Abstract
最近の繊維束microendoscopy技術は、イメージング技術または分光技術の組み合わせのいずれかを用いてインビボで組織の非侵襲的な分析を可能にします。単一の光プローブにイメージングと分光技術を組み合わせることにより、組織の健康状態のより完全な分析を提供することができます。この記事では、2つの異なる様式は、単一の光プローブに、高解像度蛍光microendoscopy画像と拡散反射分光法を組み合わせています。高分解能蛍光microendoscopyイメージングは、頂端組織のマイクロアーキテクチャを視覚化し、主に質的な技術がために使用される技術である腫瘍性および非腫瘍性組織との間の効果的なリアルタイムの分化を示しました。拡散反射分光法は、局所ヘモグロビン濃度、メラニン濃度、および酸素飽和度を含む組織の生理学的パラメータを抽出することができる技術です。この記事では、仕様rを説明しますインスツルメンテーションを構築し、その後、in vivoでヒトの皮膚上の技術を実証する方法を、光ファイバープローブを構築するためにequired。この作品は、具体的には、頂端皮膚ケラチノサイトは、その関連する生理学的パラメータと同時登録することができ、組織のマイクロアーキテクチャことを明らかにしました。ここで紹介する計測機器や繊維束プローブは、器官系の様々な使用のためのハンドヘルドまたは内視鏡と互換性のあるデバイスのいずれかとして最適化することができます。追加の臨床研究は、異なる上皮疾患状態のためのこの技術の実行可能性をテストするために必要とされます。
Introduction
繊維束microendoscopy技術は、典型的には、イメージング技術または分光技術の組み合わせのいずれかを用いて、インビボ組織に分析する。小サブセルラー解像度で1-3一つのそのようなイメージング技術、高分解能蛍光microendoscopy、缶画像頂端組織のマイクロアーキテクチャ、マイクロスケール視野、プロフラビン、フルオレセイン、またはピラニンインクなどの局所造影剤を使用して。1,3-11このイメージングモダリティは、質的に低いとリアルタイムに罹患し、健康な上皮組織を分化における有望な臨床成績を示しています観察者間変動。8時には、研究者らは、細胞や核の大きさや腺領域として定量的な特徴を抽出するために、高解像度蛍光顕微鏡データを使用しますが、これは組織形態を可視化をターゲットに、主に定性的な手法のまま。1,3,8-一方10、分光技術は、このような拡散反射分光法のような機能的な組織情報を提供し、定量的に、複数の臓器に癌病変を識別する際に臨床成績を約束を示しているに向かって標的化される。2,12-15
したがって、潜在的にモダリティの両方のタイプを組み込んだデバイスが必要であり、さらに、観察者間の変動を減少させる、組織のマイクロアーキテクチャのリアルタイム可視化を維持し、組織の健康状態のより完全な分析を提供します。この目標を達成するために、マルチモーダルプローブベースの機器は、単一の光ファイバープローブ内の2つのモダリティ組み合わせた構築した。高分解能蛍光microendoscopyサブ拡散反射分光法を頂端の定性的な高解像度画像11このメソッド共レジスタ地元のヘモグロビン濃度を含む二つの異なる組織の深さから定量的なスペクトル情報（機能的特性）との組織形態（構造特性）（[HB]）、メラニン濃度（[メル]）、および酸素飽和度（SAO 2）。11,12,16は、この特定のサブ拡散反射分光法様式は、提供するために2つのユニークな組織深度をサンプリングするために2つの光源-検出器の分離（のSDS）を使用し基底膜と下にある組織間質にダウンサンプリングすることで組織の健康のより包括的な画像。11
ファイバープローブは、約50,000 4.5μmの直径の繊維要素、1.1ミリメートルと1.2ミリメートルの全体的なコーティング直径のクラッド径を有する中央1ミリメートル径のイメージファイバで構成されています。イメージファイバは、220ミクロンのクラッド直径が5 200ミクロンの直径の繊維に囲まれています。各200μmのマルチモード光ファイバは、離れてイメージファイバの中心から864ミクロンの中心間距離に位置しています。 200μmのマルチモードファイバの各々が25°離れています。 「ソース」繊維として左端200μmのマルチモードファイバを使用して、追加目μmの「コレクション」繊維として200μmのマルチモードファイバをreeが、この形状は、必ずしも374ミクロンの3中心のSDSを作成し、730ミクロン、1051ミクロン、および1323。ファイバー先端は、一定の繊維間の距離を保つ筒状の金属ケース内に封入されています。円筒状の金属ケースの直径は3mmです。光ファイバープローブの先端部（光ファイバープローブ先端に向かって）は2フィートの長さです。プローブを4フィート全長のために、さらに2フィートである（計装向かって）近位端部6のそれぞれの個々の繊維に分離する。 図1は、光ファイバープローブの表現を示します。
図1：光ファイバープローブ設計光ファイバープローブは、1 1ミリメートル径のイメージファイバと4200μmのマルチモードファイバで構成されています。このこの図は、左端の200ミクロンのマルチモードファイバ（スケールバー≈1ミリメートル）に対する374ののSDSを得るために、プローブ先端で繊維の形状を制約する（a）は、金属製エンドキャップの表現、730、および1051ミクロンを示しています（b）は、繊維が、金属キャップ内に拘束され、ファイバコア、ファイバクラッディング、およびファイバ被覆（スケールバー≈1mm）で示し、（c）は 、繊維の周りに保護ポリアミドシース（スケールバー≈1 mm）と、（D ）金属フィンガーグリップと全ての繊維を含む単一の黒いケーブル（スケールバー≈4ミリメートル）、および（e）プローブ（スケールバー≈4ミリメートルの遠位先端の絵）を有するプローブの完成遠位先端部、。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
このマルチモーダル機器および関連するテクニック他の複合構造/機能の技術はそれが異なるモダリティを組み合わせる存在しないが、QUEは、単一のプローブ内のこれらの様式の第一の組み合わせです。例えば、ハイパースペクトルイメージングは定量的なヘモグロビンおよびメラニン特性を有する広視野イメージングを組み合わせた、17,18、および他の技術は、いくつか例を挙げると19、組織のタンパク質発現の分析を光コヒーレンストモグラフィー（OCT）を組み合わせたものが開発されています。下部消化管および食道内または口腔内で使用するためのハンドヘルドプローブとして、内視鏡の使用など、様々な目的のために最適化することができ、一般的な光ファイバープローブを使用し、コンパクトで簡単に実装する計装セットアップでこの記事を報告そして、外部の皮膚の配置。11,20
この計測器のハードウェアは、拡散反射スペクトルを取得した後、得られたvolumを抽出するために、カスタム・データ収集および後処理コードの両方を必要とします[Hbの]、[メル]、およびSAO 2を含む電子平均組織の生理的パラメータ。カスタムデータ取得コードは、（高分解能蛍光顕微鏡用）カメラから同時に取得し、（拡散反射分光法）分光計を可能にするように構築されました。ドライバは、多くの場合、さまざまなプログラミング言語との統合を可能にするために、メーカーのウェブサイトから入手可能です。カスタム後処理コードがin vivoでの先験的吸収値をインポートする[ヘモグロビン]と[メル] 21、その後スペクトルの近似曲線を作成し、以前に開発された非線形最適化フィッティング処理を採用しています。22近似曲線を最小化することにより構築されています自身と生のスペクトルとの間のχ2値が近似曲線から、最低χ2値。22コードを用いて組織の生理的パラメータ（[ヘモグロビン]、[メル]、およびSAO 2）を決定すること含むように修正することができますそのようなここで使用される外因性のピラニンインクとしてだけでなく、他の発色団から吸収するので、そのターゲットの生理的パラメータは影響を受けません。
このような【のHb]、[メル]、およびSAO 2などの組織の健康の生理学的指標は、治療に対する腫瘍応答の報告として、または局所血管新生および血管形成の指標として用いることができる。高分解能蛍光microendoscopyモダリティ含める14,23ガイドプローブの配置を助け、上皮組織の構造と機能の関係の全体像と研究者を提供します。この記事では、マルチモーダルmicroendoscopeの構築と応用が記載されている。11
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Protocol
施設内倫理委員会の承認（IRB＃15-09-149）は、この研究のすべての側面のためのアーカンソー大学で人体実験プログラムから入手しました。記載の方法は承認されたガイドラインに従って行われ、インフォームドコンセントは、全ての参加者から得ました。
高分解能蛍光Microendoscopyモダリティの1組立
注：高分解能蛍光microendoscopyモダリティのアセンブリのための手順は、 図2に視覚化することができます。
- 30ミリメートルケージキューブの内部に470 nmのダイクロイックミラーを配置します。
- 30ミリメートルケージキューブを取得し、マウントダイクロイックフィルタを削除します。
- マウントダイクロイックフィルタで470 nmのダイクロイックミラーを配置します。
- インサートReおよびケージキューブの内部にバックマウントダイクロイックフィルタを固定します。
- 30ミリメートルのケージキューブにケージアセンブリロッドを取り付けます。
- 確保しますケージキューブの前に4 1.5インチケージアセンブリロッド。
- ケージキューブの右側に4 3.0インチケージアセンブリロッドを固定します。
- ケージキューブの左側に斜めに2 2.0インチケージアセンブリロッドを固定します。
- ケージプレート/レンズチューブアセンブリをビルドします。
- 1.0インチのねじ30ミリメートルケージプレートを取得し、提供スレッドを使用して、ケージプレートの内側にストレスフリーの保持リングを取り付けます。
- ストレスのない保持リングに1.0インチのレンズチューブにネジ。
- 第1.0インチ、1.0インチのレンズチューブに30ミリメートルのケージプレートをネジ付き取り付け、2ケージプレートが同一面になるように、標準的な保持リングを調整します。
- 30ミリメートルのケージキューブの左側に1.0インチケージプレート/レンズチューブアセンブリをスライドさせます。
- マウントアセンブリを直角ミラーを構築します。
- 直角ミラーマウントと1.0インチのUV強化アルミミラーを取得します。
- 1.0株式会社を配置時間UV強化アルミミラーミラーにマウントして締めます。
- マウント鏡の前に4 2.0インチケージアセンブリロッドを固定します
- ケージキューブの右側に斜めに2 2.0インチケージアセンブリロッドを固定します。
- 30mmケージプレートの各開口部を介して対向するケージアセンブリロッドを配置することによって、直角ミラー1.0インチケージプレート/鏡筒組立体の左側にアセンブリマウント接続。
- アセンブリの右側に3.0インチケージアセンブリロッドを介してマウントz軸変換を通します。
- z軸への変換10X色消し対物レンズを取り付けマウント。
- 1.0インチファイバアダプタプレート/ XY軸移動レンズマウントアセンブリビルドします。
- XY軸移動マウントと1.0インチファイバアダプタプレートを取得します。
- XY軸移動レンズマウントに1.0インチのファイバアダプタプレートを固定します。
- スライドトン彼は1.0インチのファイバアダプタ/ XY軸変換レンズ、対物レンズの前に装着してください。
- 2 0.5インチ長く、1.0インチ径のレンズチューブ、1 40分の440 nmのバンドパスフィルター（励起フィルター）と1つの36分の525 nmのバンドパスフィルタ（発光フィルター）を取得します。
- フィルタの外側に矢印が雄ねじと鏡筒の側面に直面しているような、0.5インチ長、1.0インチ径のレンズチューブの内側に各フィルタを配置します。
- アセンブリにフィルターを取り付けます。
- 2標準の保持リングを入手します。
- 標準止め輪と0.5インチ長く、1.0インチ径のレンズチューブ内部のフィルターを固定します。
- 30ミリメートルケージキューブの前面に励起フィルターとレンズチューブにネジとマウント直角ミラーに発光フィルターとレンズチューブにねじ込みます。
- マウント直角ミラーの前面に発光フィルターと0.5インチのレンズチューブにネジ。
- Obtainは2 1.0インチは、30ミリメートルのケージプレートをネジ付きとフィルタを含む0.5インチ長く、1.0インチ径のレンズチューブの前に配置します。
- エポキシまたは強力な接着剤を使用して、励起フィルターに接続されているケージプレートにLED 455nmのを添付してください。
- 1 0.5インチ長く、1.0インチ径のレンズチューブと50ミリメートルの焦点距離1.0インチ色消しチューブレンズを入手します。
- レンズの外側の矢印が外ねじ付きレンズチューブの側面に直面しているようなレンズ鏡筒内部のチューブレンズを配置します。
- アセンブリへのチューブレンズにねじ込みます。
- 1標準の保持リングを入手します。
- 標準の保持リングと0.5インチ長く、1.0インチ径のレンズチューブの内側にレンズを固定します。
- 一番左のケージプレートにチューブレンズと鏡筒を取り付けます。
- チューブレンズを含む0.5インチ長く、1.0インチ径のレンズ鏡筒の前に30ミリメートルのケージプレートを置きます。
- アタッチ 30mmケージプレートの内部にストレスフリーの保持リング。
- ストレスフリーの保持リングとケージプレートにUSB白黒カメラを取り付けます。
- デバイスを搭載する光ポストを構築します。
- 4 0.5インチポストホルダ、4 0.5インチ光学ポスト、および4つの取り付けベースを取得します。
- 0.5インチのポストホルダー内部0.5インチ光学ポストを固定します。
- 架台上に0.5インチのポストホルダーを固定します。
- 30ミリメートルケージキューブの下にあるネジ穴に4つの光学ポストマウントデバイスでのネジは、直角ミラーは、LEDに接続されているケージプレート、およびカメラに接続されたケージプレートをマウントします。
- 高解像度蛍光microendoscopyモダリティの建設を完了するために、光学ブレッドボードや光学テーブルのいずれかに4つの光学ポストマウントデバイスにねじ込みます。
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図2：高解像度蛍光microendoscopyモダリティのアセンブリは、高解像度の蛍光microendoscopyモダリティは、ダイクロイックミラーの処理に取られ、特別な注意を払って、1.0インチ径サイズのコンポーネントのシェルを構築することによって構築することができ、対物レンズ、励起/発光フィルター、およびチューブレンズ。これらの構成要素のガラス面は慎重にレンズペーパーを使用して処理する必要があります。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
サブ拡散反射率分光法モダリティの2組立
注：サブ拡散反射分光モダリティのアセンブリのための手順は、 図3に視覚化することができます。
- エポキシまたは強力な接着剤を使用して、タングステン - ハロゲン光源を入手し、1.0インチthreadeを確保フロントへのD 30ミリメートルケージプレート。
- ケージプレートに4 3.0インチケージアセンブリロッドを固定します。
- ケージアセンブリロッドにマウントz軸変換を取り付けます。
- マウントz軸への変換20X色消し対物レンズにねじ込みます。
- アセンブリをマウントファイバアダプタプレート/ XY軸変換レンズをビルドします。
- XY軸移動マウントと1.0インチのファイバアダプタプレートを取得します。
- XY軸移動レンズマウントにファイバアダプタプレートを固定します。
- 1.0インチのファイバアダプタ/ XY-翻訳は、対物レンズの前にアセンブリをスライドマウント。
- モーターアームアセンブリをビルドします。
- カスタムビルドのアルミモーターアームと1 SMAファイバアダプタプレートを取得します。
- （雌ねじ付き）アルミモーターアームに（雄ねじ付き）ファイバアダプタプレートにねじ込みます。
- 4＃4-40 0.5インチネジでモーターアームにカスタム構築されたアルミモーターアームアダプタを取り付けます。
- モーター/モーターアーム/モータハウジングアセンブリをビルドします。
- カスタム構築されたアルミニウム製モータハウジングと400段階のステッピングモーターを入手します。
- ステッピングモータとモータハウジングのネジ穴をラインアップし、その後4＃4-40 0.5インチのネジで固定します。
- モーターアームアセンブリの開口部を介してステッピングモータの回転運動ロッドをフィードし、アルミモーターアームアダプタの固定ネジを締めます。
- 光スイッチアセンブリをビルドします。
- カスタム構築されたアルミニウム光スイッチと3 1.0インチファイバアダプタプレートを取得します。
- 光スイッチのネジ穴にアダプタープレートを通します。
- 4＃4-40 0.5インチのネジで光スイッチにカスタム構築されたアルミニウム光スイッチのフェースプレートを取り付けます。
- Tの中心孔を介してステッピングモータの回転運動ロッドを供給することにより、光スイッチ、モータ/モータアーム/モータハウジングアセンブリを取り付けます彼の光スイッチ。
- 電気回路基板とステッピングモータドライバを入手して、ブレッドボードの中央溝を横切ってステッピングモータドライバを配置します。
- ステッピングモータドライバのため（ 図3、2.12）、12 V電源、およびステッピングモータの電気的な接続の概略図を観察します。
- 電動光スイッチの構成を完了するための回路図（ 図3、2.12）で指定されたステッピングモータドライバ、12 V電源、ステッピングモータを接続します。
- 光スイッチコンポーネントと以前に構築された （ 図2、1.24）の高分解能蛍光microendoscopyアセンブリ周辺光ブレッドボードや光学テーブルにタングステン-ハロゲン光源にネジ。
- モーターアームアセンブリの1.0インチファイバアダプタプレートに550ミクロンの一端、0.22 NAパッチケーブルを接続します。
- ファイバに0.22 NAパッチケーブル、550ミクロンのもう一方の端を接続しますまたはUSB分析計。
- マルチモーダル高解像度画像とサブ拡散反射分光法繊維束microendoscopeの完了を終了する計測器にそれぞれ1.0インチのファイバーアダプタープレートに5末端プローブケーブルにネジ。
- ステップ1.9.2で述べた1.0インチのファイバーアダプタープレートに中央直径1mmのイメージファイバケーブルにネジ。
- ステップ2.6で述べた1.0インチのファイバアダプタプレートに左端の200ミクロンのマルチモード光ファイバケーブルにねじ込みます。
- ステップ2.9.2で述べたタングステン-ハロゲンランプに取り付けられた左端の1.0インチファイバアダプタに2 回目 200μmのマルチモード光ファイバケーブルにねじ込みます。
- ステップ2.9.2で述べた中央の1.0インチファイバアダプタプレートに3 回目 200μmのマルチモード光ファイバケーブルにねじ込みます。
- ステップ2.9.2で述べた右端の1.0インチファイバアダプタプレートに4 番目の 200μmのマルチモードファイバケーブルにねじ込みます。
図3：サブ拡散反射分光モダリティのアセンブリ 、サブ拡散反射分光モダリティが200μmのマルチモード伝送ファイバと分光器を介して光を集束する対物レンズに結合された基本的なタングステン-ハロゲンランプを用いて構築することができます。また、特注の電動光スイッチは、各SDS切り替えることランプファイバー分光計経路内に構築することができます。複数のSDSから取得するために、複数の分光計を用いて、研究者らは、光スイッチのコンポーネントをバイパスすることができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。サブ拡散反射率分光法モダリティの3キャリブレーション
注：Fをollowing手順（セクション3）は、スペクトルデータ収集（セクション4）の前に完了しなければなりません。
- 455 nmのLED、ブロードバンドタングステン - ハロゲンランプ、CMOSカメラ、USBスペクトロメータ、ステッピングモータ、およびモータ制御ボードを含む計器のすべてのコンポーネント、電源をオンにします。タングステン - ハロゲンランプ上のシャッターが開いていることを確認します。
- すべての周囲の光をオフにします。
- カスタムデータ収集ソフトウェアを開きます。
- 適切な温度に達するまでのランプのための30分間安定させる分光器からの固有のノイズのために実行されている機器を保管してください。
- カスタム構築された、3D印刷校正標準器の底部開口部内側20％拡散反射率標準を置きます。
- カスタムの左端のスロット内部の光ファイバープローブを配置し、3Dは、 図4で実証、ファイバーホルダー印刷。左端のスロットである2.1ミリメートル、で反射率標準に光ファイバープローブの先端から垂直距離を修正しますオペアンプ分光器に到達する信号は、374ミクロンの最初のSDSのために最大化されたtimum距離。
- 分光計は、374ミクロンの最初のSDSに接続されるように、最も左の位置に電動式光スイッチを調整します。
- 500ミリ秒の積分時間を設定します。この積分時間は、分光器を飽和させたが、実質的に低い積分時間を維持しないように選択されなければなりません。
- ソフトウェアで「スペクトルを取得」をクリックすることにより、スペクトル、R maxの、374μmを取得します。
- タングステン-ハロゲンランプのシャッターを閉じ、ソフトウェアで「スペクトルを取得」をクリックすることにより、バックグラウンドノイズのスペクトルは、R 暗い、374μmを記録。取得した後、再びシャッターを開きます。
- カスタムの右端のスロット内部に光ファイバープローブを配置し、3Dは、 図4で実証、ファイバーホルダーをプリント。右端のスロットは繊維-oからの垂直距離を固定します分光器に到達する信号は、730ミクロンの第二SDSのために最大となる最適な距離である3.9ミリメートル、での反射率標準にPTICプローブ先端。
- 分光計は、730ミクロンの第二のSDSに接続されるように、中間位置に電動式光スイッチを調整します。
- ソフトウェアで「スペクトルを取得」をクリックすることにより、スペクトル、R maxの、730μmを取得します。
- タングステン-ハロゲンランプのシャッターを閉じ、ソフトウェアで「スペクトルを取得」をクリックすることにより、バックグラウンドノイズのスペクトルは、R 暗い、730μmを記録。
- もう一度シャッターを開きます。
図4：サブ拡散反射分光モダリティの較正は、予め実験的な較正は、光ファイバープローブの先端は、別に配置されなければなりませんSDSに応じて20％拡散反射標準からの垂直距離。一貫して全ての実験を横切ってこれらの垂直距離を達成するために、キャリブレーション標準デバイス20％、拡散反射率標準から正確な距離にプローブを保持する（（A）に示した装置の断面）を設計しました。この特定の光ファイバープローブのセットアップでは、タングステン-ハロゲンランプからの光は、光源-検出器の分離に光スイッチを介して示されている（B）374ミクロンおよび730ミクロン（光路から除去し、モータ及びモータアームと（C）明瞭にするために）。 （D）2.1 374μmのSDSのためのミリメートル、および（e）3.9ミリメートルの距離730μmのSDSは、キャリブレーションのために必要とされるために。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。インビボデータ Acquisitio 4.ヒト皮膚から、nおよび光学特性の抽出
このセクションでは、マルチモーダルmicroendoscope技術は、in vivoでヒトの皮膚に実証されます。
- カスタムデータ集録ソフトウェアを開き、「積分時間」をクリックすることにより、分光器積分時間を調整し、それはこの場合には（ステップ3.8）で500ミリ秒であった、校正時と同じになるように設定してください。
- 研究者の用途に異なる場合があり、データを取得する皮膚の面積を、決定します。この場合には、前腕の薄い皮膚はデモンストレーションとして選ばれました。
- 皮膚領域は、髪が含まれている場合は、使い捨ての滅菌カミソリで毛を削除します。
- ピラニンインクが含まれている標準的な黄色の蛍光ペンを取得し、軽く選ばれた皮膚領域をマーク。
- 455 nmのLEDをオンにして、タングステン - ハロゲンランプにシャッターを閉じます。
- 皮膚に優しい接触にプローブを配置します。
- プローブAを移動ソフトウェアの覗き窓に頂端ケラチノサイトアーキテクチャのライブ高解像度のフィードを表示するには、組織の染色領域にラウンド。
- ソフトウェアでは、「露出時間」と「ゲイン」をクリックして適切な値を入力し、「設定を適用」をクリックすることで、画像の飽和を回避するために、150ミリ秒この場合の10dBのゲインを適切な露光時間とゲインを選択インタフェース。
- ソフトウェアインターフェイスで」を取得イメージ」をクリックして画像を取得します。
- 同じ画像サイトにプローブを維持しながら、455 nmのLEDをオフにして、タングステン - ハロゲンランプにシャッターを開きます。
- 分光計は、374ミクロンの第二のSDSに接続されるように、左の位置に電動式光スイッチを調整します。
- ソフトウェアインターフェイスの「スペクトルの取得」をクリックすることにより、スペクトル、R 組織、374μmを取得します。
- 中間位置など番目に電動式光スイッチを調整します分光計で730ミクロンの第二のSDSに接続されています。
- ソフトウェアインターフェイスの「スペクトルの取得」をクリックすることにより、スペクトル、R 組織、730μmを取得し ます。
- カスタムポスト処理ソフトウェアを開きます。
- 「ファイル名を指定して実行」をクリックすることにより、後処理ソフトウェアを実行し、ソフトウェアによってプロンプトが表示されたときにデータが保存されたフォルダから高解像度の蛍光画像、4キャリブレーションスペクトル、および2 in vivoでのスペクトルを選択します。
注：カスタムソフトウェアは、以下の式を使用して、真の絶対反射率（R 腹筋、374μmおよびR 腹筋、730μm）を取得します 。
後処理のコードは、前述のように、拡散反射スペクトルに近似曲線を算出する（式1及び2）、次いでDETE（[ヘモグロビン]、[メル]、およびSAO 2）を含む組織の生理的パラメータをrmines。11,22,24
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Representative Results
このプロトコルに続いて、研究者は、全視野（ 図5）を用いて組織部位の合焦点高解像度の画像を取得します。標準的な黄色の蛍光ペンからピラニンインクで染色した場合、このようなプロフラビンなどの染料で染色された場合は、個々の細胞核を見ることができるのに対し、細胞の概要を、見ることができます。スペクトルの取得に続いて、後処理ソフトウェアは、サブ拡散反射スペクトルに適合し、[ヘモグロビン]、[メルための値を決定するためにインビボでヘモグロビン濃度（[Hbの]）及びメラニン濃度（[メル]）21の先験的な知識を使用して]、及び組織酸素飽和度（SAO 2） 図5に示すように、後処理ソフトウェアは、広い生理的境界を使用する（[ヘモグロビン] = 0〜150 mg / mlで、[メル] = 0〜30 mg / mlであり、SAO 2較正されたスペクトルに合わせて= 0~100％）。21
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Discussion
ここで報告マルチモーダル高解像度画像とサブ拡散反射分光法繊維束microendoscopeは、ヒトまたは動物の研究のための内視鏡またはハンドヘルドの使用を含む種々の用途のために研究者によって最適化して使用することができます。従って、ヘモグロビン濃度、メラニン濃度、および2つの異なる組織の深さからの組織酸素飽和度の測定値と一緒に、インビボ頂端組織のマイクロアーキテクチャで可視化する柔軟な方法を提供します。この記事では、蛍光造影剤として、ピラニンインクを用いて、高解像度の撮像システムとサブ拡散反射画像化システムを組み立てるためのプロトコルの概説、およびインビボでのヒト組織におけるその適用を示し、光ファイバープローブの仕様を説明し組織の可視化。プロフラビンまたはフルオレセインなどの他のインクは、適切な承認を得て代わりにピラニンインクを用いることができる。4-7,11
">任意のプローブの機能は、この設計から変更されてもよい。高分解能蛍光microendoscopyモダリティの場合、直径1mmのイメージファイバは、4.5μmでの一定のサブセルラー空間分解能が得られ、4.5μmの間隔で50,000個々のコア繊維から成り0.14と1.40ミリメートル。50ミリメートルの焦点距離チューブレンズの間の直径で容易に入手可能なこれらのイメージファイバーを見つけることができます小さいまたは大きい視野を得るために、異なるサイズのイメージファイバを望む。研究者は、CMOSセンサは、そのように選択しました。イメージファイバから完全な、1mmの視野を捕獲した。チューブレンズの焦点距離を拡大し、サンプリング周波数を増加させるが、視野を減少さ増加、一定の対物レンズを保持する場合。11したがって、の倍率対物レンズ、結像レンズの焦点距離、撮像素子の大きさ、およびイメージファイバ缶の大きさ及び必要に応じて最適化されるべきである。最後に、フィルタ及び励起光光源は、蛍光色素の励起/発光スペクトルに応じて変更することができる。4-7プローブ及び高分解能蛍光microendoscopy計測を変更することに加えて、サブ拡散反射分光計測を修正することができます。サブ拡散反射分光法様式のために、異なる大きさのマルチモードファイバは、各SDSで使用することができます。より小さな直径のマルチモードファイバを提供し、より小さな領域にわたって光を集めることができるようになりますが、繊維径が200μm未満が使用された場合、信号対雑音を増加させるために同一の間隔をあけファイバのアレイを使用することをお勧めします。皮膚または口腔組織を分析する研究者は、研究者らは、プローブサイズに関する追加された制約に直面するだろう、視野および信号対雑音が、このような食道や胃腸管のような狭い発光器官で増加する全体的に大きいプローブから利益を得ることができます特に修道院の生検ポートとの互換性のためにional内視鏡。8その他の分光コンポーネント修正することができる広帯域光源と電動式光スイッチが含まれます。タングステン-ハロゲンランプは、他の光源にすることができるが、この場合、選択された、信号対雑音を増加させ、下側の積分時間よいキセノンアークランプおよびLEDを含む、他の研究で使用されてきた。2,15,20電動式光スイッチは、ここで紹介するカスタム3のSDSまで対応できるように設計されていますが、多かれ少なかれ入力を含むように修飾することができます。電動光スイッチは、信号対雑音比を低下させる、広帯域光源と分光器との間に追加の光学部品を追加しないことに留意すべきです。スイッチは、同時にデータを取得し、複数の分光器と研究者のために必要であるが、光スイッチの部品を含めて最終的にSDSあたりおよそ$ 3,000 USDによって計装コストを削減しないことがあります。
計装の構築（
トラブルシューティングに関しては、スペクトルは貧しいフィットの結果（平均生データとあてはめたデータとの間の10％を超えるパーセント誤差）は（[ヘモグロビン]、[メル]、およびSAO 2）ここで提示3組織の生理学的パラメータの信頼性の低い値が得られます。貧しいフィットは、最も可能性の高いデータ収集時のプローブと皮膚のサイト間の移動、後処理コードの狭い境界条件、または信頼性の低い[ヘモグロビン]の先験的な値と[メル]のいずれかの結果である。11,21,24、これらの3つの一般的なエラーの発生における26の改善は、サブ拡散反射スペクトルの正確なフィッティングを固定する必要があります。したがって、データ収集は、スペクトル内の運動アーチファクトを低減するために分光計の積分時間を減少させることによって改善することができます。さらに、境界条件、後処理下記[ヘモグロビン]、[メル]、およびSAO 2の可能な計算の出力値の範囲を表します。これらの研究では、境界条件は、[ヘモグロビン]のために0-10 mg / mlで、SAO 2 [メル]のための21,22 0-40 mg / mlで、27,28および0から100パーセントでした
このマルチモーダルイメージングと分光繊維束microendoscopyプラットフォームへの主要な制限は、広視野撮像モダリティの欠如です。高分解能蛍光microendoscopyモダリティは急速な組織の大きな領域を走査することが難しく、直径1mmの円形視野を有します。この制限を克服するための一つの計算方法は、画像MOSAありますIckingのは、使用される技術は、単一の、より大きな画像マップに隣接するマイクロスケール画像を積層して、より広い視野を提供する。10このような画像モザイクは、以前プリエトらによって実証された。結腸の画像特徴を調査するために10をアンこの制限を克服するための計器の変更は、このようなパリキらによって提示されたプローブとして、従来の内視鏡の生検ポートを有するプローブの互換性作ることになります。結腸直腸新生物を調査する。8この機能は、広視野の利点を組み合わせました高分解能蛍光microendoscopyのマイクロスケール画像と図8
全体として、この技術は、in vivoでヒトの皮膚に示し、下層のメラニン濃度、ヘモグロビン濃度、および組織酸素飽和度との同時登録高解像度の組織のマイクロアーキテクチャ画像（ 図5）の値を示しました。このTECHNiQueには、 生体内で構造的および機能的組織異常の間のリンクを調査することを望む、または観察可能な構造変化の非存在下での組織機能の変化を分析する研究者によって使用することができます。今後の研究では、様々な上皮疾患状態におけるこの技術の実現可能性を調査します。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs, Inc. | CM1-DCH | |
| 470 nm Dichroic Mirror (Beam Splitter) | Chroma Corporation | T470lpxr | |
| Cage Assembly Rod, 1.5", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER1.5-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 3.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER3-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 2.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER2-P4 | |
| SM1-Threaded 30 mm Cage Plate | Thorlabs, Inc. | CP02 | |
| SM1 Series Stress-Free Retaining Ring | Thorlabs, Inc. | SM1PRR | |
| SM1 Lens Tube, 1.00" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L10 | |
| Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs, Inc. | KCB1 | |
| 1" UV Enhanced Aluminum Mirror | Thorlabs, Inc. | PF10-03-F01 | |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs, Inc. | SM1Z | |
| 10X Olympus Plan Achromatic Objective | Thorlabs, Inc. | RMS10X | |
| XY Translating Lens Mount | Thorlabs, Inc. | CXY1 | |
| SMA Fiber Adapter Plate with SM1 Thread | Thorlabs, Inc. | SM1SMA | |
| SM1 Lens Tube, 0.50" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L05 | |
| 440/40 Bandpass Filter (Excitation) | Chroma Corporation | ET440/40x | |
| 525/36 Bandpass Filter (Emission) | Chroma Corporation | ET525/36m | |
| Quick Set Epoxy | Loctite | 1395391 | |
| 455 nm LED Light Housing Kit - 3-Watt | LED Supply | ALK-LH-3W-KIT | |
| 1" Achromatic Doublet, f = 50 mm | Thorlabs, Inc. | AC254-050-A | |
| Flea 3 USB Monochrome Camera | Point Grey, Inc. | FL3-U3-32S2M-CS | |
| 0.5" Post Holder, L = 1.5" | Thorlabs, Inc. | PH1.5 | |
| 0.5" Optical Post, L = 4.0" | Thorlabs, Inc. | TR4 | |
| Mounting Base, 1" x 2.3" x 3/8" | Thorlabs, Inc. | BA1S | |
| Long Lifetime Tungsten-Halogen Light Source (Vis-NIR) | Ocean Optics | HL-2000-LL | |
| 20X Olympus Plan Objective | Edmund Optics, Inc. | PLN20X | |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm Adaptor | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Housing | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Stepper Motor - 400 steps/revolution | SparkFun Electronics | ROB-10846 | Multiple suppliers |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch Face-Plate | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Arduino Uno - R3 | SparkFun Electronics | DEV-11021 | Multiple suppliers |
| Electronic Breadboard - Self-Adhesive | SparkFun Electronics | PRT-12002 | Multiple suppliers |
| EasyDriver - Stepper Motor Driver | Sparkfun Electronics | ROB-12779 | |
| 12 V, 229 mA Power Supply | Phihong | PSM03A | Multiple suppliers |
| Enhanced Sensitivity USB Spectrometer (Vis-NIR) | Ocean Optics | USB2000+VIS-NIR-ES | |
| 550 µm, 0.22 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs, Inc. | M37L01 | |
| Custom-Built Fiber-Optic Probe | Myriad Fiber Imaging | N/A | |
| 20% Spectralon Diffuse Reflectance Standard | Labsphere, Inc. | SRS-20-010 | |
| Standard Yellow Highlighter | Sharpie | 25005 | Multiple suppliers, proflavine or fluorescein can be substituted |
References
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