Protocol
L'utilisation de rats pour la recherche était conforme aux lignes directrices établies par le Comité de protection des animaux de l'Université de Tokyo.
1. Préparation de l'ADN plasmidique
- Générer des plasmides d' ADN pour l' électroporation in vivo par sous - clonage de l'ADNc ou la séquence shRNA dans un plasmide d'expression pour des cellules de mammifère 12. Utilisez un cytomegalovirus précoce immédiat amplificatrices et poulet β-actine promoteur fusion (CAG) promoteur induite par le plasmide 13 car il permet une expression forte et stable. Pour l' expression de shRNA sous le contrôle d'un promoteur CAG, utiliser un système de cassette shRNA base mir30-pour sous - cloner le shRNA 14.
- On purifie l' ADN de plasmide avec un kit Maxi-prep selon les instructions du fabricant, et remettre en suspension l'ADN avec une solution saline tamponnée par HEPES (140 mM de NaCl, 0,75 mM de Na 2 HPO 4, HEPES 25 mM, pH 7,40). Ajuster la concentration de l'ADN pour ≥ 4 pg / pl.
2. Stérilisation des instruments chirurgicaux et Saline
- des instruments chirurgicaux autoclave et la solution de NaCl à 0,9%.
3. Préparation du verre Micropipette
- Tirez pipettes de verre en utilisant un extracteur de pipette. Coupez la pointe de la pipette à un diamètre de 30-50 pm. Utilisez les paramètres suivants: Chaleur, 600; Velocity, 50; Temps, 75.
4. Chirurgie animale, injection d'ADN et électroporation
Note: Une plusFace à cette étape est décrite dans la figure 1. Bien que la procédure pour les bébés rats sont décrits ici, le procédé est également applicable à des animaux plus âgés qui utilisent la même procédure.
- Anesthésier le rat avec de l'isoflurane dans la zone d'induction jusqu'à ce que l'animal devient immobile en ajustant le débit d'oxygène à 0,4 L / min et la concentration d'isoflurane à 4% (vol / vol). Effectuer orteil pincement pour confirmer anesthetization bon.
- Placez le rat sur le plus chaud préchauffé sous un microscope binoculaire, et maintenir une anesthésie en administrant en continu isoflurane à travers le masque. Ajuster le débit d'oxygène à 0,2 L / min et la concentration d'isoflurane à 2% (vol / vol). Utilisez des gouttes oculaires pour prévenir la sécheresse des yeux si les yeux de l'animal sont ouverts.
- Fixer les jambes avec du ruban adhésif chirurgical.
- Nettoyer la peau sur la cuisse postérieure avec povidone-iode, et faire une incision avec un scalpel.
Note: Rasez les zones chirurgicales si les zones chirurgicales sont recouvertes de hair. - Exposer le nerf sciatique en créant une ouverture entre les quadriceps femoris et muscle biceps fémoral avec des aiguilles à coudre.
- Mouiller le nerf avec une solution de NaCl à 0,9%. Absorber l'excès d'eau avec du papier non pelucheux.
- Insérez la base d'une micropipette de verre sur un tube flexible, et remplir la quantité adéquate de solution d'ADN (au moins un microlitre) dans la micropipette en aspirant doucement.
- Soulevez le nerf exposé en tirant doucement sur le côté distal du nerf à l'aide d'une aiguille.
Note: Ne pas appliquer une tension sur le nerf pour minimiser le stress mécanique. - Insérer la micropipette de verre dans le site distal du nerf, et injecter la solution d'ADN par application d'une pression (par exemple par soufflage dans l'extrémité ouverte du tube flexible). Injecter la solution d'ADN jusqu'à ce que le nerf apparaît en vert (1 pi maximum). Parce que l'insertion fréquente de la micropipette peut endommager le nerf, ne pas insérer la micropipette plus de deux fois.
- Placer un tweezer type d'électrode de platine d'environ 1-2 mm en dehors du nerf. Remplir l'espace entre l'électrode et le culot avec une solution de NaCl à 0,9%.
Remarque: Ne tenez pas le nerf avec l'électrode pour éviter toute contrainte mécanique sur le nerf. - Appliquer des impulsions électriques sur le site d'injection en utilisant une électroporation avec l'électrode. Après la première série d'impulsions, inverser l'électrode et appliquer une autre série d'impulsions. Utilisez les paramètres suivants: tension, 50 V; durée d'impulsion, 5 ms; intervalle d'impulsion, 100 msec; nombre d'impulsions, 4 fois.
- Nettoyez le site d'électroporation avec une solution de NaCl à 0,9%.
- Répétez les étapes 04.04 au 04.11 sur le nerf sciatique controlatéral.
5. Post-électroporation
- Fermer les incisions avec la colle cyanoacrylate.
- Après séchage de la colle, nettoyer la plaie avec de la povidone-iode.
- Relâchez le chiot à partir du masque. Chauffer le chiot sur un plus chaud au moins pendant une heure, afin de lui permettre de se rétablir complètement de l'anesthésie. réo ne pas laisser le chiot sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante.
- Après récupération de l'anesthésie, retourner le chiot chez le rat mère. Ne pas retourner le chiot jusqu'à guérison complète.
6. Post-chirurgie
- Maison des chiots de rat dans la cage jusqu'à ce que la conduite des expériences 11 (voir les exemples dans la figure 3). Administrer carprofène (5 mg / kg; ip), un médicament non-stéroïdiens anti-inflammatoires, ou de la buprénorphine (0,1 mg / kg, sc), un analgésique opioïde, si nécessaire.
Remarque: Si le chiot de rat ne pousse pas bien ou l'inflammation est observée autour du site de la chirurgie, exclure l'animal à partir des expériences.
Representative Results
Un exemple d'un nerf sciatique transfectées avec la protéine fluorescente rouge (RFP) exprimant le plasmide est représenté sur la figure 2A. Les cellules présentant une morphologie bipolaire, une caractéristique de SCs, ont été faiblement transfectées avec DP. Aucune fluorescence de DP a été détectée dans les axones. Nous trouvons généralement ~ 100 SCs transfectées dans chaque nerf. Cette efficacité de transfection semble similaire à l'in vivo SC efficacité de l' infection en utilisant des vecteurs lentiviraux 4.
Expériences immunocoloration ont montré que la plupart (~ 96%) , les cellules de la DP-positif à P7 co-marquée pour S100, un marqueur de SC (figure 2B), et 91% des cellules de la DP-positif au P14 co-marquée pour PBM, un marqueur myélinisation SC (figure 2C), ce qui suggère que le transfert de gène par électroporation est hautement sélectif pour myélinisantes SC.
L'introduction de plusieurs gènes dans SCs
Chez les rongeurs, la myélinisation lance autour de la naissance, ce qui augmente de façon spectaculaire au cours des deux premières semaines après la naissance, puis diminue progressivement. Ainsi, en manipulant génétiquement SCs au cours de ces fenêtres de temps de développement, les mécanismes sous-jacents à ces différents stades de myélinisation peuvent être clarifiées. Les vecteurs lentiviraux sont un bon outil pour unenalyzing myélinisation, en particulier car ils ont une toxicité minimale, mais lentivirus seulement infecter néonatale nerfs sciatiques 5,6. A titre de comparaison, le transfert de gène à médiation par électroporation fonctionne bien lorsque la transfection est réalisée sur P3 (Figure 2E, partie supérieure) ou P14 (figure 2E, en bas).
Les applications du roman dans la méthode d'électroporation in vivo sont décrits ici. La figure 3A montre des images au microscope optique de GFP exprimant myélinisantes SCs à divers stades de développement (P7, P14, P21 et P31). Par l'analyse au microscope optique, les changements de paramètres morphologiques, tels que la longueur et le diamètre, peuvent être évalués. A noter que ces paramètres ont des valeurs similaires par rapport aux rats intacts les nerfs périphériques 15,16, ce qui indique que les nerfs développent électroporées sans effets néfastes significatifs. La figure 3B montre une image au microscope électronique de LacZ expressing myélinisantes SCs. Dans ce cas, LacZ a été utilisé comme marqueur d'expression. β-galactosidase en utilisant Bluo-gal, un substrat insoluble dans l'éthanol, permet l'analyse de la structure de la myéline SCs transfectées par microscopie électronique à 11,17. Dans ces expériences, le rôle des molécules de signalisation peut être examinée en faisant taire ou d'augmenter leur expression, permettant ainsi à l'analyse de la perte de fonction ou des effets de gain de fonction. En plus de l'analyse des tissus fixés, in vivo , le transfert de gène à médiation par électroporation peut également être appliquée à vivre des expériences d'imagerie. Par exemple, la figure 3C montre une myélinisation SC co-exprimant G-GECO1.1 18, un indicateur vert fluorescent cytosolique Ca 2+, et R-GECO1mt 19, un indicateur rouge fluorescent mitochondrial Ca 2+. En exprimant ces indicateurs, nous avons identifié une voie de signalisation qui contrôle cytosoliques et mitochondriales Ca 2+ concentrations dans myélinisantes SCs . Ainsi, la présente méthode peut être utilisée pour étudier une variété de mécanismes de signalisation, en particulier lorsque des sondes fluorescentes génétiquement codés sont disponibles pour détecter les signaux d'intérêt.
Figure 1:. Schéma de l'i n vivo électroporation Méthode d' abord, le nerf sciatique du rat anesthésié est exposé. En second lieu, l'ADN du plasmide est injecté dans le nerf sciatique. Troisièmement, les impulsions électriques sont délivrées au site d'injection à travers l'électrode en forme de pince. Enfin, la plaie est fermée avec de la colle. Cette procédure peut être répétée sur le nerf controlatéral. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Les résultats représentatifs sur nerfs sciatiques transfectées (A) Une image représentative d'un nerf sciatique transfectées.. Le nerf a été transfecté avec le plasmide de DP exprimant à P3, et fixé à P7. (B) Une image représentative d'une cellule DP-transfectées à P7 montrant colocalisation avec S100, un marqueur de SC. (C) Une image représentative d'un nerf sciatique DP-transfectées à P14 montrant colocalisation avec PBM, un marqueur myélinisation SC. (D) Une image représentative d'un nerf sciatique cotransfectées avec la GFP et les plasmides de la DP-exprimant. SCs transfectées exprimés simultanément GFP et RFP. (E) Une image de myélinisation SCs à P31 transfectées à P3, lorsque la myélinisation commence ( en haut), et une image de SCs myélinisantes à P31 transfectées au P14, lorsque la plupart des grandes axones deviennent myélinisées ( en bas), ce qui suggère que transfection de SCs myélinisantes peut être atteint non seulement dans les nerfs néonatals, mais aussi dans les nerfs plus matures. Les barres d'échelle = 200 pm (A); 50 pm (BE). Ce chiffre a été modifié à partir de notre publication précédente 11. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Application in vivo électroporation (A) Une analyse au microscope optique du développement de la myélinisation SCs.. nerfs sciatiques ont été électroporés avec le plasmide exprimant la GFP à P3, et ont été fixés à différents stades de développement (P7, P14, P21 et P31). Des images représentatives de GFP-positives SCs sont indiqués sur la gauche. La longueur moyenne et le diamètre sont résumés comme moyenne ± SEM (n = 30-47 de 3 nerfs) sur la droite. La longueur et le diamètre de myélinisation augmente SCs que le développement se poursuit. (B) Une image au microscope électronique d'un nerf sciatique transfectée avec un LacZ codant pour le plasmide. Un SC transfectée (astérisque blanc, à gauche) a été marqué avec finement précipités du produit de la réaction β-galactosidase. (C) Une image d'un SC cotransfecté avec G-GECO1.1, un indicateur vert fluorescent cytosolique Ca 2+, et R-GECO1mt, un indicateur rouge fluorescent mitochondrial Ca 2+. Les régions dans les rectangles en pointillés blancs sont représentés élargie dans les panneaux sur la droite. Barres d'échelle = 50 pm (A et C); 1 pm (B). Ce chiffre a été modifié à partir de notre publication précédente 11. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 03 143 422 001 | Plasmid DNA purification kit |
| Fast Green CFC | WAKO | 069-00032 | Dye for DNA injection |
| GC 150T-10 | HARVARD APPARATUS | 30-0062 | Glass capillary |
| Suction tubing | Drummond | 05-2000-00 | Suction tubing for micro injection |
| MODEL P-97 | SUTTER INSTRUMENT CO. | Micropipette puller | |
| CUY21 Single Cell | BEX | Electroporator CUY21 Single Cell | Pulse generator |
| Electric warmer | KODEN | CAH-6A | Warmer during the surgery |
| Isofluolane | Mylan | 1119701G1076 | Anesthetic |
References
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