Abstract
Fri-lösning kapillärelektrofores (CE) separerar analyter, vanligen laddade föreningar i lösning genom tillämpning av ett elektriskt fält. Jämfört med andra analytiska separationstekniker, såsom kromatografi, är CE billig, robust och kräver ingen provberedning (för ett antal komplexa naturliga matriser eller polymera prover) på ett effektivt sätt. CE är snabb och kan användas för att följa utvecklingen av blandningar i realtid (t ex kemisk reaktionskinetik), eftersom signalerna som observeras för de separerade föreningarna är direkt proportionella mot mängden av dessa i lösning.
Här, är effektiviteten hos CE visats för att övervaka den kovalenta ympningen av peptider på kitosan-filmer för efterföljande biomedicinska tillämpningar. Kitosan s antimikrobiella och biokompatibla egenskaper gör den till ett attraktivt material för biomedicinska tillämpningar, såsom celltillväxtsubstrat. Kovalent ympning peptid RGDS (arginin - glycin -asparaginsyra - serin) på ytan av kitosan filmer syftar till att förbättra cellvidhäftning. Historiskt, kromatografi och aminosyraanalys har använts för att tillhandahålla en direkt mätning av mängden ympad peptid. Men gör lika exakt men realtidsövervakning av peptiden ympning processen snabb separation och frånvaro av provberedning från CE. CE är i stånd att separera och kvantifiera de olika komponenterna i reaktionsblandningen: (den icke-ympade) peptiden och de kemiska kopplingsmedel. På detta sätt användningen av CE resulterar i förbättrade filmer för tillämpningar nedströms.
Kitosan filmer karaktäriserades genom solid-state NMR (kärnmagnetisk resonans) spektroskopi. Denna teknik är mer tidskrävande och kan inte tillämpas i realtid, men ger en direkt mätning av peptiden och sålunda validerar CE teknik.
Introduction
Fri lösning kapillärelektrofores (CE) är en teknik som separerar föreningar i lösningar baserade på deras laddning till friktionsförhållande 1,2. Charge-till-storleksförhållande nämns ofta i litteraturen, men denna förenkling gäller inte polyelektrolyter, inklusive polypeptider i detta arbete, och också visat sig inte vara lämpligt för små organiska molekyler 3. CE skiljer sig från andra separationstekniker i det att den inte har en stationär fas, endast en bakgrunds elektrolyt (vanligen en buffert). Detta gör det möjligt för tekniken att vara robust i sin förmåga att analysera ett stort antal prover med komplexa matriser 4 såsom växtfibrer 5, jäsning brygger 6 ympning på syntetiska polymerer 7, matprov 8, och knappast lösliga peptider 9 utan tråkiga provberedning och rening. Detta är särskilt betydelsefullt för komplexa polyelektrolyter som har upplösningsfrågor (sUCH som kitosan 10 och gellangummi 11) och föreligger därför som aggregerat eller utfällt i lösning och har framgångsrikt analyseras utan provfiltrering. Vidare analys av socker i frukostflingor involverade injicera prov med partiklar av frukostflingor prover fälldes i vatten 8. Detta omfattar även en analys av grenade polyelektrolyter eller sampolymerer 12,13. Ett omfattande arbete har också genomförts för att utveckla CE tekniker speciellt för analys av proteiner för proteomik 14, kirala separation av naturliga eller syntetiska peptider 15 och mikrochip separationer av proteiner och peptider 16. Eftersom separation och analys sker i en kapillär, är endast små volymer av prov och lösningsmedel användas som medger CE för att ha en lägre löpande kostnad än andra separationstekniker inkluderande kromatografi 5,6,17. Eftersom separationen av CE är snabb, tillåter den monitoring av reaktionskinetik. Detta visades i fallet med ympning av peptider på kitosan filmer för förbättrad celladhesion 18.
Kitosan är en polysackarid härledd från N -deacetylation av kitin. Kitosan filmer kan användas för olika biomedicinska tillämpningar såsom bioadhesiva 19 och celltillväxtsubstrat 18,20, på grund av chitosan s biokompatibilitet 21. Cellbindning till specifika extracellulära matrixproteiner, såsom fibronektin, kollagener och laminin, är direkt kopplat till överlevnad av cellerna 22. Notably, olika celltyper kräver ofta fastsättning på olika extracellulära matrisproteiner för överlevnad och riktig funktion. Cellbindning till kitosan filmer visades förbättras genom ympning av fibronektin 23; dock, är förberedelse, rening och ympning av sådana stora proteiner inte är ekonomiskt lönsamt. Växelvis ett område av små peptider have visats kunna efterlikna egenskaperna för stora extracellulära matrisproteiner. Till exempel, peptider såsom de fibronektin mimetika RGD (arginin - glycin - asparaginsyra) och RGDS (arginin - glycin - asparaginsyra - serin) har använts för att underlätta och öka cellvidhäftning 24. Kovalent ympning av RGDS på kitosan filmer resulterade i förbättrad cell fäste för celler är kända för att binda till fibronektin in vivo 18. Ersätta större proteiner gillar fibronektin med mindre peptider som har samma funktion ger en betydande kostnadsminskning.
Här var peptid ympning till kitosan utförs som tidigare publicerats 18. Såsom tidigare visats, ger detta tillvägagångssätt enkel och effektiv ympning med hjälp av kopplingsmedel EDC-HCl (1-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid) och NHS (N-hydroxisuccinimid) att funktionalisera karboxylsyran av RGDS att vara ympas påkitosanfilm. Två fördelar med denna ympning metod är att den inte kräver någon ändring av kitosan eller peptiden, och det genomförs i vattenmedium för att maximera kompatibilitet med framtida cellodlingstillämpningar 18,20. Som kopplingsmedel och peptiden kan laddas, är CE en lämplig metod för analys av reaktionskinetiken. Viktigt är analys av reaktionskinetik via CE möjliggör realtidsövervakning av ympningsreaktionen och möjliggör både optimering och kvantifiera graden av ympning därmed.
Medan det inte rutinmässigt är nödvändigt kan resultaten av CE-analys valideras off-line genom en direkt mätning av peptiden ympning på de chitosaninnehållande filmer med användning av solid-state NMR (kärnmagnetisk resonans) spektroskopi 25,26 för att demonstrera den kovalenta ympningen av peptiden på filmen 18. Men jämfört med solid-state NMR-spektroskopi, realtidsanalys som tillhandahålls avCE möjliggör kvantifiering av peptiden konsumtionen i realtid och därmed förmåga att bedöma kinetiken för reaktionen.
Ovannämnda metod är enkel och möjliggör realtidsanalys av peptid ympning på kitosan filmer med indirekt kvantifiering av omfattningen av ympning. Den visade metoden kan utvidgas till realtid kvantitativ bedömning av olika kemiska reaktioner så länge reaktanterna eller produkterna som skall analyseras kan laddas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av kitosan filmer
- Väg in 2 g isättika, komplett till 100 ml med ultrarent vatten.
- Väg upp 1,7 g kitosan pulver, tillsätt 100 ml av den 2% m / m ättiksyravattenlösning. Rör om under 5 dagar med omrörarstav och magnetomrörarplatta vid rumstemperatur antingen täckt med aluminiumfolie eller i mörker.
- Centrifugera kitosan dispersionen vid 1076 xg vid 23 ° C under 1 timme. Samla in supernatanten med en spruta och kassera fällning.
- För varje film, alikvot 10 ml av den kitosan suspensionen in i en 9 cm Petriskål av plast vid rumstemperatur. Låt filmerna omfattas torka i minst 7 dagar.
- Använda sax klippa de torra filmerna i 1 x 1 cm kvadrater. Notera: Experimentet kan pausas i detta skede.
2. Framställning av fosfatbuffrad saltlösning (PBS)
- Väg upp 8 g natriumklorid, 0,2 g kaliumklorid, 1,44 g dinatrium-väte phosfosfat och 0,24 g kaliumdivätefosfat.
- Upplösa dessa vägde ut kemikalier i 800 ml ultrarent vatten och titrera lösningen med koncentrerad saltsyra till pH 7,4.
Notera: Experimentet kan pausas i detta skede.
3. Framställning av 75 mM natriumboratbuffert vid pH 9,2
- Väg upp 3,0915 g borsyra. Lös det i 75 ml ultrarent vatten.
- Titrera borsyra lösningen till ett pH-värde av 9,2 med en natriumhydroxidlösning med en koncentration av 10 M eller högre.
Varning: Koncentrerad natriumhydroxidlösningar är frätande och bör hanteras med handskar. - Komplett med ultrarent vatten för att erhålla 100 ml lösning. Detta ger en 500 mM natriumboratbuffert vid pH 9,2.
- Späd 500 mM natriumboratbuffert med ultrarent vatten till 75 mM natriumboratbuffert. Notera: Experimentet kan pausas i detta skede.
4. Framställning av Chitosan Films för ympningsreaktionen
- Skölj 10 kvadrat kitosan filmer (1 x 1 cm) i 5 ml PBS under 2 timmar i en petriskål vid rumstemperatur.
- Under denna tid, förbereda och validera kapillärelektrofores instrument (steg 5).
5. Upprättande och validering av kapillärelektrofores Instrument
- Förbered en 43.5 cm nakna smält kiseldioxid kapillär med en innerdiameter av 50 ^ m (43,5 cm är den totala längden, den effektiva längden för detekteringsfönstret är normalt 35 cm) genom att försvaga polymeren yttre beläggning av kapillären vid inställd längd med en trubbigt redskap sedan knäppa kapillär.
- Skapar ett fönster för kapillären genom att använda en tändare för att bränna polymerbeläggningen på 8.5 cm från inloppet och efter det svalnar torka den ren med etanol. Bränn beläggning av kapillären vid varje ände för några millimeter med en lättare, och efter det svalnar torka av den med etanol.
- Plats kapillär inside detektionsfönster och installera den i kapillärkassetten genom att placera den på lika längder i inlopp och utlopp och linda den runt spindlarna i kassetten. sedan installera kassetten i kapillärelektrofores instrument.
- Ställ in parametrarna i metoden för varje separation. I programvarumenyn väljer "metod" och sedan "redigera hela metoden". Ställa in temperatur, tid, spänning, och flaskor som används för separationen (exempelvis 25 ° C, 10 min, 30 kV).
- I sektionen för-konditionering, ställa in de på varandra följande spolningar: 10 min med 1 M natriumhydroxid (i vatten), 5 min med 0,1 M natriumhydroxid (i vatten), 5 min med ultrarent vatten och 5 min med 75 mM natriumboratbuffert vid pH 9,2 för den första metoden av en serie av analyser.
- För de följande metoderna, ställa den inställda de på varandra följande spolningar i avsnittet förkonditionering: 1 min med en M natriumhydroxid (i vatten), 5 min med 75 mM natriumboratbuffert vid pH 9.2.
- I insprutningssektionen, ställa in parametrar för en hydrodynamisk injektion med 30 mbar tryck i 10 sekunder för alla metoder. I separationssektionen, fastställa villkoren separations till 30 kV vid 25 ° C under 9 minuter för alla metoder.
OBS: Se användarhandboken för specifik CE instrument som förfarande för drift av CE instrumentet kan variera mellan tillverkare. Förbered en M natriumhydroxidlösning på dagen.
- Injicera och separera en neutral intern standard (10 pl av 10% volym / volym dimetylsulfoxid (DMSO), i vatten späddes i 450 | il 75 mM natriumboratbuffert). Sedan injicera och separera på samma sätt en oligoacrylate standard (löst i ultrarent vatten vid 10 g ∙ L -1, se lista över material) för att kontrollera giltigheten av kapillär. Paus sekvensen här tills ympningsreaktionen är redo att börja.
6. Förlängning av RGDS på kitosanfilm
- Väg ut peptiden (1 mg RGDS)och kopplingsmedel (3 mg EDC-HCl och 2 mg NHS).
- 2 h efter starten av kitosanfilm blötläggning i PBS, lösa upp peptiden och de kopplingsmedel i 5 ml PBS.
- Ta en 50 pl alikvot av denna lösning. Tillsätt 2 pl av 10% volym / volym DMSO i vatten som en inre neutral standard till portionen. Analysera prov med CE (se steg 7).
- Ta bort de 5 ml PBS användes för att skölja kitosan filmer från petriskålen. Tillsätt 5 ml lösning av peptid- och kopplingsmedel till petriskål innehållande kitosan filmer.
- Täck petriskål med paraffin film och placera den på en skakapparat vid rumstemperatur. Ta 50 l alikvoter av reaktionsmedia på bestämda tider.
OBS: Den totala analystiden med CE är 15 min, vilket sålunda en alikvot kan tas varje 15 min (eller varje 30 min om två reaktioner övervakas parallellt, etc.).- Tillsätt 2 pl av 10% volym / volym DMSO i vatten som en inre neutral standard till varje aliquot.
OBS: Portioner bör analyseras med CE så snart de tas (se steg 7).
- Tillsätt 2 pl av 10% volym / volym DMSO i vatten som en inre neutral standard till varje aliquot.
- Efter fyra timmar av skakningar och delprov bort, bort petriskål från shaker. Avlägsna reaktionsmediet från petriskål. Tillsätt 5 ml PBS för att skölja kitosan filmer.
- Avlägsna PBS från Petri-skålen, skölj kitosanfilm med ultrarent vatten och låta dem torka över natten. Avlägsna ultrarent vatten och lagra filmer vid -20 ° C i en plastpetriskål.
7. Övervakning av ympningsreaktionen Använda CE
- Injicera och separata alikvoter av reaktionsmedier omedelbart efter avlägsnande från petriskål med användning av betingelserna analys som i avsnitt 5.2.
- Vid fullbordande av separation skölja kapillären med ultrarent vatten under 10 min. Torka det genom en färg med en tom flaska (luft) under 10 minuter.
OBS: Experimentet kan pausas i detta skede.
8. Data Trea tment för CE
- Kontrollera giltigheten av varje separation, genom att kontrollera att både strömmen under separationen och migrationstiden för den elektroosmotiska rörlighet markör (DMSO i detta fall) liknar dem som observerades för oligoacrylate standard separation.
OBS: Upp till 10-15% variation är acceptabelt från det förväntade aktuella värdet av ca 50 pA och migration tidsvärde på 1,3 minuter (bör elektromobilitetsvärden användas i stället för migrations gånger om en högre repeterbarhet krävs). - För varje lyckad separation, exportera rådata från kapillärelektrofores programmet genom att välja en specifik datauppsättning, högerklicka på export och välja en lämplig signal.
- Konvertera rådata som registrerats av CE (presenteras som UV-absorbans som en funktion av migrationstiden). Konvertera X-axeln (migrationstiden t m) in i en elektroforetisk rörlighet μ följande ekvation 1:
n en "src =" / filer / ftp_upload / 54.549 / 54549eq1.jpg "/> (1)
där L ^ är längden till detektorn, är L t den totala längden av kapillären, V är spänningen, och t eo är migreringstiden för en neutral specie (DMSO inre standard i detta fall) 27.
Omvandla Y-axeln av de rådata (absorbans i AU) till en fördelning av elektroforetiska rörlig W (μ) följande Ekvation 2: 28
(2)
(2) 9. Ytterligare karakterisering av peptid-ympade Films 18
- Sätt peptid ympade kitosan filmer, rullade runt sig, i en 4 mm solid-state NMR rotorn. Fyll rotorn med fosfatbuffrad koksaltlösning för att svälla filmerna, och stäng rotorn. Vänta några timmar.
- Analysera film med 13 </ sup> C NMR-spektroskopi 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CE är väl lämpad för övervakning av ympning av peptider (t.ex. RGDS) på kitosan-filmer. Lämpliga kopplingsmedel innefattar EDC-HCl och NHS vilka aktiverar peptiden som skall ympas på kitosan (Figur 1). CE är i stånd att separera de olika molekyler av intresse från reaktionsmediet. Att tilldela topparna på elektrofores, rena RGDS, EDC-HCl och NHS löstes, injiceras och separeras separat. Efter toppvärden fick reaktionsmediet injiceras och de olika reaktionskomponenterna identifierades (Figur 2). EDC-HCl omsattes i en sidoprodukt EDH-HCl (3 - (((etylamino) (hydroxi) metylen) amino) - N, N -dimethylpropan-1-amin). Dimetylsulfoxid (DMSO) används som en inre standard för CE-separationer. Kitosan är närvarande i ympning experiment i form av olösliga filmer och därför inte injiceras eller observerats i CE. Notera att för alla rådata, than in migration tidsaxeln omvandlas till en elektroforetisk rörlighet axel (Ekvation 1) och UV-absorbansen axeln i en fördelning av elektroforetiska rörlig W (μ) (ekvation 2).
Som de alikvoter tas från reaktionsmediet de placeras in i CE instrumentet och injiceras. Omfattningen av reaktionen övervakas genom minskningen av toppen i samband med RGDS (Figur 3). Det kan också ses att EDC-HCl topp minskar medan EDH-HCl topp ökar över tiden. Det är viktigt att notera att det inte finns någon signal som kan tilldelas till en produkt från en sidoreaktion av peptiden, på så sätt att det förutsätts att de RGDS avlägsnas från reaktionsmediet håller på att ympas på kitosanfilm. Överlagrade elektroferogram (figur 3a) tillåter kvantifiering av peptidförbrukning från början till slutet av reaktionen. Det skall noteras attäven om kinetiken ades initialt under 18 timmar (figur 3B), var 4 h, anses tillräckligt för att reaktionen skall fortsätta till dess maximala utsträckning. För att möjliggöra kvantifiering en optimal injektionsvolym krävs för att säkerställa den signal-brusförhållande är tillräckligt hög samtidigt förhindra överbelastning (Figur 4A) och i fråga om RGDS var injektioner måste fyllas i realtid för att förhindra polykondensation (Figur 4B ).
CE-baserad teknik som beskrivs här för att analysera peptid ympning till kitosan filmer är snabb och enkel; Men det inte kvantifiera ympning processen direkt. NMR-spektroskopi användes för att demonstrera ympning; denna mätning kan inte göras i realtid (det tar vanligen flera timmar) och måste slutföras efterreaktion. Den kvalitativa jämförelse av kitosan filmer före och efter ympning visar lyckad ympning av peptiderna through uppträdandet av en signal vid 70 ppm i de ympade filmerna motsvarar amidbindningen mellan kitosan och peptiden (figur 5).
Figur 1. Scheme of ympningsreaktionen. Kemisk reaktionsschema visar aktiveringen av EDC-HCl och NHS av karboxylsyrafunktionella gruppen RGDS följt av ympning på kitosan film yta. Klicka här för att se en större version av denna siffra .
Figur 2. Peak tilldelning av de arter som förekommer i reaktionsmediet. A. Separation och toppvärden för lösningar av partiellt hydrolyserade EDC HCI (rosa), RGDS (röd), NHS (blå), liksom för PBS (lila) och reaktionsmediet (svart). B. elektroferogram av reaktionsmedia (svart) presenteras som en funktion av migrationstiden (elektro rörlighet bör användas för att övervinna dålig repeterbarhet i migrations gånger). klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. CE övervakning av RGDS konsumtion. (A) överlagras peptid toppar vid reaktionstiden 30 minuter (lila heldragen linje), 60 min (magenta streckad linje), 90 min (blå heldragen linje), 120 min (grön streckad linje), 150 min (röd heldragen linje) och (B) kinetik ympning genomfört över 18 timmar i replikat (kvadrat och cirkel).pload / 54.549 / 54549fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. överlagrade peptidtoppar i reaktionsmediet visar suboptimala resultat (A) Varierande (hydrodynamisk) insprutningstider. 5 sek (blå linje), 10 sekunder (svart linje), 20 sekunder (röd linje) och 30 sek (magentafärgad linje) . (B) reaktionsmedier kvar i en CE flaska under en längre tid innan injektion. 30 min (röd linje) och 90 min (blå linje) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. 13C svällt-state NMR-spektra för kitosan-filmer. Jämförelse av filmer före (svart linje) och efter (blå linje) peptid ympning. Signaler, som före endast i spektrumet registreras efter ympning anges med asterisker. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Enkelheten i protokollet som beskrivs här gör det idealiskt för utbredd tillämpning. Dock måste särskild uppmärksamhet ägnas åt följande viktiga steg.
Korrekt CE instrument beredning
Det är viktigt att separera en känd standard omedelbart före separationen av okända prov (såväl som vid slutet av en serie av separationer) för att kontrollera giltigheten av kapillären och instrumentet på dagen. Denna standard kan vara en oligoacrylate 27 eller vilket prov som helst känt för att ge multipla toppar över ett brett område av migrationstider. Övervakning av strömmen under alla separationer och analysera migrering av en neutral markör i varje separation är viktiga åtgärder för att identifiera problem. Ett instabilt nuvarande eller stora variationer (mer än 10-15%) i platåvärdet av strömmen kan bero på bristande överensstämmelse i bufferten (pH eller koncentration). Om den följs av en fördröjd migration tid av den neutrala kokare det kan också bero på kapillären inte vara tillräckligt ren. Rutinkontroller av pH-värdet i bufferten och en extra spolning av kapillären i 10 min med 1 M natriumhydroxid (nyberedd) kan användas för att förhindra / ändra detta problem. Under experimentet kan extra reningssteg användas för att säkerställa en optimal separation, typiskt innefattande eller förlänga en flush med koncentrerad vattenlösning av natriumhydroxid för att regenerera säkrings kvarts kapillär yta.
Rätt behandling uppgifter
Vid avslutningen av experimentet, är väsentligt lämplig behandling av rådata då man jämför resultaten. Detta involverar omvandling av X och Y-axeln som erhållits från CE instrumentet (steg 8,3). Migrerings tider som bestäms i CE har en relativt dålig repeterbarhet och vi rekommenderar att du använder elektroforetiska rörlig istället, vilket leder till en mycket bättre repeterbarhet. Betydelsen av korrekt t reating data har visats tidigare med separationen och karakteriseringen av kitosan 10, poly (akrylsyra) 29, segmentsampolymerer 13 och detekteringen av sockerarter i frukostflingor 8 genom mindre standardavvikelser (RSD) observeras mellan experiment för mobiliteter än för migrationstider . Vidare har CE visat sig vara mer robust än HPLC vid separation av monosackarider i komplexa matriser 5. Andra steg för optimering kan innefatta justering av injektionsvolym (tidpunkten för injektion) för att tillåta separation med god känslighet utan att orsaka överbelastning som skulle förhindra kvantifiering. En insprutningstiden av 10 sek anses optimal vid 30 mbar (Figur 4B): en kortare insprutningstid leder till en minskad känslighet medan längre insprutningstider leder till en topp form distorsion indikativ för kapillär överbelastning.
Betydelsen av realtidsövervakning
ove_content "> En kritisk styrkan i denna CE-baserad metod är förmågan att övervaka reaktioner i realtid. Detta kräver optimala CE villkor för detektering och separation av den relevanta reaktant (er) och / eller produkt (er). Dessutom för analys av kemiska reaktioner en lämplig tidpunkt noll måste tas som ett riktmärke för reaktionen, vilket vanligtvis består i separation av de uppmätta ut reaktanterna strax före reaktionen börjar detta kan göras till exempel före en viss reaktant införs innan. temperaturen ökas, eller före UV-bestrålning påbörjas för att utlösa reaktionen.I fallet med ympning av peptid RGDS (Onto kitosan, eller på ett annat substrat), är peptiden förmåga att reagera med sig själv för att producera linjära oligomerer eller grenade strukturer genom polykondensation 18. Detta beror på att RGDS innehåller både amin och karboxylsyragrupper funktionella grupper. Dessa peptid oligomerer har inte samma electrophoretic rörlighet som de initiala peptid RGDS och kan därför orsaka en felaktig kvantifiering, till exempel genom samarbete migration med andra arter. Det är därför viktigt att se till att alikvoter av reaktionsmediet injiceras och separeras inom några minuter efter att tas från reaktionsmediet (Figur 4B).
Korrekt beredning av kitosan filmer
När specifikt arbetar med kitosan filmer finns ett antal åtgärder för att ansluta sig till. Under produktionen av de kitosan filmer, filmerna måste lämnas att torka under minst 7 dagar (företrädesvis mer). Om detta inte är slutförd, när filmerna placeras i PBS-buffert för att skölja de kommer att lösas upp i stället för att bilda en svälld film som sedan förhindrar nästa steg. Dessutom är det viktigt att neutralisera filmen före ympningsreaktionen för att avlägsna eventuell kvarvarande ättiksyra, som kan lakas ut av filmen och konkurrera medpeptiden för ympningsreaktionen 18. Detta kan göras genom blötläggning i en utspädd vattenlösning av natriumhydroxid eller i PBS. PH för den buffert som används som lösningsmedel för ympningsreaktionen är också kritisk: om det är för sur filmerna kommer delvis eller helt lösas upp. Under ympningsreaktionen är det viktigt att filmen är i stånd att ha maximal kontakt med reaktionslösningen. Därför är den petriskål med filmerna och reaktionsblandningen placerades på en skakanordning. Det är också absolut nödvändigt att förhindra avdunstning av reaktionsblandningen för att förhindra okontrollerade koncentrationsvariationer som resulterar i felaktiga kvantifieringar; användningen av paraffinfilm för att täcka petriskål var effektivt för att förhindra det.
Den största begränsningen av CE-tekniken är att individuellt det inte kan bekräfta ympning processen. I samband med den kemiska ympningsprocessen nämnts ovan är kvantifiering av peptiden ympning indirekt. Dettakan övervinnas med hjälp av en kompletterande teknik såsom solid-state NMR-spektroskopi, såsom tidigare nämnts. Andra begränsningar för CE-teknik är att den kräver föreningen av intresse att debiteras. Därför neutrala arter kommer att migrera samtidigt. I vissa fall kan detta övervinnas om föreningen av intresse komplex med borat. Slutligen, om föreningen av intresse inte innehåller kromoforer detektering annat än UV, såsom ledningsförmåga kan behöva användas. Detta kräver ytterligare köp av en ledningsdetektor som kräver optimering.
Fördelar med att analysera peptid ympning via CE vs andra analysmetoder
CE-metoden har flera fördelar jämfört alternativa indirekta metoder inklusive högupplösande vätskekromatografi (HPLC), aminosyraanalys (AAA) och den direkta metoden för NMR-spektroskopi. Jämfört med AAA det är en hög genomströmning, robust metod which gör det möjligt att analysera komplexa prover effektivt utan tråkiga provberedning. Detta är fördelaktigt speciellt vid analys av kemiska reaktioner i realtid. HPLC har använts tidigare för peptid ympning analys 30, men det ansågs endast semi-kvantitativ. CE har en lägre driftskostnad än HPLC och inte kräver prov filtrering före analys, vilket minimerar risken för provförlust 5. Även 13 C NMR-spektroskopi kan direkt mäta produkten av intresse, är det en dyr teknik och kan inte mäta det i realtid.
Protokollet descripted här ger en snabb, effektiv, billig och tillförlitlig metod för optimering peptid ympning till kitosanfilm. Denna nya metod ger således betydande fördelar för att skräddarsy de cellvidhäftningsegenskaperna hos kitosan filmer jämfört med traditionellt använda metoder, såsom kromatografi och AAA. Denna CE-metoden kan användas för att övervaka ett antalandra kemiska reaktioner i realtid, typiskt reaktioner sker på tidsramen för flera timmar, för vilka reaktanterna / produkter av intresse kan laddas. I detta fall är det dock viktigt att notera att CE-metoden bör optimeras före analysen av en annan kemisk reaktion för att möjliggöra en lyckad analys. Detta inbegriper analys av de rena reaktanter och produkter innan reaktionen för att göra det möjligt att identifiera dem och se till att de kan detekteras och separeras, såväl som att säkerställa att inga föroreningar kan förhindra kvantifieringen. Separationen kan förbättras och den totala analystiden förändras genom att variera kapillärlängd, buffertkomposition och spänning, och potentiellt med användning av en kapillär med belagda väggar. Detekteringen kan förbättras genom modifiering av de förhållanden under vilka provet injiceras för att gynna de laddade reaktantema eller genom att injicera en större mängd av provet i kapillären. Vidare kan andra detektorer bortsett från UV-detektion be inkl fluorescens, kontaktledningsdetektorer eller CE kan kopplas till en masspektrometer. Förmågan att övervaka reaktioner i realtid gör det möjligt för ympningsreaktionen utföras direkt i en CE-ampull om underlaget är i lösning och kan analyseras av CE. Detta kan ske direkt i CE instrument, som vi nyligen framförde den för ympning av aminoantipyrin på poly (akrylsyra) 7 Dessutom är metoden inte begränsad till ympning reaktioner men kan förlängas för att övervaka olika andra kemiska reaktioner. Vidare kan övervakningen av reaktionerna tillåter optimering av reaktionen och kan också användas för att validera produkten av reaktionen. Så länge som föreningen av intresse kan lösas och debiteras tillåter CE metoden snabb, billig och robust separation, detektion och kvantifiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water | Millipore | All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality | |
| Chitosan powder (medium molecular weight) | Sigma-Aldrich | 448877 | lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides |
| Acetic acid - Unilab | Ajax Finechem | 2-2.5L GL | laboratory reagent |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | laboratory reagent, corrosive |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | Irritant to skin |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | Irritant to skin |
| Sodium chloride | Ajax Finechem | 466-500G | laboratory reagent |
| Potassium chloride - Univar | Ajax Finechem | 384-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Disodium hydrogen phosphate - Unilab | Ajax Finechem | 1234-500G | laboratory reagent, slight skin irritant |
| Potassium dihydrogen phosphate - Univar | Ajax Finechem | 4745-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Oligoacrylate standard | custom made | See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46 | |
| Boric acid | BDH AnalR, Merck Pty Ltd | 10058 | Corrosive |
| Hydrochloric acid - Unilab | Ajax Finechem | A1367-2.5L | laboratory reagent, corrosivie |
| Fused silica tubing | Polymicro (Molex) | TSP050375 | Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies | G7100CE | Capillary electrophoresis instrument |
| Orbital shaker | IKA | KS260 | |
| Electronic balance | Mettler Toledo | MS204S | |
| Milli-Q Synthesis | Millipore | ZMQS5VF01 | Ultrapure water filtration system |
| Parafilm | Labtek | PM966 | Parrafin wax |
References
- Muthukumar, M. Theory of electrophoretic mobility of a polyelectrolyte in semidilute solutions of neutral polymers. Electrophoresis. 17, 1167-1172 (1996).
- Barrat, J. L., Joanny, J. F. in Advances in Chemical Physics, Vol Xciv Vol. 94 Advances in Chemical Physics. , John Wiley & Sons Inc. 1-66 (1996).
- Fu, S. L., Lucy, C. A. Prediction of electrophoretic mobilities. 1. Monoamines. Anal. Chem. 70, 173-181 (1998).
- Harvey, D. Modern Analytical Chemistry. , McGraw Hill. (2000).
- Oliver, J. D., Gaborieau, M., Hilder, E. F., Castignolles, P. Simple and robust determination of monosaccharides in plant fibers in complex mixtures by capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 1291, 179-186 (2013).
- Oliver, J. D., Sutton, A. T., Karu, N., Phillips, M., Markham, J., Peiris, P., Hilder, E. F., Castignolles, P. Simple and robust monitoring of ethanol fermentations by capillary electrophoresis. Biotechnology and Applied Biochemistry. 62, 329-342 (2015).
- Thevarajah, J. J., Sutton, A. T., Maniego, A. R., Whitty, E. G., Harrisson, S., Cottet, H., Castignolles, P., Gaborieau, M. Quantifying the Heterogeneity of Chemical Structures in Complex Charged Polymers through the Dispersity of Their Distributions of Electrophoretic Mobilities or of Compositions. Anal. Chem. 88, 1674-1681 (2016).
- Toutounji, M. R., Van Leeuwen, M. P., Oliver, J. D., Shrestha, A. K., Castignolles, P., Gaborieau, M. Quantification of sugars in breakfast cereals using capillary electrophoresis. Carbohydr. Res. 408, 134-141 (2015).
- Miramon, H., Cavelier, F., Martinez, J., Cottet, H. Highly Resolutive Separations of Hardly Soluble Synthetic Polypeptides by Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 82, 394-399 (2010).
- Mnatsakanyan, M., Thevarajah, J. J., Roi, R. S., Lauto, A., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation of chitosan by degree of acetylation using simple free solution capillary electrophoresis. Anal. Bioanal. Chem. 405, 6873-6877 (2013).
- Taylor, D. L., Ferris, C. J., Maniego, A. R., Castignolles, P., in het Panhuis, M., Gaborieau, M. Characterization of Gellan Gum by Capillary Electrophoresis. Australian Journal of Chemistry. 65, 1156-1164 (2012).
- Thevarajah, J. J., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation and characterization of synthetic polyelectrolytes and polysaccharides with capillary electrophoresis. Adv. Chem. 2014, 798503 (2014).
- Sutton, A. T., Read, E., Maniego, A. R., Thevarajah, J., Marty, J. -D., Destarac, M., Gaborieau, M., Castignolles, P. Purity of double hydrophilic block copolymers revealed by capillary electrophoresis in the critical conditions. J. Chromatogr. A. 1372, 187-195 (2014).
- Righetti, P. G., Sebastiano, R., Citterio, A. Capillary electrophoresis and isoelectric focusing in peptide and protein analysis. Proteomics. 13, 325-340 (2013).
- Ali, I., Al-Othman, Z. A., Al-Warthan, A., Asnin, L., Chudinov, A. Advances in chiral separations of small peptides by capillary electrophoresis and chromatography. J. Sep. Sci. 37, 2447-2466 (2014).
- Kasicka, V. Recent developments in capillary and microchip electroseparations of peptides (2011-2013). Electrophoresis. 35, 69-95 (2014).
- JoVE Science Education Database. Capillary Electrophoresis (CE). Essentials of Analytical Chemistry. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/10226/capillary-electrophoresis-ce (2016).
- Taylor, D. L., Thevarajah, J. J., Narayan, D. K., Murphy, P., Mangala, M. M., Lim, S., Wuhrer, R., Lefay, C., O'Connor, M. D., Gaborieau, M., Castignolles, P. Real-time monitoring of peptide grafting onto chitosan films using capillary electrophoresis. Anal. Bioanal. Chem. 407, 2543-2555 (2015).
- Rinaudo, M. Chitin and chitosan: Properties and applications. Prog. Polym. Sci. 31, 603-632 (2006).
- Li, Z., Leung, M., Hopper, R., Ellenbogen, R., Zhang, M. Feeder-free self-renewal of human embryonic stem cells in 3D porous natural polymer scaffolds. Biomaterials. 31, 404-412 (2010).
- Domard, A. A perspective on 30 years research on chitin and chitosan. Carbohydr. Polym. 84, 696-703 (2011).
- Shekaran, A., Garcia, A. J. Nanoscale engineering of extracellular matrix-mimetic bioadhesive surfaces and implants for tissue engineering. Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj. 1810, 350-360 (2011).
- Custodio, C. A., Alves, C. M., Reis, R. L., Mano, J. F. Immobilization of fibronectin in chitosan substrates improves cell adhesion and proliferation. J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 316-323 (2010).
- Boateng, S. Y., Lateef, S. S., Mosley, W., Hartman, T. J., Hanley, L., Russell, B. RGD and YIGSR synthetic peptides facilitate cellular adhesion identical to that of laminin and fibronectin but alter the physiology of neonatal cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 288, C30-C38 (2005).
- Lefay, C., Guillaneuf, Y., Moreira, G., Thevarajah, J. J., Castignolles, P., Ziarelli, F., Bloch, E., Major, M., Charles, L., Gaborieau, M., Bertin, D., Gigmes, D. Heterogeneous modification of chitosan via nitroxide-mediated polymerization. Polym. Chem. 4, 322-328 (2013).
- Gartner, C., Lopez, B. L., Sierra, L., Graf, R., Spiess, H. W., Gaborieau, M. Interplay between Structure and Dynamics in Chitosan Films Investigated with Solid-State NMR, Dynamic Mechanical Analysis, and X-ray Diffraction. Biomacromolecules. 12, 1380-1386 (2011).
- Castignolles, P., Gaborieau, M., Hilder, E. F., Sprong, E., Ferguson, C. J., Gilbert, R. G. High resolution separation of oligo(acrylic acid) by capillary zone electrophoresis. Macromol. Rapid Commun. 27, 42-46 (2006).
- Chamieh, J., Martin, M., Cottet, H. Quantitative Analysis in Capillary Electrophoresis: Transformation of Raw Electropherograms into Continuous Distributions. Anal. Chem. 87, 1050-1057 (2015).
- Maniego, A. R., Ang, D., Guillaneuf, Y., Lefay, C., Gigmes, D., Aldrich-Wright, J. R., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation of poly(acrylic acid) salts according to topology using capillary electrophoresis in the critical conditions. Anal. Bioanal. Chem. 405, 9009-9020 (2013).
- Chung, T. W., Lu, Y. F., Wang, S. S., Lin, Y. S., Chu, S. H. Growth of human endothelial cells on photochemically grafted Gly-Arg-Gly-Asp (GRGD) chitosans. Biomaterials. 23, 4803-4809 (2002).
