Protocol
El uso de ratas para la investigación estaba en conformidad con las directrices establecidas por el Comité de Protección de los Animales de la Universidad de Tokio.
1. Preparación de ADN plásmido
- Generar plásmidos de ADN para la electroporación in vivo por subclonación del cDNA o secuencia shRNA en un plásmido de expresión para células de mamíferos 12. Use un citomegalovirus temprano inmediato de potenciador y de pollo β-actina de promotor de fusión (CAG) promotor impulsado plásmido 13, ya que permite la expresión fuerte y estable. Para la expresión de shRNAs bajo el control de un promotor de CAG, utilizar un sistema de casete de shRNA basado en mir30 para subclonar el shRNA 14.
- Se purifica ADN de plásmido con un kit maxi-prep de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y resuspender el DNA con solución salina tamponada con HEPES (NaCl 140 mM, 0,75 mM Na 2 HPO 4, HEPES 25 mM; pH 7,40). Ajustar la concentración de DNA a ≥ 4 g / l.
2. La esterilización de instrumentos quirúrgicos y solución salina
- instrumentos quirúrgicos autoclave y la solución de NaCl 0,9%.
3. Preparación de la micropipeta de vidrio
- Tire de pipetas de vidrio utilizando un extractor de pipeta. Cortar la punta de la pipeta a un diámetro de 30 a 50 micras. Utilice los siguientes parámetros: Calor, 600; Velocity, 50; Tiempo, 75.
4. Cirugía animal, la inyección de ADN y la electroporación
Nota: Un excesovista de este paso es descrito en la Figura 1. Aunque se describen el procedimiento de crías de rata aquí, el método es también aplicable a animales más maduros utilizando el mismo procedimiento.
- Anestesiar la rata con isoflurano en el cuadro de inducción hasta que el animal se inmoviliza mediante el ajuste del flujo de oxígeno a 0,4 L / min y la concentración de isoflurano al 4% (vol / vol). Realizar dedo pellizcar para confirmar la anestesia adecuada.
- Ponga la rata en la precalentado más caliente bajo un microscopio binocular, y mantener la anestesia mediante la administración de isoflurano forma continua a través de la mascarilla. Ajuste el flujo de oxígeno a 0,2 L / min y la concentración de isoflurano al 2% (vol / vol). Aplique las gotas para evitar la sequedad de los ojos si los ojos del animal están abiertas.
- Fijar las piernas con cinta quirúrgica.
- Limpiar la piel en la cara posterior del muslo con povidona yodada, y hacer una incisión con un bisturí.
Nota: Afeitado áreas quirúrgicas si las áreas quirúrgicas están cubiertas con haire. - Exponer el nervio ciático mediante la creación de una abertura entre los músculo cuádriceps femoral y el músculo bíceps femoral con agujas de coser.
- Humedecer el nervio con una solución de NaCl al 0,9%. Absorber el exceso de agua con papel libre de pelusas.
- Insertar la base de una micropipeta de vidrio en tubo flexible, y llenar la cantidad adecuada de solución de ADN (por lo menos un microlitro) en la micropipeta aspirando suavemente.
- Levante el nervio expuesto tirando suavemente de la parte distal del nervio usando una aguja.
Nota: No aplicar tensión al nervio para minimizar el estrés mecánico. - Insertar la micropipeta de vidrio en el sitio distal sobre el nervio, e inyectar la solución de ADN por la aplicación de presión (es decir, por soplado en el extremo abierto del tubo flexible). Inyectar la solución de ADN hasta que aparezca el nervio verde (1 l como máximo). Debido a la inserción frecuente de la micropipeta puede dañar el nervio, no inserte la micropipeta más de dos veces.
- Coloque un TWEezer de tipo electrodo de platino de aproximadamente 1-2 mm de distancia del nervio. Llenar el hueco entre el electrodo y el nervio con una solución de NaCl al 0,9%.
Nota: No sostenga el nervio con el electrodo para evitar el estrés mecánico sobre el nervio. - Aplicar pulsos eléctricos a la zona de la inyección utilizando un electroporador con el electrodo. Después de la primera serie de impulsos, invierta el electrodo y aplicar otra serie de impulsos. Utilice los siguientes parámetros: tensión, 50 V; duración del pulso, a 5 mseg; intervalo de impulso, 100 mseg; número de impulsos, 4 veces.
- Limpiar el sitio de la electroporación con una solución de NaCl al 0,9%.
- Repita los pasos 4.4 a 4.11 en el nervio ciático contralateral.
5. Post-electroporación
- Cerrar las incisiones con pegamento de cianoacrilato.
- Después de secar el pegamento, limpiar la herida con povidona-yodo.
- Liberar al cachorro de la máscara de la cara. Calentar el cachorro en un calentador al menos durante una hora con el fin de permitir que se recupere completamente de la anestesia. reo deje desatendido el cachorro hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente.
- Después de la recuperación de la anestesia, devolver el cachorro a la rata madre. No devuelva el cachorro hasta que esté completamente recuperado.
6. Post-cirugía
- Casa las crías de ratas en la jaula hasta la realización de los experimentos 11 (ver ejemplos en la Figura 3). Administrar carprofeno (5 mg / kg; ip), un fármaco no esteroide anti-inflamatorio, o buprenorfina (0,1 mg / kg, sc), un analgésico opioide, si se requiere.
Nota: Si la cría de rata no crece bien o se observa inflamación alrededor del sitio de la cirugía, excluir a los animales a partir de los experimentos.
Representative Results
Un ejemplo de un nervio ciático transfectadas con la proteína fluorescente roja (RFP) expresando plásmido se muestra en la Figura 2A. Células que muestran la morfología bipolar, una característica de SCs, se transfectaron escasamente con RFP. No se detectó fluorescencia de RFP en los axones. Por lo general, encontramos ~ 100 SC transfectadas en cada nervio. Esta eficiencia de transfección parece similar a la eficacia de infección SC in vivo utilizando vectores lentivirales 4.
Experimentos de inmunotinción mostraban que la mayoría (~ 96%) de las células RFP-positiva en P7 co-etiquetados para S100, un marcador SC (Figura 2B), y 91% de las células RFP-positiva en P14 co-etiquetados para MBP, un marcador myelinating SC (Figura 2C), lo que sugiere que la transferencia génica mediante electroporación es altamente selectivo para myelinating SCs.
Introducción de múltiples genes en las SC
En roedores, la mielinización inicia alrededor del nacimiento, lo que aumenta drásticamente durante las dos primeras semanas después del nacimiento, y luego disminuye gradualmente. Por lo tanto, por la manipulación genética de las SC durante estas ventanas de tiempo de desarrollo, los mecanismos subyacentes a estos diferentes etapas de la mielinización se pueden aclarar. lentiviral vectores son una buena herramienta para unanalizado mielinización, en particular, ya que tienen una toxicidad mínima, pero los lentivirus infectan solamente neonatal nervios ciáticos 5,6. En comparación, la transferencia de genes mediada por electroporación funciona bien cuando la transfección se lleva a cabo en P3 (Figura 2E, arriba) o en P14 (Figura 2E, abajo).
Aquí se describen las aplicaciones del nuevo método de electroporación in vivo. La figura 3A muestra imágenes de microscopía óptica de expresión de GFP-SC myelinating en las distintas etapas del desarrollo (P7, P14, P21 y P31). Por análisis microscópico de luz, cambios en los parámetros morfológicos, como la longitud y el diámetro, se pueden evaluar. Tenga en cuenta que estos parámetros tienen valores similares en comparación con los nervios periféricos de rata intacta 15,16, lo que sugiere que los nervios electroporadas se desarrollan sin efectos perjudiciales significativos. La Figura 3B muestra una imagen de microscopía electrónica de LacZ-expressing myelinating SC. En este caso, LacZ fue utilizado como un marcador de expresión. β-galactosidasa tinción utilizando Bluo-gal, un sustrato insoluble en etanol, permite el análisis de la estructura de la mielina de las SC transfectadas mediante microscopía electrónica de 11,17. En estos experimentos, el papel de las moléculas de señalización puede ser examinado por el silenciamiento o aumentar su expresión, lo que permite el análisis de la pérdida de función o los efectos de ganancia de función. Además del análisis de tejido fijado, transferencia génica in vivo mediada por electroporación también se puede aplicar a vivir experimentos de imagen. Por ejemplo, la figura 3C muestra una myelinating SC co-expresión de G-GECO1.1 18, un indicador fluorescente verde citosólica de Ca2 +, y 19 R-GECO1mt, un indicador fluorescente de color rojo mitocondrial de Ca2 +. Mediante la expresión de estos indicadores, hemos identificado una vía de señalización que controla citosólica y mitocondrial de Ca 2 + concentraciones en myelinating SC . Por lo tanto, el presente método se puede utilizar para estudiar una variedad de mecanismos de señalización, en particular cuando las sondas fluorescentes codificadas genéticamente están disponibles para detectar las señales de interés.
Figura 1:. Esquemática de la i n electroporación in vivo Método En primer lugar, el nervio ciático de la rata anestesiada se expone. En segundo lugar, el plásmido de ADN se inyecta en el nervio ciático. En tercer lugar, los impulsos eléctricos se entregan al sitio de inyección a través del electrodo en forma de fórceps. Por último, la herida se cierra con pegamento. Este procedimiento se puede repetir en el nervio contralateral. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Los resultados representativos en nervios ciáticos transfectadas (A) Una imagen representativa de un nervio ciático transfectadas.. El nervio se transfectadas con el plásmido que expresa al RFP-P3, y se fija en P7. (B) Una imagen representativa de una célula RFP-transfectadas en P7 mostrando colocalización con S100, un marcador SC. (C) Una imagen representativa de un nervio ciático RFP-transfectadas en P14 mostrando colocalización con MBP, un marcador myelinating SC. (D) Una imagen representativa de un nervio ciático cotransfectadas con plásmidos GFP y RFP-expresión. SC transfectadas expresan simultáneamente GFP y RFP. (E) Una imagen de myelinating SCS P31 transfectadas en P3, cuando comienza la mielinización (arriba), y una imagen de las SC myelinating en P31 transfectadas en P14, cuando la mayoría de grandes axones mielinizados convierten (abajo), lo que sugiere que transfreflejo de las SC myelinating se puede lograr no sólo en los nervios neonatal, sino también en los nervios más maduros. Barras de escala = 200 m (A); 50 micras (BE). Esta cifra se modificó a partir de nuestra publicación anterior 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Aplicación de electroporación in vivo (a) un análisis microscópico de luz del desarrollo de myelinating SC.. Los nervios ciáticos se sometieron a electroporación con el plásmido que expresa GFP en P3, y se fijaron en las diversas etapas del desarrollo (P7, P14, P21 y P31). Imágenes representativas de las SC positivas para GFP se muestran a la izquierda. La longitud media y el diámetro se resumen como media ± SEM (n = 30 - 47 desde el de 3 nervios) a la derecha. La longitud y el diámetro de myelinating castas aumenta a medida que avanza el desarrollo. (B) Un electrón imagen microscópica de un nervio ciático transfectadas con un plásmido que codifica LacZ. A transfectadas SC (asterisco blanco, izquierda) se finamente etiquetado con precipitados del producto de reacción β-galactosidasa. (C) Una imagen de un SC cotransfected con G-GECO1.1, un indicador fluorescente verde citosólica de Ca2 +, y R-GECO1mt, un indicador fluorescente de color rojo mitocondrial de Ca2 +. Las regiones dentro de los rectángulos de puntos blancos se muestran ampliada en los paneles de la derecha. Barras de escala = 50 micras (A y C); 1 m (B). Esta cifra se modificó a partir de nuestra publicación anterior 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 03 143 422 001 | Plasmid DNA purification kit |
| Fast Green CFC | WAKO | 069-00032 | Dye for DNA injection |
| GC 150T-10 | HARVARD APPARATUS | 30-0062 | Glass capillary |
| Suction tubing | Drummond | 05-2000-00 | Suction tubing for micro injection |
| MODEL P-97 | SUTTER INSTRUMENT CO. | Micropipette puller | |
| CUY21 Single Cell | BEX | Electroporator CUY21 Single Cell | Pulse generator |
| Electric warmer | KODEN | CAH-6A | Warmer during the surgery |
| Isofluolane | Mylan | 1119701G1076 | Anesthetic |
References
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