanto, em comparação com a do estado sólido espectroscopia de RMN, a análise em tempo real fornecida pelaCE permite a quantificação do consumo de péptido em tempo real e, assim, a capacidade de avaliar a cinética da reacção.

O método acima mencionado é simples e permite a análise em tempo real de péptido enxertia em filmes de quitosana com quantificação indirecta da extensão da enxertia. O método demonstrado pode ser estendido para a avaliação quantitativa em tempo real de diferentes reacções químicas, desde que os reagentes ou os produtos a serem analisados ​​pode ser carregada.

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Protocol

1. Preparação de quitosano Films

  1. Pesar 2 g de ácido acético glacial, completa a 100 ml com água ultrapura.
  2. Pesar 1,7 g de pó de quitosano, juntar 100 ml de solução a 2% m / m de ácido acético aquoso. Agita-se durante 5 dias, com uma barra de agitação e placa de agitação magnética à temperatura ambiente, quer coberto com folha de alumínio ou, no escuro.
  3. Centrifugar a dispersão de quitosano a 1076 xg a 23 ° C durante 1 h. Recolhe-se o sobrenadante com uma seringa e descartar o precipitado.
  4. Para cada película, uma alíquota de 10 ml da suspensão de quitosana em plástico de 9 cm de caixa de Petri à temperatura ambiente. Deixar os filmes cobertos para secar por pelo menos 7 dias.
  5. Usando uma tesoura cortar os filmes secos em 1 x 1 cm quadrados. Nota: O experimento pode ser pausado nesta fase.

2. Preparação de solução salina tamponada com fosfato (PBS)

  1. Pesar 8 g de cloreto de sódio, 0,2 g de cloreto de potássio, 1,44 g de hidrogenofosfato dissódico PhosPhate e 0,24 g de di-hidrogenofosfato de potássio.
  2. Dissolve-se estes produtos químicos pesados ​​em 800 ml de água ultrapura e titula-se a solução com ácido clorídrico concentrado para pH 7,4.
    Nota: O experimento pode ser pausado nesta fase.

3. Preparação de tampão de borato de sódio 75 mM a pH 9,2

  1. Pesar 3,0915 g de ácido bórico. Dissolve-lo em 75 ml de água ultrapura.
  2. Titula-se a solução de ácido bórico a um pH de 9,2 com uma solução de hidróxido de sódio a uma concentração de 10 M ou superior.
    Atenção: soluções concentradas de hidróxido de sódio são corrosivos e devem ser manuseados com luvas.
  3. Completar com água ultrapura para se obter 100 ml de solução. Obteve-se um tampão de borato de sódio 500 mM a pH 9,2.
  4. Diluir o tampão de borato de sódio 500 mM com água ultrapura com tampão de borato de sódio 75 mM. Nota: O experimento pode ser pausado nesta fase.

4. Preparação de quitosano Films para a reacção de enxerto

  1. Lavagem de 10 filmes de quitosana quadrados (1 x 1 cm) em 5 ml de PBS durante 2 h em placas de Petri à temperatura ambiente.
  2. Durante este tempo, preparar e validar o instrumento de electroforese capilar (passo 5).

5. Preparação e validação do Instrumento de Eletroforese Capilar

  1. Prepara-se uma de 43,5 cm nua capilar de sílica fundida, com um diâmetro interno de 50 mm (43,5 centímetros é o comprimento total, o comprimento efectivo para a janela de detecção é normalmente 35 cm), enfraquecendo o revestimento exterior de polímero do capilar com o comprimento conjunto com um utensílio contundente, em seguida, encaixe o capilar.
    1. Criar uma janela para o capilar usando um isqueiro para queimar o revestimento de polímero de 8,5 cm da entrada e depois que esfria limpe-o com etanol. Queimar o revestimento do capilar em cada extremidade por alguns milímetros, com um isqueiro, e depois que esfria limpe-o com etanol.
    2. insi capilar lugarjanela de detecção e instalá-lo na cassete capilar, colocando-o em distâncias iguais na entrada e na saída e enrolando-a em torno dos eixos da cassete. Em seguida, instale a cassete no instrumento eletroforese capilar.
  2. Definir os parâmetros do método para cada separação. No menu do software selecione "método" e depois "editar o método inteiro". Ajustar a temperatura, o tempo, a tensão, e os frascos utilizados para a separação (por exemplo 25 ° C, 10 min, 30 kV).
    1. Na secção de pré-condicionamento, definir os rubores consecutivos: 10 minutos com hidróxido de sódio a 1 M (em água), 5 min com hidróxido de sódio 0,1 M (em água), 5 min com água ultrapura e 5 min com tampão de borato de sódio 75 mM a pH 9,2 para o primeiro método de uma série de análises.
    2. Para os métodos subsequentes, definir o conjunto das ondas consecutivas na secção de pré-condicionamento: 1 min com hidróxido de sódio a 1 M (em água), 5 min com tampão de borato de sódio 75 mM a pH 9.2.
    3. Na secção de injecção, para definir os parâmetros de uma injecção com pressão hidrodinâmico 30 mbar durante 10 segundos para todos os métodos. Na secção de separação, definir as condições de separação a 30 kV, a 25 ° C durante 9 min para todos os métodos.
      NOTA: Consulte o manual do usuário do instrumento específico CE como procedimento para operar o instrumento CE pode variar entre os fabricantes. Preparar a solução de hidróxido de sódio 1 M no dia.
  3. Injectar e separar um padrão interno de neutro (10 ul de 10% v / v de sulfóxido de dimetilo (DMSO), em água diluída em 450 ul de tampão de borato de sódio 75 mM). Injetar e separar da mesma forma um padrão oligoacrylate (dissolvido em água ultrapura em 10 g ∙ L -1; veja Lista de Materiais) para verificar a validade do capilar. Pausar a sequência aqui até a reacção de enxerto está pronto para começar.

6. Alongamento das RGDS Onto Quitosana Film

  1. Pesar o péptido (1 mg RGDS)e os agentes de acoplamento (3 mg de EDC-HCl e 2 mg de NHS).
  2. 2 horas após o início da imersão filme de quitosano em PBS, dissolve-se o péptido e os agentes de acoplamento em 5 ml de PBS.
    1. Tomar uma aliquota de 50 ul desta solução. Adicionar 2 mL de 10% v / v de DMSO em água, como um padrão interno neutro à alíquota. Analisar a alíquota com CE (veja o passo 7).
  3. Remover os 5 ml de PBS utilizada para enxaguar os filmes de quitosana da placa de Petri. Adicionar a solução de 5 ml de agentes de acoplamento de péptidos e para a placa de Petri contendo os filmes de quitosana.
  4. Cubra o prato de Petri com filme de parafina e colocá-lo em um agitador orbital à temperatura ambiente. Tome 50 mL alíquotas de meios de reacção em tempos do jogo.
    NOTA: O tempo total de análise de CE é de 15 minutos, assim, uma alíquota pode ser feita a cada 15 minutos (ou a cada 30 min se duas reacções são monitorizadas em paralelo, etc).
    1. Adicionar 2 mL de 10% v / v de DMSO em água, como um padrão interno para cada ponto morto aiIQUOT.
      NOTA: As aliquotas devem ser analisadas com CE, logo que eles são levados (ver passo 7).
  5. Após 4 horas de agitação e remoção de alíquotas, remova a placa de Petri do shaker. Remover o meio de reacção a partir da placa de Petri. Adicionar 5 ml de PBS para lavar os filmes de quitosana.
  6. Remover o PBS a partir da placa de Petri, lavar o filme quitosana com água ultrapura e permitir-lhes a secar durante a noite. Remover a água ultrapura e armazenar as películas à temperatura de -20 ° C em uma placa de Petri de plástico.

7. Monitoramento de Reação Enxerto Usando CE

  1. Injectar e alíquotas separadas de meio de reacção imediatamente após a remoção da placa de Petri utilizando as condições de análise como na secção 5.2.
  2. Após a conclusão das separações enxaguar o capilar com água ultrapura durante 10 min. Seque-o através de um flush com um frasco vazio (ar) durante 10 min.
    NOTA: O experimento pode ser pausado nesta fase.

8. Dados Trea tamento para CE

  1. Verificar a validade de cada separação, por verificar que tanto a corrente durante a separação e o tempo de migração do marcador mobilidade electro-osmótico (DMSO neste caso) são semelhantes aos observados para a separação padrão oligoacrylate.
    NOTA: até 10-15% de variação é aceitável do valor atual esperado de cerca de 50 mA e valor tempo de migração de 1,3 min (valores de mobilidade eletroforética deve ser usado em vez de tempos de migração se um repetibilidade superior é exigido).
  2. Para cada separação bem-sucedida, exportar os dados brutos do software eletroforese capilar, selecionando um conjunto de dados específico, clique direito sobre a exportação e selecionar um sinal apropriado.
  3. Converter os dados em bruto gravados pela CE (apresentada como absorvância de UV em função do tempo de migração). Converter o eixo X (tempo de migração T m) para uma mobilidade electroforética μ seguinte equação 1:
    n 1 "src =" / files / ftp_upload / 54549 / 54549eq1.jpg "/> (1)
    em que L é o comprimento d ao detector, G t é o comprimento total do tubo capilar, V é a tensão, e t EO é o tempo de migração de uma espécie neutra (padrão interno DMSO neste caso) 27.
    Converter o eixo Y dos dados em bruto (absorvância em AU) para uma distribuição de mobilidades electrof W (μ) seguinte equação 2: 28
    equação 2 (2)

9. Caracterização Adicional dos enxertado com Peptídeo 18 Films

  1. Insira filmes de quitosana enxertado com peptídicos, laminados em torno de si, em um solid-state rotor NMR 4 mm. Encher o rotor com solução salina tamponada com fosfato a inchar dos filmes, e fechar o rotor. Espere por algumas horas.
  2. Analisar o filme com 13 </ sup> C espectroscopia de RMN 18.

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Representative Results

CE está bem adaptado para monitorar a enxertia de péptidos (por exemplo, RGDS) sobre os filmes de quitosano. Os agentes de acoplamento adequados incluem EDC-HCl e NHS que activam o péptido a ser enxertado na quitosano (Figura 1). CE é capaz de separar os diferentes moléculas de interesse a partir do meio de reacção. Para designar os picos no electroferograma, RGDS puros, EDC-HCl e NHS foram dissolvidos, injectados separadamente e separada. Após a atribuição de pico, o meio de reacção foi injectada e os vários reagentes foram identificados (Figura 2). De EDC-HCl reagiram para um produto secundário EDH-HCl (3 - (((etilamino) (hidroxi) metileno) amino) - N, N -dimethylpropan-1-amina). Dimetil sulfóxido (DMSO) é utilizado como padrão interno para as separações CE. O quitosano está presente no experimento de enxerto na forma de filmes insolúveis e, portanto, não é injectado ou observados em CE. Note-se que para todos os dados em bruto, tgravou eixo do tempo de migração é convertido num eixo mobilidade electroforética (Equação 1) e o eixo de absorção de UV para uma distribuição de mobilidades electrof W (μ) (equação 2).

À medida que as aliquotas são retiradas do meio de reacção que são colocadas dentro do instrumento CE e injectado. A extensão da reacção é monitorizado por meio da diminuição do pico relacionado com RGDS (Figura 3). Também pode ser visto que o pico de EDC-HCl diminui enquanto o EDH-HCl pico aumenta ao longo do tempo. É importante notar que não existe um sinal que pode ser atribuído a um produto de uma reacção secundária do péptido, assim, presume-se que os RGDS ser removido do meio de reacção está a ser enxertado na película de quitosano. Eletroferogramas sobrepostas (Figura 3A) permitem que a quantificação do consumo de péptido a partir do início até ao fim da reacção. É de notar queembora a cinética foi inicialmente medido durante 18 horas (Figura 3B), 4 h foi considerada suficiente para que a reacção prossiga a sua extensão máxima. Para permitir a quantificação de um volume de injecção óptimo é necessário para assegurar a relação sinal-ruído é suficientemente elevado, evitando a sobrecarga (Figura 4A) e no caso de RGDS, injecções foram obrigados a ser completado em tempo real para impedir policondensação (Figura 4B ).

A técnica baseia-CE descrito aqui para analisar peptídeo enxerto para filmes de quitosana é rápido e simples; No entanto, ele não quantificar o processo de enxerto directamente. espectroscopia de RMN é usado para demonstrar o enxerto; esta medida não pode ser feito em tempo real (que normalmente leva várias horas) e deve ser concluído pós-reação. A comparação qualitativa dos filmes de quitosano antes e após enxerto mostra o enxerto bem sucedido dos péptidos throurg o aparecimento de um sinal a 70 ppm nos filmes enxertados correspondentes à ligação amida entre o quitosano e o péptido (Figura 5).

figura 1
Figura 1. Esquema da reacção de enxerto. Esquema de reacção química que mostra a activação por EDC-HCl e NHS do grupo funcional ácido carboxílico de RGDS seguido por seu enxerto na superfície de cinema do quitosano. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura .

Figura 2
Figura 2. atribuição de pico das espécies presentes no meio de reacção. A. Separação e atribuição de pico para soluções de EDC parcialmente hidrolisada HCI (rosa), RGDS (vermelho), NHS (azul), bem como para a PBS (roxo) e o meio de reacção (preto). B. electroferogramas dos meios de reacção (preto) apresentado como uma função do tempo de migração (electroforética mobilidade deve ser usado para superar má capacidade de repetição em tempos de migração). por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura monitoramento 3. CE do consumo RGDS. (A) Sobrepor picos de Peptídeos em tempo de reação de 30 min (linha sólida roxo), 60 minutos (linha do traço magenta), 90 min (linha azul sólida), 120 min (linha do traço verde), 150 min (linha sólida vermelha) e (B) cinética de enxertia completou mais de 18 horas em repetições (quadrado e um círculo).pload / 54549 / 54549fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. picos peptídicos sobreposta em meios de reacção mostrando resultados sub-óptimos (A) Variável (hidrodinâmico) tempos de injeção:. 5 seg (linha azul), 10 seg (linha preta), 20 seg (linha vermelha) e 30 segundos (linha magenta) . Mídia (B) reacção foi deixada em um frasco CE por um período prolongado de tempo antes da injecção:. 30 min (linha vermelha) e 90 min (linha azul) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. 13C espectros de RMN inchada-estado de filmes de quitosana. Comparação dos filmes antes (linha preta) e depois (linha azul) enxertia peptídeo. Sinais presentes apenas no espectro registrado após a enxertia são indicadas por asteriscos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A simplicidade do protocolo descrito aqui torna-o idealmente adequado para aplicação generalizada. No entanto, uma atenção especial deve ser dada a uma das seguintes etapas principais.

Preparação instrumento adequado CE

É importante para separar um padrão conhecido, imediatamente antes da separação de amostras desconhecidas (bem como no fim de uma série de separações) para verificar a validade do capilar e instrumento no dia. Este padrão pode ser uma oligoacrylate 27 ou qualquer amostra de concentração conhecida para se obter vários picos através de uma vasta gama de tempos de migração. Acompanhamento do corrente durante todas as separações e analisar a migração de um marcador neutro em cada separação são passos fundamentais para identificar problemas. Um variações de corrente ou instáveis ​​grandes (mais do que 10-15%) no valor de patamar da corrente pode ser devido à inconsistência no tampão (pH ou concentração). Se ele é seguido por um migratio retardadaN vez do fabricante neutra também pode ser devido ao capilar de não ser suficientemente limpo. controlos de rotina do pH do tampão e de um autoclismo extra do capilar durante 10 minutos com hidróxido de sódio 1 M (preparada de fresco) pode ser utilizado para prevenir / alterar este problema. Durante a experiência, podem ser empregues passos adicionais de limpeza para assegurar uma separação óptima, tipicamente incluindo alongamento ou uma lavagem com hidróxido de sódio aquoso concentrado para regenerar a superfície do fusível capilar de sílica.

Tratamento de dados adequada

Na conclusão do experimento, o tratamento adequado dos dados brutos é essencial quando se comparam resultados. Isto envolve a conversão de X e do eixo Y obtido a partir do instrumento CE (passo 8.3). Os tempos de migração determinados em CE têm um relativamente pobre repetibilidade e recomendamos a utilização de mobilidades eletroforéticas vez, levando a uma muito melhor repetibilidade. O significado de t correctamente dados RIANDO tem sido mostrado previamente com a separação e caracterização de quitosano 10, poli (ácido acrílico) 29, copolímeros de blocos 13 e a detecção de açúcares em cereais de pequeno almoço 8 através de desvios padrão mais pequenos (RSD) observados entre experiências para as mobilidades do que para os tempos de migração . Além disso, CE tem sido demonstrado ser mais robustas do que a separação por HPLC em monossacáridos de 5 em matrizes complexas. Outros passos de optimização pode incluir o ajuste do volume da injecção (tempo de injecção) para permitir a separação com boa sensibilidade sem provocar sobrecarga que impediria quantificação. Um tempo de injecção de 10 segundos é considerada óptima a 30 mbar (Figura 4B): um tempo de injecção mais curto leva a uma sensibilidade reduzida, enquanto tempos de injecção mais longos conduzem a uma forma de pico distorção indicativo de sobrecarga capilar.

Importância do monitoramento em tempo real

ove_content "> Uma força crítica do presente método à base de CE é a capacidade de monitorizar reacções em tempo real. Isto requer condições CE óptimas para a detecção e a separação do reagente relevante (s) e / ou produto (s). Além disso, para o análise de reacções químicas de um tempo apropriado zero deve ser tomado como um valor de referência da reacção, o que tipicamente consiste na separação dos reagentes medidos para fora imediatamente antes da reacção a partir deste pode ser feito, por exemplo, antes de um reagente particular, é introduzido, antes. a temperatura é aumentada, ou antes da irradiação UV é iniciada para provocar a reacção.

No caso de o enxerto da RGDS péptido (Onto quitosano ou em outro substrato), o peptídeo é capaz de reagir com ele próprio para a produção de oligómeros lineares ou estruturas ramificadas por meio de policondensação 18. Isto é porque RGDS contém tanto grupos funcionais de ácido carboxílico e amina. Estes oligômeros de peptídeos não tem o mesmo emobilidade lectrophoretic como os RGDS peptídicos iniciais e, portanto, podem causar uma quantificação imprecisa, através por exemplo de co-migração com outras espécies. Por conseguinte, é importante para assegurar que se alíquotas do meio de reacção são injectadas e separados dentro de poucos minutos de ser tomadas a partir do meio de reacção (Figura 4B).

A preparação adequada dos filmes de quitosana

Quando especificamente lidar com filmes de quitosana, há uma série de passos para aderir. Durante a produção dos filmes de quitosana, os filmes devem ser deixados a secar durante pelo menos 7 dias (preferivelmente mais). Se este não é completada, quando os filmes são colocados em tampão PBS para enxaguar eles vão dissolver em vez de formar uma película inchada que impede, em seguida, os seguintes passos. Além disso, é importante para neutralizar a película antes da reacção de enxertia para remover qualquer ácido acético restante, que podem lixiviar para fora da película e competir como péptido para a reacção de enxerto 18. Isto pode ser feito através de imersão em hidróxido de sódio aquoso diluído, ou em PBS. O pH do tampão usado como solvente para a reacção de enxerto é também crítica: se for muito ácida os filmes irá dissolver-se parcialmente ou completamente. Durante a reacção de enxerto é importante que o filme é capaz de ter o máximo contacto com a solução reaccional. Portanto, a placa de Petri contendo os filmes e a mistura de reacção são colocados num agitador. Também é imperativo para evitar a evaporação da mistura de reacção para evitar variações de concentração não controladas, resultando em quantificações imprecisos; a utilização de uma película de parafina para cobrir a placa de Petri foi eficaz para o evitar.

A principal limitação da técnica da CE é que individualmente não é capaz de confirmar que o processo de enxerto. No contexto do processo de enxertia química mencionado acima, a quantificação do enxerto péptido é indirecta. estepodem ser superados com a utilização de uma técnica complementar, tais como espectroscopia de RMN de estado sólido, como mencionado anteriormente. Outras limitações da técnica CE incluem que ele exige que o composto de interesse para ser carregada. Portanto espécies neutras migrará ao mesmo tempo. Em certos casos isso pode ser superado se o composto de interesse com complexos de borato. Finalmente, se o composto de interesse não contêm cromóforos detecção com excepção de UV, tais como condutividade pode precisar de ser utilizado. Isto requer a compra adicional de um detector de condutividade que requer optimização.

Vantagens da análise de enxertia péptido via CE vs outros métodos analíticos

O método de CE tem várias vantagens sobre os métodos indirectos alternativas, incluindo cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), análise de aminoácidos (AAA) e o método directo de espectroscopia de RMN. Em comparação com AAA é uma high-throughput, método robusto which lhe permite analisar amostras complexas de forma eficiente sem a preparação da amostra tedioso. Isto é vantajoso, especialmente na análise de reacções químicas, em tempo real. HPLC foi usado anteriormente para o péptido de enxertia análise 30, no entanto, considerou-se apenas semi-quantitativa. CE tem um custo de funcionamento inferior a de HPLC e não necessita de filtração da amostra antes da análise, minimizando o risco de perda de amostra 5. Embora 13 C RMN espectroscopia é capaz de medir directamente o produto de interesse, que é uma técnica dispendiosa e não é capaz de medir em tempo real.

O protocolo descripted aqui fornece um método rápido, eficiente, barato e confiável para otimizar peptídeo enxerto de filme de quitosana. Esta nova abordagem proporciona assim vantagens significativas para adaptar as propriedades de ligação de células de filmes de quitosano, em comparação com métodos tradicionais tais como cromatografia e AAA. Este método de EC pode ser utilizado para monitorar um certo númerode outras reações químicas em tempo real, normalmente reações que ocorrem no período de várias horas, para a qual os reagentes / produtos de interesse pode ser cobrado. Neste caso, no entanto, é importante observar que o método de EC deve ser optimizada, antes da análise de uma reacção química diferente para permitir uma análise bem sucedida. Isto inclui a análise dos reagentes e produtos puros antes da reacção para permitir que sejam identificadas e assegurar que podem ser detectados e separados, assim como para assegurar que nenhum contaminante pode impedir quantificação. A separação pode ser melhorada e o tempo de análise total de alterada fazendo variar o comprimento capilar, composição do tampão e de tensão, e, potencialmente, usando uma coluna capilar com paredes revestidas. A detecção pode ser melhorado modificando as condições em que a amostra é injectado para favorecer os reagentes carregados ou por injecção de uma quantidade maior da amostra no capilar. Além disso, outros detectores Além de detecção de UV pode be empregue, incluindo fluorescência, detectores de condutividade sem contacto ou a CE pode ser acoplado a um espectrómetro de massa. A capacidade de monitorizar reacções em tempo real permite que a reacção de enxerto a ser realizada directamente num frasco de EC se o substrato está em solução e é capaz de ser analisada por CE. Isto pode efectuar-se directamente no interior do instrumento CE, tal como foi realizada recentemente para enxerto de aminoantipirina em poli (ácido acrílico) 7 Além disso, a abordagem não está limitada a reacções de enxerto, mas pode ser estendida para monitorizar várias outras reacções químicas. Além disso, a monitorização das reacções permite a optimização da reacção e pode também ser usado para validar o produto da reacção. Enquanto o composto de interesse pode ser dissolvido e carregada, o método de EC permite rápido, barato e robusto separação, a detecção e quantificação.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Water Millipore All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality
Chitosan powder (medium molecular weight) Sigma-Aldrich 448877 lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides
Acetic acid - Unilab Ajax Finechem 2-2.5L GL laboratory reagent
Dimethylsulfoxide Sigma-Aldrich D4540 laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested
Sodium hydroxide  Sigma-Aldrich 221465  laboratory reagent, corrosive 
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide  Sigma-Aldrich D80002 Irritant to skin 
N-hydroxysuccinimide  Sigma-Aldrich 130672 Irritant to skin
Sodium chloride  Ajax Finechem 466-500G laboratory reagent
Potassium chloride - Univar Ajax Finechem 384-500G analytical reagent, slight skin irritant
Disodium hydrogen phosphate - Unilab Ajax Finechem 1234-500G laboratory reagent, slight skin irritant
Potassium dihydrogen phosphate - Univar Ajax Finechem 4745-500G analytical reagent, slight skin irritant
Oligoacrylate standard custom made See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46
Boric acid  BDH AnalR, Merck Pty Ltd 10058 Corrosive
Hydrochloric acid - Unilab Ajax Finechem A1367-2.5L laboratory reagent, corrosivie
Fused silica tubing Polymicro (Molex) TSP050375 Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter 
Agilent 7100 CE Agilent Technologies G7100CE Capillary electrophoresis instrument
Orbital shaker  IKA KS260
Electronic balance Mettler Toledo MS204S
Milli-Q Synthesis  Millipore ZMQS5VF01 Ultrapure water filtration system
Parafilm  Labtek PM966 Parrafin wax

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References

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Chemistry Edição 116 electroforese capilar a monitorização da reacção em tempo real o enxerto péptido quitosano filmes células epiteliais de estado sólido de ressonância magnética nuclear (RMN) espectroscopia
Eletroforese Capilar para monitorar Peptide Enxertia em quitosana Films em Tempo real
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Thevarajah, J. J., O'Connor, M. D., Castignolles, P., Gaborieau, M. Capillary Electrophoresis to Monitor Peptide Grafting onto Chitosan Films in Real Time. J. Vis. Exp. (116), e54549, doi:10.3791/54549 (2016).

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