Abstract
Последние методы microendoscopy волоконно-пучка позволяют неинвазивный анализ ткани в естественных условиях с использованием либо методов визуализации или комбинацию методов спектроскопии. Сочетание методов визуализации и спектроскопии в один оптический зонд может обеспечить более полный анализ здоровья ткани. В этой статье две разнородные формы сочетаются с высоким разрешением флуоресценции microendoscopy изображений и спектроскопии диффузного отражения, в один оптический датчик. Высокое разрешение флуоресценции microendoscopy изображений является метод, используемый для визуализации верхушечные ткани микроархитектура и, хотя в основном качественной техники, продемонстрировал эффективную дифференциацию в режиме реального времени между опухолевой и не опухолевой ткани. Диффузный отражательной спектроскопии является метод, который может извлечь ткани физиологических параметров, включая локальную концентрацию гемоглобина, концентрацию меланина, и насыщение кислородом. В данной статье описываются характеристики гequired для построения волоконно-оптический датчик, как строить измерительные приборы, а затем демонстрирует технику на коже человека в естественных условиях. Эта работа показала, что ткани микро-архитектуры, в частности, вершинные кератиноциты кожи, могут быть совместно зарегистрированы и связанные с ним физиологические параметры. Приборы и волоконно-пучка зонд, представленные здесь могут быть оптимизированы как или карманного компьютера или эндоскопически-совместимое устройство для использования в различных системах органов. Дополнительные клинические исследования необходимы для того, чтобы проверить жизнеспособность этой методики для различных эпителиальных болезненных состояний.
Introduction
Волоконно-расслоение методы microendoscopy обычно анализируют в естественных условиях ткани с использованием либо методов визуализации или комбинацию методов спектроскопии. 1-3 Один из таких методов обработки изображений с высоким разрешением флуоресценции microendoscopy, может изображение верхушечные ткани микроархитектура с субклеточном разрешением в небольшой , микромасштабная поле-обзора, с использованием местного применения контрастного агента , такого как профлавина, флуоресцеин или pyranine чернил. 1,3-11 Этот механизм визуализации показал перспективные клинические показатели в качественно дифференцировать больных и здоровых эпителиальной ткани в режиме реального времени с низким между наблюдателями вариабельность. 8 Иногда исследователи будут использовать данные флуоресцентной микроскопии высокого разрешения для извлечения количественных функций , таких как клетки и размер ядра или железы области, но это по- прежнему в первую очередь качественная методика нацелена на визуализации морфологии тканей. 1,3,8- 10 с другой стороны, методы спектроскопии, такиев спектроскопии диффузного отражения, нацелены на предоставление информации функциональной ткани и показали перспективные клинические показатели в количественном отношении выявления раковых поражений во многих органах. 2,12-15
Таким образом, существует потребность в устройстве, включающего оба типа механизмов для потенциально дальнейшего снижения изменчивости между наблюдателями, поддерживать в реальном времени визуализации тканей микроархитектуры, а также обеспечить более полный анализ здоровья тканей. Для достижения этой цели, мультимодальный зонд на основе инструмент был построен , который сочетает в себе два условия в одном оптоволоконного зонда:. С высоким разрешением флуоресценции microendoscopy и суб-спектроскопии диффузного отражения 11 Этот метод со-регистрам качественные изображения с высоким разрешением верхушечных морфология ткани (структурные свойства) с количественной спектральной информации (функциональные свойства) из двух различных глубинах тканей, включая локальную концентрацию гемоглобина ([Hb]), концентрация меланина ([Мел]), и насыщение крови кислородом (SaO 2). 11,12,16 Эта специфическая модальность отражательной спектроскопии суб-диффузная использует два источника детектора разделений (SDSS) к образцу два уникальных глубины ткани , чтобы обеспечить более полную картину здоровья ткани путем отбора проб вплоть до базальной мембраны и стромы основной ткани. 11
Волокно-зонд состоит из центрального мм диаметра 1 изображения волокна с приблизительно 50 000 4,5 мкм элементов диаметром волокна, диаметром оболочки 1,1 мм и общим диаметром покрытия 1,2 мм. Изображение волокно окружено пятью 200 мкм волокон диаметра с диаметром оболочки 220 мкм. Каждый 200 мкм многомодового волокна расположена на расстоянии от центра до центра 864 мкм, вдали от центра волокна изображения. Каждый из многомодовых волокон 200 мкм 25 ° друг от друга. Используя крайний левый 200 мкм многомодового волокна в качестве "источника" волокна, а также дополнительный тысРЗЭ 200 мкм многомодового волокна как "коллекция" волокон, эта геометрия обязательно создает три центра до центра 374 карточки безопасности мкм, 730 мкм, 1,051 мкм и 1,323 мкм. Кончики волокна заключены в цилиндрический металлический корпус, который держит расстояния между константой волокон. Диаметр цилиндрического металлического корпуса составляет 3 мм. Дистальный конец (к волоконно-оптического зонда) волоконно-оптический зонд длиной 2 фута. Зонд затем разделяется на шесть соответствующих отдельных волокон на проксимальном конце ( по направлению к измерительной аппаратуры) , которая имеет длину еще 2 фута, для общей длиной 4 фута. На рисунке 1 показано представление волоконно-оптического зонда.
Рисунок 1:. Волоконно-оптический зонд дизайн Волоконно-оптический датчик состоит из одного мм диаметра 1 волокна изображения и четыре 200 мкм многомодовых волокон. Этарисунке показаны представления (а) торцевая крышка металл , который ограничивает геометрию волокон на конце зонда с получением SDSS 374, 730 и 1051 мкм по крайней левой мкм многомодового волокна 200 (Шкала бар ≈ 1 мм), (б) волокна будучи стесненными внутри металлического колпачка, показывая сердцевинами волокон, оболочки волокна и волокна покрытия (шкала бар ≈ 1 мм), (с) защитный полиамид оплетка вокруг волокон (шкала бар ≈ 1 мм), (г ) готовый дистальный наконечник зонда, с металлическим кончиком большого пальца и одного черного кабеля , содержащего все волокна (Масштаб бар ≈ 4 мм), и (е) картина дистального конца зонда (Масштаб бар ≈ 4 мм). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Это мультимодальный приборы и связанные с ними Techniдие первое сочетание этих условий в пределах одного зонда, хотя другие комбинированные структурные / функциональные методы существуют, которые сочетают различные методы. Например, гиперспектральных изображений сочетает в себе широкие поля визуализации с количественным гемоглобина и меланина свойствами, 17,18 и другие методы были разработаны , которые сочетают оптической когерентной томографии (ОКТ) с анализом экспрессии белка ткани, 19 , чтобы назвать несколько. В этой статье отчеты о компактном и удобном для реализации установки измерительных приборов, которая использует общий волоконно-оптический датчик, который может быть оптимизирован для различных целей, в том числе эндоскопического использования в нижней части желудочно-кишечного тракта и пищевода или в качестве переносного зонда для использования в ротовой полости и внешнее размещение кожи. 11,20
Аппаратные средства для этой аппаратуры требует как пользовательские сбора данных и код постобработки для получения диффузного спектров отражения и затем извлечь в результате Volumе усредненный ткани физиологические параметры , включая [Hb], [Мел] и SaO 2. Код сбора пользовательских данных был построен, чтобы обеспечить одновременное приобретение с камеры (для высокого разрешения флуоресцентной микроскопии) и спектрометр (для спектроскопии диффузного отражения). Водители часто можно найти на сайтах производителей, чтобы обеспечить интеграцию с различными языками программирования. Код таможенный пост-обработка импортирует априорных значений поглощение в естественных условиях [Hb] и [Мел] 21 , а затем использует ранее разработанный процесс подгонки нелинейной оптимизации , который создает подогнанную кривую спектров. 22 встроенна кривая построена путем минимизации χ 2 значение между собой и необработанного спектров и определение ткани физиологических параметров ([Hb], [Мел], и SAO 2) из подобранной кривой и с наименьшим х 2 значение. 22 код может быть изменен , чтобы включитьпоглощение из других хромофоров, а, например, как экзогенного pyranine чернила, используемые здесь, так что целевые физиологические параметры не изменяются.
Физиологические показатели здоровья ткани, такие как [Hb], [Мел] и SaO 2, могут быть использованы в качестве отчетов опухолевого ответа на терапию или в качестве индикаторов местного васкуляризации и ангиогенеза. 14,23 В том числе высокого разрешения флуоресценции microendoscopy модальности помогает размещение зонда руководство и обеспечивает следователям более полную картину взаимосвязи между структурой эпителиальной ткани и функции. В этой статье, строительства и применения мультимодальных microendoscope описана. 11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
утверждение совета Обзор Институциональная (IRB # 15-09-149) была получена из программы Субъекты исследовательского человека в Университете штата Арканзас по всем аспектам этого исследования. Описанные здесь методы были проведены в соответствии с утвержденными руководящими принципами, и информированное согласие было получено от всех участников.
1. Сборка высокого разрешения флуоресценция Microendoscopy модальности
Примечание: Изложенные этапы сборки высокого разрешения флуоресценции microendoscopy модальности можно визуализировать на рисунке 2.
- Поместите 470 нм дихроичное зеркало внутри клетки Куб 30 мм.
- Получают 30 мм клетку куб и удалить дихроичный держатель фильтра.
- Поместите 470 нм дихроичное зеркало в дихроичным держатель фильтра.
- Повторно вставьте и закрепите дихроичный держатель фильтра обратно в клетку куб.
- Приложить Кейджа Стержни Ассамблеи к клетке куба 30 мм.
- Безопасныйчетыре 1,5 дюйма клетка сборки стержней к передней части клетки куба.
- Закрепите четыре 3,0-дюймовый каркас сборки стержней к правой стороне клетки куба.
- Безопасные два 2,0-дюймовый каркас сборки стержней по диагонали на левой стороне клетки куба.
- Построить сетчатая пластина / Lens Tube в сборе.
- Получите 1,0 дюйма с резьбой 30 мм сетчатую пластину с и прикрепить беззаботным стопорное кольцо с внутренней стороны клетки пластины с помощью прилагаемого нарезание резьбы.
- Винт в 1,0 дюйма объектива трубки к свободной от стрессов стопорного кольца.
- Прикрепление второй 1,0 дюйма с резьбой 30 мм сетчатую пластину на 1,0 дюйма объектива трубку и настроить стандартные стопорные кольца таким образом, что две клетки пластины находятся на одном уровне.
- Вставьте 1,0 дюйма сетчатая пластина / Lens трубчатого узла на левой стороне клетки куба 30 мм.
- Построить правый угол зеркало крепление в сборе.
- Получить под прямым углом зеркало крепление и 1,0 дюйма УФ-Enhanced алюминиевого зеркала.
- Поместите 1.0 вклч UV с повышенной алюминиевое зеркало в зеркало крепление и затяните.
- Закрепите четыре 2,0 дюйма клетка сборки стержней к передней части зеркала крепления
- Безопасные два 2,0-дюймовый каркас сборки стержней по диагонали на правой стороне клетки куба.
- Подключение правый угол зеркало узел подвески на левой стороне сборки трубки на 1,0 дюйма сетчатая пластина / линзы, помещая противостоящие агрегат клетки стержней через соответствующие отверстия в обойме пластины 30 мм.
- Автор перевод Z-оси крепления через 3,0 дюйма клетка сборки стержней на правой стороне узла.
- Приложить 10X ахроматический объектив к оси перевода монтирования.
- Построить 1,0 дюйма адаптер волокна пластины / XY-оси линзы перевода крепление в сборе.
- Получить ху оси перевода и крепление 1,0 дюйма адаптер волокна пластины с.
- Закрепить 1,0 дюйма волокна переходную пластину в ху оси перевода объектива.
- Авто-тон 1,0 дюйма волокна адаптер / ху оси перевод байонет узел в передней части объектива.
- Получите два 0,5 дюйма длиной, 1,0 дюйма объектив диаметром трубы, один 440/40 нм полосовой фильтр (фильтр возбуждения) и один 525/36 нм полосовой фильтр (излучение).
- Поместите каждый фильтр внутри 0,5 дюйма длиной, 1,0 дюйма линзы диаметр трубки, таким образом, что стрелка на внешней стороне фильтра обращена к стороне трубы объектива с наружной резьбой.
- Прикрепите фильтры к сборке.
- Получить два стандартных стопорные кольца.
- Закрепите фильтры внутри на 0,5 дюйма длиной, 1,0 дюйма диаметр линзы трубок со стандартными фиксирующими кольцами.
- Заверните линзы трубки с фильтром возбуждения к передней части клетки куба 30 мм и привинтить в объективе трубки с фильтром излучения к прямоугольным зеркалом монтирования.
- Заверните 0,5 дюйма объектива трубки с фильтром излучения к передней части правого угла зеркала монтирования.
- Obtaiп два 1,0 дюйма с резьбой 30 мм корпусные пластины и поместите их перед 0,5 дюйма длиной, 1,0 дюйма диаметром объектива пробирки, содержащие фильтры.
- С помощью эпоксидной смолы или сильный клей, приложите 455 нм привело к сетчатую пластину, подключенного к фильтру возбуждения.
- Получите один 0,5 дюйма длиной, 1,0 дюйма объектива диаметром трубки и 1,0 дюйма ахроматический объектив дублет трубка с фокусным расстоянием 50 мм.
- Поместите пробирку линзы внутри объектива трубки таким образом, чтобы стрелка на внешней стороне линзы обращена к стороне объектива трубы с наружной резьбой.
- Винт в трубке объектива до сборки.
- Получить один стандартный стопорное кольцо.
- Закрепите объектив внутри 0,5 дюйма длиной, 1,0 дюйма линзы диаметром трубки со стандартным стопорным кольцом.
- Прикрепите трубку объектива с трубкой объектива до крайнего слева пластины клетки.
- Поместите 30 мм сетчатую пластину на перед 0,5 дюйма длиной, 1,0 дюйма диаметром объектива пробирку, содержащую трубки линзы.
- Прикрепление беззаботным стопорное кольцо к внутренней стороне пластины 30 короткозамкнутым мм.
- Приложить USB монохромную камеру к клетке пластины с беззаботным стопорного кольца.
- Построить оптические приборы пост монтажа.
- Получить четыре 0,5 дюйма пост держатели, четыре оптических сообщения 0,5 дюйма, а четыре монтажных оснований.
- Закрепить оптические сообщения 0,5 дюйма внутри на 0,5 дюйма пост держателей.
- Закрепите 0,5 дюйма пост держателей на монтажные оснований.
- Винтовой в четыре оптических пост монтажных устройств к резьбовыми отверстиями, расположенными под клеткой куба 30 мм, правый угол зеркало крепление, сетчатую пластину, соединенную с СИД, и сетчатую пластину, соединенную с камерой.
- Заверните четыре оптических пост для монтажа устройств либо к оптическому макете или оптическом столе, чтобы закончить строительство высокого разрешения флуоресценции microendoscopy модальности.
ftp_upload / 54564 / 54564fig2.jpg "/>
Рис . 2: Монтаж высокого разрешения флуоресценции microendoscopy модальности высокого разрешения флуоресценции microendoscopy модальность может быть построена путем создания оболочки компонентов диаметра размером 1,0 дюйма, с особой тщательность в обработке дихроичное зеркало, линза объектива, возбуждение / фильтры выбросов и объектив трубки. Стеклянные поверхности этих компонентов должны быть тщательно обработаны с помощью объектива бумагу. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
2. Сборка Суб-диффузной отражательной спектроскопии модальности
Примечание: Изложенные шаги по сборке механизма отражательной спектроскопии к югу-диффузная можно визуализировать на рисунке 3.
- Получить источник света вольфрам-галоген, и, с помощью эпоксидной смолы или сильный клей, обеспечить 1,0 дюйма threaded 30 мм сетчатая пластина на фронт.
- Закрепите четыре 3,0 дюйма клетка сборки стержней в сетчатую пластину.
- Прикрепление перевод ось г крепление к клетке сборки стержней.
- Винт в 20Х ахроматической линзы объектива к оси перевода монтирования.
- Построить волоконно-адаптер пластина / XY-оси линзы перевода крепление в сборе.
- Получить ху оси перевода монтирования и 1,0 дюйма волокна переходную пластину.
- Закрепите адаптер волокна пластину в ху оси перевода объектива.
- Передвиньте 1,0 дюйма волокна адаптер / ху-перевод узел подвески в передней части объектива.
- Сборка узла двигателя рычаг.
- Получить изготовленный на заказ алюминиевый мотор руку и одну SMA адаптер волокна пластины.
- Заверните адаптер волокна пластины (с наружной резьбой) в алюминиевый мотор руки (с внутренней резьбой).
- Прикрепите изготовленный на заказ алюминиевый адаптер двигателя кронштейн для двигателя руку с четырьмя # 4-40 0,5 дюйма. Винтами.
- Построить корпус кронштейна / двигатель в сборе двигатель / двигатель.
- Получить пользовательский встроенный алюминиевый корпус двигателя и шаговый двигатель 400 шагов.
- Выстроить отверстия для винтов на шаговый двигатель и корпус двигателя и закрепите с четырьмя # 4-40 0,5 дюйма винтами.
- Поток вращающегося двигателя шток шагового двигателя через отверстие узла двигателя рычага и затяните фиксирующий винт на адаптере рычага алюминиевого двигателя.
- Построить узел оптического переключателя.
- Получить пользовательский встроенный алюминиевый оптический переключатель и три 1,0 дюйма адаптер волокна пластины.
- Резьба адаптера пластин в резьбовые отверстия в оптическом коммутаторе.
- Прикрепите изготовленный на заказ алюминиевый оптический переключатель лицевой панелью на оптический коммутатор с четырьмя # 4-40 0,5 дюйма винтами.
- Прикрепите кронштейн / моторный узел корпуса двигателя / двигателя к оптическим переключателем путем подачи вращающегося двигателя шток шагового двигателя через центральное отверстие тон оптический переключатель.
- Получить электрическую печатную плату и драйвер шагового двигателя, а затем поместить драйвер шагового двигателя через центральную канавку макете.
- Соблюдайте электрическую схему подключения (рис 3, 2.12) для водителя шагового двигателя, 12 В блок питания и шаговый двигатель.
- Подключите драйвер шагового двигателя, 12 В источник питания и шаговый двигатель , как указано на схеме (рис 3, 2.12) для завершения строительства моторизованного оптического переключателя.
- Ввернуть оптических компонентов выключатель и источник света вольфрамовая галогенная к оптическому макете или оптическом столе вблизи ранее построенный (рис 2, 1,24) с высокой разрешающей способностью флуоресценции microendoscopy сборки.
- Прикрепите один конец 550 мкм, 0,22 NA соединительный кабель к 1,0 дюйма адаптера волокна пластины узла двигателя рычага.
- Подключите другой конец 550 мкм, 0,22 NA соединительный кабель к волокну подключитьили от USB-спектрометра.
- Винт в пяти дистальных кабелей зонда к соответствующим 1,0 дюйма адаптер волокна пластин на инструментовке, чтобы закончить завершение мультимодальных изображений с высоким разрешением и суб-спектроскопии диффузного отражения волоконно-расслоения microendoscope.
- Винт в центральной 1 мм диаметр изображения волокна кабеля к 1,0 дюйма адаптера волокна пластины, упомянутой в пункте 1.9.2.
- Винт в крайнем левом 200 мкм многомодового волокна кабеля к 1,0 дюйма адаптера волокна пластины, упомянутой в пункте 2.6.
- Заверните 2 - й 200 мкм кабеля многомодового волокна в крайнее левое 1,0 дюйма волокна адаптера , прикрепленного к вольфрамо-галогенной лампой , упомянутой в пункте 2.9.2.
- Ввернуть 3 - й 200 мкм кабеля многомодового волокна к средней 1,0 дюйма адаптера волокна пластины , упомянутой в пункте 2.9.2.
- Винт в кабеле на основе многомодового волокна с 4 - й 200 мкм в крайнее правое 1,0 дюйма адаптера волокна пластины , упомянутой в пункте 2.9.2.
Рисунок 3:. Монтаж модальности отражательной спектроскопии суб-диффузный Модальность суб-спектроскопии диффузного отражения может быть построена с использованием основного вольфрам-галогенные лампы , соединенный с линзой объектива для фокусировки света через 200 мкм многомодового доставки волокна и спектрометр. Кроме того, пользовательский встроенный моторизованный оптический переключатель может быть построен в пределах пути лампы волоконно-спектрометр, предназначенный для переключения между каждым SDS. Исследователи , использующие несколько спектрометров для получения из нескольких паспортов безопасности может обойти оптический компонент переключателя. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.3. Калибровка Суб-диффузной отражательной спектроскопии модальности
Примечание: пollowing шаги (раздел 3), должны быть завершены до спектрального сбора данных (раздел 4).
- Включите все компоненты приборов, в том числе 455 нм LED, широкополосным вольфрамо-галогенной лампы, CMOS камеры, USB-спектрометре, шаговым двигателем и панели управления двигателем. Убедитесь, что затвор на вольфрамо-галогенной лампы открыта.
- Выключите все окружающее освещение.
- Откройте программное обеспечение на заказ сбора данных.
- Держите оборудование работает в течение 30 мин для лампы достигают нужной температуры и присущего шума от спектрометра стабилизации.
- Поместите диффузное стандарт отражения 20% внутри нижнего отверстия заказного, 3D печатная калибровки стандартного устройства.
- Поместите волоконно-оптический датчик внутри крайнего левого слота обычая, 3D напечатаны волоконно-держатель, показано на рисунке 4. Крайний левый слот фиксирует перпендикулярное расстояние от волоконно-оптического зонда к стандарту отражательной способности на 2,1 мм, что является ормальных расстояние, в котором сигнал достигает спектрометра максимальна в течение первых SDS 374 мкм.
- Регулировка моторизованного оптический переключатель в левой позиции таким образом, чтобы спектрометр соединен с первым SDS 374 мкм.
- Установить время интеграции до 500 мс. На этот раз интеграция должна быть выбрана, чтобы не насыщать спектрометр, но поддерживать время практически низкой интеграции.
- Приобретают спектр, R макс, 374μm, нажав кнопку "Приобретать Spectrum" в программном обеспечении.
- Закройте затвор на вольфрамо-галогенной лампой и записывают спектр, R темный, 374μm, фонового шума, нажав кнопку "Приобретать Spectrum" в программном обеспечении. После приобретения, открыть затвор еще раз.
- Поместите волоконно-оптический датчик внутри крайний правый слот обычай, 3D напечатаны волоконно-держатель, показано на рисунке 4. Крайний правый слот фиксирует перпендикулярное расстояние от волоконно-оptic наконечник зонда к стандарту отражательной способности на 3,9 мм, что оптимальное расстояние, в котором сигнал достигает спектрометра максимальна для второй SDS 730 мкм.
- Регулировка моторизованного оптический переключатель в среднее положение таким образом, чтобы спектрометр соединен со вторым SDS 730 мкм.
- Приобретают спектр, R макс, 730μm, нажав кнопку "Приобретать Spectrum" в программном обеспечении.
- Закройте затвор на вольфрамо-галогенной лампой и записывают спектр, R темный, 730μm, фонового шума, нажав кнопку "Приобретать Spectrum" в программном обеспечении.
- Откройте затвор еще раз.
Рис . 4: Калибровка механизма отражательной спектроскопии суб-диффузная Для предварительной экспериментальной калибровки, волоконно-оптический наконечник зонда должен быть помещен в разноеперпендикулярные расстояния от 20% стандарта диффузного отражения в зависимости от SDS. Для того, чтобы последовательно достичь этих перпендикулярных расстояний во всех экспериментах, калибровка стандартное устройство было разработано (перекрестное устройство сечения , показанного на (а)) , чтобы удерживать датчик на точных расстояниях от стандарта на 20% диффузного отражения. В этом конкретном волоконно-оптической установки зонда, свет от вольфрамовой галогенной лампы показан через оптический переключатель на источник-детектор разделений (б) 374 мкм и (с) 730 мкм (с двигателя и его руку удалены из оптического пути для ясности). Расстояния (D) 2,1 мм для SDS 374 мкм, и (е) 3,9 мм для SDS 730 мкм требуются для калибровки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.4. В Vivo данных Acquisitioп и оптического извлечения свойств из человеческой кожи
В этом разделе мультимодальный техника microendoscope будет продемонстрирована на коже человека в естественных условиях.
- Откройте специальное программное обеспечение для сбора данных и настроить время интегрирования спектрометра, нажав кнопку "Время интеграции" и установите его так, что он такой же, как во время калибровки, который был 500 мс в этом случае (шаг 3.8).
- Определить участок кожи, в которой для получения данных, которые могут отличаться по заявлению следователя. В этом случае, тонкая кожа предплечья была выбрана в качестве демонстрации.
- Если участок кожи содержит волосы, удалить волосы с одноразовой стерильной бритвой.
- Получить стандартный желтый маркер, который содержит pyranine чернила, и слегка отметить выбранный участок кожи.
- Включите нм LED 455 и закрыть затвор с вольфрамовой галогенной лампой.
- Поместите зонд в нежном контакте с кожей.
- Перемещение зондомкруглый на запятнанную область ткани для просмотра живого корма с высоким разрешением верхушечного архитектуры кератиноцитов на окне просмотра программного обеспечения.
- Выберите подходящее время экспозиции и усиления, 150 мс и 10 дБ усиления в этом случае, чтобы избежать насыщения изображения, нажав кнопку "Время экспозиции" и "Gain", введя в соответствующие значения, а затем нажмите кнопку "Применить настройки" в программном обеспечении интерфейс.
- Приобретать изображение, нажав кнопку "Image" Acquire в интерфейсе программного обеспечения.
- При сохранении зонда в том же месте изображения, выключите светодиод 455 нм и открыть затвор к вольфрамо-галогенной лампы.
- Регулировка моторизованного оптический переключатель в левое положение, таким образом, чтобы спектрометр соединен со вторым SDS 374 мкм.
- Приобретать спектры, R ткани, 374μm, нажав кнопку "Приобретать Spectra" в интерфейсе программного обеспечения.
- Отрегулируйте моторизованный оптический переключатель в среднее положение таких гона спектрометре соединен со вторым SDS 730 мкм.
- Приобретать спектры, R ткани, 730μm, нажав кнопку "Приобретать Spectra" в интерфейсе программного обеспечения.
- Откройте программное обеспечение на заказ постобработки.
- Запустите программное обеспечение постобработки, нажав кнопку "Выполнить" и выберите флуоресцентного изображения с высоким разрешением, четыре спектра калибровки, а два в естественных условиях спектры из папки , в которой данные были сохранены при запросе программного обеспечения.
ПРИМЕЧАНИЕ: специальное программное обеспечение получает истинное абсолютное отражательная способность (R абс, 374μm и R ABS, 730μm) с использованием следующих уравнений.
Код после обработки, как описано выше, вычисляет подогнанную кривую спектров диффузного отражения (уравнения 1 и 2), а затем Determines ткани физиологические параметры , включая ([Hb], [Мел] и SaO 2). 11,22,24
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В соответствии с этим протоколом, следователь будет получить изображение высокого разрешения в фокусе участка ткани с полным полем зрения (рисунок 5). Контуры клеток можно увидеть, если окрашивали pyranine чернилами из стандартного желтого подсветки, в то время как отдельные клеточные ядра можно увидеть, если окрашивали красителем, такой как профлавина. После спектрального приобретения, программное обеспечение постобработки использует априорного знания в естественных условиях концентрации гемоглобина ([Hb]) и концентрации меланина ([Мел]) 21 , чтобы соответствовать спектров отражения суб-диффузная и определяют значения [Hb], [Мел ], а также ткани насыщение крови кислородом (SaO 2) , как показано на рисунке 5. программное обеспечение постобработки использует широкие физиологические границы ([Hb] = 0-150 мг / мл, [Мел] = 0-30 мг / мл, и SaO 2 = 0-100%) , чтобы соответствовать калиброванные спектры. 21
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мультимодальных изображений с высоким разрешением и суб-спектроскопии диффузного отражения волоконно-пучок microendoscope сообщили здесь могут быть оптимизированы и использоваться исследователями для различных применений, включая эндоскопические или портативного использования для человека или животных исследований. Таким образом , он обеспечивает гибкий способ визуализации в естественных условиях апикальной ткани микроархитектуры наряду с измерениями концентрации гемоглобина, концентрации меланина, и насыщение тканей кислородом из двух различных глубинах ткани. В данной статье описаны спецификации для волоконно-оптического зонда, наметил протокол для сборки системы формирования изображений с высоким разрешением и суб-диффузная система отражения изображения, и показано его применение в тканях человека в естественных условиях, с использованием pyranine чернил в качестве флуоресцентного контрастного вещества для визуализация ткани. Другие чернила, такие как профлавина или флуоресцеина, могут быть использованы вместо pyranine чернил с соответствующей маркировкой. 4-7,11
"> Любая функция зонд может быть изменен от этой конструкции. Для получения высокого разрешения флуоресценции microendoscopy модальности, 1 мм Диаметр волокна изображение состоит из 50000 отдельных основных волокон с шагом 4,5 мкм, что приводит к постоянной субклеточном пространственным разрешением 4,5 мкм . Исследователи, желающие другое волокно размера изображения, чтобы получить меньшее или большее поле-обзора можно найти эти изображения волокна легко доступны с диаметром от 0,14 до 1,40 мм. тюбике объективом с фокусным расстоянием 50 мм была выбрана таким образом, чтобы датчик CMOS захватили полный 1 мм поле-обзора из волокна изображения. При сохранении объективной постоянной объектива, увеличивая фокусное расстояние трубки линзы будет увеличиваться коэффициент увеличения и частоту дискретизации , но уменьшения поля-обзора. 11 Таким образом, увеличение в линза объектива, фокусное расстояние объектива трубки, размер датчика изображения, и размер волокна изображения может и должна быть оптимизирована в зависимости от необходимости. и, наконец, фильтры и Возбуждающий светисточник может быть изменен в зависимости от спектров возбуждения / испускания флуоресцентных красителей. 4-7 В дополнение к модификации зонда и высокого разрешения флуоресценции microendoscopy приборы, измерительные приборы отражательной спектроскопии суб-диффузный может быть изменен.Для модальности отражательной спектроскопии суб-диффузная, разного размера многомодовые волокна могут быть использованы в каждом SDS. Меньшие многомодовых диаметр волокна будут иметь возможность поставлять и собирать свет на меньшей площади, но рекомендуется использовать массив одинаково расположенных волокон, чтобы увеличить отношение сигнал-шум, если диаметры волокон используются менее 200 мкм. Исследователи, анализирующие кожи или ткани полости рта, может извлечь выгоду из общего большого зонда для увеличения поля-обзора и отношение сигнал-шум, но в более узких светящихся органов, таких как пищевод или желудочно-кишечного тракта, следователи столкнутся добавлены ограничения относительно размера зонда, особенно для совместимости с биопсией портом монастыряРациональная эндоскопы. 8 Другие компоненты спектроскопии , которые могут быть модифицированы включают широкополосный источник света и моторизованных оптический переключатель. Вольфрамовый-галогеновая лампа была выбрана в данном случае, хотя возможны и другие источники света могут и использовались в других исследованиях, в том числе ксеноновые дуговые лампы и светодиоды, которые могут увеличить отношение сигнал-шум и меньший времени интеграции. 2,15,20 моторизованный оптический переключатель, представленный здесь была специально построена для обработки до трех паспортов безопасности, но может быть изменен, чтобы включать в себя больше или меньше входов. Следует отметить, что моторизованный оптический коммутатор действительно добавляет дополнительный оптический компонент между источником света и широкополосного спектрометра, уменьшая сигнал-шум. Выключатель не может быть необходимо для исследователей с несколькими спектрометрами, которые приобретают данные одновременно, но в том числе оптический коммутационный компонент в конечном счете, снижает стоимость измерительных приборов примерно на $ 3000 долларов за SDS.
Строительство контрольно-измерительных приборов (
Что касается поиска и устранения неисправностей, спектров приводит к плохим припадков (в среднемпроцент ошибок больше , чем 10% от исходных данных и встроенными данными) будет давать недостоверные значения для трех тканевых физиологических параметров ([Hb], [Мел] и SaO 2) , представленные здесь. Бедные припадки, скорее всего , результатом либо движения между зондом и участок кожи во время сбора данных, узкие граничные условия в коде последующей обработки, или ненадежных априорных значений [Hb] и [Мел]. 11,21,24, 26 Улучшения в этих трех общих возникновением ошибки следует зафиксировать точную подгонку спектров суб-диффузного отражения. Таким образом, сбор данных может быть улучшена за счет уменьшения времени интегрирования спектрометра для уменьшения артефактов движения в спектрах. Кроме того, граничные условия представляют собой диапазон возможных значений для вывода вычислительной [Hb], [Мел] и SaO 2 следующий пост-обработки. В этих исследованиях, граничные условия были 0-10 мг / мл для [Hb], 21,22 0-40 мг / мл для [Мел], 27,28 и 0-100% для SaO 2,
Основным ограничением для этого мультимодальных изображений и спектроскопии волоконно-расслоения microendoscopy платформы является отсутствие механизма Widefield визуализации. С высокой разрешающей способностью флуоресценции microendoscopy модальность имеет круглое поле-обзора, который составляет 1 мм в диаметре, что делает его трудно быстро сканировать большую площадь ткани. Один вычислительный метод, чтобы преодолеть это ограничение является изображение МСДIcking, метод , используемый для обеспечения более широкого поля-обзора путем укладки соседних микроскопических изображений в единый, на карте большего размера изображения. 10 Такое мозаик изображение было ранее продемонстрировано Прието и др. , чтобы исследовать ободочной особенности изображения. 10 AN модификация инструментария , чтобы преодолеть это ограничение было бы сделать зонд совместимый с портом биопсийный обычного эндоскопа, например, зонда , представленного Парикх и др. , чтобы исследовать колоректального неоплазии. 8 Эта функция сочетает в себе преимущества зрения поле обзора по всей с микро-масштаба изображения высокого разрешения флуоресценции microendoscopy. 8
В целом, эта техника была продемонстрирована на в естественных условиях человеческой кожи и показывает значение совместного регистрации с высокой разрешающей способностью ткани микро-архитектурных изображений с основной концентрацией меланина, концентрации гемоглобина, и насыщение тканей кислородом (рисунок 5). Это техничIQUE могут быть использованы исследователями , желающими изучить связь между структурными и функциональными аномалиями ткани в живом организме , или функциональные изменения анализирующая ткани в отсутствие наблюдаемых структурных изменений. Дальнейшие исследования будут исследовать жизнеспособность этой методики в различных эпителиальных болезненных состояний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs, Inc. | CM1-DCH | |
| 470 nm Dichroic Mirror (Beam Splitter) | Chroma Corporation | T470lpxr | |
| Cage Assembly Rod, 1.5", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER1.5-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 3.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER3-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 2.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER2-P4 | |
| SM1-Threaded 30 mm Cage Plate | Thorlabs, Inc. | CP02 | |
| SM1 Series Stress-Free Retaining Ring | Thorlabs, Inc. | SM1PRR | |
| SM1 Lens Tube, 1.00" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L10 | |
| Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs, Inc. | KCB1 | |
| 1" UV Enhanced Aluminum Mirror | Thorlabs, Inc. | PF10-03-F01 | |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs, Inc. | SM1Z | |
| 10X Olympus Plan Achromatic Objective | Thorlabs, Inc. | RMS10X | |
| XY Translating Lens Mount | Thorlabs, Inc. | CXY1 | |
| SMA Fiber Adapter Plate with SM1 Thread | Thorlabs, Inc. | SM1SMA | |
| SM1 Lens Tube, 0.50" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L05 | |
| 440/40 Bandpass Filter (Excitation) | Chroma Corporation | ET440/40x | |
| 525/36 Bandpass Filter (Emission) | Chroma Corporation | ET525/36m | |
| Quick Set Epoxy | Loctite | 1395391 | |
| 455 nm LED Light Housing Kit - 3-Watt | LED Supply | ALK-LH-3W-KIT | |
| 1" Achromatic Doublet, f = 50 mm | Thorlabs, Inc. | AC254-050-A | |
| Flea 3 USB Monochrome Camera | Point Grey, Inc. | FL3-U3-32S2M-CS | |
| 0.5" Post Holder, L = 1.5" | Thorlabs, Inc. | PH1.5 | |
| 0.5" Optical Post, L = 4.0" | Thorlabs, Inc. | TR4 | |
| Mounting Base, 1" x 2.3" x 3/8" | Thorlabs, Inc. | BA1S | |
| Long Lifetime Tungsten-Halogen Light Source (Vis-NIR) | Ocean Optics | HL-2000-LL | |
| 20X Olympus Plan Objective | Edmund Optics, Inc. | PLN20X | |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm Adaptor | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Housing | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Stepper Motor - 400 steps/revolution | SparkFun Electronics | ROB-10846 | Multiple suppliers |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch Face-Plate | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Arduino Uno - R3 | SparkFun Electronics | DEV-11021 | Multiple suppliers |
| Electronic Breadboard - Self-Adhesive | SparkFun Electronics | PRT-12002 | Multiple suppliers |
| EasyDriver - Stepper Motor Driver | Sparkfun Electronics | ROB-12779 | |
| 12 V, 229 mA Power Supply | Phihong | PSM03A | Multiple suppliers |
| Enhanced Sensitivity USB Spectrometer (Vis-NIR) | Ocean Optics | USB2000+VIS-NIR-ES | |
| 550 µm, 0.22 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs, Inc. | M37L01 | |
| Custom-Built Fiber-Optic Probe | Myriad Fiber Imaging | N/A | |
| 20% Spectralon Diffuse Reflectance Standard | Labsphere, Inc. | SRS-20-010 | |
| Standard Yellow Highlighter | Sharpie | 25005 | Multiple suppliers, proflavine or fluorescein can be substituted |
References
- Muldoon, T. J., et al. Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy. Opt Express. 15, 16413-16423 (2007).
- Rajaram, N., Reichenberg, J. S., Migden, M. R., Nguyen, T. H., Tunnell, J. W. Pilot clinical study for quantitative spectral diagnosis of non-melanoma skin cancer. Lasers Surg Med. 42, 716-727 (2010).
- Louie, J. S., Richards-Kortum, R., Anandasabapathy, S. Applications and advancements in the use of high-resolution microendoscopy for detection of gastrointestinal neoplasia. Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 1789-1792 (2014).
- Chang, S. S., et al. High resolution microendoscopy for classification of colorectal polyps. Endoscopy. 45, 553-559 (2013).
- Muldoon, T. J., et al. Noninvasive imaging of oral neoplasia with a high-resolution fiber-optic microendoscope. Head Neck. 34, 305-312 (2011).
- Muldoon, T. J., et al. Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett's esophagus. J Biomed Opt. 15, 026027 (2010).
- Prieto, S. P., Powless, A. J., Boice, J. W., Sharma, S. G., Muldoon, T. J. Proflavine Hemisulfate as a Fluorescent Contrast Agent for Point-of-Care Cytology. PLoS One. 10, e0125598 (2015).
- Parikh, N., et al. In vivo diagnostic accuracy of high resolution microendoscopy in differentiating neoplastic from non-neoplastic colorectal polyps: a prospective study. Am J Gastroenterol. 109, 68-75 (2014).
- Shin, D., et al. Quantitative analysis of high-resolution microendoscopic images for diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma. Clin Gastroenterol Hepatol. 13, 272-279 (2015).
- Prieto, S. P., et al. Qualitative and quantitative comparison of colonic microendoscopy image features to histopathology. Proc SPIE Int Soc Opt Eng. 9328, (2015).
- Greening, G. J., et al. Fiber-bundle microendoscopy with sub-diffuse reflectance spectroscopy and intensity mapping for multimodal optical biopsy of stratified epithelium. Biomed Opt Express. 6, 4934-4950 (2015).
- Rajaram, N., Gopal, A., Zhang, X., Tunnell, J. W. Experimental validation of the effects of microvasculature pigment packaging on in vivo diffuse reflectance spectroscopy. Lasers Surg Med. 42, 680-688 (2010).
- Spliethoff, J. W., et al. Monitoring of tumor response to cisplatin using optical spectroscopy. Transl Oncol. 7, 230-239 (2014).
- Chang, V. T., et al. Quantitative physiology of the precancerous cervix in vivo through optical spectroscopy. Neoplasia. 11, 325-332 (2009).
- Yu, B., Shah, A., Nagarajan, V. K., Ferris, D. G. Diffuse reflectance spectroscopy of epithelial tissue with a smart fiber-optic probe. Biomed Opt Express. 5, 675-689 (2014).
- Hennessy, R., Goth, W., Sharma, M., Markey, M. K., Tunnell, J. W. Effect of probe geometry and optical properties on the sampling depth for diffuse reflectance spectroscopy. J Biomedical Opt. 19, 107002 (2014).
- Ghassemi, P., Travis, T. E., Moffatt, L. T., Shupp, J. W., Ramella-Roman, J. C. A polarized multispectral imaging system for quantitative assessment of hypertrophic scars. Biomed Opt Express. 5, 3337-3354 (2014).
- Vasefi, F., et al. Polarization-sensitive hyperspectral imaging in vivo: a multimode dermoscope for skin analysis. Sci Rep. 4, (2014).
- Winkler, A. M., Rice, P. F. S., Drezek, R. A., Barton, J. K. Quantitative tool for rapid disease mapping using optical coherence tomography images of azoxymethane-treated mouse colon. J Biomedl Opt. 15, 041512 (2010).
- Bish, S. F., et al. Handheld Diffuse Reflectance Spectral Imaging (DRSi) for in-vivo characterization of skin. Biomed Opt Express. 5, 573-586 (2014).
- Prahl, S. A. Optical Absorption of Hemoglobin. , http://omlc.org/spectra/hemoglobin/ (1999).
- Rajaram, N., et al. Design and validation of a clinical instrument for spectral diagnosis of cutaneous malignancy. Appl Opt. 49, 142-152 (2010).
- Hennessy, R., Markey, M. K., Tunnell, J. W. Impact of one-layer assumption on diffuse reflectance spectroscopy of skin. J Biomed Opt. 20, 27001 (2015).
- Rajaram, N., Nguyen, T. H., Tunnell, J. W. Lookup table-based inverse model for determining optical properties of turbid media. J Biomed Opt. 13, 050501 (2008).
- Nichols, B. S., Rajaram, N., Tunnell, J. W. Performance of a lookup table-based approach for measuring tissue optical properties with diffuse optical spectroscopy. J Biomed Opt. 17, 057001 (2012).
- Greening, G. J., James, H. M., Muldoon, T. J. Optical Phantoms: Diffuse and Sub-diffuse Imaging and Spectroscopy Validation. , SPIE Spotlights. 1-37 (2015).
- Karsten, A. E., Smit, J. E. Modeling and verification of melanin concentration on human skin type. Photochem Photobiol. 88, 469-474 (2012).
- Glennie, D. L., Hayward, J. E., Farrell, T. J. Modeling changes in the hemoglobin concentration of skin with total diffuse reflectance spectroscopy. J Biomed Opt. 20, 035002 (2015).
- Lim, L., Nichols, B., Rajaram, N., Tunnell, J. W. Probe pressure effects on human skin diffuse reflectance and fluorescence spectroscopy measurements. J Biomed Opt. 16, 011012 (2011).
