Protocol
השימוש חולדות למחקר היה בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי ועדת צער בעלי חיים של אוניברסיטת טוקיו.
1.Preparation של DNA פלסמיד
- צור פלסמידים DNA עבור electroporation in vivo על ידי subcloning את cDNA או רצף shRNA לתוך פלסמיד ביטוי בתאי יונקים 12. השתמש משפר מוקדם מיידי ציטומגלווירוס והעוף β-יקטין היתוך אמרגן (CAG) פלסמיד מונחה אמרגן 13 משום שהיא מאפשרת ביטוי חזק ויציב. עבור ביטוי של shRNAs תחת השליטה של מקדם חטיבה, להשתמש במערכת קלטת shRNA מבוסס mir30 עבור subcloning את shRNA 14.
- לטהר DNA פלסמיד עם ערכת maxi-prep פי הוראות היצרן, ו resuspend DNA עם בופר-HEPES (140 mM NaCl, 0.75 מ"מ Na 2 4 HPO, 25 HEPES מ"מ; pH 7.40). התאם את הריכוז של ה- DNA כדי ≥4 מיקרוגרם / μl.
עיקור 2. של מכשירי ניתוח מלוח
- מכשירי ניתוח חיטוי פתרון NaCl 0.9%.
3. הכנה של זכוכית Micropipette
- משוך טפטפות זכוכית באמצעות חולץ פיפטה. חותכים את קצה פיפטה בקוטר של 30-50 מיקרומטר. השתמש בפרמטרים הבאים: חום, 600; מהירות, 50; זמן, 75.
4. ניתוח בעלי חיים, הזרקת דנ"א Electroporation
הערה: מעללאור שלב זה מתואר באיור 1. למרות ההליך עבור גורי חולדה מתואר כאן, השיטה היא גם לגבי בעלי חיים בוגרים יותר באותו אופן.
- להרדים חולדה עם isoflurane בתיבת האינדוקציה עד שהחיה הופכת נייחת ידי התאמת זרימת חמצן 0.4 L / min ואת ריכוז isoflurane ל -4% (כרך / כרך). בצע בוהן צביטה כדי לאשר הרדמה תקינה.
- מכניסים את החולדה על שחומם מראש חם תחת מיקרוסקופ המשקפת, ולשמור הרדמה על ידי מתן isoflurane ברציפות דרך מסיכת פנים. התאם את זרימת החמצן 0.2 L / min ואת הריכוז isoflurane עד 2% (כרך / כרך). עין להשתמש בטיפות כדי למנוע יובש של עיניים אם העיניים של החיה פתוחות.
- תקן את הרגליים בעזרת פלסטר.
- נקה את העור על הירך האחורית עם יוד povidone, ולעשות חתך עם אזמל.
הערה: לגלח באזורים כירורגית אם האזורים כירורגית מכוסים hאוויר. - לחשוף את עצב השת ידי יצירת פתח בין שריר הירך הארבע ראשי ואת שריר הירך הדו-ראשי עם מחטי תפירה.
- להרטיב את העצב עם פתרון 0.9% NaCl. ספוג מים עודפים עם נייר נטול סיבים.
- הכנס את הבסיס של micropipette זכוכית על צינור גמיש, ולמלא את כמות נאותה של פתרון ה- DNA (לפחות מיקרוליטר אחד) לתוך micropipette ידי aspirating בעדינות.
- הרם את העצבים החשופים ידי משיכת הצד הדיסטלי בעדינות של העצב באמצעות מחט.
הערה: אין ליישם מתח החוצפה למזער לחץ מכאני. - הכנס את micropipette זכוכית לשטח האתר דיסטלי על העצב, ולהזריק את פתרון ה- DNA על ידי הפעלת לחץ (כלומר על ידי נושף לתוך הקצה הפתוח של הצינור הגמיש). להזריק פתרון ה- DNA עד העצב נראה ירוק (1 מקסימום μl). מכיוון כניסה תכופה של micropipette יכול לפגוע בעצב, אל תכניסו את micropipette יותר מפעמים.
- מניחים tweעזר מסוג פלטינה אלקטרודה על זה מזה 1-2 מ"מ מן העצב. למלא את הפער בין האלקטרודה ואת העצב עם פתרון 0.9% NaCl.
הערה: אל תקרב את העצב עם אלקטרודה כדי למנוע לחץ מכני על העצב. - החל פולסים חשמליים על הזריקה באמצעות electroporator עם האלקטרודה. אחרי סט הדופק הראשון, להפוך את האלקטרודה ולהחיל סט דופק אחר. השתמש בפרמטרים הבאים: מתח, 50 V; משך דופק, 5 אלפיות שנייה; מרווח דופק, 100 msec; מספר דופק, 4 פעמים.
- נקה את אתר electroporation עם תמיסת 0.9% NaCl.
- חזור על שלבים 4.4-4.11 על גיד הנשה הנגדי.
5. לאחר electroporation
- סגור את החתכים עם דבק cyanoacrylate.
- לאחר ייבוש הדבק, לנקות את הפצע עם יוד povidone.
- שחרר את הגור מן מסיכת פנים. לחמם את הגור על חם לפחות במשך שעה על מנת לאפשר לו להתאושש מהרדמה מלאה. Do ישאיר את הגור ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו מספיק.
- לאחר ההתאוששות מן ההרדמה, להחזיר את הגור אל החולדה האם. אל תשלח את הגור עד התאושש לחלוטין.
6. לאחר ניתוח
- בית גורי החולדה בכלוב עד עורכי הניסויים 11 (ראה דוגמאות באיור 3). נהל carprofen (5 מ"ג / ק"ג; ip) חברה לא סטרואידיות נוגדות דלקת התרופה, או עצירות (0.1 מ"ג / ק"ג, SC), משכך כאבים אופיואידים, אם נדרש.
הערה: אם את גור החולדה אינו גדל היטב או דלקת הוא ציין סביב אתר הניתוח, אל תכלול את החיה מן הניסויים.
Representative Results
דוגמא גיד הנשה טרנספקציה עם חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) -expressing פלסמיד מוצגת איור 2 א. תאים מראים מורפולוגיה דו קוטבית, מאפיין של גיל, היו transfected בדלילות עם RFP. לא קרינת RFP זוהתה אקסונים. בדרך כלל אנחנו מוצאים ~ 100 גיל טרנספקציה בכל עצב. יעילות transfection זה נראה דומה יעילות זיהום in vivo SC באמצעות 4 וקטורים lentiviral.
ניסויי Immunostaining הראו כי רוב (~ 96%) תאי RFP החיובי ב P7 שיתוף שכותרתו עבור S100, סמן SC (איור 2 ב), ו -91% של תאי RFP-חיובי P14 שיתוף שכותרתו עבור MBP, סמן myelinating SC (איור 2 ג), דבר המצביע כי העברת גנים ידי electroporation הוא סלקטיבי מאוד עבור myelinating גיל.
מבוא של מספר רב של גנים לתוך גיל
במכרסמים, myelination יוזם סביב לידה, להגדיל באופן משמעותי במהלך השבועות הראשונים לאחר לידה, ולאחר מכן פוחת בהדרגה. לכן, על ידי מניפולציה גנטית SCS במהלך חלונות זמן התפתחותיים אלו, המנגנונים בשלבים שונים אלה של מעטפת המיאלין יכולים להתברר. וקטורי Lentiviral הם כלי טובnalyzing myelination, במיוחד כאשר יש להם רעילות מינימלית, אבל lentiviruses רק להדביק 5,6 עצבים הנשה בילוד. לשם השוואה, העברת גנים בתיווך electroporation עובד היטב כאשר transfection מתנהל על P3 (איור 2E, למעלה) או על P14 (איור 2E, למטה).
היישומים של הרומן בשיטה electroporation vivo מתוארים כאן. איור 3A מראה תמונות מיקרוסקופיות לאור GFP להביע גיל myelinating בשלבים התפתחותיים שונים (P7, P14, P21 ו P31). על ידי ניתוח מיקרוסקופי אור, שינויים בפרמטרים מורפולוגיים, כגון אורך וקוטר, ניתן להעריך. שים לב הפרמטרים האלה יש ערכים דומים לעומת עצבים היקפיים עכברוש שלם 15,16, הדבר המצביעים על כך את עצבי electroporated להתפתח ללא השפעות מזיקות משמעותיות. איור 3 ב מציג תמונה מיקרוסקופית אלקטרונים של LacZ-expressing myelinating גיל. במקרה זה, LacZ שימש כסמן הביטוי. β-galactosidase מכתים באמצעות bluo-gal, מצע מסיס-אתנול, מאפשר ניתוח הרכב המיאלין של גיל transfected על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים 11,17. בניסויים אלה, את התפקיד של מולקולות איתות יכול להיבדק על ידי השתקה או משלים הביטוי שלהם, ובכך לאפשר ניתוח של אובדן של פונקציה או לזכות של פונקציה אפקטים. בנוסף הניתוח של רקמות קבועות, העברת גני vivo בתיווך electroporation יכולה להיות מיושמת גם לחיות ניסויי הדמיה. לדוגמה, איור 3 ג מראה SC myelinating שיתוף להביע G-GECO1.1 18, אינדיקטור Ca cytosolic פלואורסצנטי ירוק 2+, ו- R-GECO1mt 19, מחוון אדום ניאון המיטוכונדריה Ca 2+. על ידי בעת אינדיקטורים אלה, זיהינו מסלול איתות שולט cytosolic המיטוכונדריה Ca 2 + ריכוזים ב myelinating גיל . לכן, השיטה הנוכחית שניתן להשתמש בם כדי ללמוד מגוון רחב של מנגנוני איתות, במיוחד כאשר בדיקות ניאון גנטית בקידוד זמינות כדי לזהות את האותות של עניין.
איור 1:. סכמטי של i n vivo Electroporation השיטה הראשונה, עצב השת של עכברוש הרדים חשוף. שנית, פלסמיד DNA מוזרק לתוך גיד הנשה. פולסים שלישיים, חשמל מועברים על הזריקה דרך האלקטרודה מלקחיים בצורה. לבסוף, הפצע נסגר עם דבק. הליך זה ניתן לחזור על העצב הנגדי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: נציג תוצאות על העצבים Sciatic טרנספקציה (א) תמונה מייצגת של עצב השת transfected.. העצב היה transfected עם פלסמיד להביע RFP ב P3 ו- קבוע ב P7. (ב) תמונה מייצגת של תא RFP-טרנספקציה ב P7 מראה colocalization עם S100, סמן SC. (C) תמונה מייצגת של עצב השת-טרנספקציה RFP ב P14 מראה colocalization עם MBP, סמן SC myelinating. (ד) תמונה מייצגת של עצב השת cotransfected עם GFP ו פלסמידים להביע RFP. גיל טרנספקציה זמנית הביע GFP ו RFP. (ה) תמונה של myelinating SCS ב P31 transfected ב P3, כאשר מעטפת המיאלין (למעלה), וכן תמונה של גיל myelinating ב P31 transfected ב P14, כאשר האקסונים הגדולים ביותר להפוך myelinated (למטה), דבר המצביע על transf כישיקוף של גיל myelinating יכול להיות מושגת לא רק עצבים בילוד, אלא גם בעצבים בוגרים יותר. ברי סולם = 200 מיקרומטר (א); 50 מיקרומטר (BE). נתון זה היה שונה מן הפרסום הקודם שלנו 11. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: יישום של in vivo Electroporation (א) ניתוח מיקרוסקופי לאור התפתחות myelinating גיל.. עצבים הנשה היו electroporated עם פלסמיד להביע GFP ב P3 ו- תוקנו בשלבים התפתחותיים שונים (P7, P14, P21 ו P31). נציג תמונות של גיל GFP החיובי מוצגות בצד השמאל. אורכו וקוטרו הממוצע מסוכמים ממוצע ± SEM (n = 30 - 47 מ 3 עצבים) מימין. אורכו וקוטרו של myelinating עליות גיל כמו תמורת פיתוח. (ב) תמונה מיקרוסקופית אלקטרונים של עצב השת טרנספקציה עם LacZ קידוד פלסמיד. SC טרנספקציה (כוכבית לבנה, משמאל) הייתה שכותרתו דקה עם משקעים של מוצר התגובה β-galactosidase. (C) תמונה של SC cotransfected עם G-GECO1.1, אינדיקטור ירוק ניאון cytosolic Ca 2 +, ו- R-GECO1mt, אינדיקטור אדום ניאון המיטוכונדריה Ca 2+. האזורים בתוך המלבנים הלבנים המנוקדים מוצגים מוגדל הפנלים מצד ימין. ברי סולם = 50 מיקרומטר (A ו- C); 1 מיקרומטר (B). נתון זה היה שונה מן הפרסום הקודם שלנו 11. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 03 143 422 001 | Plasmid DNA purification kit |
| Fast Green CFC | WAKO | 069-00032 | Dye for DNA injection |
| GC 150T-10 | HARVARD APPARATUS | 30-0062 | Glass capillary |
| Suction tubing | Drummond | 05-2000-00 | Suction tubing for micro injection |
| MODEL P-97 | SUTTER INSTRUMENT CO. | Micropipette puller | |
| CUY21 Single Cell | BEX | Electroporator CUY21 Single Cell | Pulse generator |
| Electric warmer | KODEN | CAH-6A | Warmer during the surgery |
| Isofluolane | Mylan | 1119701G1076 | Anesthetic |
References
- Nave, K. A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 503-533 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nat Protoc. 9, 1956-1968 (2014).
- Cotter, L., et al. Dlg1-PTEN interaction regulates myelin thickness to prevent damaging peripheral nerve overmyelination. Science. 328, 1415-1418 (2010).
- Gonzalez, S., Fernando, R. N., Perrin-Tricaud, C., Tricaud, N. In vivo introduction of transgenes into mouse sciatic nerve cells in situ using viral vectors. Nat Protoc. 9, 1160-1169 (2014).
- Ozcelik, M., et al. Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves. J Neurosci. 30, 4120-4131 (2010).
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
- Glatzel, M., et al. Adenoviral and adeno-associated viral transfer of genes to the peripheral nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 442-447 (2000).
- Homs, J., et al. Schwann cell targeting via intrasciatic injection of AAV8 as gene therapy strategy for peripheral nerve regeneration. Gene Ther. 18, 622-630 (2011).
- Aspalter, M., et al. Modification of Schwann cell gene expression by electroporation in vivo. J Neurosci Methods. 176, 96-103 (2009).
- Ino, D., et al. Neuronal Regulation of Schwann Cell Mitochondrial Ca(2+) Signaling during Myelination. Cell Rep. 12, 1951-1959 (2015).
- Struhl, K. Chapter 3; Subcloning of DNA fragments. Curr Protoc Mol Biol. , Unit3 16 (2001).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Chang, K., Elledge, S. J., Hannon, G. J. Lessons from Nature: microRNA-based shRNA libraries. Nat Methods. 3, 707-714 (2006).
- Schlaepfer, W. W., Myers, F. K. Relationship of myelin internode elongation and growth in the rat sural nerve. J Comp Neurol. 147, 255-266 (1973).
- Webster, H. D. The geometry of peripheral myelin sheaths during their formation and growth in rat sciatic nerves. J Cell Biol. 48, 348-367 (1971).
- Weis, J., Fine, S. M., David, C., Savarirayan, S., Sanes, J. R. Integration site-dependent expression of a transgene reveals specialized features of cells associated with neuromuscular junctions. J Cell Biol. 113, 1385-1397 (1991).
- Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca(2)(+) indicators. Science. 333 (2), 1888-1891 (2011).
- Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153 (2014).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev Growth Differ. 50, 507-511 (2008).
- Taveggia, C., Feltri, M. L., Wrabetz, L. Signals to promote myelin formation and repair. Nat Rev Neurol. 6, 276-287 (2010).
- Saijilafu,, Hur, E. M., Zhou, F. Q. Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nat Commun. 2, 543 (2011).
- Tanaka, Y., Hirokawa, N. Mouse models of Charcot-Marie-Tooth disease. Trends Genet. 18, S39-S44 (2002).
