Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Elektroporasyon tarafından Kemirgen Siyatik Sinir Schwann Hücreleri için Vivo Gen Transferi

Published: September 8, 2016 doi: 10.3791/54567
Automatic Translation
1,2, 1
1Department of Pharmacology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 2Laboratory for Cell Polarity Regulation, Quantitative Biology Center, RIKEN

Protocol

Araştırma için sıçanların kullanılması Tokyo Üniversitesi Hayvan Refahı Komitesi tarafından oluşturulan kurallara uygun olarak yapıldı.

Plasmid DNA 1.Preparation

  1. Memeli hücreleri 12 için bir ifade plazması içine cDNA veya shRNA dizisi alt-klonlanmasıyla in vivo elektroporasyon için DNA plasmidleri oluşturur. Güçlü ve istikrarlı bir ifade sağlar çünkü bir sitomegalovirüs hemen erken arttırıcı ve tavuk β-aktin promotör füzyon (CAG) promotör-tahrikli plazmid 13 kullanın. CAG promotörün kontrolü altında shRNAs ekspresyonu için, shRNA 14 alt klonlama için mir30 tabanlı shRNA kaseti sistemini kullanır.
  2. Üreticinin talimatlarına göre bir maksi-hazırlık kiti ile plazmid DNA arındırın ve HEPES-tamponlu tuzlu su (140 mM NaCI, 0.75 mM Na 2 HPO 4, 25 mM HEPES, pH 7.40) ile DNA tekrar süspansiyon. ug / ul ≥ 4 DNA'nın konsantrasyonu ayarlayın.
    3. Not: Plazmid DNA'ların uygun bileşim olup, her plazmidin transfeksiyon verimliliğine göre belirlenmelidir.

Cerrahi Aletler ve Salin 2. Sterilizasyon

  1. Otoklav cerrahi aletler ve% 0.9 NaCl çözeltisi.

Cam mikropipet 3. hazırlanması

  1. Bir pipet çektirmenin kullanarak cam pipetler çekin. 30-50 um bir çapa pipet ucu kesilir. Aşağıdaki parametreleri kullanın: Isı, 600; Hız, 50; Zaman, 75.

4. Hayvan Cerrahisi, DNA Enjeksiyon ve Elektroporasyon

Not: Bir overBu adımın görünüşüdür, Şekil 1 'de tarif edilmektedir. sıçan yavrularından prosedürü burada açıklanmış olmakla birlikte, yöntem, aynı zamanda, aynı prosedür kullanılarak daha olgun hayvanlara uygulanabilir.

  1. Hayvan% 4 (hacim / hacim) 0.4 L / dak oksijen akışını ve izofluran konsantrasyonu ayarlanarak hareketsiz hale gelinceye kadar indüksiyon kutusunda izofluran ile sıçan anestezisi. Doğru anesthetization onaylamak için kısma ayak gerçekleştirin.
  2. binoküler mikroskop altında ısıtılmış sıcak sıçan koyun ve sürekli yüz maskesi ile izofluran verilerek anestezi korumak. % 2 (hacim / hacim) 0.2 L / dak oksijen akışını ve izofluran konsantrasyonu ayarlayın. Kullanım göz hayvanın gözleri açıksa gözlerin kurumasını önlemek için düşer.
  3. ameliyat bandı ile bacakları sabitleyin.
  4. povidon-iyot ile arka uyluk cilt temizlemek ve bir neşter ile bir kesi yapmak.
    Not: Cerrahi alanlar h ile kaplıdır eğer cerrahi alanları Tıraşhava.
  5. kuadriseps arasında bir açıklık femoris kasının ve pazı dikiş iğneleri ile kas femoris oluşturarak siyatik siniri Açığa.
  6. % 0.9 NaCl çözeltisi ile sinir ıslatın. havsız kağıt ile fazla suyu emer.
  7. Esnek boru üzerinde, bir cam mikropipet taban yerleştirin ve yavaşça aspire mikropipet DNA solüsyonuna (en az bir mikrolitre), yeterli miktarda dolgu.
  8. hafifçe iğne kullanarak sinirin distal tarafını çekerek maruz siniri kaldırın.
    Not: mekanik stresi en aza indirmek için sinir gerginliği sürmeyin.
  9. Sinirin distal site içine cam mikropipet takın ve uygulayarak basıncı ile DNA çözümü enjekte (esnek borunun açık ucuna üfleyerek yani). Sinir yeşil (1 ul maksimum) görünene kadar DNA çözümü enjekte edilir. Mikropipet sık ekleme sinirine zarar verir, çünkü iki katından fazla mikropipet fazla takmayın.
  10. Bir TWE yerleştirinezer tipi yaklaşık 1-2 mm aralıklı sinir platin elektrot. elektrot ve% 0.9 NaCl çözeltisi ile sinir arasındaki boşluğu doldurmaktadır.
    Not: sinire mekanik stresten kaçınmak elektrot ile sinir tutmayın.
  11. elektrotlu bir elektro kullanarak enjeksiyon yerinde elektrik darbeleri uygulayın. İlk darbe seti sonra, elektrot ters ve başka darbe seti uygulanır. Aşağıdaki parametreleri kullanın: gerilim, 50 V; darbe süresi, 5 ms; nabız aralığı, 100 msn; nabız sayısı, 4 kez.
  12. % 0.9 NaCl çözeltisi ile elektroporasyon sitesi temizleyin.
  13. Tekrarlayın kontralateral siyatik sinir üzerine 4,4-4,11 adımları.

5. Post-elektroporasyon

  1. siyanoakrilat yapıştırıcı ile kesiler kapatın.
  2. tutkal kurutulduktan sonra, povidon-iyot ile yarayı temizleyin.
  3. yüz maskesi gelen yavru bırakın. tamamen anestezi kurtarmak için izin vermek için bir saat en az bir sıcak yavru ısıtın. Dyeterli bilinci yerine kadar o yavru sahipsiz bırakmayın.
  4. anestezi kurtarma sonra, anne sıçan yavru dönün. Tamamen iyileşene kadar yavru iade etmeyin.

6. Post-cerrahi

  1. (Şekil 3 örneklere bakınız) deneyler 11 iletken kadar kafeste Ev sıçan yavruları. karprofen yönetme (5 mg / kg; ip), bir steroid olmayan anti-inflamatuar ilaç, ya da buprenorfinin (0.1 mg / kg, sc), bir opioid analjezik, gerekirse.
    Not: Sıçan yavru iyi büyümek değil veya inflamasyon cerrahi site çevresinde görülürse, deneylerden hayvan hariç.

Representative Results

plazmid -expressing kırmızı flöresanlı protein (RFP) ile transfekte edilmiş bir siyatik sinirinin bir örneği, Şekil 2A'da gösterilmiştir. Bipolar morfoloji gösteren hücreler, AVM bir özelliği, seyrek RFP ile transfekte edildi. Hiçbir RFP floresan akson saptandı. Biz genellikle ~ Her sinirde 100 transfekte SC'ler bulabilirsiniz. Bu transfeksiyon verimliliği lentiviral vektörler 4 kullanılarak in vivo SC enfeksiyonu verimliliği benziyor.

Immün deneyler göstermiştir ki çoğu (~% 96) P7 S100, sc işaretleyici (Şekil 2B) eş-etiketli ve P14 RFP-pozitif hücre% 91 MBP için ko-etiketli bir Myelinating SC marker TTT-pozitif hücreler (Şekil 2C), elektroporasyon ile gen transferini göstermektedir SC'ler myelinating için son derece seçicidir.

AVM içine birden fazla genlerin tanıtımı edilen in vivo elektroporasyon yöntemin önemli bir avantajı, kolay bir prosedür ile birden fazla gen transferi kapasitesidir. Şekil 2B in vivo elektroporasyon kullanılarak GFP ve RFP eksprese eden plasmidlerin bir karışımı ile transfekte edilmiş bir siyatik sinirinin temsili bir görüntüsünü gösterir. SC'ler yaklaşık% 97, çok yönlü genlerin yüksek olarak etkili taşınmasında, sadece birden çok plasmidlerin karışımları electroporating elde edilebileceğini göstermektedir, GFP ve çift pozitif RFP edildi.

kemirgenlerde, miyelinasyon dramatik doğum sonrası ilk iki hafta boyunca artan doğum etrafında başlatır ve sonra yavaş yavaş azalır. Böylece, genetik bu gelişim zaman pencereleri sırasında SC'ler manipüle ederek, miyelinasyon bu farklı aşamalarını altında yatan mekanizmaları açıklığa kavuşturulması şarttır. Lentiviral vektörler için iyi bir araçtırminimal toksisiteye sahip olarak özellikle miyelinasyon nalyzing ama lentivirüsler yalnızca doğum siyatik sinirleri, 5,6 enfekte. Transfeksiyon (Şekil 2E, alt) P3 (Şekil 2E, yukarıda) ya da P14 ile gerçekleştirilen zaman karşılaştırıldığında, elektroporasyon aracılı gen transferi iyi çalışır.

Vivo elektroporasyon yöntemi romanın uygulamaları burada açıklanmıştır. Şekil 3A GFP-ifade eden çeşitli gelişim evreleri (P7, P14, P21 ve P31) de myelinating SC'ler ışık mikroskobik görüntüleri gösterir. ışık mikroskopik analizi ile, örneğin uzunluk ve çap olarak morfolojik parametrelerde değişiklikler değerlendirilebilir. Bu parametreler Electroporated sinirler önemli zararlı etkileri olmadan geliştirmek düşündüren, bozulmamış sıçan periferik sinirlerin 15,16 oranla benzer değerlere sahip olduğunu unutmayın. Şekil 3B LacZ-Expre bir elektron mikroskobik görüntü gösterirssing SC'ler myelinating. Bu durumda, LacZ bir ekspresyon belirteci olarak kullanıldı. β-galaktosidaz Bluo-gal, bir etanol çözülmeyen substrat kullanılarak boyama elektron mikroskobu 11,17 transfekte SC'ler miyelin yapısının analiz edilmesini sağlar. Bu deneylerde, sinyal moleküllerinin rolü ve böylece zarar fonksiyon-veya-kazanç fonksiyonu etkilerinin analizi sağlayan, susturulması veya ekspresyonunu arttırarak incelenebilir. Sabit doku analizine ek olarak, in vivo elektroporasyon aracılı gen transferi, aynı zamanda görüntüleme deneyleri canlı uygulanabilir. Örneğin, Şekil 3C, G-GECO1.1 18, yeşil floresan sitosolik Ca2 + gösterge, ve R-GECO1mt 19, kırmızı floresan mitokondriyal Ca 2 + göstergesi ko-eksprese eden bir Myelinating SC göstermektedir. Bu göstergeleri ifade ederek, SC'ler myelinating sitozolik ve mitokondriyal Ca 2 + konsantrasyonları kontrol eden bir sinyal yolunu tespit . Bu durumda, bu yöntem, genetik olarak kodlanmış floresan probları ilgi sinyalleri tespit etmek için kullanılabilir, özellikle sinyal çeşitli mekanizmalar çalışma için kullanılabilir.

Şekil 1
Şekil 1:. I n in vivo Elektroporasyon Yöntemi Birinci, anestezi sıçan siyatik sinirin şematik maruz kalmaktadır. İkinci olarak, plazmid DNA, siyatik sinir enjekte edilir. Üçüncü olarak, elektrikli bakliyat forseps şeklindeki elektrodun yoluyla enjeksiyon yerinde teslim edilir. Son olarak, yara yapıştırıcı ile kapatılır. Bu işlem karşı sinirin tekrar edilebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

"> şekil 2
Şekil 2: Transfekte Siyatik Sinir üzerinde Temsilcisi Sonuçlar (A) transfekte siyatik sinirinin bir temsilcisi görüntü.. Sinir P3 TTT eksprese eden plazmid ile transfekte edilmiş ve P7 sabitlendi. (B) S100, bir SC işaretleyici ile ko gösteren P7 bir RFP transfekte hücrenin bir temsilcisi görüntü. MBP, bir Myelinating SC işaretleyici ile ko gösteren P14 bir RFP transfekte siyatik sinirinin (C) bir temsilci görüntü. (D), GFP ve RFP ifade eden plazmid ile transfekte siyatik sinirinin bir temsili görüntüsü. Transfekte SC'ler aynı anda GFP ve RFP ifade etti. (E) miyelinasyon başlar P3, (üst) transfekte P31 de SC'ler myelinating bir görüntü ve en büyük aksonlar (alt) miyelinli hale P14, P31 transfekte de myelinating AVM bir görüntü, bu transf düşündürenMyelinating SCS ection yenidoğan sinirlerdeki değil, aynı zamanda daha olgun sinirlerdeki sadece elde edilebilir. Ölçek çubukları = 200 um (A); 50 mikron (BE). Bu rakam önceki yayının 11 modifiye edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3:., In vivo elektroporasyon (A) SCS myelinating gelişimi bir ışık mikroskopik analizi uygulaması. Siyatik sinirleri P3 GFP ifade plazmidi ile elektropore edildi ve çeşitli gelişim evrelerindeki (P7, P14, P21 ve P31) sabitlenmiştir. GFP-pozitif SC'ler temsili görüntüler solda gösterilmektedir. ortalama uzunluğu ve çapı (n = 3, ortalama ± SEM olarak sunulmuştur0 - sağda 3 sinirler) 47. geliştirme ilerledikçe SC'ler artar myelinating uzunluğu ve çapı. (B) kodlayan bir plazmit LacZ ile transfekte edilmiş bir siyatik sinirinin bir elektron mikroskopik görüntüsü. Transfekte SC (sol beyaz bir yıldız işareti), ince β-galaktosidaz reaksiyon ürünü çökelti ile işaretlenmiştir. (C) G-GECO1.1, bir yeşil floresan sitozolik Ca 2 + göstergesi, ve R-GECO1mt, bir kırmızı floresan mitokondriyal Ca 2 + göstergesi ile kotransfekte bir SC bir görüntü. beyaz noktalı dikdörtgenler içinde bölgeler sağdaki panellerin genişlemiş gösterilmiştir. Ölçek çubukları = 50 um (A ve C); 1 uM (B). Bu rakam önceki yayının 11 modifiye edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Genopure Plasmid Maxi Kit Roche 03 143 422 001 Plasmid DNA purification kit
Fast Green CFC WAKO 069-00032 Dye for DNA injection
GC 150T-10 HARVARD APPARATUS 30-0062 Glass capillary
Suction tubing Drummond 05-2000-00 Suction tubing for micro injection
MODEL P-97 SUTTER INSTRUMENT CO. Micropipette puller
CUY21 Single Cell BEX Electroporator CUY21 Single Cell Pulse generator
Electric warmer KODEN CAH-6A Warmer during the surgery
Isofluolane Mylan 1119701G1076 Anesthetic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nave, K. A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 503-533 (2014).
  2. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
  3. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nat Protoc. 9, 1956-1968 (2014).
  4. Cotter, L., et al. Dlg1-PTEN interaction regulates myelin thickness to prevent damaging peripheral nerve overmyelination. Science. 328, 1415-1418 (2010).
  5. Gonzalez, S., Fernando, R. N., Perrin-Tricaud, C., Tricaud, N. In vivo introduction of transgenes into mouse sciatic nerve cells in situ using viral vectors. Nat Protoc. 9, 1160-1169 (2014).
  6. Ozcelik, M., et al. Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves. J Neurosci. 30, 4120-4131 (2010).
  7. Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
  8. Glatzel, M., et al. Adenoviral and adeno-associated viral transfer of genes to the peripheral nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 442-447 (2000).
  9. Homs, J., et al. Schwann cell targeting via intrasciatic injection of AAV8 as gene therapy strategy for peripheral nerve regeneration. Gene Ther. 18, 622-630 (2011).
  10. Aspalter, M., et al. Modification of Schwann cell gene expression by electroporation in vivo. J Neurosci Methods. 176, 96-103 (2009).
  11. Ino, D., et al. Neuronal Regulation of Schwann Cell Mitochondrial Ca(2+) Signaling during Myelination. Cell Rep. 12, 1951-1959 (2015).
  12. Struhl, K. Chapter 3; Subcloning of DNA fragments. Curr Protoc Mol Biol. , Unit3 16 (2001).
  13. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  14. Chang, K., Elledge, S. J., Hannon, G. J. Lessons from Nature: microRNA-based shRNA libraries. Nat Methods. 3, 707-714 (2006).
  15. Schlaepfer, W. W., Myers, F. K. Relationship of myelin internode elongation and growth in the rat sural nerve. J Comp Neurol. 147, 255-266 (1973).
  16. Webster, H. D. The geometry of peripheral myelin sheaths during their formation and growth in rat sciatic nerves. J Cell Biol. 48, 348-367 (1971).
  17. Weis, J., Fine, S. M., David, C., Savarirayan, S., Sanes, J. R. Integration site-dependent expression of a transgene reveals specialized features of cells associated with neuromuscular junctions. J Cell Biol. 113, 1385-1397 (1991).
  18. Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca(2)(+) indicators. Science. 333 (2), 1888-1891 (2011).
  19. Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153 (2014).
  20. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev Growth Differ. 50, 507-511 (2008).
  21. Taveggia, C., Feltri, M. L., Wrabetz, L. Signals to promote myelin formation and repair. Nat Rev Neurol. 6, 276-287 (2010).
  22. Saijilafu,, Hur, E. M., Zhou, F. Q. Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nat Commun. 2, 543 (2011).
  23. Tanaka, Y., Hirokawa, N. Mouse models of Charcot-Marie-Tooth disease. Trends Genet. 18, S39-S44 (2002).

Tags

Nörobilim Sayı 115 Schwann hücresi siyatik sinir miyelin geliştirme, elektroporasyon nörobiyoloji
Elektroporasyon tarafından Kemirgen Siyatik Sinir Schwann Hücreleri için <em>Vivo</em> Gen <em>Transferi</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ino, D., Iino, M. In Vivo… More

Ino, D., Iino, M. In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation. J. Vis. Exp. (115), e54567, doi:10.3791/54567 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter