Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

В естественных условиях переноса гена к шванновских клеток в нерве Грызун седалищного путем электропорации

Published: September 8, 2016 doi: 10.3791/54567
Automatic Translation
1,2, 1
1Department of Pharmacology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 2Laboratory for Cell Polarity Regulation, Quantitative Biology Center, RIKEN

Protocol

Использование крыс для исследования было сделано в соответствии с правилами, установленными Комитетом по охране животных из Университета Токио.

1.Preparation плазмидной ДНК

  1. Генерирование ДНК плазмид для электропорации в естественных условиях путем субклонирования кДНК или последовательность shRNA в плазмиде экспрессии для клеток млекопитающих 12. Используйте цитомегаловируса ранние усиливающие и куриные бета-актина фьюжн (CAG) промотор-приводом плазмиды 13 , поскольку она позволяет сильной и стабильной экспрессии. Для экспрессии shRNAs под контролем промотора CAG, используют mir30 на основе системы кассетного shRNA дл субклонировани в shRNA 14.
  2. Очищают плазмидной ДНК с помощью макси-Prep Kit в соответствии с инструкциями производителя, и ресуспендируют ДНК с HEPES-буферном солевом растворе (140 мМ NaCl, 0,75 мМ Na 2 HPO 4, 25 мМ HEPES, рН 7,40). Отрегулируйте концентрацию ДНК ≥ 4 мкг / мкл.
    3. Примечание: оптимальный состав плазмидных ДНК должна быть определена в соответствии с эффективности трансфекции каждой плазмиды.

2. Стерилизация хирургических инструментов и физиологический раствор

  1. Автоклавы хирургические инструменты и 0,9% раствор NaCl.

3. Подготовка стекла микропипетки

  1. Потянуть стеклянные пипетки с помощью пипетки съемник. Обрежьте кончик пипетки диаметром 30-50 мкм. Используйте следующие параметры: Тепло, 600; Скорость, 50; Время, 75.

4. Хирургическое лечение животных, инъекции ДНК и электропорация

Примечание: за кадромвид этого шага описана на рисунке 1. Хотя процедура для крысят описаны здесь, способ также применим к более зрелых животных с использованием той же процедуры.

  1. Обезболить крыс с изофлуран в индукционной коробке, пока животное не будет неподвижен путем регулировки потока кислорода до 0,4 л / мин и изофлуран концентрации до 4% (об / об). Выполните палец щипать, чтобы подтвердить правильность обезболивание.
  2. Поместите крысу на подогретый теплее под бинокулярным микроскопом, и поддержания анестезии путем непрерывного введения изофлуран через маску. Отрегулировать поток кислорода до 0,2 л / мин и изофлуран концентрации до 2% (об / об). Используйте глазные капли, чтобы предотвратить сухость глаз, если глаза животного открыты.
  3. Зафиксируйте ноги с хирургической лентой.
  4. Очистите кожу на задней бедра с повидон-йодом, и сделать надрез скальпелем.
    Примечание: Бритье хирургические области, если хирургические участки покрыты чвоздух.
  5. Выставляют седалищный нерв, создавая отверстие между четырехглавой мышцы бедра и двуглавая мышца бедра с швейными иглами.
  6. Влажные нерва с 0,9% раствором NaCl. Поглощенный избыток воды с безворсовой бумаги.
  7. Вставьте основание стеклянной микропипетки на гибкой трубки, и заполнить достаточное количество раствора ДНК (по крайней мере, один микролитр) в микропипетки, осторожно аспирационных.
  8. Поднимите обнаженный нерв, осторожно потянув дистальной стороны нерва с помощью иглы.
    Примечание: Не прикладывайте напряжение к нерву, чтобы минимизировать механическое напряжение.
  9. Вставьте стекло микропипетки в дистальный участок на нерв, и впрыскивают раствор ДНК, применяя давление (например , путем продувки в открытый конец гибкой трубки). Вводят раствор ДНК до тех пор, пока не появится нерв зеленым (максимум 1 мкл). Поскольку частое введение микропипетки может повредить нерв, не вставляйте микропипетка более чем в два раза.
  10. Поместите TWEэцер типа платинового электрода около 1-2 мм друг от друга от нерва. Заполните зазор между электродом и нервом с 0,9% -ным раствором NaCl.
    Примечание: Не держите нерва с электродом, чтобы избежать механических напряжений на нерв.
  11. Применение электрических импульсов на месте инъекции с использованием электропоратора с электродом. После первого набора импульсов, инвертировать электрода и применить другой набор импульсов. Используйте следующие параметры: напряжение, 50 В; длительность импульса, 5 мс; интервал между импульсами, 100 мс; число импульсов, в 4 раза.
  12. Очистите сайт электропорации с 0,9% раствором NaCl.
  13. Повторите шаги 4.4-4.11 на контралатеральной седалищного нерва.

5. После электропорации

  1. Закройте надрезы с цианакриловым клеем.
  2. После высыхания клея, очистить рану с повидон-йодом.
  3. Отпустите детеныша от лицевой маски. Подогреть на детеныша теплее по крайней мере, в течение часа, с тем чтобы позволить ему полностью восстановиться от анестезии. Dо не оставляйте без присмотра щенка, пока он не пришел в сознание достаточное.
  4. После выхода из наркоза, вернуть щенка к матери крысы. Не возвращать щенка, пока полностью не выздоровел.

6. Послеоперационный

  1. Дом в крысят в клетке до проведения опытов 11 (смотри примеры на рисунке 3). Администрирование карпрофен (5 мг / кг; бр), нестероидный противовоспалительный препарат, или бупренорфин (0,1 мг / кг, подкожно), опиоидного анальгетика, в случае необходимости.
    Примечание: Если щенок крысы не растут хорошо или воспаление наблюдается вокруг места операции, исключить животное из экспериментов.

Representative Results

Примером седалищного нерва, трансфицированных красный флуоресцентный белок (RFP) -expressing плазмиды показана на фигуре 2А. Клетки, демонстрирующие биполярного морфологии, характеристика ГКС, были слабо трансфицировали RFP. Ни один ЗП флуоресценции не был обнаружен в аксонах. Как правило, мы находим ~ 100 трансфецированных в каждом SCs нерва. Эта эффективность трансфекции кажется похож на SC эффективность инфекции в естественных условиях с использованием лентивирусов векторов 4.

Иммунным окрашиванием эксперименты показали , что большинство (~ 96%) RFP-положительных клеток при Р7 со-меченого для S100, КА маркера (Фигура 2В), и 91% от RFP-положительных клеток при Р14 со-меченого для МВР, в myelinating SC маркера (фиг.2С), предполагая , что перенос генов с помощью электропорации является высоко селективным для myelinating ГКС.

Введение нескольких генов в SCs естественных условиях методом электропорации в описанном здесь является способность передавать несколько генов с помощью простой процедуры. На рисунке 2D показан репрезентативный изображение седалищного нерва , трансфицированных смесью GFP и RFP-экспрессирующих плазмид с использованием в естественных условиях электропорации. Около 97% ГКС были GFP и RFP двойной положительный, предполагая, что высокую эффективность доставки множества генов может быть достигнуто путем простого электропорации смеси нескольких плазмид.

У грызунов, миелинизации инициирует вокруг рождения, резко возрастает в течение первых двух недель после рождения, а затем постепенно уменьшается. Таким образом, с помощью методов генной манипуляции во время этих SCs развития временных окон, механизмы, лежащие в основе этих различных стадий миелинизации могут быть уточнены. Lentiviral векторы являются хорошим инструментом дляnalyzing миелинизации, в частности , так как они имеют минимальную токсичность, но лентивирусов инфицируют только неонатальной седалищного нервов 5,6. Для сравнения, электропорации-опосредованный перенос генов хорошо работает , когда трансфекция проводится на P3 (рис 2Е, сверху) или на Р14 (рис 2Е, внизу).

Применения романа в естественных условиях методом электропорации описаны здесь. На рисунке 3А показаны легкие микроскопические изображения GFP-экспрессирующие myelinating SCs на различных стадиях развития (P7, P14, P21 и P31). При легкой микроскопического анализа, изменения морфологических параметров, таких как длина и диаметр, можно оценить. Обратите внимание , что эти параметры имеют близкие значения по сравнению с неповрежденной крыс периферических нервов 15,16, предполагая , что электропорации нервы развиваются без значительных вредных эффектов. На рис 3B показана электронная микроскопическое изображение LacZ-expressing myelinating SCS. В этом случае, LacZ, был использован в качестве маркера экспрессии. β-галактозидазы окрашивание с использованием Bluo-гал, этанол нерастворимый субстрат, дает анализ структуры миелина трансфицированных SCs с помощью электронной микроскопии 11,17. В этих экспериментах роль сигнальных молекул могут быть исследованы с помощью глушителей или увеличении их выражение, таким образом, позволяя анализировать с потерей функции или усиления из-функции эффектов. В дополнение к анализу фиксированной ткани, в естественных условиях электропорации-опосредованный перенос генов может быть также применен жить эксперименты визуализации. Например, на рисунке 3C показывает myelinating SC коэкспрессирующей G-GECO1.1 18, зеленый флуоресцентный индикатор цитозольного Ca 2+ и R-19, GECO1mt красный флуоресцентный митохондриальный индикатор Ca 2+. Выражая эти показатели, мы определили сигнальный путь , который управляет цитозольных и митохондриальных Ca 2+ концентрации в myelinating SCs , Таким образом, настоящий способ может быть использован для изучения различных сигнальных механизмов, в частности, когда генетически кодируемые флуоресцентные зонды доступны для обнаружения сигналов, представляющих интерес.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Схема I N естественных условиях электропорации первый метод, седалищного нерва у анестезированных крыс подвергается. Во-вторых, плазмидная ДНК вводят в седалищный нерв. В-третьих, электрические импульсы поступают на месте инъекции через щипцов-образный электрод. Наконец, рана закрыта с клеем. Эта процедура может быть повторена на контралатеральной нерва. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

"> фигура 2
Рисунок 2: Представитель Результаты по трансфицированных седалищного нервах (А) представитель образ трансфицированных седалищного нерва.. Нерв трансфицировали RFP-экспрессирующих плазмид в P3, и фиксируется на Р7. (Б) представитель образ RFP-трансформированных клеток при Р7 показывая колокализацию с S100, в SC маркером. (C) представитель образ RFP-трансфицировали седалищного нерва при P14 , показывая колокализацию с МВР, в myelinating SC маркера. (D) представитель образ седалищного нерва котрансфицируют с GFP и RFP , экспрессирующих плазмид. Трансфицированных Стволовые одновременно выражали GFP и RFP. (E) Изображение myelinating SCs на P31 , трансфицированные в P3, когда начинается миелинизации (вверху), и образ myelinating SCs на P31 трансфицировали в P14, когда большинство крупных аксонов становятся миелинизированы (внизу), предполагая , что Transfпрогиб из myelinating SCs может быть достигнуто не только в неонатальной нервов, но и в более зрелых нервов. Шкала баров = 200 мкм (А); 50 мкм (BE). Эта цифра была изменена с нашей предыдущей публикации 11. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Применение в естественных условиях электропорации (а) световой микроскопический анализ развития myelinating ГКС.. Седалищный нервы были электропорации с GFP-экспрессирующие плазмиды в P3, и были зафиксированы на разных стадиях развития (P7, P14, P21 и P31). Типичные изображения GFP-положительных SCs показаны на левой стороне. Средняя длина и диаметр суммированы в виде среднего значения ± SEM (n = 30 - 47 из 3-х нервов) справа. Длина и диаметр myelinating SCS увеличивается по мере развития. (В) Электронно - микроскопический образ седалищного нерва , трансфицированных плазмидой , кодирующей LacZ. Трансфицированной SC (белая звездочка, слева) тонко метят выделениями продукта реакции β-галактозидазы. (C) Изображение SC котрансфицируют с G-GECO1.1, зеленый флуоресцентный цитозольного индикатора Са 2+ и R-GECO1mt, красный флуоресцентный митохондриального индикатора Са 2+. Области внутри белых пунктирными прямоугольниками показаны в увеличенном виде панелей справа. Масштабные полоски = 50 мкм (А и С); 1 мкм (Б). Эта цифра была изменена с нашей предыдущей публикации 11. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Genopure Plasmid Maxi Kit Roche 03 143 422 001 Plasmid DNA purification kit
Fast Green CFC WAKO 069-00032 Dye for DNA injection
GC 150T-10 HARVARD APPARATUS 30-0062 Glass capillary
Suction tubing Drummond 05-2000-00 Suction tubing for micro injection
MODEL P-97 SUTTER INSTRUMENT CO. Micropipette puller
CUY21 Single Cell BEX Electroporator CUY21 Single Cell Pulse generator
Electric warmer KODEN CAH-6A Warmer during the surgery
Isofluolane Mylan 1119701G1076 Anesthetic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nave, K. A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 503-533 (2014).
  2. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
  3. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nat Protoc. 9, 1956-1968 (2014).
  4. Cotter, L., et al. Dlg1-PTEN interaction regulates myelin thickness to prevent damaging peripheral nerve overmyelination. Science. 328, 1415-1418 (2010).
  5. Gonzalez, S., Fernando, R. N., Perrin-Tricaud, C., Tricaud, N. In vivo introduction of transgenes into mouse sciatic nerve cells in situ using viral vectors. Nat Protoc. 9, 1160-1169 (2014).
  6. Ozcelik, M., et al. Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves. J Neurosci. 30, 4120-4131 (2010).
  7. Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
  8. Glatzel, M., et al. Adenoviral and adeno-associated viral transfer of genes to the peripheral nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 442-447 (2000).
  9. Homs, J., et al. Schwann cell targeting via intrasciatic injection of AAV8 as gene therapy strategy for peripheral nerve regeneration. Gene Ther. 18, 622-630 (2011).
  10. Aspalter, M., et al. Modification of Schwann cell gene expression by electroporation in vivo. J Neurosci Methods. 176, 96-103 (2009).
  11. Ino, D., et al. Neuronal Regulation of Schwann Cell Mitochondrial Ca(2+) Signaling during Myelination. Cell Rep. 12, 1951-1959 (2015).
  12. Struhl, K. Chapter 3; Subcloning of DNA fragments. Curr Protoc Mol Biol. , Unit3 16 (2001).
  13. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  14. Chang, K., Elledge, S. J., Hannon, G. J. Lessons from Nature: microRNA-based shRNA libraries. Nat Methods. 3, 707-714 (2006).
  15. Schlaepfer, W. W., Myers, F. K. Relationship of myelin internode elongation and growth in the rat sural nerve. J Comp Neurol. 147, 255-266 (1973).
  16. Webster, H. D. The geometry of peripheral myelin sheaths during their formation and growth in rat sciatic nerves. J Cell Biol. 48, 348-367 (1971).
  17. Weis, J., Fine, S. M., David, C., Savarirayan, S., Sanes, J. R. Integration site-dependent expression of a transgene reveals specialized features of cells associated with neuromuscular junctions. J Cell Biol. 113, 1385-1397 (1991).
  18. Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca(2)(+) indicators. Science. 333 (2), 1888-1891 (2011).
  19. Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153 (2014).
  20. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev Growth Differ. 50, 507-511 (2008).
  21. Taveggia, C., Feltri, M. L., Wrabetz, L. Signals to promote myelin formation and repair. Nat Rev Neurol. 6, 276-287 (2010).
  22. Saijilafu,, Hur, E. M., Zhou, F. Q. Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nat Commun. 2, 543 (2011).
  23. Tanaka, Y., Hirokawa, N. Mouse models of Charcot-Marie-Tooth disease. Trends Genet. 18, S39-S44 (2002).

Tags

Neuroscience выпуск 115 Шванн клеток седалищный нерв миелина развитие, электропорации нейробиологии
<em>В естественных условиях</em> переноса гена к шванновских клеток в нерве Грызун седалищного путем электропорации
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ino, D., Iino, M. In Vivo… More

Ino, D., Iino, M. In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation. J. Vis. Exp. (115), e54567, doi:10.3791/54567 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter