Abstract
Les techniques récentes de microendoscopie faisceau de fibres permettent une analyse non-invasive de tissu in vivo en utilisant soit des techniques d'imagerie ou une combinaison des techniques de spectroscopie. La combinaison des techniques d'imagerie et de spectroscopie dans une sonde optique unique peut fournir une analyse plus complète de la santé des tissus. Dans cet article, deux modalités différentes sont combinées, l'imagerie à haute résolution fluorescence microendoscopie et la spectroscopie de réflectance diffuse, dans une sonde optique unique. Haute résolution de l'imagerie par fluorescence microendoscopie est une technique utilisée pour visualiser les tissus apicale micro-architecture et, bien que la plupart du temps une technique qualitative a montré la différenciation en temps réel efficace entre les tissus néoplasiques et non néoplasiques. spectroscopie de réflexion diffuse est une technique qui permet d'extraire les paramètres physiologiques de tissus, y compris la concentration en hémoglobine locale, la concentration de la mélanine, et la saturation en oxygène. Cet article décrit les spécifications rbligatoire pour construire la sonde à fibre optique, comment construire l'instrumentation, puis montre la technique sur la peau humaine in vivo. Ce travail a révélé que le tissu micro-architecture, kératinocytes spécifiquement apical de la peau, peut être co-enregistré avec ses paramètres physiologiques associés. La sonde d'instrumentation et de faisceau de fibre présentée ici peut être optimisé soit comme un appareil portatif, ou par voie endoscopique compatible pour une utilisation dans une variété de systèmes d'organes. la recherche clinique supplémentaire est nécessaire pour tester la viabilité de cette technique pour différents états pathologiques épithéliales.
Introduction
Techniques de microendoscopie fibre faisceau analysent typiquement dans un tissu in vivo en utilisant soit des techniques d'imagerie ou une combinaison des techniques de spectroscopie. 1-3 Une telle technique d'imagerie à haute résolution de la fluorescence microendoscopie, peut imager un tissu apicale de micro-architecture avec une résolution de sous-cellulaire dans une petite , micro - champ de vue, en utilisant un agent de contraste topique tel que proflavine, fluorescéine, ou de l' encre pyranine. 1,3-11 Cette modalité d'imagerie a montré prometteur performance clinique dans qualitativement différencier le tissu épithélial malade et sain en temps réel avec une faible variabilité inter-observateur. 8 de temps en temps, les enquêteurs utiliseront les données de microscopie par fluorescence à haute résolution pour extraire des caractéristiques quantitatives telles que la cellule et la taille nucléaire ou de la zone des glandes, mais cela reste une technique essentiellement qualitative ciblée sur la visualisation de la morphologie des tissus. 1,3,8- 10 d'autre part, les techniques de spectroscopie, par exemplecomme la spectroscopie de réflectance diffuse, sont ciblés à fournir des informations de tissus fonctionnels et ont montré prometteur performance clinique pour identifier quantitativement les lésions cancéreuses dans plusieurs organes 2,12-15.
Par conséquent, il y a un besoin pour un dispositif intégrant les deux types de modalités pour potentiellement réduire davantage variabilité inter-observateur, maintenir la visualisation en temps réel du tissu micro-architecture, et de fournir une analyse plus complète de la santé des tissus. Pour atteindre cet objectif, un instrument à base de sonde multimodal a été construit qui combine deux modalités dans une sonde à fibre optique unique:. Haute résolution fluorescence microendoscopie et la spectroscopie de réflectance sous-diffuse 11 Cette méthode de co-registres qualitatives des images à haute résolution de apical la morphologie des tissus (propriétés structurelles) avec des informations quantitatives spectrale (propriétés fonctionnelles) à partir de deux profondeurs de tissu distinctes, y compris la concentration d'hémoglobine locale ([Hb]), la concentration de mélanine ([Mel]), et la saturation en oxygène (SaO 2). 11,12,16 Cette spectroscopie de réflectance modalité de sous-diffuse spécifique utilise deux séparations source-détecteur (FDS) pour échantillonner deux profondeurs de tissus uniques pour fournir une image plus complète de la santé des tissus par échantillonnage jusqu'à la membrane basale et le stroma de tissu sous - jacent. 11
La fibre-sonde est constitué d'un diamètre de 1 mm d'image fibre centrale à environ 4,5 um 50 000 éléments de fibre de diamètre, d'un diamètre de gaine de 1,1 mm et un diamètre de revêtement global de 1,2 mm. La fibre d'image est entourée de cinq 200 um fibres de diamètre avec des diamètres de revêtement de 220 um. Chaque fibre de 200 um multimode est situé à une distance de centre à centre de 864 um à une distance du centre de la fibre d'image. Chacune des fibres multimodes 200 um sont 25 °. En utilisant le plus à gauche fibre multimode de 200 um comme fibre "source", et le plus eree 200 um fibres multimodes comme les fibres "collection", cette géométrie crée nécessairement trois SDD centre à centre de 374 um, 730 um, 1051 um et 1323 um. Les extrémités des fibres sont enfermées dans une enveloppe métallique cylindrique qui maintient les distances entre les fibres constante. Le diamètre de l'enveloppe métallique cylindrique est de 3 mm. L'extrémité distale (vers la pointe de la sonde à fibre optique) de la sonde à fibre optique est de 2 pieds de long. La sonde se sépare alors en six fibres individuelles respectives à l'extrémité proximale (vers l'instrumentation) , ce qui est un temps supplémentaire de 2 pieds de long, pour une longueur totale de 4 pieds. La figure 1 montre une représentation de la sonde à fibre optique.
Figure 1:. Conception de la sonde à fibre optique La sonde à fibre optique se compose d'un 1 mm de diamètre d' image fibre et quatre 200 um fibres multimodes. Cefigure montre des représentations de (a) l'embout métallique qui limite la géométrie des fibres à la pointe de la sonde pour obtenir SDD de 374, 730 et 1051 um par rapport à la gauche de 200 fibres um multimode (barre d' échelle ≈ 1 mm), (b) les fibres étant limitées dans le capuchon métallique, montrant les noyaux de fibres, gaine de fibre, et revêtement de fibres (barre d' échelle ≈ 1 mm), (c) le polyamide de gaine protectrice autour des fibres (barre d' échelle ≈ 1 mm), (d ) l'embout distal fini de la sonde, avec la poignée de doigt métallique et unique câble noir contenant toutes les fibres (barre d' échelle ≈ 4 mm), et (e) une image de l'extrémité distale de la sonde (barre d' échelle ≈ 4 mm). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Cette instrumentation multimodal et techni associéQue est la première combinaison de ces modalités au sein d'une seule sonde, bien que d'autres techniques structurelles / fonctionnelles combinées existent qui combinent différentes modalités. Par exemple, l' imagerie hyperspectrale combine l' imagerie grand champ avec l' hémoglobine et la mélanine propriétés quantitatives, 17,18 et d' autres techniques ont été développées qui combinent la tomographie par cohérence optique (OCT) avec l' analyse de l' expression des protéines tissulaires, 19 pour ne citer que quelques - uns. Cet article présente une configuration d'instrumentation compacte et facile à mettre en œuvre qui utilise une sonde générale de fibre optique qui peut être optimisée à des fins diverses, y compris l'utilisation endoscopique dans le tube et de l'oesophage gastro-intestinal inférieur ou comme sonde de poche pour une utilisation dans la cavité buccale et le placement de la peau externe. 11,20
Le matériel pour cette instrumentation nécessite à la fois l'acquisition de données personnalisées et le code de post-traitement pour acquérir des spectres de réflectance diffuse, puis extraire le volum résultanttissus paramètres physiologiques e-moyenne , y compris [Hb], [Mel], et SaO 2. Le code d'acquisition de données personnalisées a été construit pour permettre l'acquisition simultanée d'une caméra (pour la microscopie de fluorescence à haute résolution) et un spectromètre (pour la spectroscopie de réflectance diffuse). Les pilotes sont souvent disponibles sur les sites Web des fabricants pour permettre l'intégration avec une variété de langages de programmation. Le code post-traitement personnalisé importe une des valeurs d'absorption a priori in vivo [Hb] et [Mel] 21 et utilise un procédé de montage d'optimisation non linéaire précédemment développé qui crée une courbe ajustée des spectres. 22 La courbe ajustée est construit en minimisant la χ 2 valeur entre lui - même et les spectres bruts et la détermination des tissus paramètres physiologiques ([Hb], [Mel], et SÃO 2) à partir de la courbe ajustée et avec le χ 2 plus bas prix. 22 le code peut être modifié pour inclurel'absorption d'autres chromophores ainsi, comme l'encre pyranine exogène utilisé ici, ainsi que des paramètres physiologiques cibles ne sont pas affectés.
Indicateurs physiologiques de la santé des tissus, tels que [Hb], [Mel], et SaO 2, peuvent être utilisés comme des rapports de la réponse tumorale à la thérapie ou comme des indicateurs de la vascularisation locale et l' angiogenèse. 14,23 Y compris une haute résolution fluorescence microendoscopie modalité aide le placement de la sonde de guidage et fournit aux enquêteurs une image plus complète de la relation entre la structure du tissu épithélial et la fonction. Dans cet article, la construction et l' application du microendoscope multimodal est décrit. 11
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Protocol
l'approbation du Conseil d'examen institutionnel (IRB # 15-09-149) a été obtenu à partir du programme Sujets de recherche humaine à l'Université de l'Arkansas pour tous les aspects de cette étude. Les méthodes décrites ont été réalisées conformément aux lignes directrices approuvées, et le consentement éclairé a été obtenu de tous les participants.
1. Assemblée de la haute résolution Fluorescence microendoscopie Modalité
Remarque: Les étapes décrites pour l' assemblage de la haute résolution fluorescence microendoscopie modalité peuvent être visualisées dans la figure 2.
- Placer un 470 nm Miroir dichroïque dans une cage Cube 30 mm.
- Obtenir une cage cube de 30 mm et retirez le support de filtre dichroïque.
- Placer un miroir dichroïque de 470 nm dans le filtre dichroïque de montage.
- Re-insérer et fixer le support de filtre dichroïque à l'intérieur du cube de la cage.
- Fixer l'Assemblée Cage Rods à 30 mm Cage Cube.
- Garantirquatre tiges d'assemblage de cage 1,5 pouces à l'avant du cube de la cage.
- Fixer quatre tiges d'assemblage de la cage 3,0 pouces sur le côté droit du cube de la cage.
- Sécurisées deux tiges d'assemblage de la cage de 2,0 pouces en diagonale sur le côté gauche du cube de la cage.
- Construire une Assemblée Tube / Objectif Cage Plate.
- Obtenir une plaque filetée de la cage 30 mm 1.0 pouces et fixer un anneau de retenue sans stress à l'intérieur de la plaque de cage à l'aide du filetage prévu.
- Visser dans un tube de verre de 1,0 pouces à l'anneau de retenue sans stress.
- Attacher un deuxième 1,0 pouce filetée 30 mm de la plaque de cage dans le tube de verre de 1,0 pouces et d'ajuster les bagues de retenue standards de telle sorte que les deux plaques de cage sont alignés.
- Faites glisser l'Assemblée Tube / Objectif 1,0 pouce Cage de plaque sur le côté gauche du 30 mm Cage Cube.
- Construire le miroir à angle droit de montage assemblage.
- Obtenir un miroir à angle droit de montage et un miroir en aluminium de 1,0 pouces UV renforcée.
- Placer le 1,0 inch UV renforcée miroir d'aluminium dans le miroir de montage et serrer.
- Fixer quatre tiges d'assemblage de la cage 2,0 pouces à l'avant de la monture de miroir
- Sécurisées deux tiges d'assemblage de la cage de 2,0 pouces en diagonale sur le côté droit du cube de la cage.
- Connectez le miroir à angle droit monter ensemble sur le côté gauche de l'ensemble du tube plaque de cage 1,0 pouce / objectif en plaçant les tiges d'assemblage de cage opposées à travers les ouvertures respectives de la plaque de la cage de 30 mm.
- Enfilez monter une traduction axe z à travers les tiges d'assemblage de la cage 3.0 pouces sur le côté droit de l'assemblage.
- Fixer un objectif achromatique 10X à la traduction de montage de l'axe z.
- Construire un 1.0 pouces plaque d'adaptateur de fibre xy axe / lentille de conversion de montage assemblage.
- Obtenir une traduction xy axe de montage et une plaque d'adaptateur de fibre de 1,0 pouces.
- Fixer la fibre plaque d'adaptation de 1,0 pouce dans le xy axe lentille de traduction de montage.
- Diapositive til 1.0 pouces fibre adaptateur xy axe / lentille de traduction monter ensemble en face de l'objectif.
- Obtenir deux 0,5 pouce de long, des tubes de 1,0 pouces de diamètre de lentille, un filtre passe-bande 440/40 nm (filtre d'excitation 525/36) et un filtre passe-bande nm (filtre d'émission).
- Placer chaque filtre à l'intérieur d'un 0,5 pouce de long, le tube de verre d'un diamètre de 1,0 pouces, de telle sorte que la flèche à l'extérieur du filtre est en face du côté du tube à lentille avec les filets externes.
- Fixez les filtres à l'assemblée.
- Obtenir deux bagues de retenue standard.
- Fixer les filtres à l'intérieur des tubes, 0,5 pouce de long lentilles de diamètre de 1,0 pouces avec les bagues de retenue standard.
- Visser dans le tube de lentille avec le filtre d'excitation à l'avant de la cage 30 mm cube et visser dans le tube de lentille avec le filtre d'émission vers le miroir à angle droit de montage.
- Visser dans le tube de verre de 0,5 pouces avec le filtre d'émission à l'avant du miroir à angle droit de monter.
- obten 1,0 pouce deux plaques filetée 30 de la cage mm et de les placer en face des tubes de 0,5 pouce de long, lentille de diamètre de 1,0 pouces contenant les filtres.
- En utilisant époxy ou colle forte, joindre une 455 nm LED à la plaque de cage reliée au filtre d'excitation.
- Obtenir une 0,5 pouce de long, le tube de verre d'un diamètre de 1,0 pouces et une lentille de tube doublet achromatique 1,0 pouce avec une longueur focale de 50 mm.
- Placer la lentille de tube intérieur du tube de lentille de telle sorte que la flèche sur la face extérieure de la lentille est en face du côté du tube à lentille avec les filets externes.
- Visser la lentille de tube à l'ensemble.
- Obtenir une bague de retenue standard.
- Fixer la lentille à l'intérieur de 0,5 pouces de long, tube de verre de diamètre de 1,0 pouces avec la bague de retenue standard.
- Fixer le tube à lentille avec la lentille de tube à la plaque de la cage la plus à gauche.
- Placer une plaque de cage 30 mm en face de la 1,0 pouces tube de verre d'un diamètre de 0,5 pouce de long contenant la lentille de tube.
- Joindre une le stress retenue sans anneau à l'intérieur de la plaque de cage de 30 mm.
- Fixer une caméra USB monochrome à la plaque de cage avec la bague de retenue sans stress.
- Construire les dispositifs optiques de montage après.
- Obtenir quatre supports de 0,5 pouces de poste, quatre 0,5 pouces messages optiques et quatre bases de montage.
- Fixer les messages optiques de 0,5 pouces à l'intérieur des titulaires de poste de 0,5 pouces.
- Fixer les titulaires des postes de 0,5 pouces sur les bases de montage.
- Visser les dispositifs de montage de quatre post optique aux trous de vis situés sous le 30 mm cage cube, monter le miroir à angle droit, la plaque de cage reliée à la LED, et la plaque de cage relié à la caméra.
- Vissez les quatre post dispositifs optiques à soit un breadboard optique ou table optique de montage pour terminer la construction de la haute résolution fluorescence microendoscopie modalité.
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Figure 2:. Assemblée de la haute résolution fluorescence microendoscopie modalité La modalité haute résolution fluorescence microendoscopie peut être construit par la construction d' une enveloppe de composants 1.0 pouces de diamètre taille, avec un soin particulier apporté à la manipulation du miroir dichroïque, objectif, excitation / les filtres d'émission et lentille de tube. Les surfaces en verre de ces composants doivent être manipulés avec précaution en utilisant du papier de verre. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
2. Assemblée de la Sous-diffuse Modalité réflectance Spectroscopy
Note: Les étapes décrites pour le montage de la spectroscopie de réflectance modalité sous-diffus peuvent être visualisées sur la figure 3.
- Obtenir une source de lumière tungstène-halogène et, en utilisant époxy ou un adhésif puissant, obtenir un Threade 1.0 poucesd 30 mm plaque de cage sur le devant.
- Fixer quatre tiges d'assemblage de la cage 3,0 pouces à la plaque de cage.
- Joindre une traduction de l'axe z monter les tiges d'assemblage de la cage.
- Visser dans un 20X achromatic objectif à la traduction monter l'axe z.
- Construire une fibre plaque d'adaptation xy axe / lentille de conversion de montage assemblage.
- Obtenir une traduction xy axe de montage et une fibre plaque d'adaptation 1.0 pouces.
- Fixer la plaque d'adaptation de la fibre dans le xy axe lentille de traduction de montage.
- Faites glisser le 1.0 adaptateur de fibre pouces / xy-traduction monter ensemble en face de l'objectif.
- Construire l'ensemble de bras de moteur.
- Obtenir le bras moteur en aluminium sur mesure et un SMA plaque d'adaptation de la fibre.
- Visser la plaque d'adaptation de la fibre (avec filetage extérieur) dans le bras moteur d'aluminium (avec un filetage interne).
- Fixer l'aluminium bras moteur adaptateur intégré personnalisé au bras du moteur avec quatre # 4-40 0,5 po. Vis.
- Construire l'ensemble moteur / moteur du logement bras / moteur.
- Obtenir le carter de moteur en aluminium fabriquée sur mesure et le moteur pas à pas 400.
- Aligner les trous de vis sur le moteur pas à pas et le carter du moteur, puis fixer avec quatre # 4-40 vis 0,5 pouces.
- Alimenter la tige du moteur de rotation du moteur pas à pas à travers l'ouverture de l'ensemble de bras moteur et serrer la vis de blocage sur l'adaptateur de bras moteur en aluminium.
- Construire l'ensemble de commutateurs optiques.
- Obtenir le commutateur optique en aluminium sur mesure et trois plaques d'adaptation de la fibre 1.0 pouces.
- Enfiler les plaques d'adaptation dans les trous filetés dans le commutateur optique.
- Fixer l'aluminium commutateur optique têtière sur mesure sur le commutateur optique avec quatre vis # 4-40 0,5 pouces.
- Attacher l'ensemble de boîtier bras moteur / moteur / moteur à l'interrupteur optique en introduisant la tige du moteur de rotation du moteur pas à pas à travers le trou central de la til commutateur optique.
- Obtenir une carte de circuit électrique et de commande de moteur pas à pas, puis placez le pilote de moteur pas à pas à travers la rainure centrale de la planche à pain.
- Observez le schéma de connexion électrique (Figure 3, 2.12) pour le pilote de moteur pas à pas, l' alimentation 12 V, et moteur pas à pas.
- Connectez le pilote de moteur pas à pas, l' alimentation 12 V, et moteur pas à pas tel que spécifié dans le schéma de circuit (figure 3, 2.12) pour achever la construction du commutateur optique motorisé.
- Visser l'optique des composants de commutation et source de lumière tungstène-halogène à un breadboard optique ou table optique à proximité du construit précédemment (Figure 2, 1,24) à haute résolution assemblage fluorescence microendoscopie.
- Attacher une extrémité d'un 550 um, 0,22 NA câble de raccordement à la plaque d'adaptateur de fibre de 1,0 pouces de l'ensemble de bras de moteur.
- Attachez l'autre extrémité de la 550 um, 0,22 NA câble de raccordement à la fibre connecterou du spectromètre USB.
- Vissez les cinq câbles de sonde distale aux 1,0 pouces adaptateur fibre plaques respectives sur l'instrumentation pour terminer la fin de l'imagerie à haute résolution multimodal et sous-spectroscopie de réflectance diffuse de faisceau de fibre microendoscope.
- Visser le câble central 1 mm image diamètre de fibre à la plaque d'adaptateur de fibre de 1,0 pouces mentionnée dans l'étape 1.9.2.
- Visser la plus à gauche 200 um câble de fibre optique multimode à la plaque d'adaptateur de fibre de 1,0 pouces mentionné à l'étape 2.6.
- Visser le câble à fibre multimode 2 nd 200 um à l'extrême gauche adaptateur de fibre de 1,0 pouces fixée à la lampe halogène-tungstène mentionné à l' étape 2.9.2.
- Visser dans le 200 um câble fibre multimode 3 e à la plaque d'adaptateur de fibre 1.0 pouces milieu mentionné à l' étape 2.9.2.
- Vissez le câble 4 e 200 um de fibre multimode à la plaque d'adaptateur de fibre de 1,0 pouces à droite mentionnée à l' étape 2.9.2.
Figure 3:. Assemblée de la spectroscopie de réflectance modalité de sous-diffuse Le sous-diffuse la spectroscopie de réflectance modalité peut être construit en utilisant une lampe halogène-tungstène de base couplé à un objectif pour focaliser la lumière à travers la fibre de distribution 200 um multimode, et un spectromètre. En outre, un commutateur optique motorisé sur mesure peut être construit dans le chemin lampe-fibre spectromètre pour basculer entre chaque SDS. Les enquêteurs en utilisant plusieurs spectromètres d'acquérir de multiples FDS peut contourner le composant optique du commutateur. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.3. Calibrage de la Sous-réflectance diffuse Spectroscopy Modalité
Remarque: Le fétapes uite (section 3) doivent être remplis avant la collecte des données spectrales (section 4).
- Allumez toutes les composantes de l'instrumentation, y compris le 455 nm LED, lampe halogène-tungstène à large bande, appareil photo CMOS, spectromètre USB, moteur pas à pas, et la carte de commande du moteur. Vérifiez que le volet de la lampe halogène-tungstène est ouvert.
- Coupez toute la lumière ambiante.
- Ouvrez le logiciel d'acquisition de données personnalisé.
- Gardez l'équipement en cours d'exécution pendant 30 min pour la lampe atteindre une température appropriée et pour le bruit inhérent du spectromètre à se stabiliser.
- Placer un étalon de réflexion diffuse de 20% à l'intérieur de l'ouverture inférieure du calibrage imprimé 3D dispositif intégré standard personnalisé.
- Placer la sonde à fibre optique à l' intérieur du gauche fente de la coutume, 3D imprimé porte-fibre, le montre la figure 4. La gauche fente fixe la distance perpendiculaire de la sonde pointe de la fibre optique à l'étalon de réflexion à 2,1 mm, ce qui est le opla distance timum dans lequel le signal atteignant le spectromètre est maximisée pour la première SDD de 374 um.
- Régler le commutateur optique motorisé à la position la plus à gauche de telle sorte que le spectromètre est connecté à la première SDD de 374 um.
- Réglez le temps d'intégration de 500 msec. Ce temps d'intégration doit être choisi de manière à ne pas saturer le spectromètre, mais de maintenir un temps d'intégration pratiquement faible.
- Acquérir un spectre, R max, 374μm, en cliquant sur "Acquérir Spectrum" dans le logiciel.
- Fermez le volet de la lampe halogène-tungstène et enregistrer un spectre, R sombre, 374μm, de bruit de fond, en cliquant sur "Acquérir Spectrum" dans le logiciel. Une fois acquis, ouvrir à nouveau l'obturateur.
- Placer la sonde à fibre optique à l' intérieur de la fente à droite de la coutume, 3D imprimé porte-fibre, le montre la figure 4. La fente droite fixe la distance perpendiculaire de la fibre-opointe de la sonde CITP à l'étalon de réflexion à 3,9 mm, ce qui est la distance optimale dans laquelle le signal atteint le spectromètre est maximisée pour la deuxième SDD de 730 um.
- Régler le commutateur optique motorisé à la position centrale de telle sorte que le spectromètre est connecté à la deuxième SDS de 730 um.
- Acquérir un spectre, R max, 730μm, en cliquant sur "Acquérir Spectrum" dans le logiciel.
- Fermez le volet de la lampe halogène-tungstène et enregistrer un spectre, R sombre, 730μm, de bruit de fond, en cliquant sur "Acquérir Spectrum" dans le logiciel.
- Ouvrez le déclencheur à nouveau.
Figure 4:. Calibration de la spectroscopie de réflectance modalité de sous-diffus Pour l' étalonnage pré-expérimentale, la pointe de la sonde à fibre optique doit être placé à différentsles distances perpendiculaires à la norme de réflectance diffuse à 20% en fonction du SDS. Pour atteindre systématiquement ces distances perpendiculaires à travers toutes les expériences, un dispositif standard d'étalonnage a été conçu (section transversale de l' appareil montré en (a)) pour maintenir la sonde à des distances exactes de l'étalon de réflexion diffuse de 20%. Dans cette configuration spécifique de la sonde à fibre optique, lumière de la lampe halogène-tungstène est représenté par le commutateur optique à séparations source-détecteur de (b) 374 um et (c) 730 um (avec bras moteur et du moteur retiré du chemin optique pour plus de clarté). Distances de (d) de 2,1 mm pour les 374 um SDS, et (e) de 3,9 mm pour les 730 um SDS sont nécessaires pour l' étalonnage. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.4. In Vivo données Acquisition et extraction de la propriété optique de la peau humaine
Dans cette section, la technique de microendoscope multimodal sera démontrée sur la peau humaine in vivo.
- Ouvrez le logiciel d'acquisition de données personnalisées et d'ajuster le temps d'intégration du spectromètre en cliquant sur "Temps d'intégration" et réglez de sorte qu'il est le même que lors de l'étalonnage, qui était de 500 msec dans ce cas (étape 3.8).
- Déterminer la surface de la peau dans laquelle l'acquisition de données, qui peuvent différer sur l'application de l'enquêteur. Dans ce cas, la peau fine de l'avant-bras a été choisi comme une démonstration.
- Si la zone de peau contient les cheveux, enlever les poils avec un rasoir stérile à usage unique.
- Obtenir un surligneur jaune standard, qui contient de l'encre pyranine, et légèrement marquer la zone choisie de la peau.
- Allumez le nm LED 455 et fermer l'obturateur à la lampe halogène-tungstène.
- Placer la sonde en contact doux avec la peau.
- Déplacer la sonde aronde sur la zone tachée du tissu pour afficher une haute résolution flux en direct de l'architecture de kératinocytes apical sur la fenêtre de visualisation du logiciel.
- Sélectionnez un temps d'exposition appropriée et le gain, 150 msec et 10 dB de gain dans ce cas, pour éviter saturation de l'image, en cliquant sur "Temps d'exposition" et "Gain", en tapant les valeurs appropriées, puis en cliquant sur "Appliquer les paramètres" dans le logiciel interface.
- Acquérir une image en cliquant sur "Acquérir l'image" dans l'interface du logiciel.
- Tout en gardant la sonde sur le même site d'image, éteindre la LED 455 nm et ouvrir l'obturateur à la lampe halogène-tungstène.
- Régler le commutateur optique motorisé à la position gauche de telle sorte que le spectromètre est connecté à la deuxième SDS de 374 um.
- Acquérir des spectres, R tissu, 374μm, en cliquant sur "Acquérir Spectra" dans l'interface du logiciel.
- Réglez le commutateur optique motorisé à la position moyenne de ces ele spectromètre est relié à la seconde SDS de 730 um.
- Acquérir des spectres, R tissu, 730μm, en cliquant sur "Acquérir Spectra" dans l'interface du logiciel.
- Ouvrez le logiciel de post-traitement personnalisé.
- Exécutez le logiciel de post-traitement en cliquant sur "Exécuter" et sélectionnez l'image de fluorescence à haute résolution, quatre spectres d'étalonnage, et les deux spectres in vivo à partir du dossier dans lequel les données ont été sauvegardées lorsque vous êtes invité par le logiciel.
REMARQUE: Le logiciel personnalisé obtient la vraie réflexion absolue (R abs, 374μm et R abs, 730μm) en utilisant les équations suivantes.
Le code de post-traitement, comme décrit précédemment, calcule une courbe ajustée aux spectres de réflectance diffuse (équations 1 et 2), puis determines paramètres physiologiques des tissus , y compris ([Hb], [Mel], et SaO 2). 11,22,24
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Representative Results
Suite à ce protocole, l'enquêteur d' obtenir une image à haute résolution de mise au point du site de tissu avec le champ de vision (figure 5). Outlines de cellules peut être vu si taché d'encre pyranine d'un surligneur jaune standard, tandis que les noyaux des cellules individuelles peuvent être vus si colorées avec un colorant tel que proflavine. Suite à l' acquisition spectrale, le logiciel de post-traitement utilise une connaissance a priori in vivo la concentration en hémoglobine ([Hb]) et les concentrations de mélanine ([Mel]) 21 pour correspondre à la réflexion des spectres de sous-diffus et déterminer les valeurs de [Hb], [Mel ], et le tissu saturation en oxygène (SaO 2) comme le montre la Figure 5. Le logiciel de post-traitement utilise de larges limites physiologiques ([Hb] = 0-150 mg / ml, [Mel] = 0-30 mg / ml, et SaO 2 = 0-100%) pour ajuster le spectre calibré. 21
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Discussion
L'imagerie à haute résolution multimodal et sous-spectroscopie de réflectance diffuse de faisceau de fibre microendoscope rapportée ici peuvent être optimisés et utilisés par les enquêteurs pour une variété d'applications, y compris endoscopique ou l'utilisation de poche pour les études humaines ou animales. Elle fournit ainsi une méthode souple pour la visualisation des tissus de micro-architecture apicale vivo à côté des mesures de concentration en hémoglobine, la concentration de la mélanine, et la saturation en oxygène du tissu à partir de deux profondeurs de tissu différentes. Cet article décrit les caractéristiques de la sonde à fibre optique, décrit un protocole pour l' assemblage du système d'imagerie à haute résolution et sous-diffus système d'imagerie par réflexion, et montré son application dans des tissus humains in vivo, en utilisant une encre pyranine comme agent de contraste fluorescent pour la visualisation des tissus. D' autres encres, comme proflavine ou fluorescéine, peuvent être utilisés à la place de l' encre pyranine avec l' approbation appropriée. 4-7,11
"> Toute caractéristique de la sonde peut être modifiée à partir de cette conception. Pour la haute résolution fluorescence microendoscopie modalité, le 1 mm image de diamètre de fibre est composée de 50.000 fibres d'âme individuelles avec 4,5 um espacement, résultant en une résolution sub-cellulaire constante spatiale de 4,5 um . les enquêteurs veulent une autre fibre d'image de taille pour obtenir un champ de vision plus ou moins grande peut trouver ces fibres d'image facilement disponibles avec des diamètres compris entre 0,14 et 1,40 mm. une lentille de tube avec une longueur focale de 50 mm a été choisie de telle sorte que le capteur CMOS capturé la pleine 1 mm champ de vision de la fibre d'image. en gardant la constante de l' objectif, ce qui augmente la distance focale de la lentille de tube augmente le grossissement et la fréquence d' échantillonnage mais diminuent champ de vision. 11 Ainsi, le grossissement la lentille d'objectif, la distance focale de la lentille de tube, la taille du capteur d'image, et la taille de la fibre d'image peut et doit être optimisée en fonction des besoins. Enfin, les filtres et une excitation lumineusela source peut être modifié en fonction des spectres d' excitation / d'émission de colorants fluorescents. 07.04 En plus de la modification de la sonde et de haute résolution de la fluorescence microendoscopie l' instrumentation, la spectroscopie de réflectance instrumentation sous-diffuse peut être modifiée.Pour la spectroscopie de réflectance modalité sous-diffus, les différentes fibres multimodes de taille peuvent être utilisés à chaque SDS. fibres plus petit diamètre multimodes seront en mesure de livrer et de recueillir la lumière sur une zone plus petite, mais il est recommandé d'utiliser un réseau de fibres identiquement espacées pour augmenter signal-bruit si des diamètres de fibre inférieure à 200 um sont utilisés. Les enquêteurs analysant la peau ou des tissus buccaux peuvent bénéficier d'une sonde globale plus importante pour augmenter champ de vue et signal-bruit, mais dans les organes lumineux étroits, tels que l'œsophage ou du tractus gastro-intestinal, les enquêteurs devront faire face à des contraintes supplémentaires concernant la taille de la sonde, en particulier pour la compatibilité avec le port de biopsie couventendoscopes ional. 8 Autres composants de spectroscopie qui peuvent être modifiés comprennent la source de lumière à large bande et commutateur optique motorisé. Une lampe halogène-tungstène a été choisi dans ce cas, bien que d' autres sources de lumière peuvent et ont été utilisés dans d' autres études, y compris les lampes et les LED à arc xénon, ce qui peut augmenter le signal à bruit et de temps d'intégration inférieurs. 2,15,20 Le commutateur optique motorisé présenté ici a été construite pour gérer jusqu'à trois SDD, mais peut être modifié pour inclure des entrées plus ou moins. Il convient de noter que le commutateur optique motorisé n'ajoute un composant optique supplémentaire entre la source de lumière à large bande et le spectromètre, le rapport signal sur bruit diminue. Le commutateur peut ne pas être nécessaire pour les enquêteurs avec plusieurs spectromètres qui acquièrent des données simultanément, mais comprenant un composant optique de commutation en fin de compte réduit le coût de l'instrumentation d'environ 3000 $ US par SDS.
La construction de l'instrumentation (
En ce qui concerne le dépannage, les spectres résultant dans des crises pauvres (moyennecent des erreurs de plus de 10% entre les données brutes et les données ajustées) donneront des valeurs fiables pour les paramètres physiologiques trois tissus ([Hb], [Mel], et SaO 2) présentés ici. Fits pauvres sont très probablement le résultat soit le mouvement entre la sonde et le site de la peau lors de l' acquisition de données, des conditions aux limites étroites dans le code de post-traitement, ou peu fiables des valeurs a priori de [Hb] et [Mel]. 11,21,24, 26 des améliorations dans ces trois occurrences d'erreur communes devraient fixer le montage précis des spectres de réflectance sous-diffuse. Ainsi, la collecte des données peut être améliorée en réduisant le temps d'intégration du spectromètre pour réduire les artefacts de mouvement dans les spectres. En outre, les conditions aux limites représentent la gamme des valeurs possibles de sortie de calcul pour [Hb], [Mel], et SaO 2 suivant le post-traitement. Dans ces études, les conditions aux limites sont de 0 à 10 mg / ml pour [Hb], 21,22 0-40 mg / ml pour [Mel], 27,28 et 0 à 100% pour SaO 2,
La principale limitation de cette plate-forme multimodale de microendoscopie de faisceau de fibre d'imagerie et spectroscopie est l'absence d'une modalité d'imagerie à grand champ. La haute résolution par fluorescence microendoscopie modalité a un champ de vision circulaire qui est de 1 mm de diamètre, ce qui rend difficile de balayer rapidement une grande surface de tissu. Une méthode de calcul pour surmonter cette limitation est l'image mosaic, une technique utilisée pour fournir un champ de vision plus large par l' empilement des images micro-échelle adjacentes en une seule grande image map. 10 l' image telle mosaïquage a été précédemment démontré par Prieto et al. pour enquêter sur les caractéristiques de l' image colique. 10 Une la modification de l' instrumentation pour surmonter cette limitation ferait la sonde compatible avec le port de biopsie d'un endoscope classique, tel que la sonde présentée par Parikh et al. , pour étudier néoplasie colorectale. 8 ce dispositif combine les avantages d'un champ de vision à l' échelle avec l' imagerie micro-échelle de haute résolution fluorescence microendoscopie. 8
Dans l' ensemble, cette technique a été démontrée sur vivo la peau humaine et montre la valeur des tissus à haute résolution des images micro-architecture de co-enregistrement avec la concentration sous - jacente de la mélanine, la concentration en hémoglobine et la saturation en oxygène tissulaire (Figure 5). Cette technique peut être utilisée par les chercheurs qui souhaitent étudier le lien entre les anomalies structurelles et fonctionnelles des tissus in vivo, ou des modifications fonctionnelles de tissus d'analyse en l'absence de changements structurels observables. Les études futures étudieront la viabilité de cette technique dans divers états pathologiques épithéliales.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs, Inc. | CM1-DCH | |
| 470 nm Dichroic Mirror (Beam Splitter) | Chroma Corporation | T470lpxr | |
| Cage Assembly Rod, 1.5", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER1.5-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 3.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER3-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 2.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER2-P4 | |
| SM1-Threaded 30 mm Cage Plate | Thorlabs, Inc. | CP02 | |
| SM1 Series Stress-Free Retaining Ring | Thorlabs, Inc. | SM1PRR | |
| SM1 Lens Tube, 1.00" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L10 | |
| Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs, Inc. | KCB1 | |
| 1" UV Enhanced Aluminum Mirror | Thorlabs, Inc. | PF10-03-F01 | |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs, Inc. | SM1Z | |
| 10X Olympus Plan Achromatic Objective | Thorlabs, Inc. | RMS10X | |
| XY Translating Lens Mount | Thorlabs, Inc. | CXY1 | |
| SMA Fiber Adapter Plate with SM1 Thread | Thorlabs, Inc. | SM1SMA | |
| SM1 Lens Tube, 0.50" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L05 | |
| 440/40 Bandpass Filter (Excitation) | Chroma Corporation | ET440/40x | |
| 525/36 Bandpass Filter (Emission) | Chroma Corporation | ET525/36m | |
| Quick Set Epoxy | Loctite | 1395391 | |
| 455 nm LED Light Housing Kit - 3-Watt | LED Supply | ALK-LH-3W-KIT | |
| 1" Achromatic Doublet, f = 50 mm | Thorlabs, Inc. | AC254-050-A | |
| Flea 3 USB Monochrome Camera | Point Grey, Inc. | FL3-U3-32S2M-CS | |
| 0.5" Post Holder, L = 1.5" | Thorlabs, Inc. | PH1.5 | |
| 0.5" Optical Post, L = 4.0" | Thorlabs, Inc. | TR4 | |
| Mounting Base, 1" x 2.3" x 3/8" | Thorlabs, Inc. | BA1S | |
| Long Lifetime Tungsten-Halogen Light Source (Vis-NIR) | Ocean Optics | HL-2000-LL | |
| 20X Olympus Plan Objective | Edmund Optics, Inc. | PLN20X | |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm Adaptor | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Housing | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Stepper Motor - 400 steps/revolution | SparkFun Electronics | ROB-10846 | Multiple suppliers |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch Face-Plate | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Arduino Uno - R3 | SparkFun Electronics | DEV-11021 | Multiple suppliers |
| Electronic Breadboard - Self-Adhesive | SparkFun Electronics | PRT-12002 | Multiple suppliers |
| EasyDriver - Stepper Motor Driver | Sparkfun Electronics | ROB-12779 | |
| 12 V, 229 mA Power Supply | Phihong | PSM03A | Multiple suppliers |
| Enhanced Sensitivity USB Spectrometer (Vis-NIR) | Ocean Optics | USB2000+VIS-NIR-ES | |
| 550 µm, 0.22 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs, Inc. | M37L01 | |
| Custom-Built Fiber-Optic Probe | Myriad Fiber Imaging | N/A | |
| 20% Spectralon Diffuse Reflectance Standard | Labsphere, Inc. | SRS-20-010 | |
| Standard Yellow Highlighter | Sharpie | 25005 | Multiple suppliers, proflavine or fluorescein can be substituted |
References
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