Abstract
Recientes técnicas microendoscopy fibra de haz permiten el análisis no invasivo de tejido in vivo utilizando cualquiera de las técnicas de imagen o una combinación de técnicas de espectroscopia. La combinación de las técnicas de imagen y espectroscopia en una sola sonda óptica puede proporcionar un análisis más completo de la salud de los tejidos. En este artículo, dos modalidades diferentes se combinan, imágenes de alta resolución de fluorescencia microendoscopy y espectroscopia de reflectancia difusa, en una sola sonda óptica. De alta resolución de imagen microendoscopy fluorescencia es una técnica utilizada para visualizar el tejido apical micro-arquitectura y, a pesar de todo una técnica cualitativa, ha demostrado diferenciación efectiva en tiempo real entre el tejido neoplásico y no neoplásico. espectroscopía de reflectancia difusa es una técnica que puede extraer parámetros fisiológicos del tejido incluyendo concentración local de hemoglobina, la concentración de melanina, y la saturación de oxígeno. En este artículo se describen las especificaciones rEQUERIDO para construir la sonda de fibra óptica, cómo construir la instrumentación, y a continuación, muestra la técnica en la piel humana in vivo. Este trabajo reveló que el tejido de micro-arquitectura, queratinocitos de la piel específicamente apicales, puede ser co-registrado en sus parámetros fisiológicos asociados. La sonda de instrumentación y fibra de haz que aquí se presenta se puede optimizar, ya sea como un dispositivo de mano o compatible con endoscópicamente para su uso en una variedad de sistemas de órganos. Se necesita investigación clínica adicional para poner a prueba la viabilidad de esta técnica para diferentes estados de enfermedades epiteliales.
Introduction
Técnicas microendoscopy fibra haz normalmente analizan en el tejido vivo utilizando cualquiera de las técnicas de imagen o una combinación de técnicas de espectroscopia. 1-3 Una de estas técnicas de formación de imágenes de alta resolución microendoscopy fluorescencia, pueden tomar imágenes de los tejidos apicales microarquitectura con la resolución subcelular en una pequeña , el campo de visión a microescala, el uso de un agente de contraste tópico tal como proflavina, fluoresceína, o tinta piranina. 1,3-11 Esta modalidad de imagen ha mostrado prometedor rendimiento clínico en la diferenciación de tejido epitelial cualitativamente enfermo y sano en tiempo real con baja variabilidad entre observadores. 8 de vez en cuando, los investigadores utilizarán los datos de microscopía de fluorescencia de alta resolución para extraer características cuantitativas tales como células y tamaño nuclear o área de la glándula, pero esto sigue siendo una técnica cualitativa principalmente dirigido a la visualización de la morfología del tejido. 1,3,8- 10 Por otra parte, las técnicas de espectroscopia, talescomo la espectroscopia de reflectancia difusa, que están dirigidas a proporcionar información de tejido funcional y han mostrado prometedores resultados clínicos para identificar cuantitativamente las lesiones cancerosas en múltiples órganos. 2,12-15
Por lo tanto, hay una necesidad de un dispositivo que incorpora ambos tipos de modalidades para reducir potencialmente más variabilidad entre observadores, mantener visualización en tiempo real del tejido de micro-arquitectura, y proporcionar un análisis más completo de la salud del tejido. Para lograr este objetivo, un instrumento basado en la sonda multimodal fue construido que combina las dos modalidades en una sola sonda de fibra óptica:. De alta resolución microendoscopy fluorescencia y espectroscopia de reflectancia sub-difusa 11 Este método de co-registros cualitativos imágenes de alta resolución de apical morfología de los tejidos (propiedades estructurales) con información cuantitativa espectral (propiedades funcionales) a partir de dos profundidades diferentes tejidos incluyendo la concentración de hemoglobina local ([Hb]), la concentración de melanina ([Mel]), y la saturación de oxígeno (SaO 2). 11,12,16 Esta modalidad específica espectroscopia de reflectancia difusa sub-utiliza dos separaciones fuente-detector (SDSS) a la muestra dos profundidades de tejido única para proporcionar una visión más completa de la salud del tejido mediante el muestreo hasta la membrana basal y el estroma tejido subyacente. 11
La fibra sonda consta de una fibra de imagen 1 mm de diámetro central con aproximadamente 50.000 4,5 micras elementos de fibra de diámetro, un diámetro del revestimiento de 1,1 mm y un diámetro global de recubrimiento de 1,2 mm. La fibra de imagen está rodeada por cinco 200 micras fibras de diámetro con un diámetro de revestimiento de 220 micras. Cada fibra 200 micras multimodo se encuentra una distancia de centro a centro de 864 m de distancia del centro de la fibra de la imagen. Cada una de las fibras de 200 micras multimodo son de 25 °. Usando el extremo izquierdo de fibra multimodo de 200 micras como la fibra "fuente", y el TH adicionalree 200 micras fibras multimodo como las fibras "colección", esta geometría necesariamente crea tres de centro a centro de las SDS de 374 m, 730 m, 1051 m, y 1.323 micras. Las puntas de las fibras están encerrados en una carcasa metálica cilíndrica que mantiene las distancias entre fibras constante. El diámetro de la carcasa metálica cilíndrica es de 3 mm. El extremo distal (hacia la punta de la sonda de fibra óptica) de la sonda de fibra óptica es de 2 pies de largo. La sonda después se separa en los seis respectivas fibras individuales en el extremo proximal (hacia la instrumentación), que es un adicional de 2 pies de largo, para una longitud total de 4 pies. La figura 1 muestra una representación de la sonda de fibra óptica.
Figura 1:. Diseño de la sonda de fibra óptica La sonda de fibra óptica se compone de una fibra de imagen 1 mm de diámetro y cuatro 200 micras fibras multimodo. Estafigura muestra representaciones de (a) la tapa de extremo de metal que limita la geometría de las fibras en la punta de la sonda para producir las SDS de 374, 730, y 1.051 micras con respecto a la más a la izquierda de fibra de 200 micras multimodo (Escala bar ≈ 1 mm), (b) las fibras están limitados dentro de la tapa de metal, que muestra los núcleos de fibra, revestimiento de la fibra, y recubrimiento de la fibra (Escala bar ≈ 1 mm), (c) la poliamida de protección de revestimiento alrededor de las fibras (Escala bar ≈ 1 mm), (d ) la punta distal final de la sonda, con la ranura de agarre de metal y negro de cable único que contiene todas las fibras (Escala bar ≈ 4 mm), y (e) una imagen de la punta distal de la sonda (Escala bar ≈ 4 mm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Esta instrumentación asociada multimodal y técniQue es la primera combinación de estas modalidades dentro de una única sonda, aunque existen otras técnicas estructurales / funcionales combinados que combinan diferentes modalidades. Por ejemplo, las imágenes hiperespectrales combina formación de imágenes de campo amplio con propiedades cuantitativas de hemoglobina y la melanina, 17,18 y otras técnicas han sido desarrolladas que combinan la tomografía de coherencia óptica (OCT) con el análisis de la expresión de proteínas de tejido, 19 para nombrar unos pocos. Este artículo informa sobre una configuración de instrumentación compacta y fácil de implementar que utiliza una sonda de fibra óptica general que puede ser optimizado para varios propósitos, incluyendo el uso endoscópica en el tracto gastrointestinal inferior y el esófago o como una sonda de mano para su uso en la cavidad oral y la colocación de la piel externa. 11,20
El hardware para esta instrumentación requiere tanto de adquisición de datos y el código de encargo de post-procesamiento para adquirir espectros de reflectancia difusa y luego extraer el volum resultanteparámetros fisiológicos del tejido e incluyendo promediada [Hb], [Mel], y la SaO 2. El código de adquisición de datos personalizados fue construido para permitir la adquisición simultánea de una cámara (por microscopía de fluorescencia de alta resolución) y un espectrómetro (por espectroscopia de reflectancia difusa). Los conductores están a menudo disponibles de los sitios web de los fabricantes para permitir la integración con una variedad de lenguajes de programación. El código de post-procesamiento personalizado importa un archivo de valores de absorción a priori de in vivo [Hb] y [Mel] 21 y luego utiliza un proceso de adaptación de optimización no lineal desarrollado previamente que crea una curva ajustada de los espectros. 22 La curva ajustada se construye mediante la minimización del χ valor 2 entre sí mismo y los espectros en bruto y la determinación de los parámetros fisiológicos del tejido ([Hb], [Mel], y Sao 2) de la curva ajustada y con el más bajo χ 2 valor. 22 el código puede ser modificado para incluirabsorción de otros cromóforos, así, como la tinta piranina exógeno utilizado aquí, por lo que se dirigen a parámetros fisiológicos no se ven afectadas.
Indicadores fisiológicos de la salud de los tejidos, tales como [Hb], [Mel], y SaO 2, se pueden utilizar como informes de la respuesta del tumor a la terapia o como indicadores de la vascularización local y la angiogénesis. 14,23 La inclusión de una modalidad microendoscopy de fluorescencia de alta resolución ayuda a la colocación de la sonda guía y proporciona a los investigadores una visión más completa de la relación entre la estructura del tejido epitelial y la función. En este artículo, la construcción y aplicación de la microendoscope multimodal se describe. 11
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Protocol
aprobación de la Junta de Revisión Institucional (IRB # 15-09-149) se obtuvo del programa de sujetos humanos de investigación en la Universidad de Arkansas para todos los aspectos de este estudio. Los métodos descritos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices aprobadas, y el consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes.
1. Asamblea de la fluorescencia de alta resolución Microendoscopy Modalidad
Nota: Los pasos descritos para el montaje de la modalidad microendoscopy de fluorescencia de alta resolución se pueden visualizar en la Figura 2.
- Colocar un espejo dicroico 470 nm dentro de un cubo de la jaula 30 mm.
- Obtener un cubo jaula de 30 mm y retire el soporte del filtro dicroico.
- Colocar un espejo dicroico 470 nm en el filtro dicroico montaje.
- Vuelva a insertar y asegurar la montura del filtro dicroico de nuevo en el cubo de la jaula.
- Coloque la jaula de varillas de ensamblado al cubo de la jaula 30 mm.
- Segurocuatro barras de la jaula de montaje de 1,5 pulgadas en la parte delantera del cubo jaula.
- Asegure cuatro barras de la jaula de montaje de 3,0 pulgadas en el lado derecho del cubo jaula.
- Asegurar dos barras de montaje de la jaula 2.0 pulgadas en diagonal en el lado izquierdo del cubo jaula.
- Construir un conjunto de tubo / de la lente de la jaula de la Plata.
- Obtener una placa de la jaula 30 mm rosca 1.0 pulgadas y adjuntar un anillo de retención libre de estrés en el interior de la placa de la jaula usando la rosca proporcionada.
- Tornillo en un tubo de lente de 1.0 pulgadas con el anillo de retención libre de estrés.
- Adjuntar un segundo 1,0 pulgadas roscado placa de 30 mm jaula para el tubo de lente de 1,0 pulgadas y ajustar los anillos de retención estándar para que las dos placas de la jaula están al ras.
- Deslice el conjunto del tubo / de la lente 1,0 pulgadas Jaula Placa en el lado izquierdo de la jaula del cubo 30 mm.
- Construir montaje en el espejo de ángulo recto de montaje.
- Obtener un espejo en ángulo recto de montaje y un espejo de aluminio mejorado UV-1,0 pulgadas.
- Coloque el inc 1.0h UV mejorada espejo de aluminio en el espejo de montaje y apriete.
- Asegure cuatro barras de la jaula de montaje de 2,0 pulgadas en la parte delantera del soporte de espejo
- Asegure los dos vástagos de montaje de la jaula de 2,0 pulgadas en diagonal en el lado derecho del cubo jaula.
- Conectar el soporte de espejo de ángulo recto del montaje en el lado izquierdo de la placa de montaje de tubo de jaula de 1,0 pulgadas / lente mediante la colocación de las barras de montaje de la jaula opuestas a través de las respectivas aberturas de la placa de la jaula 30 mm.
- Atornille el montaje de traducción eje z a través de las barras de la jaula de montaje de 3,0 pulgadas en el lado derecho del conjunto.
- Coloque un objetivo acromático 10x a la traducción del eje z montaje.
- Construir una lente de traducción placa de adaptador de fibra de 1.0 pulgadas / xy del eje de montaje montaje.
- Obtener una traducción xy eje de montaje y una placa de adaptador de fibra de 1,0 pulgadas.
- Fije la placa de adaptador de fibra de 1,0 pulgadas en la lente traducción xy eje de montaje.
- Slide de Tque la fibra de la lente traducción adaptador / xy eje 1.0 pulgadas de montaje de montaje delante de la lente objetivo.
- Obtener dos, tubos de 0,5 pulgadas de largo 1.0 pulgadas de diámetro de la lente, uno 440/40 nm de paso de banda del filtro (filtro de excitación) y un filtro de 525/36 nm de paso de banda (filtro de emisión).
- Coloque cada filtro en el interior de un tubo de lente de diámetro 0,5 pulgada de largo 1,0 pulgadas, de manera que la flecha de la parte exterior del filtro se enfrenta a la parte del tubo de lente con las roscas externas.
- Coloque los filtros para el montaje.
- Obtener dos anillos de fijación estándar.
- Asegurar los filtros dentro de las 0,5 pulgadas de largo, tubos de lentes de diámetro 1.0 pulgadas con los anillos de fijación estándar.
- Atornillar el tubo de lente con el filtro de excitación a la parte delantera del cubo jaula 30 mm y el tornillo en el tubo de lente con el filtro de emisión para el espejo de ángulo recto montar.
- Atornillar el tubo de lente de 0,5 pulgadas con el filtro de emisión a la parte delantera del espejo de ángulo recto montar.
- obten dos placas 1,0 pulgadas roscado de la jaula 30 mm y colocarlos delante de los tubos, lentes de 1,0 pulgadas de diámetro de 0,5 pulgadas de largo que contienen los filtros.
- El uso de epoxi o adhesivo fuerte, adjuntar un LED de 455 nm a la placa de la jaula conectado al filtro de excitación.
- Obtener una, tubo de lente de diámetro 1,0 pulgadas 0,5 pulgadas de largo y una lente de tubo doblete acromático 1,0 pulgadas con una longitud focal de 50 mm.
- Coloque la lente del tubo interior del tubo de lente de tal manera que la flecha en el exterior de la lente se enfrenta a la parte del tubo de lente con las roscas externas.
- Tornillo en la lente del tubo de la asamblea.
- Obtener un anillo de retención estándar.
- Asegure la lente del interior del tubo de la lente de diámetro de 0,5 pulgadas de largo 1.0 pulgadas con el anillo de retención estándar.
- Una el tubo de lente con la lente del tubo a la placa de la jaula más a la izquierda.
- Colocar una placa de jaula 30 mm delante del tubo de lente de 0,5 pulgadas de largo, 1,0 pulgadas de diámetro que contiene la lente del tubo.
- Adjunta un anillo de retención libre de estrés en el interior de la placa de jaula 30 mm.
- Adjuntar una cámara monocromática USB a la placa de la jaula con el anillo de retención libre de estrés.
- Construir los dispositivos de montaje posterior ópticos.
- Obtener cuatro soportes de 0,5 pulgadas de correos, cuatro 0,5 pulgadas mensajes ópticos y cuatro bases de montaje.
- Asegurar los mensajes ópticos 0,5 pulgadas dentro de los titulares de los puestos de 0,5 pulgadas.
- Asegurar los titulares de los puestos de 0,5 pulgadas en las bases de montaje.
- Tornillo en los dispositivos de montaje de cuatro postes óptica a los orificios de los tornillos situados debajo del cubo de la jaula 30 mm, montaje en el espejo de ángulo recto, la placa de la jaula conectado con el LED y la placa de la jaula conectado a la cámara.
- Atornillar los cuatro dispositivos ya sea en la mesa óptica o una mesa óptica de montaje para terminar la construcción de la modalidad microendoscopy de fluorescencia de alta resolución óptica posterior.
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Figura 2:. Asamblea de la modalidad microendoscopy de fluorescencia de alta resolución La modalidad de alta resolución de fluorescencia microendoscopy puede construirse mediante la construcción de una concha de componentes de 1.0 pulgadas de diámetro de tamaño, con especial cuidado en el manejo del espejo dicroico, lente del objetivo, excitación / filtros de emisión y lente del tubo. Las superficies de cristal de estos componentes deben ser cuidadosamente manejados usando papel para lentes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Asamblea de la Sub-difusa espectroscopia de reflectancia Modalidad
Nota: Los pasos descritos para el montaje de la modalidad de la espectroscopía de reflectancia difusa sub-se pueden visualizar en la Figura 3.
- Obtener una fuente de luz de tungsteno-halógeno y, utilizando epoxi o un adhesivo fuerte, asegurar un threade 1,0 pulgadasd 30 mm placa de la jaula en la parte frontal.
- Asegure cuatro barras de la jaula de montaje de 3,0 pulgadas a la placa de la jaula.
- Adjunte una traducción del eje z de montaje de las barras de montaje de la jaula.
- Tornillo en una lente objetiva acromática 20X a la traducción del eje z montar.
- Construir una lente de traducción placa de adaptador de fibra / xy del eje de montaje montaje.
- Obtener una traducción xy eje de montaje y una placa de adaptador de fibra de 1,0 pulgadas.
- Fije la placa de adaptador de fibra en la lente traducción xy eje de montaje.
- Slide conjunto de montaje del adaptador de fibra de 1.0 pulgadas / xy traducción frente a la lente del objetivo.
- Construir el conjunto del brazo del motor.
- Obtener el brazo motor de aluminio hecha a la medida y una placa de adaptador de fibra SMA.
- Tornillo en la placa de adaptador de fibra (con rosca exterior) en el brazo de motor de aluminio (con rosca interior).
- Una el adaptador de aluminio del brazo del motor hecha a la medida para el brazo motor con cuatro # 4-40 en 0,5. Tornillos.
- Construir el conjunto de la carcasa del brazo / motor / motor.
- Obtener la carcasa del motor de aluminio hecha a la medida y el motor paso a paso 400 pasos.
- Alinear los orificios para tornillos del motor paso a paso y la carcasa del motor y luego asegure con cuatro tornillos # 4-40 0,5 pulgadas.
- Alimentar a la varilla del motor de rotación del motor paso a paso a través de la abertura del conjunto del brazo del motor y apretar el tornillo de fijación en el adaptador del brazo del motor de aluminio.
- Construir el conjunto del interruptor óptico.
- Obtener el conmutador óptico de aluminio hecha a la medida y tres placas de adaptador de fibra de 1,0 pulgadas.
- Pase los placas de adaptación en los orificios roscados en el interruptor óptico.
- Fije el conmutador óptico de aluminio cara placa hecha a la medida en el interruptor óptico con cuatro tornillos # 4-40 0,5 pulgadas.
- Sujetar el conjunto de la carcasa del brazo / motor motor / motor al conmutador óptico por la alimentación de la varilla de motor de rotación del motor paso a paso a través del agujero central de tél conmutador óptico.
- Obtener una tarjeta de circuito eléctrico y del motor de pasos, y luego colocar el conductor motor paso a paso a través de la ranura central de la placa.
- Observe el esquema de conexión eléctrica (Figura 3, 2,12) para el controlador de motor paso a paso, la fuente de alimentación 12 V, y el motor paso a paso.
- Conectar el controlador de motor paso a paso, la fuente de alimentación 12 V, y motor paso a paso como se especifica en el diagrama del circuito (Figura 3, 2,12) para completar la construcción del interruptor óptico motorizado.
- Atornillar el interruptor de componentes y fuente de luz de tungsteno-halógeno óptica en una mesa óptica o una mesa cerca de la óptica construida anteriormente (Figura 2, 1.24) de alta resolución de la Asamblea microendoscopy fluorescencia.
- Conecte un extremo de un 550 micras, 0,22 NA cable de conexión a la placa de adaptador de fibra de 1,0 pulgadas del conjunto del brazo del motor.
- Coloque el otro extremo de los 550 m, 0,22 cable de conexión a la fibra NA conectaro del espectrómetro de USB.
- El tornillo en los cinco cables de la sonda distal de las respectivas placas de adaptador de fibra de 1.0 pulgadas en la instrumentación para terminar la finalización de la alta resolución de imagen multimodal y sub-espectroscopia de reflectancia difusa microendoscope fibra de haz.
- Atornillar el cable de fibra imagen 1 mm de diámetro central en la placa de adaptador de fibra de 1,0 pulgadas se menciona en el paso 1.9.2.
- Atornillar el cable de fibra multimodo más a la izquierda 200 m a la placa de adaptador de fibra de 1,0 pulgadas se menciona en el paso 2.6.
- Atornillar el cable de fibra multimodo 2º 200 micras a la izquierda adaptador de fibra de 1,0 pulgadas unida a la lámpara de tungsteno-halógeno mencionado en el paso 2.9.2.
- Atornillar el cable de fibra multimodo de 200 m 3 al plato adaptador de fibra de 1,0 pulgadas medio mencionado en el paso 2.9.2.
- Atornillar el cable de fibra multimodo 4º 200 micras a la placa de adaptador de fibra de 1,0 pulgadas más a la derecha se menciona en el paso 2.9.2.
Figura 3:. Asamblea de la modalidad de la espectroscopía de reflectancia sub-difusa La modalidad de la espectroscopía de reflectancia sub-difusa se puede construir usando una lámpara de base de tungsteno-halógeno acoplado a una lente de objetivo para enfocar la luz a través de la fibra de distribución 200 micras multimodo, y un espectrómetro. Además, un conmutador óptico motorizado a la medida puede ser construido dentro de la trayectoria de la lámpara de fibra-espectrómetro para cambiar entre cada SDS. Los investigadores que utilizan varios espectrómetros para adquirir de múltiples SDS puede pasar por alto el componente conmutador óptico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.3. Calibración del Sub-difusa espectroscopia de reflectancia Modalidad
Nota: El fespués de pasos (sección 3) deben ser completados antes de la recogida de datos espectrales (sección 4).
- Encienda todos los componentes de la instrumentación, incluidos los 455 nm LED, lámpara de tungsteno-halógeno de banda ancha, cámara CMOS, el espectrómetro USB, motor paso a paso, y el tablero de control del motor. Asegúrese de que el obturador de la lámpara de tungsteno-halógeno está abierto.
- Apaga toda la luz ambiente.
- Abra el software de adquisición de datos personalizado.
- Mantener el equipo funcionando durante 30 minutos para llegar a la lámpara una temperatura apropiada y para el ruido inherente del espectrómetro para estabilizar.
- Coloque un patrón de reflexión difusa del 20% dentro de la abertura inferior del dispositivo 3D estándar de calibración impresa hecha a la medida.
- Coloque la sonda de fibra óptica dentro de la ranura del extremo izquierdo de la costumbre, 3D impreso de fibra de soporte, demostrado en la Figura 4. La ranura del extremo izquierdo fija la distancia perpendicular desde la punta de la sonda de fibra óptica para el patrón de reflexión a 2,1 mm, que es el opdistancia timum en el que la señal que llega al espectrómetro se maximiza para los primeros SDS de 374 micras.
- Ajuste el conmutador óptico motorizado a la posición más a la izquierda de tal manera que el espectrómetro está conectado a los primeros SDS de 374 micras.
- Ajuste el tiempo de integración de 500 ms. Este tiempo de integración debe elegirse como para no saturar el espectrómetro pero mantener un tiempo de integración prácticamente baja.
- Adquirir un espectro, Rmax, 374μm, haciendo clic en "adquirir Espectro" en el software.
- Cerrar el obturador de la lámpara de tungsteno-halógeno y registrar un espectro, R oscuro, 374μm, del ruido de fondo, haciendo clic en "Adquirir Espectro" en el software. Una vez adquirido, abra el obturador una vez más.
- Coloque la sonda de fibra óptica dentro de la ranura del extremo derecho de la costumbre, 3D impreso de fibra titular, demostrado en la Figura 4. La ranura más a la derecha fija la distancia perpendicular de la fibra-opunta de la sonda ptic al patrón de reflexión a 3,9 mm, que es la distancia óptima en la que la señal que llega al espectrómetro se maximiza para la segunda SDS de 730 micras.
- Ajuste el conmutador óptico motorizado a la posición central de tal manera que el espectrómetro está conectado a la segunda SDS de 730 micras.
- Adquirir un espectro, Rmax, 730μm, haciendo clic en "adquirir Espectro" en el software.
- Cerrar el obturador de la lámpara de tungsteno-halógeno y registrar un espectro, R oscuro, 730μm, del ruido de fondo, haciendo clic en "Adquirir Espectro" en el software.
- Abrir el obturador una vez más.
Figura 4:. Calibración de la modalidad de la espectroscopía de reflectancia difusa sub-Para la calibración previa al experimento, la punta de la sonda de fibra óptica debe ser colocado en diferentesdistancias perpendiculares del patrón de reflexión difusa 20% dependiendo de la SDS. Para lograr consistentemente estas distancias perpendicular a través de todos los experimentos, un dispositivo estándar de calibración fue diseñado (sección transversal del dispositivo se muestra en (a)) para mantener la sonda a distancias exactas del patrón de reflexión difusa del 20%. En esta configuración específica de la sonda de fibra óptica, la luz de la lámpara de tungsteno-halógeno se muestra a través del interruptor óptico en separaciones de fuente-detector de (b) 374 micras y (c) 730 micras (con el brazo motor y el motor retirado de la trayectoria óptica para mayor claridad). Las distancias de (d) 2.1 mm para los 374 micras SDS, y (e) de 3,9 mm para se requieren las 730 micras SDS para la calibración. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.4. Los datos in vivo Acquisition y la propiedad óptica Extracción de la piel humana
En esta sección, la técnica microendoscope multimodal se demostrará en la piel humana in vivo.
- Abra el software de adquisición de datos personalizados y ajustar el tiempo de integración del espectrómetro haciendo clic en "Tiempo de integración" y configurarlo para que sea el mismo que durante la calibración, que fue de 500 mseg en este caso (paso 3.8).
- Determinar el área de piel en la que la adquisición de datos, que puede diferir de la aplicación del investigador. En este caso, la fina piel del antebrazo fue elegido como una demostración.
- Si el área de la piel contiene de pelo, quitar el pelo con una maquinilla de afeitar estéril desechable.
- Obtener un marcador amarillo estándar, que contiene la tinta pyranine, y marque ligeramente el área de piel elegido.
- Encienda el LED de 455 nm y cerrar el obturador de la lámpara de tungsteno-halógeno.
- Coloque la sonda en contacto suave con la piel.
- Mueva la sonda unaredonda sobre la zona manchada de tejido para ver una alta resolución de transmisión en vivo de la arquitectura de queratinocitos apical sobre la ventana de visualización del software.
- Seleccionar un tiempo de exposición adecuado y la ganancia, 150 ms y 10 dB de ganancia en este caso, para evitar la saturación de la imagen, haciendo clic en "tiempo de exposición" y "ganancia", escribiendo los valores apropiados y haciendo clic en "Aplicar" en el software interfaz.
- Adquirir una imagen haciendo clic en "Adquirir imagen" en la interfaz de software.
- Mientras se mantiene la sonda en el mismo sitio de imagen, apague el LED de 455 nm y abrir el obturador de la lámpara de tungsteno-halógeno.
- Ajuste el conmutador óptico motorizado a la posición izquierda de tal manera que el espectrómetro está conectado a la segunda SDS de 374 micras.
- Adquirir espectros, tejidos R, 374μm, haciendo clic en "adquirir espectros" en la interfaz de software.
- Ajuste el conmutador óptico motorizado en la posición intermedia tales THen el espectrómetro está conectado a la segunda SDS de 730 micras.
- Adquirir espectros, tejidos R, 730μm, haciendo clic en "adquirir espectros" en la interfaz de software.
- Abra el software de post-procesamiento personalizado.
- Ejecutar el software de post-procesamiento haciendo clic en "Ejecutar" y seleccione la imagen de fluorescencia de alta resolución, cuatro espectros de calibración, y los dos espectros in vivo de la carpeta en la que se guardaron los datos cuando lo solicite el software.
NOTA: El software personalizado obtiene el verdadero reflectancia absoluta (R abs, 374μm y R abs, 730μm) usando las siguientes ecuaciones.
El código de post-procesamiento, como se describe anteriormente, calcula una curva ajustada a los espectros de reflectancia difusa (ecuaciones 1 y 2) y luego determines parámetros fisiológicos del tejido incluyendo ([Hb], [Mel], y la SaO 2). 11,22,24
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Representative Results
Siguiendo este protocolo, el investigador obtendrá una imagen de alta resolución que tiene el foco del sitio del tejido con el campo de visión completo (Figura 5). Contornos de las células se pueden ver si se mancha de tinta pyranine de un marcador amarillo estándar, mientras que los núcleos de células individuales se pueden ver si se mancha de un colorante tal como proflavina. Después de la adquisición espectral, el software de post-procesamiento utiliza un conocimiento a priori de la concentración de hemoglobina vivo ([Hb]) y las concentraciones de melanina ([Mel]) 21 para adaptarse a los espectros de reflectancia sub-difusa y determinar los valores para [Hb], [Mel ], y la saturación de oxígeno del tejido (SaO 2) como se muestra en la Figura 5. El software de post-procesamiento utiliza límites fisiológicos de ancho ([Hb] = 0 a 150 mg / ml, [Mel] = 0 a 30 mg / ml, y SaO 2 = 0 a 100%) para adaptarse a los espectros de calibrado. 21
Figura 5:. Co-registro de datos cualitativos y cuantitativos de la piel normal humana in vivo y un nevus melanocíticos benignos Una imagen de fluorescencia de alta resolución fue adquirido de una pyranine-tinta (de un marcador amarillo estándar) teñidas nevus melanocíticos benignos y piel normal adyacente tejido con un tiempo de exposición de 150 ms. Contornos de los queratinocitos pueden son claramente visibles en ambas imágenes. El sitio de tejido de la piel normal y nevus melanocíticos tenían concentraciones de hemoglobina de 1,63 y 0,86 mg / ml, concentraciones de melanina de 0,78 y 10,20 mg / ml, respectivamente, con la saturación de oxígeno similares de 99%. Esta figura demuestra el beneficio de co-registro de la información estructural funcional y cuantitativa cualitativa. Por favor, haga clic aquí para conocer el vers más grandesión de esta figura.
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Discussion
La alta resolución de imagen multimodal y microendoscope fibra de haz de la espectroscopía de reflectancia difusa sub-informó aquí se pueden optimizar y utilizadas por los investigadores para una variedad de aplicaciones, incluyendo endoscópica o el uso de mano de los estudios en humanos o animales. Por lo tanto, proporciona un método flexible para la visualización in vivo de tejidos apical micro-arquitectura junto con las mediciones de la concentración de hemoglobina, la concentración de melanina, y la saturación de oxígeno del tejido de dos profundidades diferentes de tejidos. Este artículo describe las especificaciones de la sonda de fibra óptica, se describe un protocolo para el montaje del sistema de imágenes de alta resolución y sistema de imágenes de reflectancia sub-difusa, y se muestra su aplicación en tejidos humanos in vivo, utilizando tinta pyranine como el agente de contraste fluorescente para visualización de los tejidos. Otras tintas, tales como proflavina o fluoresceína, se pueden utilizar en lugar de tinta piranina con la aprobación apropiada. 4-7,11
"> Cualquier característica de la sonda se puede modificar de este diseño. Para la modalidad microendoscopy de fluorescencia de alta resolución, la fibra imagen diámetro 1 mm constaba de 50.000 fibras de núcleo individuales con 4,5 micras separación, resultando en una resolución espacial sub-celular constante de 4,5 micras . los investigadores que desean una fibra de imagen de tamaño diferente para obtener un campo de visión menor o mayor puede encontrar estas fibras imagen fácilmente disponibles con diámetros entre 0,14 y 1,40 mm. una lente de tubo con longitud focal de 50 mm se eligen de manera que el sensor CMOS capturado la plena 1 mm campo de visión de la fibra de la imagen. Cuando manteniendo constante la lente objetivo, el aumento de la distancia focal de la lente del tubo aumentará magnificación y frecuencia de muestreo, pero disminuir el campo de visión. 11 Por lo tanto, la ampliación de la lente del objetivo, la longitud focal de la lente del tubo, el tamaño del sensor de imagen, y el tamaño de la fibra imagen puede y debe ser optimizada dependiendo de la necesidad. Finalmente, los filtros y la excitación de luzfuente puede ser modificado dependiendo de los espectros de excitación / emisión de los tintes fluorescentes. 4-7 Además de modificar la sonda y de alta resolución microendoscopy fluorescencia instrumentación, la instrumentación espectroscopia de reflectancia difusa sub-puede ser modificado.Para la modalidad de la espectroscopía de reflectancia difusa sub-, diferentes fibras multimodo de tamaño se pueden utilizar en cada SDS. fibras multimodo de menor diámetro serán capaces de entregar y recoger la luz sobre un área más pequeña, pero se recomienda utilizar una matriz de fibras idénticamente espaciados para aumentar la relación señal-ruido si se utilizan diámetros de fibra inferior a 200 micras. Los investigadores que analizan la piel o el tejido oral se pueden beneficiar de una sonda grande en general para aumentar el campo de visión y relación señal-ruido, pero en órganos luminosos estrechos, tales como el esófago o en el tracto gastrointestinal, los investigadores se enfrentarán limitaciones añadidas en cuanto a tamaño de la sonda, especialmente para la compatibilidad con el puerto de biopsia de conventoendoscopios ional. 8 Otros componentes de espectroscopia que pueden ser modificables se encuentra la fuente de luz de banda ancha y conmutador óptico motorizado. Una lámpara de tungsteno-halógeno se eligió en este caso, aunque otras fuentes de luz pueden y se han usado en otros estudios, incluyendo lámparas y LEDs de arco de xenón, que puede aumentar la señal a ruido y tiempos de integración más bajos. 2,15,20 La conmutador óptico motorizado presenta aquí fue construida para manejar hasta tres SDS, pero puede ser modificado para incluir más o menos entradas. Cabe señalar que el conmutador óptico motorizado le añade un componente óptico adicional entre la fuente de luz de banda ancha y el espectrómetro, la disminución de señal-a-ruido. El interruptor puede no ser necesario para los investigadores con varios espectrómetros que adquieren datos de forma simultánea, pero que incluye un componente conmutador óptico en última instancia, reduce el coste de la instrumentación en aproximadamente $ 3,000 USD por SDS.
La construcción de la instrumentación (
En lo que respecta a la resolución de problemas, espectros dan como resultado ajustes pobres (promediopor ciento de errores mayor que 10% entre datos primarios y datos empotrados) producirán valores poco fiables para los parámetros fisiológicos de tres tejidos ([Hb], [Mel], y SaO 2) presentan aquí. Ataques pobres son más probablemente el resultado de ya sea el movimiento entre la sonda y el sitio de la piel durante la adquisición de datos, las condiciones de contorno estrechas en el código de post-procesamiento, o valores a priori poco fiables de [Hb] y [Mel]. 11,21,24, 26 las mejoras en estos tres casos de errores comunes deben fijar el ajuste preciso de los espectros de reflectancia sub-difusa. Por lo tanto, la recogida de datos se puede mejorar mediante la reducción de tiempo de integración espectrómetro para reducir los artefactos de movimiento dentro de los espectros. Además, las condiciones de contorno representan el rango de posibles valores de salida computacional para [Hb], [Mel], y la SaO 2 siguiente post-procesamiento. En estos estudios, las condiciones de contorno eran 0-10 mg / ml de [Hb], 21,22 0-40 mg / ml de [Mel], 27,28 y 0-100% para la SaO 2,
La principal limitación a esta plataforma microendoscopy imagen y espectroscopía de fibra de haz multimodal es la falta de una técnica de imagen de campo amplio. La modalidad microendoscopy de fluorescencia de alta resolución tiene un campo de visión-circular que se encuentra a 1 mm de diámetro, lo que hace difícil para escanear rápidamente un gran área de tejido. Un método computacional para superar esta limitación es la imagen mosaIcking, una técnica usada para proporcionar un campo de visión más amplio por el apilamiento de imágenes adyacentes a microescala en un único mapa de imagen, más grande. 10 Tal mosaicos imagen ha sido previamente demostrada por Prieto et al. para investigar las características de imagen del colon. 10 Un modificación instrumentación para superar esta limitación estaría haciendo la sonda compatible con el puerto de biopsia de un endoscopio convencional, tal como la sonda presentado por Parikh et al. para investigar neoplasia colorrectal. 8 esta característica combina las ventajas de un campo de visión de toda con imágenes de micro-escala de microendoscopy de fluorescencia de alta resolución. 8
En general, esta técnica se demostró en vivo en la piel humana y muestra el valor de los tejidos de alta resolución de imágenes de micro-arquitectura co-registrarse con la concentración de melanina subyacente, la concentración de hemoglobina y la saturación de oxígeno en los tejidos (Figura 5). este tecnique puede ser utilizado por los investigadores que desean investigar la relación entre las anormalidades de tejido estructural y funcional en vivo, o cambios funcionales de análisis de tejido en ausencia de cambios estructurales observables. Los estudios futuros se investigar la viabilidad de esta técnica en diversos estados de enfermedad epiteliales.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs, Inc. | CM1-DCH | |
| 470 nm Dichroic Mirror (Beam Splitter) | Chroma Corporation | T470lpxr | |
| Cage Assembly Rod, 1.5", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER1.5-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 3.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER3-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 2.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER2-P4 | |
| SM1-Threaded 30 mm Cage Plate | Thorlabs, Inc. | CP02 | |
| SM1 Series Stress-Free Retaining Ring | Thorlabs, Inc. | SM1PRR | |
| SM1 Lens Tube, 1.00" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L10 | |
| Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs, Inc. | KCB1 | |
| 1" UV Enhanced Aluminum Mirror | Thorlabs, Inc. | PF10-03-F01 | |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs, Inc. | SM1Z | |
| 10X Olympus Plan Achromatic Objective | Thorlabs, Inc. | RMS10X | |
| XY Translating Lens Mount | Thorlabs, Inc. | CXY1 | |
| SMA Fiber Adapter Plate with SM1 Thread | Thorlabs, Inc. | SM1SMA | |
| SM1 Lens Tube, 0.50" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L05 | |
| 440/40 Bandpass Filter (Excitation) | Chroma Corporation | ET440/40x | |
| 525/36 Bandpass Filter (Emission) | Chroma Corporation | ET525/36m | |
| Quick Set Epoxy | Loctite | 1395391 | |
| 455 nm LED Light Housing Kit - 3-Watt | LED Supply | ALK-LH-3W-KIT | |
| 1" Achromatic Doublet, f = 50 mm | Thorlabs, Inc. | AC254-050-A | |
| Flea 3 USB Monochrome Camera | Point Grey, Inc. | FL3-U3-32S2M-CS | |
| 0.5" Post Holder, L = 1.5" | Thorlabs, Inc. | PH1.5 | |
| 0.5" Optical Post, L = 4.0" | Thorlabs, Inc. | TR4 | |
| Mounting Base, 1" x 2.3" x 3/8" | Thorlabs, Inc. | BA1S | |
| Long Lifetime Tungsten-Halogen Light Source (Vis-NIR) | Ocean Optics | HL-2000-LL | |
| 20X Olympus Plan Objective | Edmund Optics, Inc. | PLN20X | |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm Adaptor | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Housing | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Stepper Motor - 400 steps/revolution | SparkFun Electronics | ROB-10846 | Multiple suppliers |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch Face-Plate | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Arduino Uno - R3 | SparkFun Electronics | DEV-11021 | Multiple suppliers |
| Electronic Breadboard - Self-Adhesive | SparkFun Electronics | PRT-12002 | Multiple suppliers |
| EasyDriver - Stepper Motor Driver | Sparkfun Electronics | ROB-12779 | |
| 12 V, 229 mA Power Supply | Phihong | PSM03A | Multiple suppliers |
| Enhanced Sensitivity USB Spectrometer (Vis-NIR) | Ocean Optics | USB2000+VIS-NIR-ES | |
| 550 µm, 0.22 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs, Inc. | M37L01 | |
| Custom-Built Fiber-Optic Probe | Myriad Fiber Imaging | N/A | |
| 20% Spectralon Diffuse Reflectance Standard | Labsphere, Inc. | SRS-20-010 | |
| Standard Yellow Highlighter | Sharpie | 25005 | Multiple suppliers, proflavine or fluorescein can be substituted |
References
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