Abstract
최근 섬유 다발 microendoscopy 기술 이미징 기술 또는 분광 기술들의 조합을 사용하여 생체 내 조직의 비파괴 분석을 가능하게한다. 하나의 광학 탐침으로 이미징 분광기 기술을 결합하여 조직 상태의보다 완전한 분석을 제공 할 수있다. 이 기사에서는 두 개의 서로 다른 양식은 하나의 광학 프로브로, 고해상도 형광 microendoscopy 이미징 및 확산 반사율 분광학을 결합됩니다. 고해상도 형광 microendoscopy 촬상 주로 질적 기술되지만, 종양 및 비 종양 조직 간의 효율적인 실시간 분화를 보여 주었다, 정점 조직 미세 구조를 시각화하기 위해 사용되는 기술이며. 확산 반사율 스펙트럼은 로컬 헤모글로빈 농도 멜라닌 농도, 산소 포화도를 포함한 조직 생리 학적 파라미터를 추출 할 수있는 기술이다. 이 글은 사양 r에 대해 설명계측을 구축하고 생체 인간의 피부에 기술을 보여줍니다하는 방법, 광섬유 프로브를 구성하는 equired. 이 작품은 조직 마이크로 아키텍처, 특히 혀끝의 피부 각질 세포가, 그와 관련된 생리 학적 매개 변수와 함께 공동 등록 할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 여기에 제시된 수단 및 섬유 다발 프로브 장기 다양한 시스템에서 사용하기위한 핸드 헬드 또는 내시경 호환 장치 중 하나로 최적화 될 수있다. 추가의 임상 연구는 상이한 상피 질환 상태에 대한 이러한 기술의 가능성을 테스트하기 위해 필요하다.
Introduction
섬유 다발 microendoscopy 기술은 일반적으로 영상 기술 또는 분광 기술들의 조합을 사용하여 생체 조직에서 분석한다. 1-3 그러한 영상 법 고해상도 형광 microendoscopy 서브 셀룰러 해상도 이미지 수 혀끝 조직 미세 구조를 소형으로 , 마이크로 시야, 같은 proflavine, 형광, 또는 pyranine 잉크 등의 국소 조영제를 사용. 1,3-11이 영상 양상이 질적으로 저와 함께 실시간으로 질병과 건강 상피 조직을 차별화 임상 성능을 약속 보여 주었다 간 관찰자 변화. 8 때때로, 연구자는 세포 핵 크기 또는 선 곳은 양적 특징을 추출하는 고해상도 형광 현미경 데이터를 사용하지만이 조직 형태를 시각화 대상으로 주로 질적 기술 남아있다. -1,3,8- 트라이 한편 10 분광 기술, 예컨대확산 반사율 분광학으로, 기능 조직의 정보를 제공하고 정량적으로 여러 장기에 암 병변을 확인하는 임상 성능을 약속 보여 주었다 대상으로한다. 2,12-15
따라서, 잠재적으로, 또한 관찰자 간 변이성을 감소 조직 마이크로 아키텍처의 실시간 시각화를 유지하고, 조직 상태의보다 완전한 분석을 제공하는 양식의 두 가지 유형을 포함하는 장치에 대한 필요성이 존재한다. 이 목표를 달성하기 위해, 복합 프로브 기반 장비가 단일 광섬유 프로브 두 가지 양상 결합한 구성 하였다. 고해상도 형광 microendoscopy 및 서브 확산 반사율 스펙트럼을 정점 정성 고해상도의 화상 (11)이 방법의 공동 레지스터 지역 헤모글로빈 농도를 포함하는 두 개의 별개의 조직 깊이에서 양적 스펙트럼 정보 (기능성)와 조직 형태 (구조적 특성) ([HB는), 멜라닌 농도 ([멜), 및 산소 포화도 (SAO 2). 11,12,16이 특정 하위 확산 반사율 스펙트럼 양상이 제공하는 두 개의 고유 한 조직의 깊이를 샘플링하기 위해 두 개의 소스 검출기 분리 (SDS에)를 사용 기저막 및 기본 조직 기질 아래로 샘플링하여 조직의 건강에 대한 포괄적 인 그림. (11)
파이버 프로브는 약 50,000 4.5 ㎛의 직경의 광섬유 요소, 1.1 mm의 클래드 직경 1.2 mm의 전체 코팅 직경 중앙 1mm 직경 화상 섬유로 구성된다. 이미지 섬유는 220 ㎛, 클래딩 직경이 오 200 μm의 직경 섬유로 둘러싸여 있습니다. 각각 200 ㎛의 다중 모드 광섬유는 거리 화상 광섬유의 중심으로부터 864 ㎛의 중심 간 거리에 위치된다. 200 μm의 멀티 모드 섬유를 각각 25 ° 떨어져있다. '소스'섬유와 왼쪽 200 μm의 멀티 모드 광섬유 및 추가 번째를 사용하여은 "컬렉션"섬유로 200 μm의 멀티 모드 섬유를 REE,이 형상은 반드시 374 μm의 세 가지 중심 간 SDS에, 730 μm의, 1051 μm의 및 1323 μm의를 만듭니다. 섬유 팁은 섬유 상수 사이의 거리를 유지하는 원통형 금속 케이스에 동봉되어 있습니다. 통형 케이싱의 직경은 3mm이다. 광섬유 프로브 (광섬유 프로브 팁을 향해) 말단부 2 피트이다. 프로브는 4피트의 전체 길이에 대해, 추가로 2 피트이다 (계측)을 향해 기단에서 여섯 각 개개의 섬유로 분리한다. (1)는 광섬유 프로브의 표현을 나타낸다.
그림 1 :. 광섬유 프로브 설계 광섬유 프로브는 하나의 1mm 직경의 이미지 섬유 사 (200) μm의 멀티 모드 섬유로 구성되어 있습니다. 이그림의 표시를 나타낸다 (a) 금속 단부는 SDS의 374, 730를 수득 프로브 팁에서의 섬유의 형상을 제한 캡과 최 좌측 200 μm의 다중 모드 광섬유에 대하여 (눈금 막대 ≈ 1mm)로 1,051 ㎛의, (b) 섬유는 섬유 코어 광섬유 클래딩 및 섬유 피막 (스케일 바 ≈ 1mm), (c)의 섬유가 보호 아미드 외판 (눈금 막대 ≈ 1mm)을 보여주는 금속 캡 내에 제한되고, (d ) 금속 손잡이 모든 섬유를 포함하는 하나의 블랙 케이블 (눈금 막대 ≈ 4mm) 및 (e) 상기 프로브 (눈금 막대 ≈ 4mm의 원위 팁의 화상)와 프로브의 최종 말단 팁. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 복합 장비 및 관련 TECHNI다른 결합 구조 / 기능 기술이 서로 다른 양식을 결합하여 존재하지만 가야는 단일 프로브 내에서 이러한 양식의 첫 번째 조합입니다. 예를 들어, 하이퍼 스펙트 럴 영상은 몇 가지 이름을 조직 단백질 발현 분석, (19)와 빛 간섭 단층 촬영 (OCT를) 결합 개발 된 정량적 인 헤모글로빈과 멜라닌 속성, 17, 18 및 다른 기술과 넓은 필드 영상을 결합한 제품입니다. 구강에서의 사용을위한 휴대용 프로브 하부 위장관 식도 또는 내시경 사용을 포함하여 다양한 목적에 최적화 될 수있는 일반적인 광섬유 프로브를 사용하여 컴팩트하고 쉬운 구현 계측 설정이 문서 보고서 외부 피부 배치. 11,20
이 기기의 하드웨어는 확산 반사 스펙트럼을 획득 한 후 결과 있습니다 volum를 추출하는 사용자 정의 데이터 수집 및 후 처리 코드가 모두 필요합니다[혈색소], [멜], 및 상 2를 포함하는 전자 평균 조직 생리 학적 매개 변수를 설정합니다. 사용자 정의 데이터 취득 코드 (고해상도 형광 현미경) 카메라로부터의 동시 획득 및 (확산 반사율 스펙트럼의 경우) 분광계 있도록 지어졌다. 드라이버들은 다양한 프로그래밍 언어와의 통합을 허용하는 제조 업체의 웹 사이트에서 사용할 수 있습니다. 사용자 지정 후 처리 코드는 생체 [혈색소]와 [멜] (21)의 사전 흡수 값을 가져 다음 스펙트럼의 장착 곡선을 생성하는 이전에 개발 된 비선형 최적화 피팅 프로세스를 사용합니다. 22 장착 곡선이을 최소화하여 구축 자체 원료 스펙트럼 사이 χ 2 값 피팅 곡선 및 낮은 χ 2 값. 22 코드로 조직 생체 변수 ([헤모글로빈], [멜, 상투 2)을 결정하는 단계를 포함하도록 수정 될 수있다이러한 여기에 사용되는 외인성 pyranine 잉크로 다른 발색단에서 흡수, 그래서 그 대상 생리 학적 매개 변수는 영향을받지 않습니다.
이러한 [헤모글로빈], [멜, 상투이 같은 조직 상태의 생리 지표는 치료 종양 반응보고 또는 로컬 혈관 형성 및 혈관 신생의 지표로서 사용될 수있다. 14,23을 고해상도 형광 microendoscopy 양상 포함 가이드 프로브 배치를 돕고 상피 조직의 구조 및 기능 사이의 관계의 더욱 완전한 그림으로 연구자를 제공한다. 이 기사, 건설 및 복합 microendoscope의 응용 프로그램에 설명되어 있습니다. (11)
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Protocol
임상 시험 심사위원회의 승인 (IRB # 15-09-149)는 본 연구의 모든 측면에 대한 아칸소 대학에서 인간 주제 연구 프로그램에서 얻었다. 기재된 방법은 승인 된 가이드 라인에 따라 수행하고, 동의서 모든 참가자 얻었다.
고해상도 형광 Microendoscopy 양상 1. 총회
주 : 고해상도 형광 microendoscopy 양상의 조립체의 설명 단계는도 2에서 보여 질 수있다.
- 30mm의 케이지 큐브 내부 470 nm의 이색 거울을 배치합니다.
- 30mm의 케이지 큐브를 얻고 다이크로 익 필터가 장착 제거합니다.
- 마운트 다이크로 익 필터에서 470 나노 미터 다이크로 익 미러를 놓습니다.
- 다시 삽입하고, 다이크로 익 필터가 다시 케이지 큐브 내부에 장착 고정합니다.
- 30mm의 케이지 큐브에 케이지 어셈블리로드를 연결합니다.
- 안전한케이지 큐브의 앞에 네 개의 1.5 인치 케이지 어셈블리 봉.
- 케이지 큐브의 오른쪽에 네 개의 3.0 인치 케이지 어셈블리로드를 고정합니다.
- 대각선으로 카 큐브의 좌측 보안 개의 2.0 인치 케이지 어셈블리 봉.
- 케이지 플레이트 / 렌즈 튜브 어셈블리를 구축 할 수 있습니다.
- 1.0 인치 스레드 30mm 케이지 판을 얻고 제공된 나사를 사용하여 케이지 판의 내부에 응력 무료 고정 링을 연결합니다.
- 스트레스없는 고정 링에 1.0 인치 렌즈 튜브에 나사.
- 두 번째 1.0 인치 1.0 인치 렌즈 튜브에 30mm 케이지 플레이트 나사 연결하고 두 케이지 플레이트 높이가되도록 표준 고정 링을 조정합니다.
- 30mm의 케이지 큐브의 좌측에 1.0 인치 케이지 플레이트 / 렌즈 튜브 어셈블리를 밀어 넣습니다.
- 직각 미러 어셈블리 마운트 구축 할 수 있습니다.
- 직각 미러 마운트와 1.0 인치 UV 강화 알루미늄 거울을 얻습니다.
- 1.0 INC 배치시간 마운트 조이 거울 알루미늄 거울 UV는 강화.
- 마운트 미러의 전면에 네 개의 2.0 인치 케이지 어셈블리로드를 고정
- 대각선으로 카 큐브의 오른쪽에 두 개의 2.0 인치 안전 케이지 어셈블리 봉.
- 30mm의 리테이너 플레이트의 각각의 개구부에 대향 케이지 어셈블리 봉 배치하여 직각 미러가 1.0 인치 케이지 플레이트 / 렌즈 튜브 조립체의 왼쪽에 조립 장착 연결한다.
- Z 축 변환 어셈블리의 우측에 3.0 인치 케이지 어셈블리 봉을 장착 쓰레드.
- z 축 번역 마운트에 10 배 무채색 대물 렌즈를 부착합니다.
- 1.0 인치 섬유 어댑터 플레이트 / XY 축 변환 렌즈 어셈블리 마운트 구축 할 수 있습니다.
- XY로 축 번역 탑재하고 1.0 인치 섬유 어댑터 플레이트를 얻습니다.
- XY로 축 변환 렌즈 마운트에 1.0 인치 섬유 어댑터 플레이트를 고정합니다.
- 슬라이드 t그는 1.0 인치 섬유 어댑터 / XY 축 변환 렌즈 대물 렌즈 앞에 어셈블리를 장착합니다.
- 두 개의 0.5 인치 길이, 1.0 인치 직경의 렌즈 튜브, 하나 40분의 440 nm의 대역 통과 필터 (여기 필터)와 하나의 36분의 525 nm의 대역 통과 필터 (방출 필터)을 얻었다.
- 필터의 외부에있는 화살표는 수나사와 렌즈 튜브의 측면에 대향되도록, 0.5 인치의 길이, 1.0 인치 직경의 렌즈 관내 각 필터를 배치했다.
- 어셈블리에 필터를 부착합니다.
- 이 표준 고정 고리를 얻습니다.
- 표준 고정 고리와 0.5 인치 길이, 1.0 인치 직경 렌즈 튜브 내부에 필터를 고정합니다.
- 30mm의 입방체 케이지의 전면에 상기 여기 필터는 렌즈 튜브 스크류 및 직각 미러 마운트에게로 배출 필터는 렌즈 튜브에 나사.
- 직각 미러 마운트를 전면에 발광 필터 0.5 인치 렌즈 튜브 스크류.
- ObtaiN 개의 1.0 인치 30mm 케이지 판을 나사 및 필터를 포함하고 0.5 인치의 길이, 1.0 인치 직경의 렌즈 튜브 전면에 배치.
- 에폭시 또는 강력한 접착제를 사용하여 상기 여기 필터에 접속 케이지 플레이트 LED 내지 455 첨부.
- 하나의 0.5 인치 길이, 1.0 인치 직경의 렌즈 튜브와 50mm의 초점 거리를 가진 1.0 인치 무채색 이중 튜브 렌즈를 얻습니다.
- 렌즈의 외부에있는 화살표는 수나사와 렌즈 튜브의 측면에 대향되도록 상기 렌즈 튜브 내부 튜브 렌즈를 놓는다.
- 어셈블리에 튜브 렌즈에 나사.
- 하나의 표준 고정 링을 얻습니다.
- 표준 고정 링과 0.5 인치의 길이, 1.0 인치 직경의 렌즈 튜브 내부의 렌즈를 고정.
- 가장 왼쪽 케이지 플레이트에 튜브 렌즈와 렌즈 튜브를 연결합니다.
- 튜브 렌즈를 포함하고 0.5 인치의 길이, 1.0 인치 직경의 렌즈 튜브 앞의 30mm 케이지 플레이트를 놓는다.
- 첨부합니다 30mm의 케이지 판의 내부에 응력 무료 고정 링.
- 스트레스 무료 고정 링과 케이지 플레이트에 USB 흑백 카메라를 연결합니다.
- 광학 포스트 장착 장치를 구축합니다.
- 네 개의 0.5 인치 포스트 홀더, 네 개의 0.5 인치 광 게시물, 4 장착 기지를 얻습니다.
- 0.5 인치 포스트 홀더 내부에 0.5 인치 광 게시물을 고정합니다.
- 장착베이스에 0.5 인치 포스트 홀더를 고정합니다.
- 30mm의 케이지 큐브 아래에있는 나사 구멍에 네 개의 광학 포스트 장착 장치의 나사는 직각 미러는 LED에 연결된 케이지 플레이트 및 카메라에 연결 케이지 플레이트를 탑재합니다.
- 네의 고해상도 형광 microendoscopy 양상의 건설을 완료 광학 브레드 보드 또는 광학 테이블 중 하나에 장치를 장착 광학 게시물을 조입니다.
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그림 2. 고해상도 형광 microendoscopy 양상의 조립체 고해상도 형광 microendoscopy 양상은 다이크로 익 미러 운반 촬영 특별한주의와, 1.0 인치 직경의 크기 성분 쉘을 구축하여 구성 될 수 있으며, 대물 렌즈와, 여진 / 방사 필터 및 튜브 렌즈. 이러한 구성 요소의 유리 표면을 조심스럽게 렌즈 용지를 사용하여 처리해야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
하위 확산 반사율 분광학 양상 2. 총회
참고 : 하위 확산 반사율 분광 양상의 조립에 대한 설명 단계는 그림 3에 가시화 될 수있다.
- 에폭시 또는 강한 접착제를 사용, 텅스텐 할로겐 광원을 획득하고, 1.0 인치 threade을 확보전면 상에 D 30mm 케이지 플레이트.
- 케이지 판에 네 개의 3.0 인치 케이지 어셈블리로드를 고정합니다.
- Z 축 번역 케이지 어셈블리로드에 장착 연결합니다.
- Z 축 변환 마운트를 무채색으로 20X 대물 렌즈 스크류.
- 섬유 어댑터 플레이트 / XY 축 변환 렌즈 어셈블리 마운트 구축 할 수 있습니다.
- XY로 축 번역 탑재하고 1.0 인치 섬유 어댑터 플레이트를 얻습니다.
- XY로 축 변환 렌즈 마운트로 섬유 어댑터 플레이트를 고정합니다.
- 1.0 인치 섬유 어댑터 / XY-번역 대물 렌즈 앞에 어셈블리를 장착 밀어 넣습니다.
- 모터 암 어셈블리를 빌드합니다.
- 맞춤 제작 된 알루미늄 모터 팔과 하나 SMA 섬유 어댑터 플레이트를 얻습니다.
- (내부 스레딩과) 알루미늄 모터 팔에 (외부 스레딩) 섬유 어댑터 플레이트에 나사.
- 네 개의 # 4-40 0.5 인치 나사 모터 암에 대한 맞춤형 알루미늄 모터 암 어댑터를 연결합니다.
- 모터 / 모터 팔 / 모터 하우징 어셈블리를 빌드합니다.
- 맞춤 제작 된 알루미늄 모터 하우징 및 400 단계 스테퍼 모터를 얻습니다.
- 다음 나사 스테퍼 모터와 모터 하우징에 구멍까지 선 사 # 4-40 0.5 인치 나사로 고정합니다.
- 모터 아암 조립체의 개구를 통해 스텝 모터의 회전 운동 막대 피드 및 알루미늄 모터 아암 어댑터의 잠금 나사를 조인다.
- 광 스위치 어셈블리를 빌드합니다.
- 맞춤 제작 된 알루미늄 광 스위치와 세 개의 1.0 인치 섬유 어댑터 플레이트를 얻습니다.
- 광 스위치의 나사 구멍에 어댑터 플레이트 스레드.
- 네 개의 # 4-40 0.5 인치 나사 광 스위치에 맞춤 제작 된 알루미늄 광 스위치 페이스 플레이트를 연결합니다.
- t의 중앙 홀을 통해 스테핑 모터의 회전 운동로드를 공급하여 상기 광 스위치는 모터 / 모터 ARM / 모터 하우징 어셈블리를 부착그는 광 스위치.
- 전기 회로 보드 및 스텝퍼 모터 드라이버를 구하여 브레드 보드의 중앙 홈에 걸쳐 스텝퍼 모터 드라이버를 배치했다.
- 스텝 모터 드라이버 (그림 3, 2.12), 12 V 전원 공급 장치 및 스테퍼 모터의 전기 연결 회로도를 관찰한다.
- 전동 광 스위치의 구성을 완료 회로도 (그림 3, 2.12)에 규정 된 스테퍼 모터 드라이버, 12 V 전원 공급 장치 및 스테퍼 모터를 연결합니다.
- 이전에 구축 근처 광학 브레드 보드 또는 광학 테이블 (그림 2, 1.24) 고해상도 형광 microendoscopy 어셈블리에 스위치 구성 요소 및 텅스텐 할로겐 광원 광에 나사.
- 550 μm의의 한쪽 끝, 모터 암 어셈블리의 1.0 인치 섬유 어댑터 플레이트에 0.22 NA 패치 케이블을 연결합니다.
- 550 μm의의 다른 쪽 끝을 연결합니다, 섬유에 0.22 NA 패치 케이블 연결또는 USB 분광계.
- 멀티 모달 고해상도 이미징 및 서브 확산 반사율 분광 섬유 다발 microendoscope의 완료를 완료 계측에 각각 1.0 인치 섬유 어댑터 플레이트에 다섯 말단 프로브 케이블에 나사.
- 단계 1.9.2에서 언급 한 1.0 인치 섬유 어댑터 플레이트 중앙 1mm 직경의 이미지 광섬유 케이블에 나사.
- 단계 2.6에서 언급 한 1.0 인치 섬유 어댑터 플레이트에 왼쪽 200 μm의 다중 모드 광섬유 케이블을 조입니다.
- 단계 2.9.2에서 언급 된 텅스텐 - 할로겐 램프에 부착 된 1.0 인치의 가장 왼쪽 광섬유 어댑터 2 차 200 μm의 다중 모드 광섬유 케이블 스크류.
- 단계 2.9.2에서 언급 한 중간 1.0 인치 섬유 어댑터 플레이트에 3 차 200 μm의 다중 모드 광섬유 케이블을 조입니다.
- 단계 2.9.2에서 언급 한 오른쪽 1.0 인치 섬유 어댑터 판에 4 일 200 μm의 다중 모드 광섬유 케이블을 조입니다.
도 3. 서브 확산 반사율 스펙트럼 양상 조립 서브 확산 반사율 스펙트럼 양상은 200 μm의 다중 전송 광섬유를 통해 광을 집중시키는 대물 렌즈에 결합 염기성 텅스텐 - 할로겐 램프를 이용하여 구성하고, 분광기 수있다. 또한, 맞춤형 전동 광 스위치는 각 SDS 사이를 전환 할 수 램프 섬유 분광계 경로 내에서 구성 될 수있다. 광 스위치 구성 요소를 무시할 수있는 여러 SDS에에서 취득하기 위해 여러 분석기를 사용하여 조사자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.하위 확산 반사율 분광학 물리 요법 3. 교정
주 : F를따르게 단계 (섹션 3) 스펙트럼 데이터 수집 (4 절) 이전에 완료해야합니다.
- 455 LED 나노, 광대역 텅스텐 - 할로겐 램프, CMOS 카메라, USB 분석기, 스테퍼 모터 및 모터 제어 보드를 포함한 장비의 모든 구성 요소를 켭니다. 텅스텐 할로겐 램프에 셔터가 열려 있는지 확인합니다.
- 모든 주변 광을 끕니다.
- 사용자 정의 데이터 수집 소프트웨어를 엽니 다.
- 적절한 온도에 도달 램프 30 분 동안 안정 분광계에서 고유의 잡음에 출마 장비를 유지합니다.
- 사용자 정의 내장, 3D 인쇄 교정 표준 장치의 바닥 개구부 내부의 20 % 확산 반사율 표준을 놓습니다.
- 사용자 지정의 가장 왼쪽 슬롯 내부의 광섬유 프로브를 배치, 3D 그림 4에서 보여, 섬유 홀더 인쇄. 맨 왼쪽 슬롯이 2.1 mm에서 반사율 표준 광섬유 프로브 팁의 수직 거리를 해결 연산timum 거리는하는 분광계에 도달하는 신호가 374 ㎛ 인 제 SDS 최대화된다.
- 분광계는 374 ㎛ 인 제 SDS 접속되도록 가장 왼쪽에 위치하는 전동 광 스위치를 조정한다.
- 500 밀리 초에 통합 시간을 설정합니다. 분광계를 포화하지만, 실질적으로 낮은 통합 시간을 유지하지로 이러한 통합 시간을 선택해야합니다.
- 소프트웨어에서 "스펙트럼 획득"을 클릭하여 스펙트럼, R 최대, 374μm를 획득.
- 소프트웨어에서 "스펙트럼 획득"을 클릭하여 배경 소음, 374μm를 텅스텐 할로겐 램프에 셔터를 닫고 스펙트럼, R 어두운을 기록합니다. 인수 후, 다시 한 번 셔터를 엽니 다.
- 사용자 지정의 오른쪽 슬롯 내부의 광섬유 프로브를 배치, 3D 그림 4에서 보여, 섬유 홀더 인쇄. 가장 오른쪽 슬롯이 섬유 - 오의 수직 거리를 해결분광계에 도달하는 신호가 730 ㎛ 인 제 SDS 최대화하는 최적의 거리를 3.9 mm의 반사율 규격에 PTIC 탐침.
- 분광계는 730 ㎛ 인 제 SDS에 연결되도록 상기 중간 위치까지 모터의 광 스위치를 조정한다.
- 소프트웨어에서 "스펙트럼 획득"을 클릭하여 스펙트럼, R 최대, 730μm를 획득.
- 소프트웨어에서 "스펙트럼 획득"을 클릭하여 배경 소음, 730μm를 텅스텐 할로겐 램프에 셔터를 닫고 스펙트럼, R 어두운을 기록합니다.
- 다시 한 번 셔터를 엽니 다.
도 4 :. 서브 확산 반사율 스펙트럼 양상 교정 미리 실험적 교정, 광섬유 탐침은 상이한 배치해야SDS에 따라 20 %의 확산 반사율을 기준으로 수직 거리. 일관 모든 실험 전반에서 수직 거리를 달성하기 위해, 교정 표준 장치는 20 % 확산 반사율 표준에서 정확한 거리에서의 프로브를 보유하는 ((a)에 도시 된 장치의 단면)을 설계 하였다. 이러한 특정 광섬유 프로브 설정에서, 텅스텐 - 할로겐 램프의 광 소스 검출기 분리의 광 스위치를 통해 도시되어있다 (b) 374 ㎛ 내지 730 ㎛의 (광로로부터 제거 모터와 모터 팔 (c) 명확성을 위해). (라)의 거리 2.1 374 μm의 SDS에 대한 mm, 및 (e) 730 μm의 SDS가 교정에 필요한 3.9 mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.생체 데이터 Acquisitio 4.인간의 피부에서 n 및 광학 속성 추출
이 섹션에서 복합 microendoscope 기술은 생체 내 인간의 피부에 입증 될 것입니다.
- 사용자 정의 데이터 수집 소프트웨어를 열고 "통합 시간"을 클릭하여 분광계 통합 시간을 조정하고이 경우 (단계 3.8)에서 500 밀리이었다 교정,시와 동일하도록 설정합니다.
- 연구자의 응용 프로그램에 다를 수 있습니다 데이터를 획득하는 피부의 영역을 결정합니다. 이 경우, 팔뚝의 얇은 피부는 데모로 선택되었다.
- 피부 영역이 머리를 포함하는 경우, 일회용 멸균 면도기로 머리를 제거합니다.
- pyranine 잉크를 포함하는 표준 노란색 형광펜을 획득, 가볍게 선택된 피부 영역을 표시합니다.
- 455 나노 LED를 켜고 텅스텐 - 할로겐 램프에 셔터를 닫습니다.
- 피부에 부드러운 접촉 프로브를 놓습니다.
- 프로브 a를 이동조직 염색 영역 라운드 소프트웨어의 뷰잉 윈도우에 정점 각질 구조의 실시간 고해상도 공급을보십시오.
- 소프트웨어에서, "노출 시간"과 "확보"를 클릭 적절한 값을 입력 한 다음 "설정 적용"을 클릭하여 이미지의 채도를 피하기 위해 150 밀리이 경우 10 dB 이득을 적절한 노출 시간과 이득을 선택 인터페이스.
- 소프트웨어 인터페이스에서 "획득 이미지"를 클릭하여 이미지를 획득.
- 동일한 이미지 사이트에서 프로브를 유지하는 동안, 455 나노 LED를 끄고 텅스텐 - 할로겐 램프에 셔터를 엽니 다.
- 분광계는 374 ㎛ 인 제 SDS 연결되도록 좌측 위치로 동력 광 스위치를 조정한다.
- 소프트웨어 인터페이스에서 "스펙트럼 획득"을 클릭하여, 스펙트럼, R 조직, 374μm 획득.
- 중간 위치 등의 일에 동력 광 스위치를 조정분광계에서 730 ㎛ 인 제 SDS에 접속된다.
- 소프트웨어 인터페이스에서 "스펙트럼 획득"을 클릭하여, 스펙트럼, R 조직, 730μm 획득.
- 사용자 지정 후 처리 소프트웨어를 엽니 다.
- 소프트웨어에서 메시지가 표시되면 데이터가 저장된 폴더에서 두 개의 생체 스펙트럼 "실행"을 클릭하여 후 처리 소프트웨어를 실행하고 고해상도 형광 이미지, 네 교정 스펙트럼을 선택합니다.
참고 : 사용자 지정 소프트웨어는 다음 방정식을 사용하여 진정한 절대 반사율 (R 복근, 374μm 및 R 복근, 730μm)를 가져옵니다.
후 처리 코드는, 전술 한 바와 같이, 확산 반사율 스펙트럼에 대한 피팅 곡선을 계산한다 (수학 식 1과 2) 다음 DETE([혈색소], [멜, 상투 2)를 포함하여 조직의 생리 학적 파라미터를 rmines. 11,22,24
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Representative Results
이 프로토콜에 따라, 연구자는 뷰의 전체 필드 (도 5)로 조직 부위의 포커스에 고해상도 이미지를 얻을 것이다. 표준 노란색 형광펜에서 pyranine 잉크로 염색하는 경우 등 proflavine 등의 염료로 염색하는 경우 각각의 세포 핵을 볼 수있는 반면, 세포의 개요는, 볼 수 있습니다. 스펙트럼 수집 후, 후 처리 소프트웨어 서브 확산 반사율 스펙트럼을 맞고 [헤모글로빈], [멜 값을 결정하기 위해 생체 내에서 헤모글로빈 농도 ([헤모글로빈]) 및 멜라닌 농도 ([멜]) (21)의 선험적 지식을 사용하여 , 조직 산소 포화도도 5에 도시 된 바와 같이 (상 2). 사후 프로세싱 소프트웨어는 다양한 생리적 범위를 사용하여 ([헤모글로빈 = 0-150 ㎎ / ㎖ [멜 = 0-30 ㎎ / ㎖, 상투 2 = 0 ~ 100 %)는 캘리브레이션 스펙트럼에 맞게. 21
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Discussion
멀티 모달 고해상도 이미지 및 여기에보고 서브 확산 반사율 스펙트럼 섬유 다발 microendoscope 최적화 인간 또는 동물 연구 내시경 또는 휴대용 사용을 포함하여 다양한 용도 연구자에 의해 사용될 수있다. 그것은 따라서 두 개의 서로 다른 조직 깊이에서 헤모글로빈 농도, 멜라닌 농도, 조직의 산소 포화도 측정과 함께 생체 내 혀끝의 조직 마이크로 아키텍처의 시각화를위한 유연한 방법을 제공한다. 이 문서를위한 형광 조영제로 pyranine 잉크를 사용하여 고해상도 영상 시스템 및 서브 확산 반사율 이미징 시스템을 조립하기위한 프로토콜을 설명하고, 생체 내에서 인간 조직에서의 응용 프로그램을 나타내는, 광섬유 프로브에 대한 규격을 조직 시각화. 이러한 proflavine 또는 형광 같은 다른 잉크는, 대신에 적절한 승인을 pyranine 잉크를 사용할 수 있습니다. 4-7,11
"> 상관 프로브 기능이 설계에서 변경 될 수있다. 고해상도 형광 microendoscopy 양상 들어 1mm 직경 화상 섬유는 4.5 μm의 일정한 서브 셀룰러 공간 해상도의 결과 4.5 ㎛의 간격으로 50,000 개별 코어 섬유 이루어져 0.14 및 1.40 mm. 50mm의 초점 거리와 튜브 렌즈 사이 직경 쉽게 이용할 이러한 화상 섬유를 찾을 수있는 더 작은 또는 더 큰 시야를 얻기 위해 서로 다른 크기의 화상 광을 원하는. 조사자는 CMOS 센서가되도록 선택 하였다 전체 1mm 시야 화상 섬유로 캡처. 배율의 샘플링 주파수를 증가하지만 시야를 감소 튜브 렌즈의 초점 길이를 증가시키는 대물 렌즈를 일정하게 유지하는 경우. (11) 이와 같이, 배율 대물 렌즈, 초점 렌즈 튜브의 길이, 이미지 센서의 크기 및 화상 섬유의 크기 및 필요에 따라 최적화되어야 할 수있다. 마지막으로, 필터 및 광 여진소스 형광 염료의 여기 / 발광 스펙트럼에 따라 변경 될 수있다. 4-7 프로브 고해상도 형광 microendoscopy 계측 수정에 더하여, 서브 확산 반사율 분광 계측 변형 될 수있다.서브 확산 반사율 스펙트럼 양상 들어, 다른 크기의 다중 모드 섬유는 각각 SDS에서 사용될 수있다. 작은 직경의 다중 모드 섬유를 제공하고 더 작은 영역에 걸쳐 빛을 수집 할 수 있지만 섬유 직경 미만 ~ 200㎛를 사용하는 경우, 신호 - 대 - 잡음을 증가 동일하게 이격 된 섬유의 배열을 사용하는 것이 권장된다. 피부 나 구강 조직을 분석하는 연구자는 연구자가 프로브 크기에 대한 추가 제한에 직면하게 될 것이다, 시야 및 신호 대 잡음 있지만, 이러한 식도 나 위장 등의 좁은 발광 기관, 증가하는 전반적인 큰 프로브 혜택을 누릴 수 있습니다 특히 수도원의 생검 포트와 호환내시경하는 ional. 변형 될 수있다 (8) 기타 분광 요소는 광대역 광원 및 동력 광 스위치를 포함한다. 다른 광원이 신호 - 대 - 잡음 및 하부 적분 시간을 증가시킬 수 크세논 아크 램프 및 LED를 포함하여 다른 연구에 사용 된 수 있지만, 텅스텐 할로겐 램프,이 경우에 선택되었다. 2,15,20 전동 광 스위치는 여기에 제시된 정의는 SDS 세까지 처리하도록 제작되었지만, 더 많거나 적은 입력을 포함하도록 변형 될 수있다. 이는 동력의 광 스위치는 신호 - 대 - 잡음 감소, 광대역 광원 및 분석 장치 사이에 부가적인 광학 구성 요소를 추가 않는 것을 주목해야한다. 스위치는 데이터를 동시에 획득 여러 분석기와 수사관을 위해 필요하지만, 광 스위치 구성 요소를 포함하는 것은 궁극적으로 SDS 당 약 $ 3,000 USD에 의해 계측 비용을 절감하지 않을 수 있습니다.
계측의 건설 (
문제 해결에 관해서, 스펙트럼이 좋지 맞는 결과 (평균퍼센트 에러 원시 데이터와 끼워 데이터 간의 10 % 이상)이 세 조직의 생리 학적 파라미터에 대한 신뢰 값을 산출 할 것이다 ([헤모글로빈], [멜, 상투 2) 여기서 제시. 불량 맞는 데이터 수집 동안 프로브 피부 부위 사이에 움직임 하나의 가능성이 가장 높은 결과, 후 처리 코드 또는 [헤모글로빈] 및 [멜]. 11,21,24의 신뢰할 선험적 값 좁은 경계 조건, 이 세 가지 일반적인 오류 발생 26 개선 서브 확산 반사 스펙트럼의 정확한 피팅을 수정해야합니다. 따라서, 데이터 수집 스펙트럼 내의 움직임 아티팩트를 감소시키기 위해 분광계 통합 시간을 줄임으로써 개선 될 수있다. 또한, 경계 조건 후가공 다음 [헤모글로빈], [멜, 상투이 가능한 연산 출력 값의 범위를 나타낸다. 이 연구에서, 경계 조건, [혈색소]의 0 ~ 10 ㎎ / ㎖, 상 2 [멜]의 21, 22 0-40 ㎎ / ㎖, 27, 28 및 0 ~ 100 %이었다
이 복합 영상 및 분광 섬유 번들 microendoscopy 플랫폼에 기본 제한은 위드 이미징 양상의 부족이다. 고해상도 형광 microendoscopy 양상 빠르게 조직의 넓은 영역을 검사하는 것이 어려워, 직경 1mm 인 원형의 시야를 갖는다. 이러한 한계를 극복하기위한 한 계산 방법은 화상이다 MOSAicking는 사용되는 기술은 하나의 큰 이미지 맵에 인접하는 마이크로 스케일 이미지를 적층하여 넓은 시야를 제공한다. (10) 이와 같은 화상 모자이 이전 데이비스 등에 의해 입증되었다. 대장 화상 특징을 조사하기 위해. 10 이러한 한계를 극복하기 위해 계측 변형은 Parikh 등에 의해 제공되는 프로브로서, 종래 내시경의 생검 포트 프로브가 대응하게된다. 대장 종양을 조사. 팔이 기능은 넓은 시야의 장점을 결합한 고해상도 형광 microendoscopy 마이크로 스케일 이미징. 8
전반적으로,이 방법은 생체 내에서 인간 피부 및 여기서 설명하는 기본 멜라닌 농축, 헤모글로빈 농도, 조직 산소 포화도 (도 5)와 협력 가입 고해상도 조직 마이크로 아키텍처 이미지의 값을 표시 하였다. 이 TECHN개새끼는 관찰 구조적 변화가 없을 때 생체 내에서 구조적 및 기능적 비정상 조직 간의 링크 또는 해석 조직 기능의 변화를 조사하고자하는 연구에 의해 사용될 수있다. 앞으로의 연구는 다양한 상피 질병 상태에서이 기술의 가능성을 조사 할 것입니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs, Inc. | CM1-DCH | |
| 470 nm Dichroic Mirror (Beam Splitter) | Chroma Corporation | T470lpxr | |
| Cage Assembly Rod, 1.5", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER1.5-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 3.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER3-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 2.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER2-P4 | |
| SM1-Threaded 30 mm Cage Plate | Thorlabs, Inc. | CP02 | |
| SM1 Series Stress-Free Retaining Ring | Thorlabs, Inc. | SM1PRR | |
| SM1 Lens Tube, 1.00" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L10 | |
| Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs, Inc. | KCB1 | |
| 1" UV Enhanced Aluminum Mirror | Thorlabs, Inc. | PF10-03-F01 | |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs, Inc. | SM1Z | |
| 10X Olympus Plan Achromatic Objective | Thorlabs, Inc. | RMS10X | |
| XY Translating Lens Mount | Thorlabs, Inc. | CXY1 | |
| SMA Fiber Adapter Plate with SM1 Thread | Thorlabs, Inc. | SM1SMA | |
| SM1 Lens Tube, 0.50" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L05 | |
| 440/40 Bandpass Filter (Excitation) | Chroma Corporation | ET440/40x | |
| 525/36 Bandpass Filter (Emission) | Chroma Corporation | ET525/36m | |
| Quick Set Epoxy | Loctite | 1395391 | |
| 455 nm LED Light Housing Kit - 3-Watt | LED Supply | ALK-LH-3W-KIT | |
| 1" Achromatic Doublet, f = 50 mm | Thorlabs, Inc. | AC254-050-A | |
| Flea 3 USB Monochrome Camera | Point Grey, Inc. | FL3-U3-32S2M-CS | |
| 0.5" Post Holder, L = 1.5" | Thorlabs, Inc. | PH1.5 | |
| 0.5" Optical Post, L = 4.0" | Thorlabs, Inc. | TR4 | |
| Mounting Base, 1" x 2.3" x 3/8" | Thorlabs, Inc. | BA1S | |
| Long Lifetime Tungsten-Halogen Light Source (Vis-NIR) | Ocean Optics | HL-2000-LL | |
| 20X Olympus Plan Objective | Edmund Optics, Inc. | PLN20X | |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm Adaptor | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Housing | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Stepper Motor - 400 steps/revolution | SparkFun Electronics | ROB-10846 | Multiple suppliers |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch Face-Plate | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Arduino Uno - R3 | SparkFun Electronics | DEV-11021 | Multiple suppliers |
| Electronic Breadboard - Self-Adhesive | SparkFun Electronics | PRT-12002 | Multiple suppliers |
| EasyDriver - Stepper Motor Driver | Sparkfun Electronics | ROB-12779 | |
| 12 V, 229 mA Power Supply | Phihong | PSM03A | Multiple suppliers |
| Enhanced Sensitivity USB Spectrometer (Vis-NIR) | Ocean Optics | USB2000+VIS-NIR-ES | |
| 550 µm, 0.22 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs, Inc. | M37L01 | |
| Custom-Built Fiber-Optic Probe | Myriad Fiber Imaging | N/A | |
| 20% Spectralon Diffuse Reflectance Standard | Labsphere, Inc. | SRS-20-010 | |
| Standard Yellow Highlighter | Sharpie | 25005 | Multiple suppliers, proflavine or fluorescein can be substituted |
References
- Muldoon, T. J., et al. Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy. Opt Express. 15, 16413-16423 (2007).
- Rajaram, N., Reichenberg, J. S., Migden, M. R., Nguyen, T. H., Tunnell, J. W. Pilot clinical study for quantitative spectral diagnosis of non-melanoma skin cancer. Lasers Surg Med. 42, 716-727 (2010).
- Louie, J. S., Richards-Kortum, R., Anandasabapathy, S. Applications and advancements in the use of high-resolution microendoscopy for detection of gastrointestinal neoplasia. Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 1789-1792 (2014).
- Chang, S. S., et al. High resolution microendoscopy for classification of colorectal polyps. Endoscopy. 45, 553-559 (2013).
- Muldoon, T. J., et al. Noninvasive imaging of oral neoplasia with a high-resolution fiber-optic microendoscope. Head Neck. 34, 305-312 (2011).
- Muldoon, T. J., et al. Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett's esophagus. J Biomed Opt. 15, 026027 (2010).
- Prieto, S. P., Powless, A. J., Boice, J. W., Sharma, S. G., Muldoon, T. J. Proflavine Hemisulfate as a Fluorescent Contrast Agent for Point-of-Care Cytology. PLoS One. 10, e0125598 (2015).
- Parikh, N., et al. In vivo diagnostic accuracy of high resolution microendoscopy in differentiating neoplastic from non-neoplastic colorectal polyps: a prospective study. Am J Gastroenterol. 109, 68-75 (2014).
- Shin, D., et al. Quantitative analysis of high-resolution microendoscopic images for diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma. Clin Gastroenterol Hepatol. 13, 272-279 (2015).
- Prieto, S. P., et al. Qualitative and quantitative comparison of colonic microendoscopy image features to histopathology. Proc SPIE Int Soc Opt Eng. 9328, (2015).
- Greening, G. J., et al. Fiber-bundle microendoscopy with sub-diffuse reflectance spectroscopy and intensity mapping for multimodal optical biopsy of stratified epithelium. Biomed Opt Express. 6, 4934-4950 (2015).
- Rajaram, N., Gopal, A., Zhang, X., Tunnell, J. W. Experimental validation of the effects of microvasculature pigment packaging on in vivo diffuse reflectance spectroscopy. Lasers Surg Med. 42, 680-688 (2010).
- Spliethoff, J. W., et al. Monitoring of tumor response to cisplatin using optical spectroscopy. Transl Oncol. 7, 230-239 (2014).
- Chang, V. T., et al. Quantitative physiology of the precancerous cervix in vivo through optical spectroscopy. Neoplasia. 11, 325-332 (2009).
- Yu, B., Shah, A., Nagarajan, V. K., Ferris, D. G. Diffuse reflectance spectroscopy of epithelial tissue with a smart fiber-optic probe. Biomed Opt Express. 5, 675-689 (2014).
- Hennessy, R., Goth, W., Sharma, M., Markey, M. K., Tunnell, J. W. Effect of probe geometry and optical properties on the sampling depth for diffuse reflectance spectroscopy. J Biomedical Opt. 19, 107002 (2014).
- Ghassemi, P., Travis, T. E., Moffatt, L. T., Shupp, J. W., Ramella-Roman, J. C. A polarized multispectral imaging system for quantitative assessment of hypertrophic scars. Biomed Opt Express. 5, 3337-3354 (2014).
- Vasefi, F., et al. Polarization-sensitive hyperspectral imaging in vivo: a multimode dermoscope for skin analysis. Sci Rep. 4, (2014).
- Winkler, A. M., Rice, P. F. S., Drezek, R. A., Barton, J. K. Quantitative tool for rapid disease mapping using optical coherence tomography images of azoxymethane-treated mouse colon. J Biomedl Opt. 15, 041512 (2010).
- Bish, S. F., et al. Handheld Diffuse Reflectance Spectral Imaging (DRSi) for in-vivo characterization of skin. Biomed Opt Express. 5, 573-586 (2014).
- Prahl, S. A. Optical Absorption of Hemoglobin. , http://omlc.org/spectra/hemoglobin/ (1999).
- Rajaram, N., et al. Design and validation of a clinical instrument for spectral diagnosis of cutaneous malignancy. Appl Opt. 49, 142-152 (2010).
- Hennessy, R., Markey, M. K., Tunnell, J. W. Impact of one-layer assumption on diffuse reflectance spectroscopy of skin. J Biomed Opt. 20, 27001 (2015).
- Rajaram, N., Nguyen, T. H., Tunnell, J. W. Lookup table-based inverse model for determining optical properties of turbid media. J Biomed Opt. 13, 050501 (2008).
- Nichols, B. S., Rajaram, N., Tunnell, J. W. Performance of a lookup table-based approach for measuring tissue optical properties with diffuse optical spectroscopy. J Biomed Opt. 17, 057001 (2012).
- Greening, G. J., James, H. M., Muldoon, T. J. Optical Phantoms: Diffuse and Sub-diffuse Imaging and Spectroscopy Validation. , SPIE Spotlights. 1-37 (2015).
- Karsten, A. E., Smit, J. E. Modeling and verification of melanin concentration on human skin type. Photochem Photobiol. 88, 469-474 (2012).
- Glennie, D. L., Hayward, J. E., Farrell, T. J. Modeling changes in the hemoglobin concentration of skin with total diffuse reflectance spectroscopy. J Biomed Opt. 20, 035002 (2015).
- Lim, L., Nichols, B., Rajaram, N., Tunnell, J. W. Probe pressure effects on human skin diffuse reflectance and fluorescence spectroscopy measurements. J Biomed Opt. 16, 011012 (2011).
