Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Multimodal Imaging og spektroskopi Fiber-bundle Microendoscopy plattform for ikke-invasiv, Published: October 17, 2016 doi: 10.3791/54564

Abstract

Nylige fiber-bunt microendoscopy Teknikker muliggjør ikke-invasiv analyse av in vivo vev ved hjelp av enten avbildningsteknikker, eller en kombinasjon av spektroskopiteknikk. Ved å kombinere avbildning og spektroskopiteknikker i en enkelt optisk sonde kan gi en mer fullstendig analyse av vev helse. I denne artikkelen er to ulike modaliteter kombinert med høy oppløsning fluorescens microendoscopy bildebehandling og diffuse spektroskopi, i en enkelt optisk probe. Høy oppløsning fluorescens microendoscopy bildebehandling er en teknikk som brukes til å visualisere apikale vev mikro-arkitektur og, selv om det meste en kvalitativ metode, har vist effektiv i sanntid differensiering mellom neoplastiske og ikke-neoplastisk vev. Diffus refleksjonsspektroskopi er en teknikk som kan trekke vev fysiologiske parametre inkludert lokale hemoglobinkonsentrasjon, melanin konsentrasjon, og oksygenmetning. Denne artikkelen beskriver spesifikasjonene required å bygge fiberoptisk sonde, hvordan å bygge instrumentering, og viser deretter teknikken på in vivo menneskelig hud. Dette arbeidet viste at vevet mikroarkitektur, spesielt apikale hud keratinocytter, kan være co-registrert med tilhørende fysiologiske parametere. Instrumenteringen og fiberbunten sonde presentert her kan optimaliseres som enten en håndholdt eller endoskopisk-kompatibel enhet for bruk i en rekke forskjellige organsystemer. Ytterligere klinisk forskning er nødvendig for å teste levedyktighet av denne teknikken for ulike epitel sykdomstilstander.

Introduction

Fiber-bundle microendoscopy teknikker vanligvis analysere in vivo vev ved hjelp av enten bildeteknikker eller en kombinasjon av spektroskopi teknikker. 1-3 En slik avbildningsteknikk, høy oppløsning fluorescens microendoscopy, kan bildet apikale vev mikro-arkitektur med sub-mobilnettet oppløsning i en liten , mikro felt-of-view, ved hjelp av en aktuell kontrastmiddel som proflavin, fluorescein, eller pyranine blekk. 1,3-11 Denne avbildningsfunksjonalitet har vist lovende kliniske ytelse i kvalitativt skille syke og friske epitelvev i sanntid med lav inter-observatør variabilitet. 8 ganger vil etterforskerne bruke høy oppløsning fluorescens mikroskopi data til å trekke kvantitative funksjoner som celle og kjernefysisk størrelse eller kjertel området, men dette er fortsatt en hovedsakelig kvalitativ teknikk rettet mot å visualisere vev morfologi. 1,3,8- 10 på den annen side, spektroskopiteknikker, sliksom diffuse spektroskopi, er rettet mot å gi funksjonell vev informasjon og har vist lovende kliniske prestasjoner i kvantitativt identifisere til kreft i flere organer. 2,12-15

Det er derfor et behov for en anordning som omfatter begge typer modaliteter for potensielt ytterligere redusere inter-observatør variabilitet, opprettholde sanntids visualisering av vev mikro-arkitektur, og tilveiebringe en mer fullstendig analyse av vev helse. For å oppnå dette målet, ble en multimodal probe-basert instrument konstruert som kombinerer to modaliteter i en enkelt fiberoptisk sonde:. Høyoppløselige fluorescens microendoscopy og sub-diffuse spektroskopi 11 Denne metoden co-registrene kvalitative høyoppløselige bilder av apikal vev morfologi (strukturelle egenskaper) med kvantitative spektral informasjon (funksjonelle egenskaper) fra to forskjellige vev dybder inkludert lokale hemoglobinkonsentrasjon ([Hb]), melanin konsentrasjon ([Mel]), og oksygenmetning (SAO 2). 11,12,16 Denne spesifikke under diffuse spektroskopi modalitet bruker to source-detektor separasjoner (SDSS) å prøve to unike vev dybder å gi et mer helhetlig bilde av vev helse ved prøvetaking ned til kjelleren membran og stroma underliggende vev. 11

Den fiber-sonde består av en sentral 1 mm-diameter bilde fiber med ca 50 000 4,5 um diameter fiberelementer, en kledning diameter på 1,1 mm og en total belegg diameter på 1,2 mm. Bildet fiber er omgitt av fem 200 mikrometer diameter fibre med kledningsdiameter på 220 mikrometer. Hvert 200 um flermodusfiber er plassert en senter-til-senter avstand på 864 mikrometer bort fra sentrum av bildet fiber. Hver av de 200 um flermodusfibere er 25 ° fra hverandre. Bruke lengst til venstre 200 mikrometer multimode fiber som "kilden" fiber, og den ekstra thRee 200 um flermodusfibere som "samling" fibre, denne geometrien nødvendigvis skaper tre senter-til-senter HMS-datablade av 374 um, 730 um, 1051 um og 1323 um. Fiberendene er innelukket i en sylindrisk metallkabinett som holder avstanden mellom fibrene konstant. Diameteren av den sylindriske metallinnfatning som er 3 mm. Den distale ende (langs fiberoptisk sonde spissen) av den fiberoptiske sonde er 2 fot lang. Sonden deretter separerer inn i de seks respektive individuelle fibrene ved den proksimale enden (mot instrumentering) som er ytterligere 2 fot lang, for en total lengde på 4 fot. Figur 1 viser en representasjon av den fiberoptiske sonde.

Figur 1
Fig. 1: Fiber-optisk sonde utforming Den fiberoptiske sonde består av en 1 mm diameter bilde fiber og fire 200 um flermodusfibere. DetteFiguren viser representasjoner av (a) den metallendehette som begrenser geometrien av fibrene på sondespissen til dannelse av HMS-datablade av 374, 730 og 1051 um med hensyn til den lengst til venstre 200 um flermodusfiber (Skala bar ≈ 1 mm), (b) fibrene være begrenset innenfor metallhetten, som viser fiberkjerner, fiber kledning, og fiberbelegg (Skala bar ≈ 1 mm), (c) den beskyttende polyamid mantel rundt fibrene (Skala bar ≈ 1 mm), (d ) den ferdige distale spissen av sonden, med metallet fingergrepet og enkelt svart kabel som inneholder alle fibre (Skala ≈ 4 mm), og (e) et bilde av den distale enden av sonden (Skala ≈ 4 mm). klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Denne multimodale instrumentering og tilhørende tekque er den første kombinasjonen av disse modaliteter innenfor en enkelt sonde, selv om andre kombinerte strukturelle / funksjonelle teknikker eksisterer som kombinerer forskjellige modaliteter. For eksempel kombinerer hyperspektral avbildning bredt felt bildebehandling med kvantitative hemoglobin og melanin egenskaper, 17,18 og andre teknikker har blitt utviklet som kombinerer optisk koherens tomografi (OCT) med analyse av vev protein uttrykk, 19 for å nevne noen. Artikkelen rapporterer om en kompakt og enkel å implementere instrumentering oppsett som benytter en generell fiberoptisk sonde som kan bli optimalisert for forskjellige formål, inkludert endoskopisk anvendelse i den nedre fordøyelseskanalen og spiserøret, eller som en håndholdt sonde for bruk i munnhulen og ekstern hud plassering. 11,20

Maskinvaren for instrumentering krever både tilpassede datainnsamling og etterbehandling kode for å skaffe diffuse refleksjon spektra og deretter trekke den resulterende volume-gjennomsnitt vev fysiologiske parametere inkludert [Hb], [Mel], og São to. Den tilpassede datainnsamling kode ble bygget for å tillate samtidig oppkjøp fra et kamera (for høy oppløsning fluorescens mikroskopi) og et spektrometer (for diffus spektroskopi). Drivere er ofte tilgjengelig fra produsentens nettsider for å tillate integrasjon med en rekke programmeringsspråk. Den tilpassede post-prosessering kode importerer a priori absorpsjon verdier av in vivo [Hb] og [Mel] 21 og deretter benytter en tidligere utviklet ikke-lineær optimaliseringstilpasningsprosessen som skaper en montert kurve av spektrene. 22 Den tilpassede kurven er bygget ved å minimalisere χ 2 verdi mellom seg selv og den rå spektra og bestemme vev fysiologiske parametere ([Hb], [Mel], og São 2) fra montert kurve og med lavest χ 2 verdi. 22 koden kan endres til å omfatteabsorpsjon fra andre chromophores også, slik som eksogene pyranine blekket som brukes her, slik at målet fysiologiske parametre påvirkes ikke.

Fysiologiske indikatorer på vev helse, som for eksempel [Hb], [Mel], og São 2, kan brukes som rapporter om tumor respons på behandling eller som indikatorer for lokal vascularization og angiogenese. 14,23 Inkludert en høy oppløsning fluorescens microendoscopy modalitet hjelper guide sonde plassering og gir etterforskere med et mer komplett bilde av forholdet mellom epitel vev struktur og funksjon. I denne artikkelen, bygging og bruk av multimodale microendoscope er beskrevet. 11

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Institutional Review Board godkjenning (IRB # 15-09-149) ble hentet fra mennesker forskning ved University of Arkansas for alle aspekter av denne studien. Metodene som beskrives ble utført i samsvar med vedtatte retningslinjer, og informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne.

1. Montering av høy oppløsning Fluorescence Microendoscopy Modalitet

Merk: skissert trinnene for montering av høyoppløselig fluorescens microendoscopy modalitet kan visualiseres i figur 2.

  1. Plasser en 470 nm dichroic speil Inne i en 30 mm Cage Cube.
    1. Få tak i en 30 mm bur kube og fjern dichroic filter mount.
    2. Plasser en 470 nm dichroic speil i dichroic filter mount.
    3. Sett inn og fest dichroic filter montere tilbake inne i buret kuben.
  2. Fest Cage Monterings Rods til 30 mm Cage Cube.
    1. Sikrefire 1,5 tomme bur monteringsstenger til forsiden av buret kuben.
    2. Sikre fire 3,0 tomme bur monteringsstaver til høyre side av buret kuben.
    3. Sikre to 2,0 tommers bur montering stenger diagonalt på venstre side av buret kube.
  3. Bygg en Cage Plate / Lens Tube Assembly.
    1. Få tak i en 1,0 tommers gjenget 30 mm bur plate og feste en stress gratis låseringen på innsiden av buret plate ved hjelp av den medfølgende threading.
    2. Skru inn en 1,0 tommers objektiv røret til stress-free låseringen.
    3. Feste en andre 1,0 tommer gjenget 30 mm bur platen til 1,0 tommer linsen rør og justere standard monteringsringene slik at de to rammeplater er i flukt.
  4. Skyv 1,0 tommers Cage Plate / Lens Tube Assembly på venstre side av den 30 mm Cage Cube.
  5. Bygg riktig vinkel speilmontering montering.
    1. Få tak i en rettvinklet speil mount og en 1,0 tommers UV-forsterket aluminium speil.
    2. Plasser 1.0 inch UV-forsterket aluminium speil i speilet montere og stramme.
    3. Sikre fire 2,0 tommers bur monteringsstenger til forsiden av speilet mount
    4. Sikre to 2,0 tomme bur monteringsstenger diagonalt på høyre side av buret kuben.
  6. Koble høyre vinkel speil montere montering på venstre side av 1,0 tommers bur plate / objektiv slange ved å plassere den motsatte bur monteringsstenger gjennom de respektive åpninger på 30 mm buret plate.
  7. Træ en z-akse oversettelse montere gjennom 3,0 tomme bur monteringsstaver på høyre side av sammenstillingen.
  8. Fest en 10X akromatisk objektiv til z-aksen oversettelse mount.
  9. Bygg en 1,0 tommers fiber adapter plate / xy-aksen oversettingsobjektivfatning montering.
    1. Skaff en xy-aksen oversettelse mount og en 1,0 tommers fiber adapter plate.
    2. Fest 1,0 tommers fiber adapterplate inn i xy-aksen oversettelse objektivfatning.
  10. Slide than 1,0 tommers fiber adapter / xy-aksen oversettelse objektivfatning montering foran objektivet.
  11. Skaff to 0,5 tommer lange, 1,0 tommers diameter linse rør, en 440/40 nm båndpassfilter (eksitasjon filter) og en 525/36 nm båndpassfilter (utslipp filter).
  12. Plassere hvert filter inne i en 0,5 tommer lang, 1,0 tommers diameter objektiv rør, slik at pilen på utsiden av filteret som vender mot siden av linsen røret med de utvendige gjenger.
  13. Fest filtrene til forsamlingen.
    1. Skaff to standard låseringene.
    2. Sikre filtrene inni 0,5 tommer lange, 1,0 tommers diameter linse rør med standard låseringene.
    3. Skru på linsen røret med eksitasjonsfilteret til forsiden av buret 30 mm terning og skru i linsen røret med utslipp filter til den vinklede speil montere.
    4. Skru på 0,5 tommer linse tube med utslipp filter til forsiden av høyre vinkel speil montere.
  14. Obtain to 1,0 tommers gjenger 30 mm bur plater og plassere dem foran de 0,5 tommer lang, 1,0 tommers diameter linseglass med filtrene.
  15. Ved hjelp av epoxy eller sterkt lim, feste en 455 nm LED til buret plate koblet til eksitasjon filter.
  16. Oppnå en 0,5 tommer lang, 1,0 tommers diameter objektiv rør og et 1,0 inches akromatisk dublett rør linse med brennvidde på 50 mm.
  17. Plasser røret linsen inne i objektivet røret slik at pilen på utsiden av linsen er vendt mot siden av linsen rør med utvendige gjenger.
  18. Skru i røret linsen til forsamlingen.
    1. Skaff en standard låseringen.
    2. Fest linsen inne i 0,5 tommer lang, 1,0 tommers diameter objektiv rør med standard låseringen.
    3. Sett på objektivet rør med rør objektivet til venstre mest bur plate.
  19. Plasser en 30 mm bur plate foran 0,5 tommer lange, 1,0 inches diameter objektiv rør inneholdende røret linsen.
  20. Fest en stressfritt låseringen til innsiden av buret 30 mm plate.
  21. Fest en USB monokrom kamera til buret plate med stress gratis låseringen.
  22. Konstruer de optiske post monterings enheter.
    1. Skaff fire 0,5 tommers stillingsinnehavere, fire 0,5 tommer optiske innlegg, og fire monterings baser.
    2. Sikre de optiske 0,5 tommers innlegg inne i 0,5 tommers stillingsinnehavere.
    3. Fest 0,5 tommers stillingsinnehavere på feste baser.
  23. Skru ut de fire optisk legg montering enheter til skruehullene ligger under 30 mm buret kube, rett vinkel speil montere, buret plate koblet til LED, og ​​buret plate koblet til kameraet.
  24. Skru inn de fire optisk post montering enheter til enten en optisk breadboard eller optisk tabellen for å fullføre byggingen av den høyoppløselige fluorescens microendoscopy modalitet.

ftp_upload / 54564 / 54564fig2.jpg "/>
Figur 2:. Montering av høyoppløselig fluorescens microendoscopy modalitet Den høyoppløselige fluorescens microendoscopy modalitet kan konstrueres ved å bygge et skall av 1,0 tommers diameter størrelse komponenter, med spesiell omsorg tatt i å håndtere dichroic speil, objektiv, eksitasjon / emisjonsfiltre og rør linse. Glassflater på disse komponentene må nøye håndteres ved hjelp av linsepapir. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2. Montering av under diffuse spektroskopi Modalitet

Merk: Den angitte fremgangsmåten for montering av under diffus refleksjonsspektroskopi modalitet kan visualiseres i figur 3.

  1. Få tak i en wolfram-halogen lyskilde, og ved hjelp epoxy eller et sterkt lim, sikre en 1,0 tommers threaded 30 mm bur platen på forsiden.
  2. Sikre fire 3,0 tommers bur monteringsstenger til buret plate.
  3. Fest en z-akse oversettelse montere til bur monteringsstenger.
  4. Skru i en 20X akromatisk objektiv til z-aksen oversettelse montere.
  5. Bygg en fiber adapter plate / xy-aksen oversettingsobjektivfatning montering.
    1. Skaff en xy-aksen oversettelse mount og en 1,0 inches fiber adapter plate.
    2. Fest fiberadapterplaten inn i xy-aksen oversettelse objektivfatning.
  6. Skyv 1,0 tommers fiber adapter / xy-oversettelse montere montering foran objektivet.
  7. Bygg motor arm forsamlingen.
    1. Skaff spesialbygd aluminium motor arm og en SMA fiberadapterplate.
    2. Skrue i fiberen adapterplaten (med utvendig gjenging) inn i det aluminium motor arm (med innvendig gjenging).
    3. Fest spesialbygde aluminiumsmotor arm adapter til motoren arm med fire # 4-40 0,5 i. Skruer.
    4. Bygg motor / motor arm / motorhus montering.
      1. Skaff spesialbygd aluminium motorhuset og den 400 skritt stepper motor.
      2. Line opp skruehullene på stepper motor og motorhuset og fest med fire # 4-40 0,5 tommers skruer.
      3. Mate den roterende motor stang av trinnmotoren gjennom åpningen av motorarmsammenstillingen og trekk til låseskruen på aluminium motor arm adapter.
    5. Bygg den optiske bryterenheten.
      1. Skaff spesialbygde aluminiums optisk bryter og tre 1,0 tommers fiber adapterplater.
      2. Træ adapterplater inn i de gjengede hullene i den optiske bryteren.
      3. Fest spesialbygde aluminiums optisk bryter ansikt-plate på optisk bryter med fire # 4-40 0,5 tommers skruer.
    6. Fest motor / motor arm / motorhus enheten til den optiske bryteren ved å mate den roterende motor stang av trinnmotoren gjennom det sentrale hull i than optisk bryter.
    7. Skaff en elektrisk krets bord og stepper motor driver, og deretter plassere stepper motor driver på tvers av sentrale sporet på breadboard.
    8. Observere den elektriske tilkoblingen skjematisk (figur 3, 2,12) for stepper motor driver, 12 V strømforsyning, og stepper motor.
    9. Koble stepper motor driver, 12 V strømforsyning, og stepper motor som angitt i koblingsskjema (figur 3, 2,12) for å fullføre byggingen av den motoriserte optiske bryteren.
    10. Skru den optiske bytte komponenter og wolfram-halogen lyskilde til en optisk breadboard eller optisk bord i nærheten av tidligere konstruerte (figur 2, 1,24) med høy oppløsning fluorescens microendoscopy montering.
    11. Feste den ene enden av en 550 um, 0.22 NA patch-kabel til 1,0 tommer fiber adapterplate av motorarmsammenstilling.
    12. Feste den andre enden av det 550 um, 0.22 NA patch-kabelen til fiberen kobleeller av USB-spektrometer.
    13. Skru inn de fem distale probe kablene til de respektive 1,0 tommers fiber adapterplater på instrumentering for å fullføre gjennomføringen av multimodale høy oppløsning bildebehandling og sub-diffuse spektroskopi fiber-bunt microendoscope.
      1. Skru i den sentrale 1 mm diameter bilde fiberkabel til 1,0 tommer fiber adapterplaten nevnt i trinn 1.9.2.
      2. Skru lengst til venstre 200 mikrometer multimode fiber kabelen til 1,0 tommer fiber adapterplaten nevnt i trinn 2.6.
      3. Skru i 2. 200 mikrometer multimode fiber kabel til den nest siste 1,0 tommers fiber adapter festet til wolfram-halogenlampe nevnt i trinn 2.9.2.
      4. Skru i 3. 200 mikrometer multimode fiberkabel til midten 1,0 tommers fiber adapterplaten nevnt i trinn 2.9.2.
      5. Skru i 4. 200 mikrometer multimode fiber kabelen til den høyre 1,0 tommers fiber adapterplaten nevnt i trinn 2.9.2.

      Figur 3
      Fig. 3: Montering av under diffus refleksjonsspektroskopi modalitet Under diffus refleksjonsspektroskopi modalitet kan konstrueres ved anvendelse av en grunnleggende wolfram-halogenlampe koplet til en objektivlinse for å fokusere lys gjennom 200 um multimodus levering fiber, og et spektrometer. I tillegg kan en spesialbygd motorisert optisk bryter bygges innenfor lampe-fiber-spektrometer banen for å bytte mellom hver SDS. Etterforskerne ved hjelp av flere spektrometre å kjøpe fra flere HMS-datablade kan omgå den optiske bryteren komponenten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

      3. Kalibrering av under diffuse spektroskopi Modalitet

      Merk: following trinn (§ 3) må være fullført før spektral datainnsamling (§ 4).

      1. Slå på alle komponentene i instrumentering, inkludert 455 nm LED, bredbånd wolfram-halogenlampe, CMOS-kamera, USB spektrometer, stepper motor, og motorstyrekortet. Sørg lukkeren på wolfram-halogenlampe er åpen.
      2. Slå av alt lys fra omgivelsene.
      3. Åpne tilpasset datainnsamling programvare.
      4. Holde utstyret kjører i 30 min for lampen nå en passende temperatur og for iboende støy fra spektrometeret å stabilisere.
      5. Plasser en 20% diffus refleksjon standard inne bunnen åpningen av spesialbygde, 3D trykt kalibrering standard enhet.
      6. Plasser fiberoptisk sonde inne lengst til venstre sporet av den tilpassede, 3D trykt fiber-holder, vist i figur 4. Lengst til venstre sporet løser vinkelrette avstanden fra fiberoptisk sonde tips til refleksjon standard på 2,1 mm, som er den optimum avstand i hvilken signalet når spektrometeret er maksimert for de første SDS av 374 um.
      7. Justere den motoriserte optiske bryteren til den lengst til venstre stilling, slik at spektrometeret er forbundet med de første SDS av 374 um.
      8. Sett integrasjonstiden til 500 ms. Denne integrasjonstiden må velges som å ikke mette spektrometeret men opprettholde en praktisk talt lav integrasjonstiden.
      9. Tilegne seg et spektrum, R max, 374μm, ved å klikke på "Acquire Spectrum" i programvaren.
      10. Lukk lukkeren på wolfram-halogenlampe og registrere et spekter, R mørk, 374μm, bakgrunnsstøy, ved å klikke på "Acquire Spectrum" i programvaren. Når ervervet, åpne lukkeren igjen.
      11. Plasser den fiberoptiske sonde inne lengst til høyre sporet på den tilpassede, 3D trykt fiber-holder, vist i figur 4. Den lengst til høyre spalte løser den vinkelrette avstanden fra den fiber-optic sondespissen til den reflektans standard på 3,9 mm, som er den optimale avstand i hvilken signalet når spektrometeret er maksimert for den andre SDS av 730 um.
      12. Justere den motoriserte optiske bryteren i midtstilling slik at spektrometeret er forbundet med den andre SDS til 730 um.
      13. Tilegne seg et spektrum, R max, 730μm, ved å klikke på "Acquire Spectrum" i programvaren.
      14. Lukk lukkeren på wolfram-halogenlampe og registrere et spekter, R mørk, 730μm, bakgrunnsstøy, ved å klikke på "Acquire Spectrum" i programvaren.
      15. Åpne lukkeren igjen.

      Figur 4
      Fig. 4: Kalibrering av under diffus refleksjonsspektroskopi modalitet For pre-eksperimentelle kalibrering, må den fiberoptiske sondespissen være plassert i forskjelligvinkelrette avstander fra 20% diffus refleksjon standard avhengig av SDS. Til konsekvent å oppnå disse vinkelrette avstander over alle eksperimenter ble en kalibreringsstandard enhet beregnet (enhet tverrsnitt vist i (a)) for å holde sonden ved nøyaktige avstander fra 20% diffus reflektans standard. I dette konkrete fiberoptisk sonde oppsett, blir lys fra wolfram-halogenlampe som vises gjennom den optiske bryteren ved kildedetektor separasjoner av (b) 374 um, og (c) 730 nm (med motor og motor arm fjernet fra den optiske bane for klarhet). Avstander (d) 2,1 mm for 374 mikrometer SDS, og (e) 3,9 mm for 730 mikrometer SDS er nødvendig for kalibrering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

      4. In vivo data Acquisition og optisk Eiendom Utvinning fra menneskelig hud

      I denne delen vil multimodale microendoscope teknikk demonstreres på in vivo menneskelig hud.

      1. Åpne tilpasset datainnsamling programvare og justere spektrometeret integrasjon ved å klikke "Integrering Time" og sette den slik at det er den samme som under kalibrering, som var 500 msek i dette tilfellet (trinn 3.8).
      2. Bestem område av huden i å samle inn data, som kan variere på anvendelse av etterforskeren. I dette tilfelle ble den tynne huden på underarmen valgt som en demonstrasjon.
      3. Hvis huden området inneholder hår, fjerne hår med en engangs steril barberhøvel.
      4. Skaff en standard gul merkepenn, som inneholder pyranine blekk, og lett markere det valgte hudområdet.
      5. Slå på 455 nm LED og lukke luken til wolfram-halogenlampe.
      6. Plasser sonden i milde kontakt med huden.
      7. Flytt sonden enrunde på de fargede området av vev for å se en live høyoppløselig feed av apikal keratinocyte arkitektur på visningsvinduet av programvaren.
      8. Velg et passende eksponeringstid og vinning, 150 msek og 10 dB gain i dette tilfellet, for å unngå bilde metning, ved å klikke på "Exposure Time" og "Gain", skrive inn de riktige verdiene, og deretter klikke på "Apply Settings" i programvaren grensesnitt.
      9. Acquire et bilde ved å klikke på "Acquire Image" i programvaren grensesnittet.
      10. Mens du holder sonden på samme bilde nettstedet, slå av 455 nm LED og åpne lukkeren til wolfram-halogenlampe.
      11. Justere den motoriserte optiske bryteren i den venstre stilling, slik at spektrometeret er forbundet med den andre SDS av 374 um.
      12. Skaff spektra, R vev, 374μm, ved å klikke på "Acquire Spectra" i programvaren grensesnittet.
      13. Juster motoriserte optiske bryteren i midtstilling slike thi spektrometeret er forbundet med den andre SDS til 730 um.
      14. Skaff spektra, R vev, 730μm, ved å klikke på "Acquire Spectra" i programvaren grensesnittet.
      15. Åpne tilpasset etterbehandling programvare.
      16. Kjør post-prosessering programvare ved å klikke på "Kjør" og velg fluorescens bilde med høy oppløsning, fire kalibrering spektra, og de to in vivo spektra fra mappen der dataene ble lagret når du blir bedt av programvaren.
        MERK: tilpasset programvare henter den sanne absolutt refleksjon (R abs, 374μm og R abs, 730μm) ved hjelp av følgende ligninger.
        ligning 1
        ligning 2
        Den etterbehandling kode, som tidligere beskrevet, beregner en montert kurve til den diffuse refleksjonsspektra (ligningene 1 og 2) og deretter Determines vev fysiologiske parametere inkludert ([Hb], [Mel], og São 2). 11,22,24

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter denne protokollen, vil etterforskeren få en fokus høyoppløselig bilde av vevet stedet med hele synsfeltet (figur 5). Konturene av celler kan ses hvis farget med pyranine blekk fra en standard gul merkepenn, mens enkelte cellekjerner kan ses hvis farges med et fargestoff som proflavin. Etter spektral oppkjøpet, bruker post-prosessering programvare a priori kunnskap om in vivo hemoglobinkonsentrasjon ([Hb]) og melanin konsentrasjoner ([Mel]) 21 for å passe under diffuse refleksjon spektra og bestemme verdier for [Hb], [Mel ], og vev oksygenmetning (SAO 2) som vist i figur 5. Den etterbehandling programvare bruker store fysiologiske grenser ([Hb] = 0-150 mg / ml, [Mel] = 0-30 mg / ml, og São 2 = 0-100%) for å passe til den kalibrerte spektra. 21

"Figur Figur 5:. Co-registrering kvalitative og kvantitative data fra in vivo human normal hud og en godartet melanocyttisk nevus En fluorescens bilde med høy oppløsning ble kjøpt fra en pyranine-blekk (fra en standard gul merkepenn) farget godartet melanocyttisk nevus og tilstøtende normal hud vev med en eksponeringstid på 150 msek. Konturene av keratinocytter kan vises tydelig i begge bildene. Den normale hud vevstedet og melanocyttisk nevus hadde hemoglobinkonsentrasjoner på 1,63 og 0,86 mg / ml, melanin-konsentrasjoner på 0,78 og 10,20 mg / ml, henholdsvis med tilsvarende oksygenmetning på 99%. Denne figuren viser fordelen av co-registrering kvalitativ strukturelle og kvantitativ funksjonell informasjon. Klikk her for å se et større version av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den multimodal høy oppløsning bildebehandling og sub-diffuse spektroskopi fiber-bundle microendoscope rapportert her kan optimaliseres og brukes av etterforskere for en rekke applikasjoner, inkludert endoskopisk eller håndholdt bruk for mennesker eller dyrestudier. Man får altså en fleksibel metode for å visualisere in vivo apikale vev mikro-arkitektur sammen med målinger av hemoglobinkonsentrasjon, melanin konsentrasjon, og vev oksygenmetning fra to forskjellige vev dybder. Denne artikkelen beskriver spesifikasjoner for fiberoptisk sonde, skissert en protokoll for sammensetting av bildedannende system med høy oppløsning og sub-diffus reflektans avbildningssystem, og er vist dens anvendelse i humane vev in vivo, ved hjelp av pyranine blekk som det fluorescerende kontrastmiddel for vev visualisering. Andre trykkfarger, slik som proflavin eller fluorescein, kan brukes i stedet for pyranine blekk med passende godkjenning. 4-7,11

"> Enhver sonde funksjonen kan endres fra dette design. For høyoppløselige fluorescens microendoscopy modalitet, 1 mm diameter bilde fiber besto av 50.000 enkeltkjernefiber med 4,5 mikrometer avstand, noe som resulterer i en konstant sub-cellulær romlig oppløsning på 4,5 mikrometer . Undersøkere som ønsker en annen størrelse bilde fiber for å oppnå en større eller mindre felt-of-view kan finne disse bilde fibrene lett tilgjengelige med diametre mellom 0,14 og 1,40 mm. et rør linse med brennvidde på 50 mm ble valgt slik at CMOS-sensor fanget hele 1 mm felt-of-view fra bildet fiberen. Når holde objektivlinsen konstant, større enn brennvidden av røret linsen vil øke forstørrelsen og samplingsfrekvensen, men redusere felt-of-view. 11 Således forstørrelsen av objektivlinsen, brennvidde av røret linse, størrelsen av bildesensoren, og størrelsen på bildet fiber kan og bør optimaliseres avhengig av behov. Endelig, filtre og eksitasjonslysKilden kan modifiseres avhengig av eksitasjon / emisjonsspektra av fluorescerende fargestoffer. 4-7 I tillegg til modifisering av proben og høy oppløsning fluorescens microendoscopy instrumentering, kan sub-diffus refleksjonsspektroskopi instrumentering endres.

For sub-diffus refleksjonsspektroskopi modalitet kan forskjellige størrelse flermodusfibere anvendes ved hver SDS. Mindre diameter flermodusfibere vil være i stand til å levere og samle lys over et mindre område, men det anbefales å benytte en rekke likt adskilte fibre for å øke signal-til-støy Hvis fiberdiameter mindre enn 200 um brukes. Etterforskerne analysere huden eller muntlig vev kan ha nytte av en samlet større sonde for å øke felt-of-view og signal-til-støy, men i smalere lysende organer som spiserør eller mage-tarmkanalen, etterforskere vil møte lagt begrensninger angående sonde størrelse, spesielt for kompatibilitet med biopsi havnen i klosterional endoskop. 8 Andre spektroskopi komponenter som kan endres inkludere bredbånd lyskilde og motorisert optisk bryter. En wolfram-halogenlampe ble valgt i dette tilfelle, selv om andre lyskilder kan og har vært brukt i andre studier, inkludert xenon buelamper og lysdioder, som kan øke signal-til-støy og lavere integrasjonstider. 2,15,20 Den motorisert optisk bryter presenteres her ble spesialbygd for å håndtere opptil tre HMS-datablade, men kan endres til å omfatte mer eller mindre innganger. Det bør bemerkes at den motordrevne optiske bryteren legger en ytterligere optisk komponent mellom bredbånds lyskilde og spektrometer, redusere signal-til-støy. Bryteren kan ikke være nødvendig for etterforskere med flere spektrometre som kjøper data samtidig, men inkludert en optisk bryter komponent slutt reduserer instrumentering kostnadene ved ca $ 3000 USD per SDS.

Byggingen av instrumentering ( 3) er ganske grei. Den mest kritiske trinn i denne protokollen er kalibreringen av under diffus refleksjonsspektroskopi modalitet (figur 4). Kalibrering må være fullført umiddelbart før spektral datainnsamling. Én gang kalibrering er fullført, sikre at ingen deler av instrumentet er avstengt eller re-kalibrering, kan det være nødvendig. Riktig kalibrering er nødvendig for å oppnå nøyaktig reflektansspektra, og således oppnå nøyaktige verdier for underliggende melanin konsentrasjon, hemoglobinkonsentrasjon, og vev oksygenmetning fra en ukjent prøve. Beleilig, de fleste etterforskere bruker liknende kalibrering teknikker som har blitt godt beskrevet. 2,11,12,25 Informasjon om programvarekrav for å konvertere reflektansspektra til optiske parametere kan finnes andre steder. 11,24,26

I forhold til feilsøking, spektra som resulterer i dårlig anfall (gjennomsnittprosent feil er større enn 10% mellom rådata og montert data) vil gi upålitelige verdier for de tre vev fysiologiske parametre ([Hb], [Mel], og São 2) presenteres her. Dårlig passer er mest sannsynlig et resultat av enten bevegelse mellom sonden og huden området under datainnsamling, smale randbetingelser i etterbehandling kode, eller upålitelige a priori verdier av [Hb] og [Mel]. 11,21,24, 26 Forbedringer i disse tre vanligste feil forekomster bør fastsette nøyaktig tilpasning av sub-diffus refleksjon spektra. Således kan datainnsamlingen bli forbedret ved å redusere spektrometer integrasjonstiden for å redusere bevegelsesartefakter i spektrene. I tillegg grensebetingelser representerer spekter av mulige beregningsutgangsverdier for [Hb], [Mel], og São to følgende etterbehandling. I disse studiene, grensebetingelser var 0-10 mg / ml for [Hb], 21,22 0-40 mg / ml for [Mel], 27,28 og 0-100% for São 2, 21,22,27-29 Hvis måle vev uten melanin, nedre og øvre grense for [Mel] kan både enkelt settes til 0 mg / ml. Til slutt, er det anbefalt å bruke etablerte a priori absorbans verdier for hemoglobin og melanin utgitt av Prahl et al. 21 Disse enkle forbedringer bør fastsette nøyaktig tilpasning av sub-diffuse refleksjon spektra, og hvis spørsmål gjenstår, kan spektra valideres med fantomer med kjente optiske egenskaper (redusert spredning og absorpsjon koeffisienter).

Den største begrensningen på denne multimodal bildebehandling og spektroskopi fiber-bunt microendoscopy plattformen er mangelen på en widefield avbildningsfunksjonalitet. Den høyoppløselige fluorescens microendoscopy modalitet har et sirkulært felt-of-view som er 1 mm i diameter, noe som gjør det vanskelig å raskt skanne et stort område av vev. En beregningsmetode for å overvinne denne begrensningen er bildet mosaIcking, en teknikk som brukes for å gi et bredere felt-of-view ved å stable tilstøtende mikro skalere bilder i en enkelt, større bildekart. 10 Slike bilde mosaicking har tidligere blitt demonstrert av Prieto et al. å undersøke colonic bildefunksjoner. 10 An instrumentering modifikasjon for å overvinne denne begrensningen ville være å gjøre sonden forenlig med biopsi port av et konvensjonelt endoskop, såsom proben presentert av Parikh et al., for å undersøke kolorektal neoplasi. 8 denne funksjonen kombinerer fordelene ved et bredt felt-of-view med mikro-skala avbildning av høyoppløselig fluorescens microendoscopy. 8

Samlet denne teknikken ble demonstrert på in vivo menneskelig hud og viser verdien av co-registrering høy oppløsning vev mikro-arkitektoniske bilder med den underliggende melanin konsentrasjon, hemoglobinkonsentrasjon, og vev oksygenmetning (Figur 5). dette technik kan brukes av forskere som ønsker å undersøke sammenhengen mellom strukturelle og funksjonelle abnormaliteter vev in vivo, eller analysere vev funksjonelle endringer i fravær av observerbare strukturelle endringer. Fremtidige studier vil undersøke gjennomførbarheten av denne teknikken i ulike epitel sykdomstilstander.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount Thorlabs, Inc. CM1-DCH
470 nm Dichroic Mirror (Beam Splitter) Chroma Corporation T470lpxr
Cage Assembly Rod, 1.5", 4-Pack Thorlabs, Inc. ER1.5-P4
Cage Assembly Rod, 3.0", 4-Pack Thorlabs, Inc. ER3-P4
Cage Assembly Rod, 2.0", 4-Pack Thorlabs, Inc. ER2-P4
SM1-Threaded 30 mm Cage Plate Thorlabs, Inc. CP02
SM1 Series Stress-Free Retaining Ring Thorlabs, Inc. SM1PRR
SM1 Lens Tube, 1.00" Thread Depth Thorlabs, Inc. SM1L10
Right-Angle Kinematic Mirror Mount Thorlabs, Inc. KCB1
1" UV Enhanced Aluminum Mirror Thorlabs, Inc. PF10-03-F01
Z-Axis Translation Mount Thorlabs, Inc. SM1Z
10X Olympus Plan Achromatic Objective Thorlabs, Inc. RMS10X
XY Translating Lens Mount Thorlabs, Inc. CXY1
SMA Fiber Adapter Plate with SM1 Thread Thorlabs, Inc. SM1SMA
SM1 Lens Tube, 0.50" Thread Depth Thorlabs, Inc. SM1L05
440/40 Bandpass Filter (Excitation) Chroma Corporation ET440/40x
525/36 Bandpass Filter (Emission) Chroma Corporation ET525/36m
Quick Set Epoxy Loctite 1395391
455 nm LED Light Housing Kit - 3-Watt LED Supply ALK-LH-3W-KIT
1" Achromatic Doublet, f = 50 mm Thorlabs, Inc. AC254-050-A
Flea 3 USB Monochrome Camera Point Grey, Inc. FL3-U3-32S2M-CS
0.5" Post Holder, L = 1.5" Thorlabs, Inc. PH1.5
0.5" Optical Post, L = 4.0" Thorlabs, Inc. TR4
Mounting Base, 1" x 2.3" x 3/8" Thorlabs, Inc. BA1S
Long Lifetime Tungsten-Halogen Light Source (Vis-NIR) Ocean Optics HL-2000-LL
20X Olympus Plan Objective Edmund Optics, Inc. PLN20X
Custom-Built Aluminum Motor Arm N/A N/A Custom designed and built
Custom-Built Aluminum Motor Arm Adaptor N/A N/A Custom designed and built
Custom-Built Aluminum Motor Housing N/A N/A Custom designed and built
Stepper Motor - 400 steps/revolution SparkFun Electronics ROB-10846 Multiple suppliers
Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch N/A N/A Custom designed and built
Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch Face-Plate N/A N/A Custom designed and built
Arduino Uno - R3 SparkFun Electronics DEV-11021 Multiple suppliers
Electronic Breadboard - Self-Adhesive SparkFun Electronics PRT-12002 Multiple suppliers
EasyDriver - Stepper Motor Driver Sparkfun Electronics ROB-12779
12 V, 229 mA Power Supply Phihong PSM03A Multiple suppliers
Enhanced Sensitivity USB Spectrometer (Vis-NIR) Ocean Optics USB2000+VIS-NIR-ES
550 µm, 0.22 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable Thorlabs, Inc. M37L01
Custom-Built Fiber-Optic Probe Myriad Fiber Imaging N/A
20% Spectralon Diffuse Reflectance Standard Labsphere, Inc. SRS-20-010
Standard Yellow Highlighter Sharpie 25005 Multiple suppliers, proflavine or fluorescein can be substituted

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Muldoon, T. J., et al. Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy. Opt Express. 15, 16413-16423 (2007).
  2. Rajaram, N., Reichenberg, J. S., Migden, M. R., Nguyen, T. H., Tunnell, J. W. Pilot clinical study for quantitative spectral diagnosis of non-melanoma skin cancer. Lasers Surg Med. 42, 716-727 (2010).
  3. Louie, J. S., Richards-Kortum, R., Anandasabapathy, S. Applications and advancements in the use of high-resolution microendoscopy for detection of gastrointestinal neoplasia. Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 1789-1792 (2014).
  4. Chang, S. S., et al. High resolution microendoscopy for classification of colorectal polyps. Endoscopy. 45, 553-559 (2013).
  5. Muldoon, T. J., et al. Noninvasive imaging of oral neoplasia with a high-resolution fiber-optic microendoscope. Head Neck. 34, 305-312 (2011).
  6. Muldoon, T. J., et al. Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett's esophagus. J Biomed Opt. 15, 026027 (2010).
  7. Prieto, S. P., Powless, A. J., Boice, J. W., Sharma, S. G., Muldoon, T. J. Proflavine Hemisulfate as a Fluorescent Contrast Agent for Point-of-Care Cytology. PLoS One. 10, e0125598 (2015).
  8. Parikh, N., et al. In vivo diagnostic accuracy of high resolution microendoscopy in differentiating neoplastic from non-neoplastic colorectal polyps: a prospective study. Am J Gastroenterol. 109, 68-75 (2014).
  9. Shin, D., et al. Quantitative analysis of high-resolution microendoscopic images for diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma. Clin Gastroenterol Hepatol. 13, 272-279 (2015).
  10. Prieto, S. P., et al. Qualitative and quantitative comparison of colonic microendoscopy image features to histopathology. Proc SPIE Int Soc Opt Eng. 9328, (2015).
  11. Greening, G. J., et al. Fiber-bundle microendoscopy with sub-diffuse reflectance spectroscopy and intensity mapping for multimodal optical biopsy of stratified epithelium. Biomed Opt Express. 6, 4934-4950 (2015).
  12. Rajaram, N., Gopal, A., Zhang, X., Tunnell, J. W. Experimental validation of the effects of microvasculature pigment packaging on in vivo diffuse reflectance spectroscopy. Lasers Surg Med. 42, 680-688 (2010).
  13. Spliethoff, J. W., et al. Monitoring of tumor response to cisplatin using optical spectroscopy. Transl Oncol. 7, 230-239 (2014).
  14. Chang, V. T., et al. Quantitative physiology of the precancerous cervix in vivo through optical spectroscopy. Neoplasia. 11, 325-332 (2009).
  15. Yu, B., Shah, A., Nagarajan, V. K., Ferris, D. G. Diffuse reflectance spectroscopy of epithelial tissue with a smart fiber-optic probe. Biomed Opt Express. 5, 675-689 (2014).
  16. Hennessy, R., Goth, W., Sharma, M., Markey, M. K., Tunnell, J. W. Effect of probe geometry and optical properties on the sampling depth for diffuse reflectance spectroscopy. J Biomedical Opt. 19, 107002 (2014).
  17. Ghassemi, P., Travis, T. E., Moffatt, L. T., Shupp, J. W., Ramella-Roman, J. C. A polarized multispectral imaging system for quantitative assessment of hypertrophic scars. Biomed Opt Express. 5, 3337-3354 (2014).
  18. Vasefi, F., et al. Polarization-sensitive hyperspectral imaging in vivo: a multimode dermoscope for skin analysis. Sci Rep. 4, (2014).
  19. Winkler, A. M., Rice, P. F. S., Drezek, R. A., Barton, J. K. Quantitative tool for rapid disease mapping using optical coherence tomography images of azoxymethane-treated mouse colon. J Biomedl Opt. 15, 041512 (2010).
  20. Bish, S. F., et al. Handheld Diffuse Reflectance Spectral Imaging (DRSi) for in-vivo characterization of skin. Biomed Opt Express. 5, 573-586 (2014).
  21. Prahl, S. A. Optical Absorption of Hemoglobin. , http://omlc.org/spectra/hemoglobin/ (1999).
  22. Rajaram, N., et al. Design and validation of a clinical instrument for spectral diagnosis of cutaneous malignancy. Appl Opt. 49, 142-152 (2010).
  23. Hennessy, R., Markey, M. K., Tunnell, J. W. Impact of one-layer assumption on diffuse reflectance spectroscopy of skin. J Biomed Opt. 20, 27001 (2015).
  24. Rajaram, N., Nguyen, T. H., Tunnell, J. W. Lookup table-based inverse model for determining optical properties of turbid media. J Biomed Opt. 13, 050501 (2008).
  25. Nichols, B. S., Rajaram, N., Tunnell, J. W. Performance of a lookup table-based approach for measuring tissue optical properties with diffuse optical spectroscopy. J Biomed Opt. 17, 057001 (2012).
  26. Greening, G. J., James, H. M., Muldoon, T. J. Optical Phantoms: Diffuse and Sub-diffuse Imaging and Spectroscopy Validation. , SPIE Spotlights. 1-37 (2015).
  27. Karsten, A. E., Smit, J. E. Modeling and verification of melanin concentration on human skin type. Photochem Photobiol. 88, 469-474 (2012).
  28. Glennie, D. L., Hayward, J. E., Farrell, T. J. Modeling changes in the hemoglobin concentration of skin with total diffuse reflectance spectroscopy. J Biomed Opt. 20, 035002 (2015).
  29. Lim, L., Nichols, B., Rajaram, N., Tunnell, J. W. Probe pressure effects on human skin diffuse reflectance and fluorescence spectroscopy measurements. J Biomed Opt. 16, 011012 (2011).

Tags

Bioteknologi Multimodal høy oppløsning microendoscopy bildebehandling refleksjon spektroskopi spredning absorpsjon fiber-bunt optisk eiendom utvinning
Multimodal Imaging og spektroskopi Fiber-bundle Microendoscopy plattform for ikke-invasiv,<em&gt; I Vivo</em&gt; Vevet analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Greening, G. J., Rajaram, N.,More

Greening, G. J., Rajaram, N., Muldoon, T. J. Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis. J. Vis. Exp. (116), e54564, doi:10.3791/54564 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter