Protocol
研究のためのラットの使用は、東京大学の動物福祉委員会によって確立されたガイドラインに従いました。
プラスミドDNAの1.Preparation
- 哺乳動物細胞12発現プラスミド中のcDNAまたはshRNA配列をサブクローニングすることによってin vivoでエレクトロポレーションのためのDNAプラスミドを生成します。それは強く、安定した発現を可能にするため、サイトメガロウイルス最初期エンハンサーおよびニワトリβアクチンプロモーターの融合（CAG）プロモーター駆動プラスミド13を使用してください。 CAGプロモーターの制御下でshRNAの発現のために、shRNAの14をサブクローニングのためにmir30ベースのshRNAカセットシステムを使用しています。
- 製造元の指示に従ってマキシプレップキットを用いてプラスミドDNAを精製し、HEPES緩衝生理食塩水（140mMの塩化ナトリウム、0.75ミリモルのNa 2 HPO 4、25mMのHEPES、pHは7.40）でDNAを再懸濁します。 μgの/μLを≥4するDNAの濃度を調整します。
手術器具および生理食塩水の2滅菌
- オートクレーブ手術器具および0.9％NaCl溶液。
ガラスマイクロピペットの調製
- ピペットプラーを用いてガラスピペットを引き出します。 30-50ミクロンの直径にピペットの先端をカットします。以下のパラメータを使用します。熱、600;ベロシティ、50;時間、75。
4.動物の手術、DNA注射とエレクトロポレーション
注：オーバーこの手順の図は、 図1に記載されている。仔ラットの手順は、ここに記載されているが、この方法は、同様の手順を使用して、より成熟した動物にも適用可能です。
- 動物は4％（体積/体積）に0.4リットル/分およびイソフルラン濃度に酸素流量を調整することで不動になるまで、インダクションボックス内のイソフルランでラットを麻酔。適切な麻酔を確認するためにピンチつま先を実行します。
- 双眼顕微鏡下で予熱した暖かいにラットを入れ、かつ連続的にフェイスマスクを介してイソフルランを投与することにより麻酔を維持します。 0.2リットル/分および2％（体積/体積）にイソフルラン濃度に酸素流量を調整します。目は動物の目が開いている場合は、目の乾燥を防ぐために廃棄し使用します。
- 外科手術用テープで足を固定してください。
- ポビドンヨードと後部大腿部の皮膚をきれいにし、メスで切開を行います。
注：外科的領域が時間で覆われている場合は、外科的領域を剃ります空気。 - 大腿四頭筋の間に開口部を作成することによって、坐骨神経を露出すると、筋肉や上腕二頭筋が縫い針で筋肉大腿大腿。
- 0.9％NaCl溶液で神経を濡らします。リントフリーペーパーで余分な水分を吸収します。
- フレキシブルチューブの上にガラスマイクロピペットの基部を挿入して、静かに吸引することにより、マイクロピペットにDNA溶液（少なくとも1マイクロリットル）の適切な量を記入してください。
- そっと針を用いて神経の先端側を引っ張ることで露出した神経を持ち上げます。
注意：機械的ストレスを最小限にするために神経に緊張を与えないでください。 - 神経の遠位部位にガラスマイクロピペットを挿入し、（フレキシブルチューブの開放端部に吹き付けることによって）圧力を適用することによって、DNA溶液を注入します。神経が緑（1μlの最大値）が表示されるまでDNA溶液を注入します。マイクロピペットの頻繁な挿入が神経を損傷することがあるので、倍以上のマイクロピペットを挿入しないでください。
- TWEを配置離れて神経1〜2ミリメートル程度エゼル型白金電極。電極と0.9％NaCl溶液で神経の間のギャップを埋めます。
注：神経への機械的ストレスを避けるために、電極と神経を持たないでください。 - 電極とエレクトロを使用して、注射部位に電気パルスを適用します。最初のパルスセットした後、電極を反転し、別のパルスのセットを適用します。以下のパラメータを使用します。電圧、50 Vを、パルス持続時間、5ミリ秒。パルス間隔、100ミリ秒。パルス数、4回。
- 0.9％NaCl溶液でエレクトロポレーションサイトを清掃してください。
- 繰り返して、反対側の坐骨神経に4.4から4.11繰り返します。
5.ポストエレクトロポレーション
- シアノアクリレート接着剤で切開を閉じます。
- 接着剤を乾燥させた後、ポビドンヨードで傷口をきれいに。
- フェイスマスクから子犬を解放します。それは完全に麻酔から回復できるようにするために、時間の少なくともウォーマーに子犬を温めます。 Dそれは十分な意識を取り戻したまでO子犬を無人のままにしません。
- 麻酔から回復した後、母ラットに子犬を返します。完全に回復するまでの子犬を返さないでください。
6.手術後
- 実験11を行うまで、ケージの住宅仔ラット（ 図3の例を参照してください）。カルプロフェン投与（5 mgの/ kgで、腹腔内）、非ステロイド性抗炎症薬、またはブプレノルフィン（0.1ミリグラム/ kg、皮下）、オピオイド鎮痛薬、必要に応じて。
注：ラットの子犬が十分に成長しないか、炎症が手術部位付近に観測されている場合は、実験から動物を除外します。
Representative Results
プラスミド発現性赤色蛍光タンパク質（RFP）でトランスフェクトした坐骨神経の例は、図2Aに示されています。双極性形態を示す細胞は、SCの特徴は、まばらにRFPをトランスフェクトしました。いいえRFPの蛍光は軸索で検出されませんでした。我々は通常〜すべての神経で100トランスフェクトのSCを見つけます。このトランスフェクション効率は、レンチウイルスベクター4を用いたin vivo SC感染効率に似ているようです。
免疫染色実験は、ほとんど（〜96％）P7のS100、SCマーカー（ 図2B）のための共同標識し、P14のでRFP陽性細胞の91％MBPのための共同標識、髄鞘形成のSCマーカーでRFP陽性細胞（ 図2C）、エレクトロポレーションによる遺伝子導入は、SCのを髄鞘形成するための高度に選択的であることを示唆しています。
SCへの複数の遺伝子の導入
げっ歯類では、ミエリン形成が劇的生後最初の2週間の間に増加し、出産の周りに開始し、その後徐々に減少します。このように、遺伝的にこれらの発達の時間窓の間のSCを操作することによって、髄鞘形成のこれらの異なる段階のメカニズムを明確にすることができます。レンチウイルスベクターはのための良いツールです彼らは最小の毒性を持っている、特にとして、髄鞘形成をnalyzingが、レンチウイルスは唯一の新生児の坐骨神経の5,6に感染します 。トランスフェクションは（ 図2E、下）P3（ 図2E、上）またはP14に実施された場合と比較して、エレクトロポレーション媒介遺伝子導入はうまく動作します。
生体内エレクトロポレーション法における新規のアプリケーションがここで説明されている。 図3Aは、GFPを発現する種々の発生段階（P7、P14、P21とP31）で、ミエリン形成のSCの光学顕微鏡像を示します。光学顕微鏡分析により、そのような長さと直径との形態学的パラメータの変化を評価することができます。これらのパラメータは、エレクトロポ神経が重大な損傷を及ぼすことなく開発することを示唆し、無傷のラット末梢神経15,16と比較して同様の値を持っていることに注意してください。 図3Bは、LacZをexpreの電子顕微鏡像を示しますミエリン化のSCをssing。この場合には、LacZの発現をマーカーとして使用しました。 bluo-galを、エタノール不溶性基質を用いて、βガラクトシダーゼ染色、電子顕微鏡11,17によりトランスフェクトされたSCのミエリン構造の解析を可能にします。これらの実験では、シグナル伝達分子の役割は、それによって、機能喪失または機能獲得型の影響の分析を可能にする、それらの発現をサイレンシングするか、増強することによって調べることができます。固定組織の分析に加えて、 インビボでのエレクトロポレーション媒介遺伝子移入はまた、イメージング実験をライブに適用することができます。例えば、 図3Cは、G-GECO1.1 18、緑色蛍光細胞質ゾルのCa 2+インジケーター、およびR-GECO1mt 19、赤色蛍光ミトコンドリアのCa 2+指示薬を共発現ミエリンSCを示しています。これらの指標を発現することによって、我々はのSCのミエリン形成にサイトゾルおよびミトコンドリアのCa 2+濃度を制御するシグナル伝達経路を同定し 。したがって、本発明の方法は、遺伝的にコードされた蛍光プローブは、関心のある信号を検出するために利用可能である場合は特に、シグナル伝達機構の種々の研究に使用することができます。
図 1：I Nインビボ 電気穿孔方法 の概略まず、麻酔したラットの坐骨神経を露出させます。第二に、プラスミドDNAは、坐骨神経に注入されます。第三に、電気パルスは、鉗子状の電極を介して注入部位に送達されます。最後に、傷は接着剤で閉じられています。この手順では、反対側の神経に繰り返すことができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： トランスフェクトされた坐骨神経上の代表的な結果 （A）トランスフェクトされた坐骨神経の代表画像。神経はP3でRFPを発現するプラスミドでトランスフェクトし、P7に固定しました。 （B）S100、SCマーカーとの共局在化を示すP7でのRFP-トランスフェクトされた細胞の代表画像。 MBP、髄鞘形成のSCマーカーと共局在化を示すP14でRFPトランスフェクト坐骨神経の（C）A代表画像。 （D）GFPおよびRFPを発現するプラスミドで同時トランスフェクション坐骨神経の代表画像。トランスフェクトされたSCが同時にGFPおよびRFPを発現しました。 （E）ミエリン形成が始まるP3、（上）でトランスフェクトP31でのSCをミエリン形成の画像、および最も大きな軸索 は（下）有髄なっP14、でトランスフェクトP31におけるミエリン形成のSCの画像、そのTRANSFを示唆しています髄鞘形成のSCのectionは、新生児の神経ではなく、より成熟した神経だけでなく達成することができます。スケールバー=200μmの（A）。 50ミクロン（BE）。この数値は、当社の以前の出版物11から変更されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 3：in vivoでの エレクトロポレーション （A） のアプリケーションのSCをミエリン形成の発展の光顕微鏡分析。坐骨神経はP3でのGFP発現プラスミドをエレクトロポレーションした、と様々な発達段階（P7、P14、P21とP31）で固定しました。 GFP陽性SCの代表的な画像は、左側に示されています。平均長さと直径は、（n = 3の平均±SEMとしてまとめられています右側の3神経）47から0。開発が進むにつれてのSCが増加するミエリン形成の長さと直径。 （B）をコードするプラスミドのLacZでトランスフェクトされた坐骨神経の電子顕微鏡像。 （左白アスタリスク）トランスフェクトされたSCが細かくβガラクトシダーゼ反応生成物の析出物で標識しました。 （C）G-GECO1.1、緑色蛍光細胞質ゾルのCa 2+インジケーター、およびR-GECO1mt、赤色蛍光ミトコンドリアのCa 2+指示薬で同時トランスフェクションSCの画像。白い点線の長方形内の領域は、右側のパネルに拡大して示されています。スケールバー=50μmの（AおよびC） 1ミクロン（B）。この数値は、当社の以前の出版物11から変更されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 03 143 422 001 | Plasmid DNA purification kit |
| Fast Green CFC | WAKO | 069-00032 | Dye for DNA injection |
| GC 150T-10 | HARVARD APPARATUS | 30-0062 | Glass capillary |
| Suction tubing | Drummond | 05-2000-00 | Suction tubing for micro injection |
| MODEL P-97 | SUTTER INSTRUMENT CO. | Micropipette puller | |
| CUY21 Single Cell | BEX | Electroporator CUY21 Single Cell | Pulse generator |
| Electric warmer | KODEN | CAH-6A | Warmer during the surgery |
| Isofluolane | Mylan | 1119701G1076 | Anesthetic |
References
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