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Neuroscience

In vitro Enregistrement de mésentérique Afférent activité nerveuse chez la souris jéjunale et Segments colique

doi: 10.3791/54576 Published: October 25, 2016

Abstract

nerfs afférents transmettent non seulement des informations sur la physiologie normale, mais signalent également l'homéostasie perturbée et les processus physiopathologiques des différents systèmes d'organes à partir de la périphérie vers le système nerveux central. A ce titre, l'augmentation de l'activité ou de «sensibilisation» des nerfs afférents mésentériques a été alloué un rôle important dans la physiopathologie de l'hypersensibilité viscérale et les syndromes de douleur abdominale.

L' activité nerveuse afférente mésentérique peut être mesurée in vitro dans un segment intestinal isolé qui est monté dans un bain d'organe construit à cet effet , et dont le nerf splanchnique est isolé, ce qui permet aux chercheurs d'évaluer directement l' activité des nerfs adjacents au segment gastro - intestinal. L'activité peut être enregistrée au début du traitement dans des conditions normalisées pendant la distension du segment ou après l'addition de composés pharmacologiques ou serosally délivrés de manière intraluminale. Cette technique permet d'le chercheur d'étudier facilement l'effet des médicaments ciblant le système nerveux périphérique dans les échantillons de contrôle; en outre, il fournit des informations cruciales sur la façon dont l'activité neuronale est modifiée au cours de la maladie. Il convient cependant de noter que la mesure de l' activité de la décharge neuronale afférente ne constitue une station relais dans la neuronal complexe cascade de signalisation, et les chercheurs doivent garder à l' esprit de ne pas négliger l' activité neuronale à d' autres niveaux (par exemple, les ganglions de la racine dorsale, la moelle épinière ou du système nerveux central ) afin d'élucider pleinement la physiologie neuronale complexe dans la santé et la maladie.

applications couramment utilisées comprennent l'étude de l'activité neuronale en réponse à l'administration d'un lipopolysaccharide et l'étude de l'activité nerveuse afférente dans les modèles animaux du syndrome du côlon irritable. Dans une approche plus de translation, le segment de l'intestin de souris isolé peut être exposé à des surnageants provenant de patients atteints d'IBS coliques. En outre, une modificationCette technique a été récemment révélé être applicable dans les échantillons du côlon humain.

Introduction

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la signalisation sensorielle et la perception de la douleur est un processus complexe qui résulte d'une interaction complexe entre les nerfs afférents, les neurones de la colonne vertébrale, ascendants et descendants des voies facilitatrices et inhibitrices et plusieurs régions différentes du cerveau. A ce titre, des modifications à un ou plusieurs de ces niveaux peut entraîner une altération de la signalisation sensorielle et la douleur viscérale dans les états pathologiques. Pour étudier ces différents aspects de la signalisation sensorielle multiples techniques ont été développées à partir d' expériences allant de cellules individuelles (par exemple, l' imagerie calcique sur les neurones) pour les modèles entiers d'animaux (par exemple, les réponses comportementales telles que la réponse viscéromotrice). La technique décrite dans ce document permet aux chercheurs d'évaluer spécifiquement l' activité du nerf afférences in vitro à partir d' un segment isolé de l' intestin grêle ou du côlon chez les rongeurs. En bref, un segment gastro-intestinal isolé (habituellement jéjunum ou du côlon) est monté dans une chambre construite à cet effet l'enregistrement perfusé avec un K physiologiquesolution rebs. Le nerf splanchnique est disséquée et connecté à une électrode permettant l'enregistrement de l'activité neuronale dans afférences nerfs afférents splanchniques ou pelviennes. L' activité nerveuse peut être enregistrée basale ou en réponse à des pressions croissantes intraluminaux et / ou des composés pharmacologiques qui peuvent être appliqués directement dans la chambre d'enregistrement (serosally), ou via le perfusat intraluminal (mucosale) afin d' évaluer leur effet sur la décharge afférente 1-6 . À noter, les nerfs splanchniques contiennent également des fibres efférentes et afférences viscerofugal en plus des afférences sensorielles. L' un des principaux avantages de l' ex vivo enregistrement du nerf splanchnique est le fait que les chercheurs peuvent quantifier l' activité du nerf sans modulation ou de l' entrée du système nerveux central, permettant d'étudier l'effet direct des composés appliqués localement sur l' activité nerveuse. En outre, la surveillance des paramètres vitaux, comme cela est nécessaire en utilisant l'approche in vivo (voir ci - dessous), est no plus pertinente. In vitro l' enregistrement splanchnique est finalement beaucoup moins de temps que son homologue in vivo.

activité neuronale Afférent en réponse à d'autres stimuli, tels que la muqueuse caresser, de sondage en utilisant des poils de von Frey ou étirement du segment, peut être étudié dans un dispositif expérimental modifié dans lequel le tissu intestinal est coincé et ouvert longitudinalement (qui est en contraste notre configuration à l' aide d' un segment intact), comme cela a été décrit dans un précédent numéro 7,8. En outre, récemment, une technique a été décrite pour étudier colique activation nerveuse afférente dans la paroi colique lui - même via l' imagerie calcique, encore une fois en utilisant un goupillé vers le bas, ouvert longitudinalement le segment 9.

Une variante de cette technique consiste in vivo par mesure de l' activation neuronale près de l'entrée dans la moelle épinière du afférences. En bref, l'animal est placé sous sédation en position couchée, exposing la moelle épinière lombo - sacrée dans laquelle le nerf afférent des projets d'intérêt au moyen d' une laminectomie, la construction d' une paraffine remplie de puits en utilisant la peau de l'incision et le drapage de la radicule dorsale sur une électrode bipolaire de platine 10,11. Cette technique permet en outre aux chercheurs de caractériser des fibres en fonction de leur vitesse de conduction, et de distinguer les fibres C amyéliniques de Aδ fibres fines myélinisées. En outre, les radicelles dorsales contiennent exclusivement des fibres sensorielles afférentes, contrairement aux nerfs afférents et efférents splanchniques mixtes mentionnés précédemment.

Enregistrement afférences décharge nerveuse in vitro à partir isolés segments de l' intestin peut également être fait en utilisant des échantillons humains, en tant que deux groupes de recherche publiés indépendamment premiers en homme manuscrits enregistrement de l' activité du nerf afférences colique résection humaine spécimens 12,13. La mise en œuvre de cette technique pourrait entraîner une plus facilement translatisur des données murins à l'état humain, et pourrait permettre aux chercheurs d'identifier facilement des médicaments ciblant le nerf sensitif sensibilisé. L'importance clinique de caractériser l'activité nerveuse afférente, ainsi que la découverte de nouveaux réactifs thérapeutiques qui ciblent l' activité du nerf afférences exorbitant, a été minutieusement examiné par de nombreux experts dans le domaine de 14-19.

La technique in vitro ci - dessus complète le plus communément connus dans la mesure in vivo de l' activité nerveuse afférente. Lors de la mesure de l' activité neuronale in vivo, l' activité du nerf peut être mesuré directement chez l'animal sous sédation au cours de laquelle le segment d'intérêt est identifié et ensuite intubé, et une paraffine remplie de liquide et est construit en utilisant la paroi abdominale et la peau du rongeur 20. Le nerf afférences d'intérêt est alors identifié, sectionné et placé sur une électrode de platine bipolaire, ce qui permet de l'activité neuronale DE MESUREt. Cette technique permet au chercheur de moduler l'activité des nerfs afférents à vivre bien des animaux sous sédation; à ce titre, on peut étudier l'activité neuronale répond aux perturbations telles que la distension luminale ou l'administration intraveineuse d'un composé.

La recherche translationnelle se concentre aujourd'hui principalement sur l'application des surnageants d'origine humaine (par exemple., À partir de biopsies coliques, des cellules périphériques cultivées mononucléaires du sang, etc.) sur les afférences de souris jéjunum et / ou colique 21,22. Les chercheurs peuvent appliquer directement surnageants soit dans le bain d'organe ou dans la solution intraluminal qui perfuse le segment de l'intestin, de sorte que les effets différentiels de séreuse contre l'application de la muqueuse peuvent être étudiés sur la décharge nerveuse afférente. En tant que tel, il a été montré que colique supernatans biopsie de la muqueuse de patients atteints du syndrome du côlon irritable peuvent causer des réactions allergiques chez les afférences colique de souris, Guinée porcs neurones sous-muqueux et dorsale de la souris racineneurones ganglionnaires 21,23,24.

Enfin, l'enregistrement de l'activité neuronale ne se limite pas au mésentérique et / ou des neurones du bassin innervant le tractus gastro-intestinal. D' autres ont démontré que les enregistrements nerveuses peuvent être effectuées dans les afférences fournissant l'articulation du genou 25, tandis que d' autres ont caractérisé la vessie activité nerveuse afférente et 26-28, et a démontré que les afférences du bassin de la vessie et du tractus gastro - intestinal convergent, qui peut entraîner des neurones diaphonie 29.

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Protocol

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Toutes les expériences sur les animaux décrits ci-dessous ont été approuvés par le Comité d'éthique médicale et de l'utilisation des animaux d'expérimentation à l'Université d'Anvers (numéro de dossier 2012-42).

1. Préparation des tissus de jéjunale et colique afférentes Nerfs

  1. Préparation du nerf afférences jéjunale
    1. Effectuer l' euthanasie des rongeurs du rongeur adolescent ou un adulte qui a été approuvé avant l'expérience par le comité d' éthique local (par ex., La sédation terminale suivie par ponction cardiaque, la dislocation cervicale, etc.).
      NOTE: Nous avons utilisé la dislocation cervicale à sacrifier les animaux résultant ainsi dans des expériences sans la nécessité de poursuivre l' anesthésie ou de soins post-chirurgicaux que les tissus sont transformés in vitro.
      NOTE: L' âge a été montré pour atténuer les fonctions mécanosensoriels afférentes mésentérique 30, nous vous conseillons donc aux chercheurs d'adhérer à un groupe d' âge spécifique pour la durée deune seule expérience.
    2. Placer l'animal de laboratoire sacrifié dans la position couchée sur le dos et effectuer une incision médiane abdominale à travers la couche de peau et de muscle abdominal en utilisant un scalpel, étendant à partir du processus xiphoïde jusqu'à l'os du pubis.
    3. Prendre un bain dans la cavité abdominale avec une solution de Krebs à froid, afin d'éviter les tissus intra-abdominale du dessèchement (composition de Krebs: mM de NaCl 120,03 mM , KCl 6,22, 1,57 mM de NaH 2 PO 4, 15,43 mM NaHCO 3, 1,21 mM MgSO4, 11,52 mM de D-glucose et 1,52 mM de CaCl2).
    4. Rapidement exciser l'ensemble jéjunum en utilisant des ciseaux pointus en retranchant environ 20 cm de l'intestin grêle à partir immédiatement distalement de l'angle de Treitz, en prenant soin de ne pas endommager les structures environnantes et de garder le mésentère de l'intestin, qui contient les vaisseaux sanguins jéjunum et nerfs afférents, intact.
      NOTE: Pour la simple dissection jéjunale dans la cavité abdominale, on n'a pas besoin d'utiliserun stéréomicroscope, comme cela peut être facilement visualisés à l'oeil nu.
    5. Placez le jéjunum excisée dans une solution de Krebs glacée et garder sur la glace, tout en oxygénant la solution Krebs en continu avec carbogène (95% O 2, 5% de CO 2).
    6. Couper le jéjunum avec des ciseaux pointus dans de longues boucles d'environ 3 cm. Observer le faisceau mésentérique contenant les vaisseaux et les nerfs splanchniques quelque part près du centre de la boucle respective.
    7. Rincer chaque segment avec une solution de Krebs à l' aide d' un cathéter émoussé pour retirer le contenu luminal et Chyme que ceux - ci contiennent des enzymes digestives qui permettront d' accélérer la détérioration de l'échantillon de tissu in vitro.
      REMARQUE: Prenez soin de ne pas endommager la lumière de la boucle pendant le rinçage, que la destruction des villosités se traduira par la libération de médiateurs qui peuvent altérer l'activité nerveuse afférente.
    8. Identifier le segment pour mesurer l'activité de nerf afférent (par exemple, la première SEGME jéjunalent distalement du ligament de Treitz ou l'angle de Treitz), et la prise dans une chambre d'enregistrement construit à cet effet recouvert d'une couche d'élastomère de silicone.
      NOTE: Le début du jéjunum est anatomiquement définie comme la partie de l'intestin grêle où le ligament de Treitz traverse le petit intestin, appelé aussi la flexure duodenojejunal.
      REMARQUE: couvrir le fond de la chambre d'enregistrement avec une couche mince d'élastomère de silicone à l'avance avant le début de l'expérience. La préparation de cette couche en élastomère doit être effectué conformément aux instructions du fabricant 1.
    9. Perfuser la chambre constamment avec chaud, carbogenated solution de Krebs à un débit de 10 ml / min et maintenir la température de Krebs dans la constante de chambre d'enregistrement à 34 ° C.
    10. Monter le segment de jéjunum dans le bain d'organe de sorte que l'extrémité buccale est reliée au conducteur de seringue fournir un écoulement luminale et l'extrémité aborale se connecte à la sortie. Légèrement stvomir le segment, mais prendre soin de ne pas exercer une tension excessive. Fixer les deux extrémités en utilisant fermement 4/0 ligatures de soie aux ports d'entrée et de écoulement.
    11. Attacher le conducteur de la seringue à l'extrémité buccale, et perfuser le segment de jéjunum intraluminale avec une solution de Krebs (non oxygéné, de la température ambiante) à un débit de 10 ml / h.
    12. Pin le mésentère de l'appartement de segment intestinal montée contre la couche inférieure en élastomère de silicone, en utilisant des broches d'insectes. Étirez le mésentère dans le but d'optimiser la visualisation du faisceau mésentérique; ne pas exercer de pression sur le faisceau ou le jéjunum.
    13. Effectuer une dilatation de la rampe d'essai (vide infra) , en fermant l'orifice de sortie jusqu'à ce que la pression intraluminale du segment intestinal atteint 60 mmHg, afin de vérifier qu'aucune solution intraluminal Krebs fuit du segment monté. Observer une augmentation progressive de la pression intraluminale sans interruption.
    14. Observer les petites contractions du segment (wav péristaltiquees) pendant la phase de distension initiale. Le cas échéant, bloquer l'activité péristaltique par addition de 1 uM du type L bloqueur des canaux calciques nifédipine à la solution de Krebs.
      REMARQUE: Ajout d'1 uM d'atropine à la solution de Krebs en plus de nifédipine, complètement paralyser le segment intestinal. Nous avons cependant aucune expérience personnelle avec l'utilisation et l'effet de l'atropine sur l'enregistrement des nerfs afférents.
    15. En vertu d'un stéréomicroscope, doucement commencer à décoller le tissu adipeux du mésentère en tirant doucement avec deux petites pinces, en prenant soin de ne pas endommager les vaisseaux et les nerfs afférents qui sont enterrés dans le tissu adipeux.
    16. Commencer à une distance éloignée du jéjunum et exposer les vaisseaux sanguins dans le faisceau de mésentérique.
    17. Observer le nerf jéjunale afférences entre les deux navires comme une mince fil blanc encapsulé dans le tissu adipeux. Seulement disséquer plus proximalement vers le jéjunum par pelage doucement le tissu adipeux loin en utilisant des pinces lorsque lesidentification initiale des deux navires mésentériques et / ou le nerf afférent est difficile.
    18. Disséquer le nerf mésentérique jéjunale du segment libre sur une distance de plusieurs millimètres, en retirant la adhérente du tissu adipeux au nerf.
    19. Transect le nerf avec des ciseaux de tissus tranchants. Si nécessaire, décoller le tissu adipeux et conjonctif restants, ainsi que la gaine epineuronal en tirant doucement avec les petites pinces.
    20. À l'aide d'un micromanipulateur, abaisser la pointe de l'électrode d'aspiration, relié à une seringue à piston, dans le bain d'organe; puis, en manipulant le piston, aspirer doucement une solution de Krebs dans le bain d'organe de sorte que la pointe de l'électrode est immergée dans la solution de Krebs (figure 1). Faire en sorte que la solution de Krebs recouvre l'électrode de fil à l'intérieur de l'électrode d'aspiration.
      REMARQUE: Préparation de la succion capillaire en verre au borosilicate qui contient le fil-électrode avant le début de l'expérience, nousing un extracteur de pipette.
    21. Positionner la pointe de l'électrode d'aspiration à proximité immédiate du nerf brin afférences sectionnée et d'en tirer le brin nerveuse sectionnée dans le capillaire sur toute sa longueur.
    22. Manœuvrer la pointe de l'électrode vers une partie du tissu adipeux et aspirer ce dans le capillaire de verre tout en aspirant fermement avec le piston, ce qui mécaniquement 'étanchéité du nerf dans le capillaire à partir du contenu du bain d'organe.
    23. Vérifiez l'enregistrement de l' activité du nerf afférent à l' aide du système d'acquisition de données, par exemple, en effectuant une augmentation induite par distension-rampe dans afférences tir (voir ci - dessous). Suite à l'isolement du nerf dans l'électrode d'aspiration, de stabiliser la préparation pendant 15 minutes afin d'obtenir une activité nerveuse afférente spontanée de l'état d'équilibre avant d'effectuer les expériences réelles.
    24. Pour effectuer rampe ballonnement, distendre le segment intestinal en fermant l'orifice de sortie, ce qui conduit à graduel augmentation de la pression dans le segment intestinal (jusqu'à 60 mm Hg). Seulement effectuer le protocole expérimental désiré lorsque trois distensions de rampe consécutives (avec un intervalle de 15 min) donnent une décharge multi-unité reproductible (Figure 2).
  2. Préparation de la afférences lombaire splanchnique (nerf afférent colique)
    NOTE: La dissection des nerfs afférents colique nécessite une dissection plus détaillée. Déviations de l'ancien protocole 'jéjunale' sont énumérées ci-dessous:
    1. Euthanasier l'animal au moyen d'une méthode humaine, placez-le dans la position couchée, effectuer une laparotomie médiane et excessivement verser la solution glacée Krebs dans la cavité abdominale. REMARQUE: Krebs composition: NaCl 118 mM, KCl 4,75 mM, 1 mM de NaH 2 PO 4, 22 NaHCO3, 1,2 mM MgSO4, 11 mM de D-glucose et 2,5 mM de CaCl 2, 3 pM d' indométhacine.
      NOTE: Notez la composition modifiée de la solution de Krebs; indométhacine est ajouté à la manièrerésolu- afin d'éviter des altérations de l'activité du nerf afférences par les prostaglandines.
    2. Jeter le tissu adipeux, la vessie et les organes génitaux internes et déplacer doucement l'intestin grêle, d'un côté dans la cavité abdominale. Effectuer une prelevation étendue de la partie distale du côlon avec les nerfs mésentériques intacts de l'abdomen.
      REMARQUE: points de repère importants qui peuvent être inclus dans cette dissection pour faciliter la préparation ultérieure du tissu comprennent l'aorte abdominale et la veine cave, le rein gauche et la musculature du plancher pelvien.
      NOTE: Lors de la dissection, prendre soin de ne pas exercer une traction sur le tissu de liaison entre le côlon et l'aorte abdominale, car cette région contient les nerfs splanchniques lombaires.
    3. Transférer le segment de tissu dans l'élastomère de silicone doublée chambre d'enregistrement. Utiliser l'artère rénale gauche, qui provient de l'aorte abdominale, en tant que point de départ. Suivez l'aorte abdominale dans le sens aboral, rencontrer les mesenteri supérieuresc artère avec la coeliaque et mésentérique supérieure ganglion. Enfin, arrivent au niveau du tissu de jonction entre la partie distale du côlon et de l'aorte, dans lequel le nerf d'intérêt est située.
    4. Identifier l'artère mésentérique inférieure provenant de l'aorte abdominale. Le nerf lombaire afférences splanchniques peut être identifié à la base de l'artère mésentérique inférieure; il est parallèle à l'artère (figure 3).
    5. Suite à la transection du nerf, retirez délicatement la gaine de tissu conjonctif environnant et taquiner le nerf en plusieurs fils fins. Assurez-vous de garder une distance sécuritaire du côlon.
    6. Dessiner un de ces fils individuels dans l'électrode d'aspiration, «sceau» avec le capillaire entourant le tissu adipeux, comme décrit précédemment et effectuer le protocole expérimental désiré.
    7. Se débarrasser de tout tissu superflu qui est présent dans le bain d'organe (par exemple, les reins, les vaisseaux abdominaux, le tissu musculaire), uns ils peuvent perturber le signal afférent.
      REMARQUE: La nifédipine (1 uM) peut être ajouté à la solution de Krebs dans le cas où le signal de nerf afférent est perturbé par les mouvements intestinaux spontanés dus à des contractions des cellules musculaires lisses.
      REMARQUE: Les médicaments peuvent être administrés à trois endroits différents: 1) serosally en dissolvant le composé désiré dans la Krebs qui perfuse la chambre d'enregistrement, 2) directement dans le bain d'organe lors de l'arrêt temporaire de la perfusion ou 3) intraluminale par dissolution du composé d'intérêt dans la solution de Krebs dans le lecteur de seringue. La désensibilisation du nerf afférences peut se produire lorsque des doses cumulatives d'un composé sont administrés trop vite consécutivement.

Figure 1
Figure 1: Vue d' ensemble schématique du Erigé Chambre d' enregistrement et d' aspiration Electrode Vue d' ensemble détaillée de l'techni. configuration cal avec l'électrode d'aspiration et la chambre d'enregistrement en place. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Tracing Représentant de l'inscription in vitro de jéjunale Afférent Activité Nerve enregistrement typique de multi-activité nerveuse afférente jéjunale (imp.sec -1) (panneau supérieur) au départ et en réponse à 2 distensions de rampe jusqu'à 60 mmHg. (panneau inférieur), et l'identification subséquente (analyse de wavemark) de différentes mono-unités dans le signal nerveux (troisième panneau). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3:. Neuroanatomy du Colon A) L' information sensorielle du côlon est transmis par les nerfs colique lombaires (LCN) vers le système nerveux central, avec le LCN fonctionnant à proximité de l'artère mésentérique inférieure (IMA). Une partie des fibres de ce nerf colique lombaire bien sûr le long du nerf intermesenteric (IMN) pour former les nerfs splanchniques lombaires (LSN). Le ganglion mésentérique inférieure (IMG) se trouve à l'origine de l'IMA de l'aorte abdominale. Enregistrement distalement de l'IMG est obligatoire devrait chercheurs souhaitent étudier l' activité nerveuse afférente viscerofugal. B) Une vue d'ensemble schématique du dispositif expérimental. enregistrement Afférent du LCN est effectué dans un organe à la fois par l'intermédiaire d'une électrode d'aspiration relié au système d'acquisition de données. Rampe de distension peut être effectuée lors de la fermeture de l'orifice de sortie, tout en continuant l'afflux deSolution de Krebs. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

2. Acquisition de données

  1. Enregistrer l'activité du nerf par l'intermédiaire d'une électrode d'aspiration reliée à un headstage. Amplifier (gain 10k) et filtrer le signal (bande passante 500 - 5000 Hz) 20.
    NOTE: A 50/60 Hz Bruit Eliminator devrait être inclus dans le dispositif expérimental afin d'éliminer le bruit des signaux d'interférence électrique 50/60 Hz. Le signal est automatiquement numérisé et échantillonné à 20 kHz pour l'analyse.

3. Analyse 5,20

  1. Signaler la décharge nerveuse afférente que le nombre total d'impulsions / seconde pour l'ensemble du nerf ou d'utiliser un logiciel spécialisé pour effectuer une analyse plus approfondie, que des enregistrements multi-unités de l'activité globale du nerf contiennent des potentiels d'action de forme différente, l'amplitude et la largeur, correspondant à nerf différent unitésdans chaque fibre afférente (figure 2).
  2. Associez wavemarks individuels à des modèles prédéfinis, permettant la discrimination entre les simples unités. Avant l'attribution d'un pic à une certaine onde marque, un rapport signal-bruit de> 2: 1 devrait être appliquée.
    NOTE: Lors de l'analyse de wavemark, nous construisons un nouveau modèle quand au moins 10 pics similaires sont identifiés par le logiciel d'analyse. Aucun modèle est construit pour des formes plus rares de 1 à 50 pointes. Une pointe est adaptée à un modèle en utilisant l'analyse en composantes principales quand au moins 80% de ses points sont identiques à la pointe de modèle. appariement modèle est dépendante de l'opérateur, et doit toujours être effectuée par le même chercheur en aveugle.
  3. Calculer les réponses potentielles d'action en soustrayant l'activité spontanée au départ (pression intraluminale de 0 mmHg) de la réponse lors de la distension à des points de temps fixes (5 mmHg de minimum de 0 à 20 mmHg la pression intraluminale, par incréments de 10mmHg de 20 mmHg et suivantes). Mesurer décharge afférente base en utilisant une taille bin de 10 sec.
  4. Utilisez l'analyse d'un seul appareil pour classer les fibres en fonction de leur profil de décharge pendant rampe distension (Figure 4). En outre, l'analyse seule unité peut être utilisée pour étudier le profil chimiosensibilité des différents types d'unités, car tous les types d'unités affichent la même activité de tir altérée en réponse à un médicament ou composé.
  5. Classez fibres que les fibres à faible seuil ( 'de LT', typiquement exercent une augmentation des pertes au niveau des pressions de distension inférieurs), des fibres seuil haut ( «HT», exercent une augmentation des pertes au niveau des pressions de distension les plus élevées), des fibres de large plage dynamique ( «WDR», démontrer augmentation de tir pendant toute la distension de rampe) ou afférences mécaniquement insensible ( «MIA», les fibres nerveuses qui , généralement , ne répondent pas à la rampe distensions) 5; 20.
  6. Exprimez la réponse nerveuse de tir à 20 mmHg comme le pourcentage de la réponse de tir maximale pendant distension (LT%), car elle reflète l'étendue de la cuisson à la pression de distension faible.
    NOTE: En conséquence, les fibres LT se caractérisent par une LT%> 55%, alors HT sont définies par une valeur de <15%. Les valeurs des unités WDR se situent entre 15 et 55% (20). Un MIA affiche tir afférences spontanée qui est affectée par distensions.

Figure 4
Figure 4:. Représentation schématique des différentes unités Afférent fibre fonction de leur profil mécanosensible Les unités sont classées en fonction du pourcentage (LT%) de son taux de tir à 20 pression de distension mmHg par rapport à la réponse de tir maximale pendant distension. fibres à seuil bas (de panneau supérieur gauche) présentent principalement une activité accrue du nerf à des pressions de distension faibles, entraînant une LT% de plus de 55%. unités seuil haut (en haut à droitepanneau), au contraire, afficher uniquement une augmentation de la cadence de tir à des pressions nocives (% LT <15). fibres de large plage dynamique (panneau inférieur gauche) affichent une augmentation progressive de l'activité nerveuse pendant toute la distension (% LT comprise entre 15 et 55), tandis que les fibres mécaniquement insensibles (panneau inférieur droit) ne répondent pas aux pressions croissantes de distension. LT%: (afférences tir à 20 mmHg / maximale afférences tir) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Representative Results

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l'activité du nerf afférences jéjunale a été mesurée à la ligne de base et en réponse à la rampe distension 9 vieille de huit semaines mâle de 1 souris. Les animaux ont été logés dans des groupes dans des conditions normalisées (6 animaux par cage, 20 - 22 ° C, humidité 40 - 50%, 12 cycle de lumière-obscurité h) avec un accès illimité à l'eau du robinet et de chow régulière. segments jéjunales de souris affichées irrégulière décharge nerveuse afférences spontanée au départ à une pression intraluminale de 0 mmHg (moyenne activité spontanée 11,47 ± 3,31 imp / sec).

L'activité du nerf afférences jéjunale a augmenté lors de l'exécution des distensions de rampe jusqu'à 60 mmHg. En règle générale, l'augmentation de l'activité du nerf afférent qui suit la montée en pression intraluminale est caractérisée par une réponse biphasique (figure 5) consistant en une augmentation initiale rapide de l'activité de mise à feu jusqu'à la pression intraluminale atteint 20 mm de Hg, which peut être principalement attribuée à la cadence de tir accrue de fibres à bas seuil. Elle est ensuite suivie d'une phase de plateau, après quoi , une seconde augmentation de l'activité de cuisson peut être observée à partir de 40 mmHg en avant, soit l'activation des fibres essentiellement seuil haut.

Sur la base de leurs formes d'onde, simples unités peuvent être victimes de discrimination dans chaque enregistrement multi-unités et classés dans l'une des catégories mentionnées ci-dessus quatre. Dans 9 souris, nous avons discriminés 40 unités différentes (4,44 ± 1,01 unités / jejunale afférences nerveuses), avec les unités LT étant les plus répandus, suivis par des fibres WDR et HT (figure 6). L'activité de mise à feu des différentes unités en réponse à la rampe distension peut être observé sur la figure 7.

Figure 5
Figure 5: g> mésentérique Afférent décharge nerveuse (imp.sec - 1). chez les souris de type sauvage au cours de la rampe Distension mésentérique multi-unité de décharge nerveuse afférente (imp / sec -1) chez les souris de type sauvage au cours de rampe distension pour l'ensemble du nerf. Les valeurs représentent la décharge afférences moyenne ± ETM, n = 9 souris. imp.sec -1:. impulsions par seconde S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6:. Unité simple distribution de 40 unités identifiées dans Nerfs jéjunale afférentes de 9 souris sauvage de type HT: seuil élevé de fibres, LT: faible teneur en fibres de seuil, MIA: fibre mécanique insensible, WDR: fibre de large plage dynamique._blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7:. Courbes de pression de réponse pour les différents types de Subunits chez les souris de type sauvage La décharge nerveuse afférente unitaire (imp.sec -1) des quatre unités différentes qui peuvent être identifiés, chez les souris de type sauvage au cours de rampe ballonnements. Une fibre de seuil bas (LT, figure en haut à gauche) est caractérisée par une augmentation rapide de l'activité initiale de tir au cours des distensions, tandis que les fibres seuil haut (HT, figure en bas à gauche) affiche seulement augmenté le tir lors de pressions intraluminaux nocives. De larges fibres de gamme dynamique (WDR, chiffre supérieur droit) montrent une augmentation régulière de l'activité de tir pendant toute la distension et les fibres afférentes mécano-sensible (MIA, figure en bas à droite) ne répondent pas aux pressions croissantes intraluminaux. valeurs repressentiment décharge afférences moyenne ± ETM imp.sec -1:. impulsions par seconde S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Le protocole dans le présent document décrit une technique de laboratoire reproductible pour étudier l' activité du nerf afférences mésentérique chez les rongeurs utilisé par notre groupe et d' autres 3,4,7,8,12,20,21,31. Les étapes critiques au sein du protocole comprennent l'isolement rapide du tissu, l'aspiration du brin du nerf dans l'électrode d'aspiration et la «fermeture» appropriée du capillaire de verre à partir du bain d'organe par aspiration entourant le tissu adipeux dans le capillaire. L'ouverture du capillaire de verre doit être déterminée avec précision: une ouverture qui est trop petit va compliquer l'aspiration du brin nerveux dans l'électrode, alors qu'une trop grande ouverture entravera la «étanchéité» du capillaire avec le tissu adipeux, ce qui entraîne redondante bruit de fond qui entravent l'analyse (enregistrements faible signal-bruit). Pour permettre une classification unique unité fiable, afférences splanchniques devraient être divisés en différents volets afin de réduire lanombre d'unités dans l'enregistrement. En règle générale, nous suggérons visant à avoir un maximum de 4 - 5 unités dans chaque enregistrement. Les chercheurs ont donc doit régler l'ouverture sur la base de la fibre d'intérêt, et l'animal de laboratoire qui est appliqué.

Un autre point critique comprend la mise à la terre suffisante de l'installation expérimentale. L'électrode d'aspiration et la chambre d'enregistrement doivent être mis à la terre de manière adéquate et couverts par une cage de Faraday afin de minimiser les champs parasites électriques qui empêchent l'analyse de l'activité neuronale, alors que tous les autres équipements, y compris les appareils d'enregistrement, de seringue et cetera doit être installé en dehors de la cage .

En enregistrant l'activité du nerf afférences à proximité du jéjunum ou du côlon, on peut isoler la première partie de la chaîne de transduction du signal de afférences et facilement étudier la contribution et les modifications qui se produisent à la seule niveau de afférences sans interférence du nerv centralsystème ous. L' une des limites de cette technique réside dans le fait que , dans les observations in vitro ne peuvent pas toujours être extrapolées sans effort au réglage in vivo, comme la mise en place in vitro comprend une station relais de signalisation dans le nerf cascade complexe. En tant que tel, une image plus large doit être faite incorporant toutes les autres stations, comme le ganglion de la racine dorsale, système nerveux central (par exemple, l' imagerie cérébrale fonctionnelle) et descendants (inhibiteurs) voies efférentes.

Un autre avantage de cette méthode constitue la procédure technique plutôt simple, comme on n'a plus à surveiller le bien-être de l'animal de laboratoire qui fournit l'échantillon gastro-intestinaux. D'autre part est la mesure in vitro de l' activité neuronale ne convient pas pour élucider l'effet d'un médicament administré par voie systémique sur la décharge nerveuse afférente, mais les chercheurs peuvent théoriquement surmonter cet obstacle par l' administration systémique du médicament of intérêt à l'animal, suivie par ex vivo et in vitro enregistrement de l' activité nerveuse afférente. Cependant, il faut être attentif au fait que tout médicament présent dans la chambre d'enregistrement sera diluée en raison de la perfusion de bain lors de la dissection et des enregistrements ultérieurs. Enfin, la réalisation in vitro des enregistrements nerveuses splanchniques utilisant des animaux génétiquement modifiés pourrait permettre aux chercheurs d'élucider pleinement le rôle des différents canaux et récepteurs exprimés sur les fibres afférentes.

Les chercheurs de tenter de mettre en œuvre cette technique doit également garder à l'esprit que l'identification et l'isolement des afférences mésentérique et afférences pelviens exige évidemment connaissance de l'anatomie de base et de la formation technique, et les chercheurs doivent se familiariser avec les principes de base de l'électrophysiologie neuronale.

Le réglage in vitro permet en outre aux chercheurs d'identifier facilement possible tar pharmacologiquereçoit et permet de mieux comprendre le rôle physiologique de l'activité neuronale, ainsi que la signalisation sensorielle altérée dans plusieurs processus pathologiques.

En cas de mesures afférentes jéjunum, plusieurs segments de tissu d'un seul animal peuvent être étudiés simultanément, une fonctionnalité qui est assez difficile en utilisant une installation in vivo. Les chercheurs devraient toutefois interpréter avec prudence les résultats obtenus à partir de différents segments, comme les différences régionales pourraient les résultats de polarisation. Par conséquent , nous recommandons de mesurer systématiquement l' activité des nerfs afférents du même site (par exemple, premier segment distalement du ligament de Treitz ou l'angle de Treitz).

applications actuelles et futures typiques de cette technique comprennent le criblage de composés pharmacologiques qui peuvent altérer la sensibilisation des afférences mésentériques lors de pathologies qui sont caractérisées par une hypersensibilité viscérale et de la douleur. Comme déjà mentionné précédemment, l'objectif de lales composés peuvent être rencontrés en soi quelque part le long du système nerveux complexe depuis le système nerveux entérique intrinsèque au cerveau; en tant que telle, la caractérisation et la modulation de l' activité des nerfs afférents contribue à l'image plus large qui englobe également l'imagerie calcique des nerfs entériques intrinsèques et les ganglions rachidiens, la mesure de la réponse viscéromotrice comme un indicateur de l' hypersensibilité viscérale in vivo et l' imagerie cérébrale fonctionnelle, parmi d'autres.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
sodium chloride (NaCl) VWR Chemicals 27,810,295 compound Krebs solution
potassium chloride (KCl) Acros organics 196770010 compound Krebs solution
sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) VWR Chemicals 1,063,461,000 compound Krebs solution
sodium bicarbonate (NaHCO3) Merck 1,063,291,000 compound Krebs solution
magnesium sulfate (MgSO4) Merck 1,058,861,000 compound Krebs solution
calcium chloride (CaCl2) Merck 23,811,000 compound Krebs solution
D-glucose VWR Chemicals 1011175P compound Krebs solution
Distilled water compound Krebs solution
PVC tubing Scientific Laboratory Supplies The intestinal segment should be mounted over PVC tubing
Silicone tubing Scientific Laboratory Supplies The rest of the tubing, ideally silicone-based - more easily dislodging of debris in the tubing
Silk thread Pearsall Limited 10B15S220 Attachment of the segment over the PVC tubing
Syringe driver Harvard Apparatus 55-2222 Intraluminal infusion of Krebs
Binocular - including 10X magnification in oculair Zeiss STEMI 2000 Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve
Homeothermic Blanket Control Unit Harvard Apparatus 507214 Heating of the organ chamber
Custom made organ bath with Sylgard covered bottom
Spike2 software Recording and analysis of the data
Insect pins, 500 pieces, stainless steel, diameter 0.2 mm Austerlitz insect pins minutiens Dissection of the afferent nerve
Tweezer Dumont #5 inox 11 cm World Precision Instrument 500341 Dissection of the afferent nerve
Scissors, spring, 14 cm World Precision Instrument 15905 Dissection of the afferent nerve
DB digitimer  NL 108T2/10 pressure transducer
Micromanipulator Narishige M-3333 3D manipulation of the suction electrode
Micromanipulator X-4 rotating block 3D manipulation of the suction electrode
Micromanipulator GJ-8 magnetic stand 3D manipulation of the suction electrode
LightSource Euromex Microscopes Holland EK-1 Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve
CED 1401 Recording Apparatus Recording of afferent nerve activity
Humbug 50/60 Hz Noise Eliminator Quest Scientific Instruments Elimination of background noise
Infusion Pump Gibson Minipuls 2 Infusion of the organ chamber in which the segment is mounted
Microelectrode Holder Half Cells 1.5 mm World Precision Instrument MEH2SW Suction electrode for isolation of the afferent fiber
Borosilicate Glass Capillaries, 300 pc; 1.5/0.84 OD/ID World Precision Instrument 1B150-4 Capillary for the isolation of the afferent nerve

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References

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<em>In vitro</em> Enregistrement de mésentérique Afférent activité nerveuse chez la souris jéjunale et Segments colique
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Nullens, S., Deiteren, A., Jiang, W., Keating, C., Ceuleers, H., Francque, S., Grundy, D., De Man, J. G., De Winter, B. Y. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J. Vis. Exp. (116), e54576, doi:10.3791/54576 (2016).More

Nullens, S., Deiteren, A., Jiang, W., Keating, C., Ceuleers, H., Francque, S., Grundy, D., De Man, J. G., De Winter, B. Y. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J. Vis. Exp. (116), e54576, doi:10.3791/54576 (2016).

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